基因工程学原理第三章

第三章从活细胞中纯化DNA

三种不同种类的DNA

1、全细胞DNA（total cell DNA），作为提取所需克隆基因的材料来源，是必须得到的。全细胞DNA可以从细菌培养物、植物、动物细胞或其他任何用作研究的生物中获取。全细胞DNA包括生物体本身的基因组DNA（genomic DNA）及其他一切DNA分子，如：存在质粒生物体中的质粒。

2、第二种所需类型的DNA是纯净的质粒DNA。

3、如果要用到噬菌体克隆载体，那么噬菌体DNA的制备就十分必要。

3、1全细胞DNA的制备

从细菌细胞培养物中制备全细胞DNA的步骤可分为4个阶段：（1）培养细胞的生长和收集（harvested）；

（2）细胞被破碎并释放出内含物；

（3）这个细胞抽提物（cell extract）被除去DNA外的所有成分；

（4）得到的DNA溶液被浓缩。

3、1、1 细菌培养物的生长和收集

两种典型的细菌培养基组成

M9培养基

是一种典型的确定成分培养基（defined medium），其中所有成分都是可知的。这种培养基包含无机营养成分的混合物以提供基本元素，如氮、镁和钙以及葡萄糖，来提供碳源和能量。实际上，额外的

生长因子如微量元素和维生素也必须加入M9中以维持细菌的生长。

Luria-Berani（LB）培养基是一种更加复杂的不确定成分培养基（undefined medium），LB培养基包含哪些成分以及这些成分的含量都是未知的。这种培养基的两种主要成分：胰蛋白胨和酵母提取物。胰蛋白胨实际上负责提供氨基酸以及小的肽段，酵母提取物（酵母细胞部分消化后的干粉制备产物）负责提供氮源、糖类以及其他有机和无机营养。类似LB的混合培养基并不需要再另外补充成分并且能够维持种类范围很广的细菌的生长。

培养物的生长状况能够通过读取600nm 光密度（OD值）来进行检测，在该波长下每个单位的OD值相当于0.8x10v9个细胞／mL。

为了便于获得细胞的提取物，细菌必须在尽可能小的体积中被获得，因此需要在离心机中对培养物进行离心以收集细胞。相对较低的离心转速就能够使细菌在离心管底部聚集。1000mL培养基中获得的最大密度的细菌能够通过离心后再次悬浮在不到10mL的液体中。

3、1、2 细胞提取物的制备

细菌细胞外包裹着一层细胞膜和一层坚固的细胞壁。对某些特殊种类的细菌，包括大肠杆菌，细胞壁自身也包裹着一个双层的外膜。所有这些屏障在释放细胞内含物之前都必须去除。裂解细菌细胞的技术大体上可以分为两种：物理方法和化学方法。物理方法指的是以机械力的方法打破细胞外的屏障来释放内含物。化学方法则是通过将细胞暴露在能够对细胞整体结构产生影响的化学药物中来对细胞进行破碎的方法。化学裂解通常包括一种能够攻击细胞壁的成分和一种能

够除去细胞膜的成分。所用的化学物质通常使用到的是溶菌酶和乙二胺四乙酸盐（EDTA），或者两者相结合使用。溶菌酶是一种在鸡蛋清中存在的酶，并且在一些分泌物如眼泪和唾液中也存在，它能够消化掉赋予细胞壁坚固性的多聚混合物。另一方面，EDTA能够通过螯合除去对保持整个细胞外壁结构来说必不可少的钙离子，同时能够抑制一些能够降解DNA的细胞质中的酶。在某些条件下，用溶菌酶或EDTA来削弱细胞壁已经足以导致细胞膜破裂，但通常都还要加入一些去垢剂如十二烷基磺酸钠（SDS）。去垢剂通过移除液体分子并导致细胞膜破裂，协助了整个细胞外壁的裂解过程。

在裂解细胞的过程中，制备细胞提取物的最后一个步骤是细胞内不溶性残渣的去除。

3、1、3 从细胞提取物中纯化DNA

除了DNA，细菌细胞提取物中还包含大量的蛋白质和RNA。从这些混合物中纯化DNA有很多方法。

一种方法就是用试剂降解其中的杂质，留下纯的DNA溶液；另一种方法是使用离子交换层析（ion-exchange chromatography）分离各种组分，达到在细胞提取物中将DNA和蛋白及RNA分离的效果。

有机萃取和酶消化法去除杂质

除去细胞提取物中蛋白质的标准方法是，加入苯酚或1:1的苯酚与氯仿的混合物。这些有机溶剂能够沉淀出蛋白质但仍保留核酸（DNA和RNA）在水溶液中。

注意：实际上每进行一次混合和离心都会导致一定数量的DNA

分子断裂。所以，对于一些蛋白质成分较多的细胞提取物来说，在进行苯酚提取前，先用蛋白酶（protease）对细胞提取物进行处理，比如链霉蛋白酶或蛋白酶K。这些酶将肽段降解成更小的单元以便于进行苯酚提取。最有效的除去RNA的方法是使用核糖核酸酶，它能够迅速降解RNA分子，把它们变成核苷酸单元。

使用离子交换层析从细胞提取物中纯化DNA

利用荷电量的不同能将混合物分离成各种单独组分以达到纯化DNA的目的。由于细胞提取物中不同分子核电量不同，其与层析分离基质（也称树脂（resin））的结合紧密程度也不同。DNA和RNA （包括一些蛋白质）都是带负电的，它们能够结合在带正电的树脂上。通过逐渐增加盐离子浓度，不同类型的生物分子就逐一从树脂中分离下来。洗脱下来的物质先是蛋白，接着是RNA，最后是DNA。不过，如此细致的分离通常没有必要，只需要使用两个盐浓度就可以了。第一个浓度的盐溶液将蛋白和RNA洗脱下来，只留下DNA结合在上面，紧接着再用一个较高浓度的盐溶液将DNA洗脱下来，这样DNA 就从RNA和蛋白污染物中分离开来。

3、1、4 DNA取样的浓缩

有机萃取的方法常能得到浓度非常高的DNA溶液，没有必要进行进一步的浓缩。其他分离方法得到较稀的DNA溶液，需要浓缩增加DNA溶液的浓度。

最经常用到的浓缩方法是乙醇沉淀（ethanol precipitation）。在盐（严格来说是单价阳离子如钠离子）存在的条件下。处在-20℃或更

低一些的温度，纯的乙醇能够有效地使多聚核苷酸沉淀。

3、1、5 DNA浓度的测量

DNA浓度能够通过紫外吸收分光光度测定法进行测定。被DNA 溶液吸收的紫外线的量能够正比于样品溶液中的DNA含量。通常吸收量在260nm 被测量，在该波长情况下，1.0的吸收值对应于每毫升中50μg双链DNA。紫外吸收还能够被用来检测DNA制备物的纯度。对纯净的DNA样品，在260nm和280nm 的吸收量之比应为1.8。如果实际测量时这个比例小于1.8的话，就表示样品被蛋白质或苯酚污染了。

