抗坏血酸谷胱甘肽测定

还原型谷胱苷肽GSH

2．试剂配制

（1）1mM GSH标准液10mL（现用现配）：称3.0733mgGSH,加蒸馏水至10mL。(不要)

（2）5％磺基水杨酸500mL：25g溶于500mL水中。

（3）6mM DTNB：称取0.118905g DTNB溶于50mL PBS（0.1M，pH7.5）中。

（4）2mM NADPH：18.1mg NADPH溶于10mL PBS中。

（5）1mMGSSG标准液10mL：6.126mg GSSG加PBS至10mL。(不要)

实际配置

0.1M PBS(pH 7.5): 3个处理*2个品种*3次重复*0.5ml*3次测定=27ml; （实际配置50 ml）

6mM DTNB: 3个处理*2个品种*3次重复*0.2ml*3次测定=10.8ml; （实际配置50 ml，实际用量0.1189g）2mM NADPH: 3个处理*2个品种*3次重复*0.1ml*3次测定=5.4ml;（实际配置50 ml, 实际用量18.1mg）(1U)GRⅢ: 3个处理*2个品种*3次重复*0.1ml*3次测定=5.4ml; （实际配置50 ml, 实际用量10ml）5％磺基水杨酸：3个处理*2个品种*3次重复*0.01ml*3次测定=0.54ml;（实际配置10ml）(实际用量0.5g/10ml)

0.5mM PBS: 3个处理*2个品种*3次重复*1.5ml*3次测定=81ml; （实际配置100 ml）

乙醚（二乙醚）: 3个处理*2个品种*3次重复*10ml*3次测定=540ml; （实际配置1000 ml）

PBS Buffer 0.5mM: 3个处理*2个品种*3次重复*1.5ml*3次测定=81ml; （实际配置150 ml）

2-乙烯吡啶: 3个处理*2个品种*3次重复*0.2ml*3次测定=10.8ml; （实际用量20 ml）

乙醚: 3个处理*2个品种*3次重复*10ml*3次测定=540ml; （实际用量1000 ml）

1．标线制作：

配制浓度为0，0.02mM,0.04mM,0.06mM,0.08mM,0.1mM,0.12mM的标准GSH溶液（吸取上述标准液各0.1mL）加入0.5mL 0.1M磷酸钠Buffer（pH7.5）(含5mM EDTA)，0.2mL 6mM DTNB,0.1mL 2mM NADPH,0.1mL(1U)GRⅢ（谷胱甘肽还原酶）(sigma),从0.1mL GSH启动反应，测定650s的A412（OD412），绘制标准曲线。以PBS代替DTNB作空白。

3．GSH（还原型谷胱甘肽）及GSSH（氧化型谷胱甘肽）

（1）取1g新鲜叶片，加入10μL（可以取0.2g鲜样，加1.6ml提取液）5％磺基水杨酸，研磨后在14000g 离心10分钟，取1mL上清液，加入1.5mL,0.5mM PBS （pH7.5）中，再用5mL乙醚（二乙醚）抽取二次（杂质会融到乙醚层中，而乙醚处于整个反应体系得上层，你直接用枪吸取上层乙醚丢弃即可，反复进行两次即为抽取两次），此提取液用于分析总谷胱苷肽含量。

各取1mL上清液，加入1.5mL PBS Buffer 0.5mM (pH7.5),0.2mL 2-乙烯吡啶（原装试剂浓度）混合至乳胶状，在25Ⅲ反应1小时，再用5mL乙醚（原装试剂浓度）抽提2次，此提取液用于分析GSSG『GSSG －氧化型谷胱甘肽，GSH－还原型谷胱甘肽不能够直接测出，需测出氧化型和还原型谷胱甘肽含量，即总的谷胱甘肽含量，然后减去氧化型谷胱甘肽(GSSG）含量得到还原型谷胱甘肽含量（GSH））

（2）取反应混合液（0.5mL 0.1M PBS(pH 7.5)(内含5mM EDTA)，0.2mL 6mM DTNB，0.1mL 2mM NADPH,0.1mL(1U)GRⅢ（sigma），由加入0.1ml提取液开始反应，测OD412，在25Ⅲ下，反应650s（大约十分钟），分别计算总谷胱苷肽及GSH含量。以不加DTNB，加相应剂量的PBS作空白。

还原型谷胱甘肽含量的测定方法（分光光度计法）

1.实验试剂

50g/L三氯乙酸（TCA）溶液（含5mmol/L Na2-EDTA）：称取5g三氯乙酸，用蒸馏水溶解稀释至100ml。再称取186mg Na2-EDTA·2H2O，加入到100ml 50g/L三氯乙酸溶液中溶解。

0.1mol/L磷酸钠溶液缓冲液（pH7.7）：配制方法见附录。

0.1mol/L(pH6.8)磷酸钠缓冲液：配制方法见附录。

4mmol/L二硫代硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）溶液：称取15.8mg DTNB，用0.1mol/L、pH6.8磷酸缓冲液溶解，定容至10ml，混匀，4℃保存。现用现配。

100μmol/L还原型谷胱甘肽标准液：称取3.1mg 还原型谷胱甘肽，加入少量无水乙醇溶解，加蒸馏水定容至100ml。

2.实验材料

同抗坏血酸。

【实验步骤】

1.标准曲线制作

取6支试管，编号，按照表1加入各种试剂，混匀，25℃保温反应10min。以0号管为参比调零，测定显色液在412nm处的吸光度。以吸光度为纵坐标，还原型谷胱甘肽物质的量（μmol）为横坐标，绘制标准曲线。

