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琥珀酸脱氢酶作用的实验

琥珀酸脱氢酶作用的实验

1 实验目的

探究生物体内琥珀酸脱氢酶的催化反应;探究不同温度对琥珀酸脱氢酶活性的影响。

2 实验原理

琥珀酸脱氢酶是生物体内有氧呼吸中三羧酸循环的一个重要的脱氢酶,可催化琥珀酸脱氢,生成延胡索酸,并将脱下的氢交给氢受体(FAD)。在无氧条件下,可以用甲烯蓝作为氢受体,氧化型的甲烯蓝(蓝色)接受了氢、被还原生成还原型甲烯蓝(无色),又叫甲烯白。其反应如下:

脱氢酶

琥珀酸+ MB 延胡索酸+ MB·2H

甲烯蓝(蓝色)无氧条件下甲烯白(无色)

3 实验器材与试剂

剪刀、研钵、试管、恒温水浴锅、冰箱、烧杯、胶头滴管、天平、鸽子。

生理盐水:0.9% NaCl。

0.1 M 琥珀酸溶液:1.8 g琥珀酸加少量蒸馏水溶解后,用0.2 N NaOH调节pH至7.4,再用蒸馏水配成100 ml溶液。(0.2 N NaOH:4 g NaOH配成250 ml溶液。)

pH7.4磷酸缓冲液:0.2 M NaH2PO4 19 ml与0.2 M Na2HPO4 81ml混合而成。

(0.2 M NaH2PO4溶液:1.56 g NaH2PO4加蒸馏水配成50 ml溶液;

0.2 M Na2HPO4溶液:14.32 g Na2HPO4·12H2O 加蒸馏水配成200ml溶液。)

0.01% 甲烯蓝溶液:0.01 g甲烯蓝加蒸馏水配成100 ml溶液。

4 实验操作

4.1 处死鸽子(剪断鸽子的颈总动脉),剪开胸脯处皮肤,取胸脯处肌肉约3 g。剪碎。加4~

5 ml生理盐水,研磨均匀,得到肌肉匀浆。

4.2 按下表操作

试管 1 2 3

肌肉匀浆(滴)20 20 20

缓冲液(滴)20 20 20

甲烯蓝(滴)10 10 10

琥珀酸(滴)30 30 30

摇匀混合液,各试管迅速加少量液体石蜡

反应条件40℃100℃0℃

3分钟后观察并记录颜色变化

振荡试管,观察颜色变化;静置,观察颜色变化。