3、1、6 制备全细胞DNA的其他方法

液体培养基只适合于细菌、其他微生物和动植物细胞的培养。破碎细菌细胞时所使用的化学物质对其它生物细胞并不总是适用，比如说，溶菌酶对植物细胞就毫无作用。专一性的降解酶对绝大多数的细胞壁都适用，但是通常一些物理方法，比如用研钵和乳钵对冷冻的材料进行研磨要更有效。另一方面，绝大多数动物细胞根本就没有细胞壁，仅仅用去垢剂处理就能去掉外被。对于绝大多数细菌细胞来说，主要的细胞提取物就是蛋白质、DNA和RNA,因此苯酚提取或蛋白酶降解，接下来利用核糖核酸酶分解RNA，就能够得到纯净的DNA样品了。然而，对于植物细胞组织等细胞中还含有大量的其它生化成分的对象，就需要使用一些不同的方法来提纯。

方法之一是使用一种称作十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）的去垢剂，这种去垢剂能够和核酸一起形成不溶的混合物。当CTAB加入

到植物细胞提取物中时，核酸-CTAB混合物就能够沉淀出来，经过离心后，沉淀混合物聚集在离心管底部，而糖类、蛋白质以及其他杂质仍然保留在悬液中。接下来，将混合物沉淀再溶于1mol/L NaCL 溶液，使CTAB与核酸分离。这样，核酸就能利用乙醇沉淀进行浓缩并利用核糖核酸酶处理除去RNA。

也可以采用异硫氰酸胍，它具备的两种特性对DNA纯化十分有用。第一，它能够使除了核酸外的所有生化成分变性和溶解，因此实际上可以用来从任何组织细胞中分离DNA。第二，在异硫氰酸胍存在情况下，DNA会牢固地结合在二氧化硅颗粒上。

基因工程基本原理

一、 A 型题 1. F因子从一个细胞转移至另一个细胞的基因转移过程称为 (A) 转导 (B) 转化 (C) 转座 (D) 转染 (E) 接合 2. 通过自动获取或人为地供给外源DNA使受体细胞获得新的遗传表型，称为 (A) 转化 (B) 转座 (C) 接合 (D) 转导 (E) 转染 3. 由插人序列和转座子介导的基因移位或重排称为 (A) 接合 (B) 转染 (C) 转导 (D) 转座 (E) 转化 4. 由整合酶催化、在两个DNA序列的特异位点间发生的整合称

(A) 位点特异的重组 (B) 同源重组 (C) 随机重组 (D) 基本重组 (E) 人工重组 5. 发生在同源序列间的重组称为 (A) 非位点特异的重组 (B) 位点特异的重组 (C) 基本重组 (D) 人工重组 (E) 随机重组 6. 限制性核酸内切酶切割DNA后产生 (A) 5’磷酸基和3’羟基基团的末端 (B) 5’磷酸基和3’磷酸基团的末端 (C) 5’羟基和3’羟基基团的末端 (D) 3’磷酸基和5’羟基基团的末端 (E) 以上都不是 7. 可识别并切割特异DNA序列的称 (A) 非限制性核酸外切酶 (B) 限制性核酸内切酶 (C) 限制性核酸外切酶 (D) 非限制性核酸内切酶

(E) DNA酶（DNase） 8. 在重组DNA技术中催化形成重组DNA分子的是DNA (A) 解链酶 (B) 聚合酶 (C) 连接酶 (D) 内切酶 (E) 拓扑酶 9. 在重组DNA技术领域所说的分子克隆是指 (A) 建立多克隆抗体 (B) 建立单克隆抗体 (C) 有性繁殖DNA (D) 无性繁殖DNA (E) 构建重组DNA分子 10. 在下述双链DNA序列（仅列出其中一条链序列）中不属于完全回纹结构的是 (A) GGAATTCC (B) TGAATTCA (C) AGAATTCT (D) CGTTAAGC (E) AGATATCT 11. 无性繁殖依赖DNA载体的最基本性质是 (A) 卡那霉素抗性 (B) 青霉素抗性

高中生物 第一章 基因工程 第2课时 基因工程的原理和技术学案 浙科版选修3

第2课时基因工程的原理和技术 知识内容要求考情解读 基因工程的原 理和技术 b 1.简述基因工程的原理。 2.概述基因工程基本操作的几个步 骤。 一、基因工程的原理 1．基本原理 让人们感兴趣的基因(即目的基因)在宿主细胞中稳定和高效地表达。 2．变异类型 基因工程属于可遗传变异中的基因重组。 归纳总结(1)在基因工程中，不同DNA链的断裂和连接产生DNA片段的交换和重新组合，形成了新的DNA分子，在这个操作中交换了DNA片段，故属于基因重组。 (2)基因工程中的基因重组不同于减数分裂过程中的基因重组。前者属于无性生殖中的重组，并发生在不同种生物间，打破了物种间的界线，可以定向地改造生物的遗传特性，此操作均在细胞外进行。 例1科学家用纳米技术制造出一种“生物导弹”，可以携带DNA分子。把它注射入组织中，可以通过细胞的内吞作用进入细胞内，DNA被释放出来，进入到细胞核内，最终整合到细胞染色体上，成为细胞基因组的一部分，DNA整合到细胞染色体中的过程属于( ) A．基因突变B．基因重组 C．基因互换D．染色体畸变 答案 B 解析基因突变是基因内部结构的改变；染色体畸变是以染色体作为研究对象，探讨染色体结构和数目的变化；基因工程是将外源基因导入受体细胞，得到人们所需要的产物，属于基因重组。 例2下列叙述符合基因工程基本原理的是( ) A．B淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因 B．将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株 C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株 D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上 答案 B 解析基因工程是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基