项目试管号

012345

100μmol/L还原型谷胱甘肽标准液/ml00.20.40.60.8 1.0

蒸馏水/ml 1.00.80.60.40.20

0.1mol/L pH7.7磷酸缓冲液/ml 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

4mmol/L DTNB试剂/ml0.50.50.50.50.50.5

相当于还原型谷胱甘肽物质的量/μmol020*********

2.提取

取材后，称取2.5g样品置于研钵中，加入5ml经4℃预冷的50g/L三氯乙酸溶液（含5mmol/L Na2-EDTA）,在冰浴条件下研磨成匀浆后，于4℃、12000g离心20min。收集上清液来测定谷胱甘肽含量，测量提取液体积。

3.测定

取1支试管，依次加入1ml蒸馏水、1ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH7.7）和0.5ml 4mmol/L DTNB荣毅仁，混匀，即为绘制标准曲线的0号管液。以此溶液作为参比，在波长412nm处对分光光度计进行调零。

另取2支试管，分别加入1ml上清液、1ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.7）。向一支试管加入0.5ml 4mmol/L DTNB溶液，另一支试管中加入0.5ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH6.8），将两支试管置于25℃保温10min。按照

制作标准曲线的方法，迅速测定显色液在波长412nm 处的吸光度，分别记作OD s 和OD c 。重复3次。

【计算结果】

显色反应后，分别记录样品管混合液的吸光度（OD s ）和空白对照管反应混合液的吸光度（OD c ）。根据吸光度差值，从标准曲线上查出相应的还原型谷胱甘肽量，计算还原型谷胱甘肽含量（μmol/g ）。

还原型谷胱甘肽含量（μmol/g ）=

式中，n 为由标准曲线查的的溶液中还原型谷胱甘肽物质的量（μmol ）；V 为样品提取液总体积（ml ）；V s 为吸

取样品液体积（ml ）；m 为样品质量（g ）。

【注意事项】

1. 在提取样品时，需要沉淀出去蛋白质，以方志蛋白质中所含巯基及相关酶对测定结果的影响。

2.利用本方法还可以测定样品中总谷胱甘肽（GSSG+GSH ）和氧化型谷胱甘肽（GSSG ）的含量。在谷胱甘肽还原酶（GR ）作用下，将GSSG 还原成GSH 再进行测定和计算。

3. 建议在第一次测定时先做2或3个样品本底对照，如果样品中本底对照和空白对照非常接近，则说明样品液中不存在干扰物质，可以不再检测样品本底对照。

n ×V V s ×m

MDAR(单脱氢抗坏血酸还原酶)活性的测定（Mustafa Erkan and Wen-Chi Hou ,2008,1999 ）1.MDAR提取：一般取0.2g材料于预冷的研钵中，分三次加入0.05mol/L（PH7.3）的磷酸

钾缓冲液（预冷）1.8ml（难磨的材料可以加入适量的石英砂），在冰浴上研磨至匀浆，然后移到2.0ml的离心管（冲洗），于4℃12000r/min下离心20min，上清液即为MDAR粗提液，将其放入冰箱中备用（-20℃或-80℃，在液氮中迅速冷却）。

MDAR的测定：酶活性的测定的反应体系包括：2.7ml的预冷磷酸钾缓冲液（0.05mol/L，pH7.3）+0.1ml的NADH（0.2mmol/L）+0.1ml的ASA（1.0mmol/L）+0.001ml的AAO（1.0U）+0.1ml的酶提取液，以不加酶液的体系为对照，在340nm下测OD值的变化。

GR（谷胱苷肽还原酶）测定

一、试剂配置

50mM PBS（K）（pH 7.0，含0.2mmol EDTA,与APX的相同）：K2HPO4·3H2O 6.9607g+KH2PO4 2.6538g混合后定容到1L；然后加入292.25×0.2=58.45gEDTA;

10mM GSSG（用水配）：612.63×10×0.001=6.126g溶于1L水中;

2.4mM NADPH（用PBS配）：83

3.4×2.4×0.001=2.0g溶于1L水中.

实际配置

50mM PBS（K）: 3个处理*2个品种*3次重复*1.7ml*3次测定=91.8ml; （实际配置150 ml,实际用量58.45g*0.15=8.7675g）

10mM GSSG:3个处理*2个品种*3次重复*0.1ml*3次测定=5.4ml; （实际配置50 ml,实际用量6.126g*0.05=0.3063g）

2.4mM NADPH:3个处理*2个品种*3次重复*0.1ml*3次测定=5.4ml; （实际配置50 ml,实际用量2.0g*0.05=0.1g）

二、测定步骤

用3mL比色杯，依次加入1700μL 50mM PBS（K）（pH 7.8，含0.2mmol EDTA），100μL 10mmol GSSG，100μL 2.4mmol NADPH，100μL 酶液（叶绿体悬浮液，与APX相同）启动反应，25Ⅲ，以NADPH启动发应（指最后加NADPH），测定OD340，1min变化值，吸光系数2.8mM-1cm-1，不加NADPH为对照（调零）。