基因工程原理与技术思考题

Chapter I Introduction 1)什么是基因？基因有哪些主要特点？ 基因是一段可以编码具有某种生物学功能物质的核苷酸序列。 ①不同基因具有相同的物质基础.②基因是可以切割的。③基因是可以转移的。④多肽与基因之间存在 对应关系。⑤遗传密码是通用的。⑥基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。 2)翻译并解释下列名词 genetic engineering遗传工程 gene engineering基因工程：通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物获得新的遗传性状的操作。 gene manipulation基因操作：对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。 recombinant DNA technique重组DNA技术 gene cloning基因克隆：是指对基因进行分离和扩大繁殖等操作过程，其目的在于获得大量的基因拷贝，在技术上主要包括载体构建、大肠杆菌遗传转化、重组子筛选和扩大繁殖等环节。 molecular cloning分子克隆 3)什么是基因工程？简述基因工程的基本过程？p2 p4 4)简述基因工程研究的主要内容？p5 5)简述基因工程诞生理论基础p2和技术准备有哪些p3？ 6)基因表达的产物中，氨基酸序列相同时，基因密码子是否一定相同？为什么？ 否，密码子简并性 7)举例说明基因工程技术在医学、农业、工业等领域的应用。 医学:人胰岛素和疫苗 农业:抗虫BT农药 工业:工程酿酒酵母

Chapter ⅡThe tools of trade 1)什么是限制性核酸内切酶？简述其主要类型和特点？ 是一种核酸水解酶，主要从细菌中分离得到。类型特点p11 2)II型核酸内切酶的基本特点有哪些p12-14？简述影响核酸内切酶活性的因素有哪些 p14？ 3)解释限制酶的信号活性？抑制星号活性的方法有哪些？ 4)什么是DNA连接酶p15？有哪几类p16？有何不同p16？ 5)什么叫同尾酶、同裂酶p12？在基因工程中有何应用价值？ 同裂酶：识别位点、切割位点均相同，来源不同。在载体构建方面往往可以取得巧妙的应用。应用较多的同裂酶比如Sma1和Xma1，它们均识别CCCGGG，但前者切后产生钝末 同尾酶：来源各异，识别序列各不相同，但切割后产生相同的粘性末端。由同尾酶(isocaudomer)产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的。 6)什么是DNA聚合酶？根据DNA聚合酶使用的模板不同，可将其分为哪两类？各有什么活 性？p17-18 聚合酶：在引物和模板的存在下，把脱氧核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3‘-OH 末端，催化核苷酸的聚合作用。 ①依赖于DNA的DNA聚合酶 ②依赖于RNA的DNA聚合酶 7)Taq DNA聚合酶：是一种从水生嗜热菌中分离得到的一种耐热的dna聚合酶，具有5-3聚 合酶活性和3-5外切酶活性，在分子中主要用于PCR。 逆转录酶：RNA指导的DNA聚合酶， 8)Klenow片段的特性和用途有哪些？举例说明。p17 9)名词解释：S1核酸酶、核酸外切酶、磷酸化酶激酶、 甲基化酶

基因工程原理练习题及答案

基因工程原理练习题及其答案 一、填空题 1．基因工程是_________年代发展起来的遗传学的一个分支学科。 2．基因工程的两个基本特点是：(1)____________，(2)___________。 3．基因克隆中三个基本要点是：___________；_________和__________。 4．通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的___________。 5．限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自_______，第二、三两个字母取自_________，第四个字母则用___________表示。 6．部分酶切可采取的措施有：(1)____________(2)___________ (3)___________等。 7．第一个分离的限制性内切核酸酶是___________；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是_____________。8．限制性内切核酸酶BsuRI和HaeⅢ的来源不同，但识别的序列都是_________，它们属于_____________。 9．DNA聚合酶I的Klenow大片段是用_____________切割DNA聚合酶I得到的分子量为76kDa的大片段，具有两种酶活性：(1)____________；(2)________________的活性。 10．为了防止DNA的自身环化，可用_____________去双链DNA__________________。 11．EDTA是____________离子螯合剂。 12．测序酶是修饰了的T7 DNA聚合酶，它只有_____________酶的活性，而没有_______酶的活性。 13．切口移位(nick translation)法标记DNA的基本原理在于利用_________的_______和______的作用。 14．欲将某一具有突出单链末端的双链DNA分子转变成平末端的双链形式，通常可采用_________或_______________。15．反转录酶除了催化DNA的合成外，还具有____________的作用，可以将DNA- RNA杂种双链中的___________水解掉。 16．基因工程中有3种主要类型的载体：_______________、_____________、______________。 17．就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：_______________、_____________、______________。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。 18．一个带有质粒的细菌在有EB的培养液中培养一段时间后，一部分细胞中已测 不出质粒，这种现象叫。 19．pBR322是一种改造型的质粒，它的复制子来源于，它的四环素抗性基因来自于，它的氨苄青霉素抗性基因来自于。 20．Y AC的最大容载能力是，BAC载体的最大容载能力是。 21．pSCl01是一种复制的质粒。 22．pUCl8质粒是目前使用较为广泛的载体。pUC系列的载体是通过 和两种质粒改造而来。它的复制子来自，Amp 抗性基因则是来自。 23．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是；二是。 24．野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是 和。 25．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自、COS位点序列来自，最大的克隆片段达到kb。 26．野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体，原因是：(1) (2) (3) 。 27．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA共同构成的，其中来自质粒的主要结构是，而来自噬菌体的主要结构是。 28．λ噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DNA片段后，总的长度应在噬菌体基 因组的的范围内。 29．在分离DNA时要使用金属离子螯合剂，如EDTA和柠檬酸钠等，其目的是 。 30．用乙醇沉淀DNA时，通常要在DNA溶液中加人单价的阳离子，如NaCl和NaAc， 其目的是。 31．引物在基因工程中至少有4个方面的用途：(1) (2) (3) (4) 。 32．Clark发现用Taq DNA聚合酶得到的PCR反应产物不是平末端，而是有一个突出 碱基末端的双链DNA分子。根据这一发现设计了克隆PCR产物的。 33．在cDNA的合成中要用到S1核酸酶，其作用是切除在 。 34．乙醇沉淀DNA的原理是。 35．假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件：