四、计算方法：

ⅢOD/Ⅲt×Vr×VT

A×d×Vt×W

ⅢOD为反应时间内吸光度的变化（60秒吸光度－0秒吸光度）；Ⅲt为反应时间（60秒）；Vr为反应液体积（2mL）；VT提取液体积（叶绿体稀释后的体积）；A为消光系数（2.8mM-1.cm-1）；d为比色杯厚度（1cm）；Vt测定液体积（0.1mL）；W为样品鲜重（叶绿体质量）。

抗坏血酸含量的测定

抗坏血酸含量的测定 植物学实验技术 一、原理 还原型抗坏血酸（AsA）可以把铁离子还原成亚铁离子，亚铁离子与红菲咯啉（4,7-二苯基-1,10-菲咯啉，BP）反应形成红色螯合物。在534nm波长的吸收值与AsA含量正相关，故可用比色法测定。脱氧抗坏血酸（DAsA）可由二硫苏糖醇（DTT）还原成AsA。测定AsA总量，从中减去还原型AsA，即为DAsA含量。 二、仪器与用具 离心机；分光光度计；研钵；试管。 三、试剂 5%三氯乙酸（TCA）；20%TCA；无水乙醇溶液；0.4%磷酸－乙醇溶液；0.5%BP－乙醇溶液；0.03%FeCl3－乙醇溶液；0.6g/L DTT；Na2HPO4－NaOH溶液：以0.2mol/L Na2HPO4和1.2mol/L NaOH等量混合；60mmol/L DTT－乙醇。 四、方法 1. 制作标准曲线配制浓度为2mg/L，4mg/L，6mg/L，8mg/L，10mg/L，12mg/L，14mg/L的AsA系列标准液。取各浓度标准液1.0ml于试管中，加入1.0ml 5%TCA、1.0ml乙醇摇匀，再依次加入0.5ml 0.4%H3PO4－乙醇、1.0ml 0.5%BP－乙醇、0.5ml 0.03%FeCl3－乙醇，总体积5.0ml。将溶液置于30℃下反应90min，然后测定A534。以AsA浓度为横坐标，以A534为纵坐标绘制标准曲线，求出线性方程。 2. 提取取植物叶片1.0g，按1∶5（W/V）加入5%TCA研磨，4000r/min离心10min，上清液供测定。 3. 测定 （1）AsA测定取1.0ml样品提取液于试管中，按上述相同的方法进行测定，并根据标准曲线计算AsA含量。（2）DAsA测定向1.0ml样品液中加入0.5ml 60mmol/L DTT－乙醇溶液，用Na2HPO4－NaOH混合液，将溶液PH调至7~8，置于室温下10min，使DAsA还原。然后加入0.5ml 20%TCA，把PH调至1~2。按AsA相同方法进行测定，计算出总AsA含量，从中减去AsA，即得DAsA含量。

GSH含量的测定.doc

主要目的： ——测定物质还原性谷胱甘肽（GSH）的含量。 主要原理： 参照 GSH检测分析试剂盒说明书， 5,5 ’–二硫代–双–（2–硝基苯甲酸）能和 谷胱甘肽（GSH）反应产生 2–硝基– 5–巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（ GSSG）， 由于 2–硝基– 5–巯基苯甲酸是一黄色产物，通过测定其在412 nm处的最大吸 收可确定样品中谷胱甘肽的含量用纯化的谷胱甘肽（GSH）抗体包被微孔板，制 成固相抗体，往包被单抗的微孔中加入谷胱甘肽（GSH），再与HRP标记的谷胱甘 肽（ GSH）抗体结合，形成抗体 - 抗原 - 酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB显色。 TMB在 HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的谷胱甘肽（GSH）呈正相关。用酶标仪在412 nm波长下测定吸光度（ OD值），通过标准曲线计算样品中谷胱甘肽（GSH）的含量。

实验室签章

一、试剂 ——谷还原性胱甘肽（ GSH）测定试剂盒（南京建成生物研究所） 二、仪器设备 —— 96 孔酶标板 —— UV-Vis 可见多功能酶标 仪——旋涡混匀器——离心机 ——移液枪及其相应量程枪头

三、实验方法 根据试剂盒说明书具体操作步骤如下: 1.上清液的制备：取稀释后的血清或组织匀浆液 mL，加试剂一应用液 2 mL 混匀， 4000 rpm 离心 10 分钟，取上清液 1 mL 进行显色反应。 2.显色反应：空白管中加入 1 mL 试剂一，标准管加入 20μmol/LGSH标准 液 1 mL，测定管加入上步骤得到的上清液 1 mL，然后各管中分别加入mL 试剂 二、试剂三、 mL 试剂四。 3.混匀，室温静置 5 分钟后，在 412 nm处将酶标板空板进行扫描，准确吸 取 mL 各管反应液加入到新的 96 孔板中，酶标仪测定各孔吸光度（ OD值）。 4.血清中 GSH含量计算公式 GSH含量（ mg/L） 测定 OD值 -空白 OD 值 -3 mmol/L） ×标准品浓度（ 20×10 标准 OD值-空白 OD值 ×GSH分子量（ 307）×样本测试前稀释倍数 组织中 GSH含量公式 测定OD值-空白OD值 -3 GSH含量（mg/gprot ）×标准品浓度（20×10 mmol/L） ×GSH分子量（ 307）×样本测试前稀释倍数÷待测组织匀浆液蛋白浓度 （gprot/L ） 参考文献 Lapshina E A, Sudnikovich E J, Maksimchik J Z, et al. Antioxidative enzyme and glutathione S-transferase activities in diabetic rats exposed to long-term ASA treatment [J]. Life sciences, 2006, 79(19): 1804-1811.