植物基因工程的重要意义

植物基因工程的重要意义 关键词：植物基因工程技术，转基因 正文： 作为21世纪科技的重要发展项目，基因工程技术在植物方面应用的意义主要体现在以下五个方面。 1．植物基因工程技术可以实现超远缘育种,克服不亲和障碍 我们知道，在作物育种中最早应用的是植物组织培养技术，这种技术已在花卉、药材、森林和农作物育苗得到广泛的应用，我国已在甘蔗、人参和马铃薯等方面收到显著经济效益。此外，还可从培养细胞或再生植株选择所需要的突变体。如Shepard(1983)从马铃薯培养物中选出一种能抗腹疫病(Phytophthorainfectans)的抗性植株以及利用培养细胞生产诸如喜树碱等化合物。但以上方法只是同类植株的基因改变。此外人们还对植物原生质体融合进行了研究。但是植物细胞融合后性状的表达，取决于它在以后有丝分裂时染色体是否发生交换或丢失情况。[1]但到目前为止，由融合的细胞而能培养成植株者容寥寥无几，这可以说是克服远缘杂交不亲和障碍的最早例子。如果说细胞融合可以克服种属之间不亲和性，而基因重组则可在更大范围内进行了。动物基因如萤火虫的发光蛋白基因,寒带鱼的抗冻蛋白基因,蛇、蝎的毒液基因等也已转移给作物,分别获得能发光的转基因烟草,抗寒的转基因甜菜、转基因番茄和抗虫的转基因棉花等。[2]由此可见，外源基因导入植物细胞后引发的改变是巨大的。 2．植物基因工程技术可以增强作物改良力度,促进品种更新换代 作物改良基本有两方面，其中提高作物品种的光合与养分效率、病害与虫害抗性正在成为植物基因工程的研究重点,促使作物品种适应低温、干旱、雨涝、土壤瘠薄和盐碱以及温室效应等新旧灾害从而提高作物产量，也已成为基因工程育种的主要内容。 农业生产中，增加粮食产量无非依靠两种途径:一是提高作物品种的生产能力;二是减轻环境因素对作物生长的不利影响。据报道，全世界每年因虫害、病害、草害以及寒冷、干旱、盐碱等灾害对粮食生产所造成的损失令人惊叹：全球每年因虫害与病害所造成的作物减产达30%以上，因杂草所损失的粮食至少在10%以上，再加上低温、干旱和盐碱等各种因素，全世界每年至少要损失粮食产量的一半以上。[3～5] 同时，为了防治病虫害及杂草等，还要施用大量的化学农药，这不仅消耗大量的能源，更严重的是对生态环境造成了极大的甚至是不可逆的破坏。为了摆脱上述困境，从20世纪80年代起，人们开始研究和利用转基因抗性植物来预防病虫害和杂草等，并收到了良好的效果。与传统作物育种技术相比，利用基因工程技术进行遗传育种有其自身的优势，一方面由于它可以将特定的抗性基因定向转移，因而成功率较高，可大大提高选择效率，在很大程度上避免了传统育种工作的盲目性；另一方面是其基因来源打破了种属的界限，除了植物基因以外，动物和微生物的抗性基因都可以作为外源基因转人植物基因组中，并获得表达。[6] 3．植物基因工程技术可以拓宽应用研究,扩大生产领域 随着转基因植物技术日益成熟,利用植物的生物反应器作用,进行贵重药品、人畜疫苗和精细化工等的生产,因具有成本低,竞争力强的吸引力,正在成为高技术及其产业化的新兴热门领域。现已成功地将干扰素、胰岛素、多肽抗体、人血清白蛋白等基因转给植物进行这些药物的生产。美国现已得到多肽抗体转基因烟草,美国还在通过转基因植物研制麻疹、乙肝、艾滋病等疫苗,甚至成功地获得了口服植物疫苗。现国际上正在出现研制营养药物的新思路。此外,现还大量进行用于塑料、染料、涂料、洗涤、香料、润滑剂等的转基因植物研究。据

《基因工程原理》期末复习思考题教案资料

《医用基因工程》复习思考题 第一章基因和基因组及基因工程的概念 一、名词概念 ①移动基因(插入序列；转位子)；②断裂基因；③RNA剪辑； ④内含子(间隔序列)与表达子；⑤重叠基因；⑥重复序列；⑦假基因；⑧启动子与终止子；⑨起始位点、终止位点。 二、讨论题 1.什么叫基因?何谓基因的新概念?基因的主要功能是什么? 2.一种基因一种酶的提法妥否？ 3.基因密码子三联体间是否存在着逗号？ 4.基因表达的产物中，氨基酸序列相同时，基因密码子是否一定相同？为什么？ 5.何谓转位子和转位作用?转位的后果如何? 6.基因中最小的突变单位和重组单位是什么？ 7.基因工程应包括哪些内容？何谓基因工程的四大里程碑和三大技术发明? 8.真核细胞基因组中常有内含子存在，能否在原核细胞获得表达？能，为什么？不能，为什么？ 第二章基因工程中常用的工具酶 1.什么是限制性核酸内切酶？ 2.什么是R/M现象？如何解释？ 3.II型核酸内切酶的基本特点有哪些？ 4.影响II型核酸内切酶活性的因素有哪些？如何克服和避免这

些不利因素？ 5.DNA连接酶有哪两类？有何不同？ 6.甲基化酶有哪两类？有何应用价值？ 7.什么叫同尾酶、同裂酶？在基因工程中有何应用价值？ 8.平末端连接的方法有哪些？(图示) 9.Klenow酶的特性和用途有哪些？举例说明。 10.反转录酶的特性有哪些？有何应用价值？ 11.列举碱性磷酸酶BAP/CAP的应用之一。 12.列举末端核苷酸序列转移酶的应用之一。 13.质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？ 14.基因片段与载体的平末端连接的方法有哪些？ 15.用寡核苷酸和衔接物DNA的短片段连接时为使基因内部的切点保护，常用何种办法解决？ 第三章基因克隆载体 1.基因工程常用的载体有哪5种？其共同特性如何？ 2.什么是质粒？质粒分哪几种？有哪两种复制类型，质粒的分子生物学特性有哪些？ 3.质粒存在的三种形式是什么？ 4.分离质粒的基本步骤有哪些？ 5.分离纯化质粒的方法有哪几种？简述CsCl密度梯度(浮密度)分离法、碱变性法的原理，如何选择合适的分离方法？ 6.作为理想质粒载体的基本条件有哪些？ 7.什么叫插入失活，举例说明之。 8.构建pBR322质粒载体的亲本质粒有哪些？ 9.什么叫插入型和替换型噬菌体载体?插入型和替换型入噬菌体