谷胱甘肽含量测定

【实验目的】 了解植物组中中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代谢过程，学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。 【实验原理】 谷胱甘肽是有谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Gly）组成的天然三肽，是一种含巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。谷胱甘肽能和5,5’-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）。2-硝基-5-巯基苯甲酸为一黄色产物，在波长412nm处具有最大光吸收。因此，利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。 【器材与试剂】 1.实验仪器与用具 研钵、高速离心机、移液管、离心管、试管、分光光度计 2.实验试剂 还原型谷胱甘肽标准液；偏磷酸溶液；磷酸溶液缓冲液（pH7）；二硫代硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）溶液；蒸馏水。 3.实验材料 小麦叶片 【实验步骤】 1.标准曲线制作 取7支试管，编号，按照下表加入各种试剂，混匀，25℃保温反应10min。以1号管为参比调零，测定显色液在412nm处的吸光度。以吸光度为纵坐标，还原型谷胱甘肽物质的量（μmol）为横坐标，绘制标准曲线。 试管号 试剂（ml） 1 2 3 4 5 6 7 10μg/ml GSH标准液0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

蒸馏水 2.0 1.9 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 pH7磷酸缓冲液 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 DTNB试剂0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 GSH浓度μg/2ml 0 1 2 4 6 8 10 2.提取 取材后，称取0.2g样品置于研钵中，加入少量5%偏磷酸研磨成匀浆后，定容至6ml, 8000转离心10min。收集上清液来测定谷胱甘肽含量，测量提取液体积。 3.测定 取上清液2ml，显色，操作同标准曲线。重复3次。 显色反应后，分别记录样品管混合液的吸光度和空白对照管反应混合液的吸光度。根据吸光度差值，从标准曲线上查出相应的还原型谷胱甘肽量，计算还原型谷胱甘肽含量（μmol/g）。 4.计算 GSH含量（μmol/g）=（C x×V t）/ （FW×V S） 式中，C x为2ml样品中GSH的含量（μg）；V t为样品提取液总体积（ml）；V s为显色时样品液体积（ml）；FW为样品质量（g）。 【实验结果】 1.标准曲线 试管编号 1 2 3 4 5 6 7 GSH浓度（μg/2ml）0 1 2 4 6 8 10 吸光度值A 0 0.067 0.134 0.314 0.452 0.579 0.723 以GSH浓度（μg/2ml）为横坐标，吸光度值为纵坐标，建立标准曲线。

维生素C不同的测定方法及各种方法优缺点比较

维生素C不同的测定方法及各种方法优缺点比较 目前研究维生素C测定方法的报道较多,有关维生素C的测定方法如荧光法、2，6-二氯靛酚滴定法、2，4-二硝基苯肼法、光度分析法、化学发光法、电化学分析法及色谱法等,各种方法对实际样品的测定均有满意的效果. 为了解国内VC含量测定方法及其应用方面的现状及发展态势.方法以"维生素C 或抗坏血酸和测定"为检索词对1994～2002年中国期刊网全文数据库(CNKI)中的理工A、B和医药卫生专辑进行篇名检索,对所得有关维生素C含量测定的文献数据分别以年代、作者区域、载刊等级、样品类型、测定方法等进行计量分析.结果核心期刊载刊文献占文献总量的45.06％,其中光度法占65.69％,电化法占18.63％,色谱法占12.75％;复杂被测样品文献占文献总量的45.06％,其中光度法占60.92％,色谱法占19.54％,电化法占10.34％.结论目前国内维生素C含量测定仍以光度法为主流,但近年来色谱法,特别是HPLC法上升趋势尤为明显. 一．荧光法 1．原理 样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化成脱氢型抗坏血酸后，与邻苯二胺（OPDA）反应生成具有荧光的喹喔啉（quinoxaline）,其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。 脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应，以此排除样品中荧光杂质所产生的干扰。本方法的最小检出限为0.022 g/ml。 2．适用范围 本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定 3. 注意事项 3.1 大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶，因此，抗坏血酸的测定应采用新鲜样品并尽快用偏磷酸-醋酸提取液将样品制成匀浆以保存维生C。 3.2 某些果胶含量高的样品不易过滤，可采用抽滤的方法，也可先离心，再取上清液过滤。 3.3活性炭可将抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸，但它也有吸附抗坏血酸的作用，故活性炭用量应适当与准确，所以，应用天平称量。我们的实验结果证明，用2g活性炭能使测定样品中还原型抗坏血酸完全氧化为脱氢型，其吸附影响不明显。 二、2，6-二氯靛酚滴定法（还原型VC）

循环伏安法测定维生素C片中抗坏血酸的含量

循环伏安法测定维生素C片中抗坏血酸的含量 温仕君 （暨南大学化学工程与工艺2012051590）摘要：本文通过用循环伏安法测定维生素C片中抗坏血酸的含量达到以下目的要求：①学习循环伏安法测定电极反应参数的基本原理及方法；②熟悉循环伏安法的实验技术；③了解可逆波、不可逆波的循环伏安图的特点。 利用抗坏血酸具有强还原性的特点，电解抗坏血酸的溶液，在铂工作电极上发生氧化还原反应，利用电流的极值点与浓度的关系就可对抗坏血酸进行定量分析，测得维生素C片中抗坏血酸的含量为该法具有快速简便的特点而得到广泛的应用。 关键词：循环伏安法抗坏血酸维生素C片 1引言 利用被分析物氧化还原反应而对物质进行定量分析的方法很多，最常见的是滴定法，如碘量法测维生素C的含量，但是滴定法只能进行常量分析，而且碘很昂贵，如长期使用该法成本非常高。随着实验技术手段的不断发展，循环伏安法已经越来越成熟，该法不仅能够进行微量分析，还能测定电极反应的性质[1,2]。目前，循环伏安法已经广泛应用于各个领域，如药物成分分析，食品分析等。在以后的科研工作中，伏安分析法将发挥更大的作用。 2实验部分 2.1实验原理 循环伏安法将对称的三角波扫描电压（如图1）施加于电解池的电极上，记录工作电极上的电流随电压变化的曲线，及循环伏安图。在三角波的前半部分，电极上若发生还原反应（阴极过程），得到一个峰形的阴极波；而在三角波的后半部分，则得到一个峰形的阳极波。一次三角波电压扫描，电极上完成一个氧化还原循环。当工作电极被施加的扫描电压激发时，其上将产生响应电流。以该电流（纵坐标）对电位（横坐标）做图，就得到了循环伏安图（如图2所示）。 图一图二

抗坏血酸药品中维生素C含量的测定(碘量法)

抗坏血酸药品中维生素C 含量的测定 一、实验目的 1.掌握碘标准溶液的配制注意事项； 2.通过维生素C 的测定了解直接碘量法和间接碘量法的过程； 3.掌握碘量法测定抗坏血酸药品中维生素C 含量的原理和方法。 二、实验用品 1.仪器 全自动分析天平；台秤；碘量瓶；玻璃棒；洗瓶；试剂瓶；烧杯；酸式滴定管；量筒；胶头滴管；容量瓶；移液管；洗耳球。 2.试剂 分析纯O H O S 23225Na ?，分析纯2I ； 7221-r mol 017.0O C K L ?标准溶液；)s (KI 、KI 溶液100-1 L g ?，使用前配制；淀粉指示剂1 -g 5L ?；） （s a 32CO N ；l HC 溶液1 -mol 6L ?；败坏血酸片。 三、实验原理 抗坏血酸又名维生素C ，分子式686O H C 。由于分子中的烯二醇基具有还原性，能被2 I 定量地氧化成二酮基，其反应式为： 碱性条件下可使反应向右进行完全，但因维生素C 还原性很强，在碱性溶液中尤其易被空气氧化，在酸性介质中较为稳定，故反应应在稀酸（如稀乙酸、稀硫酸或偏磷酸）溶液中进行，并在样品溶于稀酸后，立即用碘标准溶液进行滴定。根据滴定消耗的2I 标准溶液的体积，便可计算出抗坏血酸药品中维生素C 的含量。 计算公式：%100m %100m m 68622?=?= 药品 药品维生素O H C I I C M V C W 2I 标准溶液的配制和标定：由于通常使用的市售2I 试剂纯度不高，故需先配成近似浓度，然后在进行标定。2I 微溶于水而易溶于KI 溶液中，但在稀的KI 溶液中溶解得很慢，故配制2I 溶液时应先在较浓的KI 溶液中进行，待溶解完全后再稀释到所需浓度。2I 溶液可以用32s O A 为基准物对I 2溶液进行标定,但32s O A （俗称砒霜）有剧毒，故用322a O S N 标准溶

GSH-Px活力的测定SOP

主要目的： ——测定物质谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px ）活力。 主要原理： ——谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px ）可以促使过氧化氢（H 2O 2）与还原性谷胱甘肽（GSH ）反应生成H 2O 及氧化性谷胱甘肽（GSSG ）,谷胱甘肽过氧化物酶的活力可用其酶促反应的速度来表示，测定此酶促反应中还原型谷胱甘肽的消耗，则可求出酶的活力。 H 2O 2+2GSH 2H 2O+GSSG GSH-Px 的活力以催化GSH 的反应速度来表示，由于这两个底物在没有酶的条件下，也能进行氧化还原反应（称为非酶促反应），所以最后计算此酶活力时必须扣除非酶促反应引起的GSH 减少的部分。而GSH 含量的测定可以跟据GSH 和二硫代二硝基苯甲酸作用生成5-硫代二硝基苯甲酸阴离子呈现较稳定的黄色，在412nm 处测其吸光度即可计算出 实验室签章 GSH-Px

一、试剂 ——谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测定试剂盒（南京建成生物研究所） 二、仪器设备 ——96孔酶标板 ——UV-Vis可见多功能酶标仪 ——旋涡混匀器 ——离心机 ——水浴锅 ——移液枪及其相应量程枪头