《基因工程原理与技术》标准答案及评分标准.0001

精品文档 《基因工程原理与技术》标准答案及评分标准 一、名词解释（本大题共5小题，每题2分，总计10分） 限制性内切酶的Star活性：限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH 等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。 受体细胞：又称为宿主细胞或寄主细胞等，从试验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从试验目的讲是有应用价值和理论研究价值的细胞 T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA 该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。 克隆基因的表达：指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过 程。典型的基因表达是基因经过转录、翻译，产生有生物活性的蛋白质的过程。 a -互补：3 -半乳糖苷酶（B -gal）是大肠杆菌lacZ基因的产物，当培养基中的一种色素元（X-gal ）被3 -gal切割后，即产生兰色。大肠杆菌的3一半乳糖苷酶由1021个氨基酸构成，只有在四聚体状态下才有活性。大肠杆菌lacZ基因由于a区域缺失，只能编码一种在氨基端截短的多肽，形成无活性的不完全酶，称为a受体；如果载体的lacZ 基因在相反方向缺失，产生在羧基端截短的多肽，这种部分3 -半乳乳糖苷酶也无活性。 但是这种蛋白质可作为a供体。受体一旦接受了供体（在体内或体外），即可恢复3 -半乳糖苷酶的活性，这种现象称为a互补. 由载体产生的a供体能够与寄主细胞产生 的无活性的a受体互作形成一种八聚体，从而恢复3 -半乳糖苷酶的活性。如果培养基 中含有X-gal的诱导物IPTG时，凡是包含有3 -半乳糖苷酶活性的细胞将转变为蓝色，反之不含有这种酶活性的细胞将保持白色。 、填空题（本大题共7小题，每空1分，总计20 分） 1、质粒按自我转移的能力可分为—接合型—质粒和—非接合型—质粒；按复制类型可分为松 弛性质粒和严紧型质粒。 2、为了防止DNA的自身环化，可用碱性磷酸酶除去双链DNA 5'—端的磷酸基团 。 3、人工感受态的大肠杆菌细胞在温度为_0匸—时吸附DNA在温度为_42乜__ 时摄人 DNA 4、仅克隆基因（DNA片段）用途而言，最简单的质粒载体也必需包括三个组成部分： 复制区：含有复制起点__、选择标记：主要是抗性基因 ________ 、__克隆位点：便于外源_ DNA的插入_。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。 5、Southern blotting 杂交能够检测外源基因是否整合进受体细胞基因组；外源基 因的转录表达需要通过—northern_杂交或_ RT-PCR_来揭示；而外源基因_____ 翻 译—水平的表达则需通过免疫学检测或Western杂交才能揭示，其使用的探针是 —蛋白质____ 。 6、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位有—细胞质_、_ —周质_、一细胞外 _。 7、Vir区基因的激活信号有三类，它们是—酚类化合物_、_中性糖和酸性糖_、— _ pH 值_。 简答题（本大题共7 小题，总计50 分） 1欢迎下载

基因工程原理练习题及其答案

基因工程复习题 题型：名词解释（10个）30分；填空（每空1分） 20分；选择题（每题1分）10分；简答题（4个）20分；论述题（2个）20分。 第一章绪论 1.名词解释： 基因工程：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。 遗传工程广义：指以改变生物有机体性状为目标，采用类似工程技术手段而进行的对遗传物质的操作，以改良品质或创造新品种。包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程和基因工程等不同的技术层次。狭义：基因工程。 克隆：无性(繁殖)系或纯系。指由同个祖先经过无性繁殖方式得到的一群由遗传上同一的DNA分子、细胞或个体组成的特殊生命群体。 2．什么是基因克隆及基本要点? 3.举例说明基因工程发展过程中的三个重大事件。 A) 限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志着DNA重组时代的开始）；B) 载体的使用； C) 1970年，逆转录酶及抗性标记的发现。 4.基因工程研究的主要内容是什么？ 基础研究： 基因工程克隆载体的研究 基因工程受体系统的研究 目的基因的研究 基因工程工具酶的研究 基因工程新技术的研究 应用研究：

基因工程药物研究 转基因动植物的研究 在食品、化学、能源和环境保护等方面的应用研究 第二章基因克隆的工具酶 1.名词解释： 限制性核酸内切酶：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。 回文结构：双链DNA中的一段倒置重复序列，当该序列的双链被打开后，可形成发夹结构。 同尾酶：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。 同裂酶：不同来源的限制酶可切割同一靶序列和具有相同的识别序列 黏性末端：DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样的DNA末端，称为粘性末端。 平末端：DNA片段的末端是平齐的。 限制性核酸内切酶的酶活性单位（U）：在酶的最适反应条件下，在50μl容积中，60分钟内完全切割1g DNA所需的酶量为1个酶活性单位（unit 或U） 限制性核酸内切酶的星活性：指限制性内切酶在非标准条件下，对与识别序列相似的其它序列也进行切割反应，导致出现非特异性的DNA片段的现象。 连杆（linker）：化学合成的8～12个核苷酸组成的寡核苷酸片段。以中线为轴两边对称，其上有一种或几种限制性核酸内切酶的识别序列，酶切后可产生一定的粘性末端，便于与具有相同粘性末端的另一DNA片段连接。 衔接头（adaptor）：化学合成的寡核苷酸，含有一种以上的限制性核酸内切酶识别序列。其一端或两端具有一种或两种内切酶切割产生的黏性末端。 底物位点优势效应：酶对同一个DNA底物上的不同酶切位点的切割速率不同。 激酶：对核酸末端羟基进行磷酸化的酶。 2.说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。 用属名第一个字母和种名的头两个字母组成的3个字母斜体的略语表示寄主菌的物种名以

常用的植物转基因技术

五种常用的植物转基因技术 植物转基因技术是通过各种物理的、化学的和生物的方法将从动物、植物及微生物中分离的目的基因整合到植物基因组中，使之正确表达和稳定遗传并且赋予受体植物预期性状的一种生物技术方法。1983年，首例抗病毒转基因烟草的成功培育标志着人类开始尝试利用转基因技术改良农作物。目前，植物转基因技术已在作物改良和育种领域发挥了重要作用。通过植物转基因技术，一些来自于动物、植物及微生物的有益基因如抗病／虫基因、抗非生物胁迫性状基因及特殊蛋白基因已被转化到农作物中以改良现有的农作物和培育新的农作物品种。以DNA重组技术为基础的植物转基因技术极大地扩展了基因信息的来源，打破了远缘物种间自身保持遗传稳定性的屏障。植物转基因技术已应用到玉米、水稻、小麦、大豆和棉花等许多农作物。同时，该技术也正在被尝试用于茄子和草莓等其它的作物中‘1’纠。目前，根据转基因植物的受体类型，植物转基因方法可以分为3大类：以外植体为受体的基因转化方法，如农杆菌介导法、基因枪法和超声波介导法；以原生质体为受体的基因转化方法，如聚乙二醇法、电击法、脂质体法及磷酸钙-DNA共沉淀法；以种质系统为受体的基因转化方法，如子房注射法和花粉管通道法。由于以原生质体为受体的基因转化方法有原生质体培养难度大，培养过程繁杂，培养工作量大且培养技术不易掌握；原生质体再生植株的遗传稳定性差、再生频率低并且再生周期长；相关的转化方法的转化率低、效果不理想等缺点，所以该类基因转化方法未被作为植物转基因的常规方法广泛使用。本文将对农杆菌介导法、基因枪法、超声波介导法、子房注射法和花粉管通道法的原理、基本步骤和优缺点作以简要介绍。 1以外植体为受体的基因转化方法 1.1农杆菌介导法 农杆菌介导法是最早应用、最实用有效并且具有最多成功实例的一种植物转基因方法。农杆菌是一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌。目前，用于植物转基因介导的农杆菌是根癌农杆菌和发根农杆菌。某些根癌农杆菌和发根农杆菌分别含有大小为200 -800bp的结构和功能相似的Ti质粒和Ri质粒。Ti质粒和Ri质粒含有3个功能区：参与农杆菌侵染植物过程的vir区、参与农杆菌基因整合到宿主植物基因组过程的T-DNA区、在农杆菌中启动质粒复制的ori区。在vir区上的vir操纵子群作用下，Ti 质粒和Ri质粒能将自身的T-DNA转入宿主植物细胞内，而后将T-DNA整合到植物基因组中。T— DNA 是质粒上一段10—30kb的序列，它的两端各有一段高度保守的25bp的同向重叠序列。由于T-DNA 转化无序列特异性，因此可用任何基因片段代替原来的T-DNA基因片段进行。 农杆菌介导法的原理是：在农杆菌基因ehvA，chvB， pscA，and att家族所编码的蛋白和植物伤口产生的酚类物质和糖类物质的共同作用下，农杆菌识别并附着在宿主细胞壁上。virD4和virB基因编码蛋白组成的type IV分泌系统将单链VirD2-T-DNA复合体运送到宿主细胞内。此外，VirE3、VirE2和VirF蛋白也通过该系统进入宿主细胞质中。在宿主细胞质中，VirE2蛋白与VirD2-T-DNA复合体结合。在VirD2核定位信号、某些农杆菌蛋白和宿主细胞蛋白的共同作用下，VirD2-T-DNA复合体进入细胞核。在VirD2、VirE2、某些宿主细胞核蛋白如AtKu80和DNA连接酶的作用下，T-DNA被整合到宿主基因组中，但具体过程不详。 农杆菌介导法的基本步骤是：(1)诱导目标植物外植体；(2)构建含有目的基因的质粒；(3)质粒导人合适的农杆菌菌株中及该菌株的活化过程；(4)植物愈伤组织的微伤口处理及农杆菌侵染；(5)共培养及脱菌处理；(6)愈伤组织筛选、分化与植株再生；(7)再生植株及其后代的外源基因及其表达产物的分子检测；(7)转基因T1代的目标性状鉴定。 农杆菌介导法具有操作简单、转化效率较高、重复性好、单拷贝整合、基因沉默现象少、转育周期

植物基因工程

一从现代农业到基因工程 (一)粮食安全现状 1、食物总量供给已成为全球的焦点之一： 从2000年开始，全球出现了当年粮食生产量比消费量低的情况，2003年全世界粮食的消费量超过生产量0.93亿吨，世界粮食储备也降低到30年来的最低水平。 1999年以来，我国粮食连续四年减产。1999-2002年，我国粮食总产量累计减少800亿公斤左右。自2000年以来，我国粮食年消费需求大致在4.8-4.9亿吨之间，产需缺口约400亿公斤。 (二)农业发展的一个主要矛盾——科技支撑能力不强 农业生产的规模化、专业化和多样化对科技提出了更高的要求，大幅度提高农业劳动生产率需要通过先进适用技术的广泛应用，而目前我国科技进步贡献率只有45%左右，与发达国家的70-80%有很大的差距。 一个农业劳动力养活的人口数： 美国：70人； 日本：约25人； 中国：4-5人。 农业发展的根本出路是现代农业，而其核心支撑条件是现代农业科技的进步。 (三)现代农业的内涵 现代农业是以现代工业和科学技术为基础，重视加强农业基础设施建设，充分汲取中国传统农业的精华，根据国内外市场需要和WTO规则，建立起采用现代科学技术、运用现代工业装备、推行现代管理理念和方法的农业综合体系(引自卢良恕院士)。 (四)建设农业科技创新体系是现代农业的一个根本任务 国家级农业科研工作应具有较强的关键性、全局性、基础性、战略性和前瞻性的特点，为加快现代农业建设提供科技支撑。省级有关农业的科研机构应逐步实行联合，重点开展应用研究和开发研究(也可根据需要适当开展应用基础研究)，重视科技成果转化，更好地为发展生产服务(引自卢良恕院士)。 到2030年，我国人口的持续增长将要达到高峰期，预计达到16亿人口，解决这个庞大人口的口粮是一个新的挑战。 随着人民生活水平的提高，肉蛋奶和水产品的消费不断增加，粮食作为饲料的比重将越来越大，人均粮食占有量的标准应有所提高。 2、食品安全性也成为全球的焦点之一： 农业综合措施、现代农业技术尤其是转基因技术的应用，使老百姓对当前食品尤其是转基因食品安全性问题十分关心。 (五)农业科技创新的一个核心内容：良种创新 农业科技创新的核心：良种+良法。良种对增产的作用所占的比重越来越大，良种是一个先进技术的集合体。 良种创新：植物良种创新、动物良种创新。植物食品占总食品的93%，动物食品占7%，但也间接来自植物食品，所以良种创新的首要任务是植物良种创新。 (六)传统育种面临的挑战 以杂交育种为核心的传统育种技术取得了丰硕的成果，目前仍然是主要作物的主要育种手段。目前传统育种技术在改良作物性状方面遇到了一些挑战，如缺乏特别性状的种质资源，育种周期长，难以克服不良性状的连锁或负相关，易受杂交不亲和及杂种不育的限制，远缘物种间不能进行遗物物质交流和性状转移。 (七)基因工程带来的机遇与竞争 20世纪50年代以来，DNA双螺旋模型和基因操纵子学说的提出，以及DNA限制性内切酶的发现，导致了DNA体外重组技术?a?a基因工程技术的发展，推动了分子生物学和基因工程本身在广度和深度方面以空前的速度蓬勃发展，生物技术相关产业和生命科学已经出现划时代的

(完整版)基因工程复习题(答案版)