三、实验方法 根据试剂盒说明书具体操作步骤如下: 1. 非酶管和酶管各加入1 mmol/LGSH 0.2 mL ，酶管加入稀释后的待测血清和组织匀浆液0.2 mL ，37 oC 水浴预温5分钟，酶管和非酶管分别加入试剂一应用液0.1 mL ，37 oC 水浴准确反应5分钟，酶管和非酶管分别加入试剂二应用液2 mL ，同时非酶管加入待测细胞上清液0.2 mL 。混匀，3500-4000转/分，离心10分钟，取上清1 mL 作显色反应。 2. 空白管加入1 mL GSH 标准品溶剂应用液，标准管加入1 mL 20 μmol/LGSH 标准液，非酶管和酶管各加入上一步骤1 mL 上清液，然后空白管、标准管、非酶管和酶管各加入1 mL 试剂三应用液，0.25 mL 试剂四应用液和0.05 mL 试剂五应用液。 3. 混匀，室温静置15分钟后，在412 nm 处将酶标板空板进行扫描，准确吸取 0.2 mL 各管反应液加入到新的96孔板中，酶标仪测定各孔吸光度（OD 值）。 4. 血清中GSH-Px 活力计算公式 GSH-Px 活力（U/mgprot ）--OD = 非酶管值酶管OD 值标准管OD 值空白管OD 值 ×标准品浓度（20 μmol/L ）×稀释倍数 组织中GSH-Px 活力计算公式 GSH-Px 活力（U/mgprot ） --OD =非酶管值酶管OD 值标准管OD 值空白管OD 值×标准品浓度×min 稀释倍数（5）反应时间（5) ÷[取样量（0.2 mL ）×待测组织蛋白浓度（mgprot/ mL ）] 参考文献 Oliveira Lazarin M, Ishii-Iwamoto E L, Yamamoto N S, et al. Liver mitochondrial function and redox status in an experimental model of non-alcoholic fatty liver disease induced by monosodium L-glutamate in rats [J]. Experimental and molecular pathology, 2011, 91(3): 687-694.

油脂类食品中17种邻苯二甲酸酯类化合物的测定气相色谱-串联质谱法编制说明

食品安全地方标准油脂类食品中17种邻苯二甲酸酯类化合物的测定气相色谱-串联质谱法（征求意见稿） 编制说明 一、标准起草的基本情况 本标准由贵州省卫生计生委组织了食品安全地方标准评审委员会专家组进行评审并通 过立项，由贵州出入境检验检疫局综合技术中心负责研制，本标准批准立项文号为卫计办函[2015]94号。主要起草人为：王兴宁、杨昌彪、曹桂红、蔡秋、林野、周贻兵、朱明、李洁。 开展方法学的研究包括：采用在线GPC净化，气相色谱-串联质谱测定油脂食品中17 种PAES的分析方法，确立了方法性能检验指标，如方法检出限、重复性、准确度及回收率等。组织3家同行实验室采用本标准方法进行对比验证。经过数据的汇总，形成制订该地方 标准的征求意见稿及编制说明。 二、标准的重要内容及主要修改情况 油脂类食品采用《油脂类食品中17种邻苯二甲酸酯类化合物的测定气相色谱-串联质谱法》进行测定，外标法定量，同时测定17种邻苯二甲酸酯类。该方法快速、准确、具有较高 的灵敏度。具体实验结果如下： 1 方法检出限 本方法的检出限（LOQ）DINP 0.1 mg/kg，其他化合物为0.05mg/kg，完全能满足我 国及国外最大允许残留量要求。 2 精密度：0.1、0.5、1.0mg/kg三水平，重复6次进行检测，计算6次相对标准偏差（RSD%），结果≤15%。 3 准确度：将上述不同浓度的混合标准溶液，各平行制备6个样品，测定样品中各组分 的含量，测定结果均在标准参考值误差范围内，表明方法的准确度良好。 4 回收率：选择没有标准物质的其他基质类别的样品对17种邻苯二甲酸酯类进行加标回收试验，回收率结果在83%~108%之间。 5 实际样品检测：经对6种食品包括不同食用油、油辣椒、方便、蛋糕实际样品进行定 量分析后表明，本方法适用于不同品种、不同类型、不同含量的油脂类食品17种邻苯二甲

水果中维生素C含量的测定

水果中维生素C含量的测定 佛山三中高中部陈荣智招树满何衍健 指导老师丘晓琳 0 引言 维生素C的功效早已被人们广泛接受，从营养补充剂、维生素C糖果、到涂在脸上的含有维生素C的保养品，全都标榜着能让你更白皙、更健康。德国营养研究会建议，每人每天应摄取50~100mg的维生素C，才能刚好让血中的维生素C浓度达到饱和，如果摄取超过此范围，身体也无法多吸收，等于浪费。而30mg的维生素C是人体1天摄取维生素C的最少值，如果低于30mg，身体就会缺乏维生素C，使部份机能无法正常运作，长期下来，甚至出现坏血 症。当下，人们讲究“食疗”，倡导“天然”，认为从天然产物摄取维生素C 更安全、更能适应人体的需要。故，我们必须思考“吃什么，怎样吃”的问题。基于这点，本课题对普遍认为含维生素C较多的水果中的维生素C的含量以及对处理过的水果（如加热）中维生素C含量进行了测定，以求得从天然产物中摄取维生素C的较佳方案。 1 维生素C简介 1.1.1维生素C的结构及性质 维生素C （Vitamin C ，Ascorbic Acid，分子式： C6H8O6 ；分子量：176.12u；分子结构如左图）又叫抗坏血 酸，是一种水溶性维生素，水溶液呈酸性，在溶液中会氧化 分解。 1.1.2维生素C主要生理功能 1、促进骨胶原的生物合成。利于组织创伤口的更快愈合； 2、促进氨基酸中酪氨酸和色氨酸的代谢，延长肌体寿命。 3、改善铁、钙和叶酸的利用。 4、改善脂肪和类脂特别是胆固醇的代谢，预防心血管病。 5、促进牙齿和骨骼的生长，防止牙床出血。； 6、增强肌体对外界环境的抗应激能力和免疫力。 1.1.3维生素C的药物作用 近代研究表明VC对人体健康至关重要： 1．坏血病。血管壁的强度和VC有很大关系。微血管是所有血管中最细小的，管壁可能只有一个细胞的厚度，其强度、弹性是由负责连接细胞具有胶泥作用的胶原蛋白所决定。当体内VC不足，微血管容易破裂，血液流到邻近组