基因工程原理复习题思考题 考试时间：2009.06.21 上午9：00-11：00 地点5D305 基因工程绪论 1、基因工程的定义与特征。 定义：在体外把核酸分子（DNA的分离、合成）插入载体分子，构成遗传物质的新组合（重组DNA），引入原先没有这类分子的受体细胞内，稳定地复制表达繁殖，培育符合人们需要的新品种（品系），生产人类急需的药品、食品、工业品等。 特征：1、具跨越天然物种屏障的能力。 2、强调了确定的DNA片段在新寄主细胞中的扩增。 2、试述基因工程的主要研究内容。 1）、目的基因的分离 2）、DNA的体外重组（载体、受体系统等） 3）、重组DNA分子转移到受体细胞及其筛选 4）、基因在受体细胞内的扩增、表达、检测及其分析。 3、基因工程在食品工业上有何应用发展？ 主要是通过基因重组，使各种转基因生物提高生产谷氨酸、调味剂、酒类和油类等有机物的产率；或者改良这些有机物组成成分，提高利用价值。 4、转基因是一把双刃剑，请客观谈谈对转基因及转基因食品安全性的认识。 转基因技术所带来的好处是显而易见的，在人类历史进步和发展中起到了积极作用。 首先，通过该项技术可以提供人们所需要的特性，改良培育新品种； 第二，延长食品保存时间或增加营养成分； 第三，将抗虫防菌基因转入到作物中，使作物本身产生抵抗病虫害侵袭的能力，减少了农药的使用量，有利于环境保护； 第四，转基因技术及基因食物在医学方面得到广泛研究和应用。 人们对转基因技术的主要担忧在于环境方面。外源基因的导入可能会造就某种强势生物，产生新物种或超级杂草、损害非目标生物、破坏原有生物种群的动态平衡和生物多样性，也即转基因生物存在潜在的环境安全问题。 转基因作物的大面积种植已有数年，食用转基因食品的人群至少有10亿之多，但至今仍未有转基因食品对生命造成危害的实例；更何况目前每一种基因工程食品在上市前，都要经过国家法律认可，食品卫生部门和环境部门的严格检测。只有测试合格了，才能投放市场。因此公众完全可以安全地消费、大胆地食用转基因食品。 第一章DNA的分子特性与利用 1、原核生物和真核生物的基因表达调控有何差别？ 1）原核基因表达调控的三个水平：转录水平调控、翻译水平调控、蛋白质加工水平的调控原核基因表达调控主要是在转录水平上的调控。 2）真核生物基因表达的特点： ●1．基因组DNA存在的形式与原核生物不同； ●2．真核生物中转录和翻译分开进行； ●3．基因表达具有细胞特异性或组织特异性； ●4．真核基因表达的调控在多个水平上进行：DNA水平的调控、转录水平调控、转 录后水平调控、翻译水平调控、蛋白质加工水平的调控；

植物基因工程技术及其管理

植物基因工程技术及其管理 摘要：植物基因工程是指植物学领域的基因工程，其研究对象是植物。本文介绍了植物基因工程概述，对植物基因工程管理进行了重点阐述，让其能够更好的为我国农业生产服务。 关键词：植物基因工程管理 植物基因工程技术是利用重组DNA技术，有计划地在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对生物基因进行改造和重新组合，再插入、整合到受体植物基因组中，使重组基因在受体细胞内表达，从而使受体植物获得新的形状，培育出高产、多抗、优质的新品种。20世纪70年代初建立发展起来的基因工程，经过几十年的不断进步和发展，已在生物学领域起着重要的作用。植物基因工程的研究与应用在世界各地蓬勃发展，被认为是21世纪农业的希望，是新的农业革命的重要组成部分。 1.植物基因工程及技术 植物基因工程就是根据人们的目标与设计，在体外对植物遗传物质——基因进行剪切、组合、拼接等，使遗传物质重新组合，然后通过特定载体(质粒、噬菌体、病毒等)转入植物细胞内，并使所需要的基因在细胞中表达，从而创造出人们需要的新的植物类型的技术。基因工程在改良植物性状、品质，增加产量，提高植物抗病、抗虫、抗逆性等各方面具有天然植物无法比拟的优越性，因此其发展空间极为广阔。 植物工程基因技术大大拓宽了植物可利用的基因库，按照人们事先计划好的方案引发定向变异己成为现实，给植物育种带来了变革(主要表现在以下几方面：能够打破生殖隔离，使得转基因技术为拓宽植物可利用基因库创造了条件，并提供了新的创造变异的技术手段；用于基因工程育种的基因大多研究得较为清楚，改良植物的目的性状明确，选择手段有效，使引发植物产生定向变异和进行定向选择成为可能；通过改良植物的一些关键性状，会使原推广品种在很大程度上得到提高，不但可以缩短育种年限，而且可能在不同的生态区取得全面突破；随着对基因工程认识的不断深入，新基因的克隆和转基因技术手段的完善，对多个基因进行定向操作也将成为可能，这在常规育种中是难已想象的，而且有可能引发新的“绿色革命”。 2.基因工程植物可能带来的危害及产生机制 人们也逐渐认识到，由于目前的科学技术水平还不能精确地预测植物基因工程的所有表现效应，植物基因工程的安全性问题已引起人们的高度重视。 2.1基因工程植物可能带来的危害

基因工程知识点

基因工程 1、操作水平：DNA分子水平 目的：定向改变遗传物质或获得基因产物。 理论基础：1）物质基础——脱氧核苷酸2）结构基础——规则的双螺旋结构3）中心法则，共用一套遗传密码2、基因工程(genetic engineering)：指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。 上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细 胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。(基因操作、遗传工程、重组DNA技术）。1973年诞生的 基本用途：分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源；大规模生产生物活性物质；设计、构建生物的新性状甚至新物种。 3、重组DNA技术：是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。其核心步骤是DNA片段之间的体外连接。 4、基因工程的基本形式： 第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程第二代蛋白编码基因的定向诱变蛋白质工程 第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构途径工程第四代基因组或染色体的转移基因组工程 5、基因工程诞生的理论基础：理论上的三大发现 1】证实了DNA是遗传物质；2】揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理； 3】遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定。 6、DNA双螺旋：带负电的糖--磷酸骨架在外侧，碱基在螺旋中间相互堆叠，以5’→3’方向反向平行关系。 第二章用于核酸操作的工具酶 1、寄主的限制和修饰现象： 【１】作用：保护自身ＤＮＡ不受限制；破坏入侵的外源ＤＮＡ，使之降解。 【２】入侵噬菌体的子代便能高频感染同一宿主菌，但却丧失了在其原来宿主细胞中的存活力。因为它们在接受新宿主甲基化酶修饰的同时，也丧失了原宿主菌甲基化修饰的标记。 2、限制性核酸内切酶的命名：如：HindⅠ属名（H）+种名（in）+株名（d）+类型（Ⅰ） II 型限制性核酸内切酶的基本特性：识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列，大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧，识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构。 **一个单位的限制酶定义为：在合适的温度和缓冲液中，在50μL反应体系中，1h完全降解1μg底物DNA所需的酶量。两种DNA甲基化酶：①DNA腺嘌呤甲基化酶（dam），甲基化酶在5’GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基. ②DNA胞嘧啶甲基化酶（dcm），甲基化酶在5’CCAGG3’或5’CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基， 受其影响的酶有EcoR II等. **3、诱发星号活性产生的原因：○1高甘油含量》5%；○2内切酶用量过大；○3低离子强度；○4高pH； ○5含有有机溶剂，如乙醇；○6Mn/Cu/Zn等非Mg二价阳离子存在。 4、DNA聚合酶I的基本性质：5‘→3‘DNA聚合酶活性；5‘→3‘的核酸外切酶活性；3‘→5‘的核酸外切酶活性。切口平移法：目前实验室中最常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法。