谷胱甘肽含量测定

植物生理学模块实验指导 玲主编 科学 还原型谷胱甘肽含量的测定方法（分光光度计法） 【实验目的】 了解植物组中中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代过程，学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。 【实验原理】 谷胱甘肽是有谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Gly）组成的天然三肽，是一种含巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。谷胱甘肽能和5,5’-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）。2-硝基-5-巯基苯甲酸为一黄色产物，在波长412nm处具有最大光吸收。因此，利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。 【器材与试剂】 1.实验仪器与用具 研钵、高速冷冻离心机、微量移液枪、离心管、试管、水浴锅、容量瓶（100ml、200ml、1000ml）、分光光度计 2.实验试剂 50g/L三氯乙酸（TCA）溶液（含5mmol/L Na 2 -EDTA）：称取5g三氯乙酸，用蒸馏水溶 解稀释至100ml。再称取186mg Na 2-EDTA·2H 2 O，加入到100ml 50g/L三氯乙酸溶液中溶解。 0.1mol/L磷酸钠溶液缓冲液（pH7.7）：配制方法见附录。 0.1mol/L(pH6.8)磷酸钠缓冲液：配制方法见附录。 4mmol/L二硫代硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）溶液：称取15.8mg DTNB，用0.1mol/L、pH6.8磷酸缓冲液溶解，定容至10ml，混匀，4℃保存。现用现配。

抗坏血酸检测的实验步骤

动物血清中抗坏血酸（Vc）的测定 一、实验目的 抗坏血酸（Ascorbic Acid）又叫维生素C（Vitamin C），是一种水溶性维生素.正常成人体内的抗坏血酸代谢活性池中约有1500mg抗坏血酸，最高储存峰值为3000mg抗坏血酸.抗坏血酸在氧化还原代谢反应中起调节作用，缺乏它可引起坏血病.抗坏血酸是一种强力的抗氧化剂、抗病毒和抗炎剂.广泛存在于食品和生物样本中，是一种免疫刺激剂.因此检测抗坏血酸在上述样本内的分布和含量就显得非常重要。 二、实验原理 三、实验仪器 试管、移液枪、漩涡混匀器、水浴锅、离心机、可见分光光度计。 四、试剂的配制 1.试剂一应用液的配制（5ml）：试剂一储备液：双蒸水=1：14稀释，混匀制 备。 2.试剂二应用液的配制：用时取一支粉剂加0.36 ml的冰醋酸再加水至40 ml, 溶解，4℃保存。 3. 试剂三应用液的配制：因溶解困难，使用前2-4h加无水乙醇60 ml充分 溶解，制备，4 ℃保存。 4. 试剂四应用液的配制：用时取0.15 ml 试剂四储备液加水至25 ml制备， 避光保存。（现用现配） 5.试剂五：液体6 ml，4 ℃保存。 6.600 ug/ml标准品应用液的配制：取一支标准品粉末溶于10 ml试剂一应用 液中，充分混匀，4℃保存。 6ug/ml标准品应用液的配制：取600 ug/ml Vc标准应用液再用试剂一应用液100倍稀释备用，现用现配。 注意：维生素C标准品易氧化，因此，最好在样本上清液制备好后再配标准，并在10 min内进行检测。 五、实验步骤 1.取实验小鼠，断颈处死，摘除眼球，眼眶取血至1.5 ml EP管，取完血液， 然后静置半小时，然后3000 rpm, 离心15 min,然后取上清至新1.5 ml EP 管，3000 rpm, 离心15 min,取上清备用 2.上清液的制备：取步骤一中上清0.15 ml加试剂一应用液0.45 ml,漩涡混 匀，放置15 min分钟后离心，3500-4000转/分，离心10分钟，上层清亮 液体为上清液。 3.上清液中Vc的测定：

抗坏血酸含量测定(分光光度计法)

植物生理学模块实验指导 李玲主编 科学出版社 一、维生素C含量的测定方法（分光光度计法） 【实验目的】 学习利用分光光度计法测定维生素C（抗坏血酸）含量的原理和方法。 【实验原理】 维生素C（抗坏血酸）具有较强的还原力，可以把铁离子（Fe3+）还原成亚铁离子（Fe2+），亚铁离子与红菲啰啉（4,7-二苯基-1,10-菲啰啉，BP）反应形成红色螯合物。此化合物在波长534nm处具有强的吸收峰，且吸光度与反应液中抗坏血酸含量呈正相关。因此，可用比色法来测定抗坏血酸含量。 【器材与试剂】 1.实验仪器与用具 离心机、分光光度计、研钵、电子天平、容量瓶（50ml和100ml）、漏斗、滤纸、离 心管、试管。 2.实验试剂 50g/L三氯乙酸（TCA）溶液：称取5g三氯乙酸（分析纯），用蒸馏水溶解，稀释至100ml。 0.4%磷酸-乙醇溶液：量取0.47ml 85%磷酸溶液加入到无水乙醇中，并用无水乙醇稀释至100ml。 5g/L BP-乙醇溶液：称取0.25g BP（纯度>97%）加入到无水乙醇中溶解，并用无水乙醇稀释至50ml。 0.3g/L FeCl3-乙醇溶液：称取0.03g FeCl3加入到100ml无水乙醇中，摇匀。