基因工程及其应用

第6章从杂交育种到基因工程 第2节基因工程及其应用 一、教学目标 知识目标 1、简述基因工程的基本原理（概念、工具、步骤）。 2、举例说出基因工程在农业、医药等领域的应用。 能力目标 1、通过对书中以及ppt课件中的插图、图片的观察，学会科学的观察方法，培养学生收集和处理科学信息的能力、获取新知识的能力、分析和解决问题的能力。 2、利用课本以外的资料和信息解决课内学习中发现的问题，培养自主学习能力。 情感态度与价值观 1、关注转基因生物和转基因食品的安全性。 2.、通过学习了解我国基因工程的发展，培养爱国主义情感，树立努力学习科学知识造福社会的决心。 重点 1、基因工程的概念； 2、基因工程工具的特点和功能； 3、基因工程的基本操作步骤。 难点 1、基因工程工具的特点和功能 2、基因工程基本操作步骤 知识点 1、基因工程的基本原理（概念、工具、步骤）。 2、基因工程的应用。 考试点基因工程的基本原理。 能力点通过对概念、原理、方法的理解和掌握，逐步形成分析、综合等思维能力，具备运用学到的知识解决实际问题的能力。 自主探究点基因工程操作的基本步骤。 易错易混点基因工程的工具和基因工程的工具酶。 训练点基因工程的工具、基因工程操作的基本步骤。 拓展点转基因生物和转基因食品的安全性讨论。 二、教法学法 多媒体教学直观教学法小组讨论法 教具：多媒体、ppt课件、动画

三、教学过程

四、当堂达标 1、下列关于基因工程技术的叙述，正确的是（） A.重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和运载体 B.所有限制酶都只能识别同一种按规定的核苷酸序列 C.选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细胞繁殖快 D.只要目的基因进入了受体细胞就能成功实现表达 2、以下说法正确的是（） A. 所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B．质粒是基因工程中惟一的运载体 C．运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接 D．基因治疗主要是对有缺陷的细胞进行修复 3、实施基因工程第一步的一种方法是把所需的基因从供体细胞内分离出来，这要利用限性内切酶。一种限制性内切酶能识别DNA子中的GAATTC顺序，切点在G和A之间，这是应用了酶的（） A．高效性 B.专一性 C．多样性 D.催化活性受外界条件影响 4、上海医学遗传研究所成功培育出第一头携带白蛋白的转基因牛，他们还研究出一种可大大提高基因表达水平的新方法，使转基因动物乳汁中的药物蛋白含量提高30多倍，转基因动物是指（） A.提供基因的动物 B.基因组中增加外源基因的动物 C.能产生白蛋白的动物 D.能表达基因信息的动物

基因工程原理

基因工程原理 基因工程原理 内容提要 1.基因工程又称基因操作、重组DNA技术, 是P. Berg等于1972年创建的。基因工程技术涉及的基本过程包括“切、连、转、选”。该技术有两个基本的特点∶分子水平上的操作和细胞水平上的表达。 2.基因工程中使用多种工具酶，包括限制性内切核酸酶、DNA连接酶和其他一些参与DNA合 成与修饰的酶类。 3.限制性内切核酸酶是基因工程中最重要的工具酶，属于水解酶类。根据限制性内切核酸酶的 作用特点，被分为三大类。Ⅱ类限制性内切核酸酶是基因工程中最常用的酶，该类酶的分子量小，专一性强,切割的方式有平切和交错切, 作用时需要Mg++作辅助因子, 但不需要ATP和SAM。 第一个被分离的Ⅱ类酶是Hind Ⅱ。 4.连接酶是一类用于核酸分子连接形成磷酸二酯键的核酸酶，有DNA连接酶和RNA连接酶之分。基因工程中使用的连接酶来自于原核生物，有两种类型的DNA连接酶∶E.coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶。基因工程中使用的主要是T4DNA连接酶，它是从T4噬菌体感染的E.coli 中分离的一种单链多肽酶，既能进行粘性末端连接又能进行平末端连接。 5.载体是能将分离或合成的基因导入细胞的DNA分子，有三种主要类型∶质粒DNA、病毒DNA、科斯质粒，在这三种类型的基础上，根据不同的目的，出现了各种类型的改造载体。 6.DNA重组连接的方法大致分为四种: 粘性末端连接、平末端连接、同聚物接尾连接、接头连 接法。粘性末端连接法是最常用的DNA连接方法,是指具有相同粘性末端的两个双链DNA分子在DNA连接酶的作用下, 连接成为一个杂合双链DNA。平末端连接是指在T4 DNA连接酶的作用下, 将两个具有平末端的双链DNA分子连接成杂种DNA分子。同聚物加尾连接就是利用末 端转移酶在载体及外源双链DNA的3'端各加上一段寡聚核苷酸, 制成人工粘性末端, 外源DNA 和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC), 然后在DNA连接酶的作用下, 连接成为重组的DNA。这种方法可适用于任何来源的DNA片段, 但方法较繁, 需要λ核酸 外切酶、S1核酶、末端转移酶等协同作用。将人工合成的或来源于现有质粒的一小段DNA分子(在这一小段DNA分子上有某种限制性内切酶的识别序列), 加到载体或外源DNA的分子上, 然后通过酶切制造黏性末端的方法称为接头连接法。 7.基因文库分为基因组文库、cDNA文库等，是指在一种载体群体中, 随机地收集着某一生物DNA的各种克隆片段, 理想地包含着该物种的全部遗传信息。 8.DNA重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。目前常用的诱导感受态转化的方法是CaCl2 法（图3-20），此外也可以用基因枪等方法转化外源DNA。 9.重组体筛选有遗传学方法、核酸杂交筛选法等。 10.基因工程技术是现代生物技术的核心，目前在工业、农业和医疗中已经显示了巨大的应用前景，并形成了一大批生物技术产业。