100μg/ml 标准抗坏血酸溶液：称取10mg 抗坏血酸（应为洁白色，如变为黄色则不能用），用50g/L TCA 溶液溶解，定容至100ml，即1ml溶液含100μg抗坏血酸。现用现配，保存于棕色瓶中，低温冷藏。 3.实验材料 苹果、梨、香蕉、柑橘等果实。 【实验步骤】 1.制作标准曲线 取7支试管，编号，按表1加入各种溶液，将混合液置于30℃反应60min，然后以0号试管混合液为参照，于波长534nm处测定吸光度值。以抗坏血酸质量为横坐标，吸光度为纵坐标汇至标准曲线，求的回归方程。 表1 制作抗坏血酸标准曲线试剂含量 项目试管号 0 1 2 3 4 5 6 抗坏血酸标准液/ml 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 50g/L TCA/ml 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 无水乙醇/ml 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 混匀、摇匀 0.4%磷酸-乙醇溶液/ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 5g/L BP-乙醇溶液/ml 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.3g/L FeCl3-乙醇溶液/ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 相当于抗坏血酸量/μg0 10 20 30 40 50 60 2.提取 洗净新鲜果实，吸干，剪碎后混匀，分别称取5g 样品置于研钵中，加入20ml 50g/L TCA溶液，在冰浴条件下研磨成浆状，转入到100ml容量瓶中，并用50g/L TCA 溶液定容至刻度，混合、提取10min后，过滤收集滤液备用。 3.测定

抗坏血酸(维生素C)的测定方法

抗坏血酸（维生素C）的测定方法（1） 在测定维生素C的国标方法中，荧光法为测定食物中维生素C含量的第一标准方法，2、4－二硝基苯肼法作为第二法。 一、荧光法 1．原理 样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化成脱氢型抗坏血酸后，与邻苯二胺（OPDA）反应生成具有荧光的喹喔啉（quinoxaline）,其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。 脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应，以此排除样品中荧光杂质所产生的干扰。本方法的最小检出限为0.022 g/ml。 2．适用范围 GB12392-90 本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定 3．仪器 3．1．实验室常用设备。 3．2．荧光分光光度计或具有350nm及430nm波长的荧光计。 3．3．打碎机。 4．试剂 本实验用水均为蒸馏水，试剂不加说明均为分析纯试剂。 （1）偏磷酸－乙酸液：称取15g偏磷酸，加入40ml冰乙酸及250ml水，搅拌，放置过夜使之逐渐溶解，加水至500ml。4℃冰箱可保存7～10天。 （2）0.15 mol/L硫酸：取10ml硫酸，小心加入水中，再加水稀释至1200ml。 （3）偏磷酸－乙酸－硫酸液：以0.15mol/L硫酸液为稀释液，其余同4.1.配制。 （4）50％乙酸钠溶液：称取500g乙酸钠（CH3COONa·3H2O），加水至1000ml。 （5）硼酸-乙酸钠溶液：称取3g硼酸，溶于100ml乙酸钠溶液（4.4）中。临用前配制。（6）邻苯二胺溶液：称取20mg邻苯二胺，于临用前用水稀释至100ml。 （7） 0.04%百里酚蓝指示剂溶液：称取0.1g百里酚蓝，加0.02mol/L氢氧化钠溶液，在玻璃研钵中研磨至溶解，氢氧化钠的用量约为10.75ml，磨溶后用水稀释至250ml。 变色范围：pH=1.2 红色 pH=2.8 黄色 pH＞4.0 兰色 （8）活性炭的活化：加200g炭粉于1L 1+9盐酸中，加热回流1~2h，过滤，用水洗至滤液中无铁离子为止，置于110~120℃烘箱中干燥，备用。 （9）标准 抗坏血酸标准溶液（1mg/ml）：准确称取50mg抗坏血酸，用溶液（4.1）溶于50ml容量瓶中，并稀释至刻度。 抗坏血酸标准使用液（100μg/ml）: 取10ml抗坏血酸标准液，用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100ml。定容前试pH值，如其pH＞2.2时，则应用溶液（4.3）稀释。 标准曲线的制备：取下述"标准"溶液（抗坏血酸含量10μg/ml）0.5、1.0、1.5和2.0ml 标准系列，取双份分别置于10ml带盖试管中，再用水补充至2.0ml。 5.操作步骤 5.1 样品制备 全部实验过程应避光。 称取100g鲜样，加100g偏磷酸-乙酸溶液，倒入打碎机内打成匀浆，用百里酚蓝指示剂调试匀浆酸碱度。如呈红色，即可用偏磷酸-乙酸溶液稀释，若呈黄色或兰色，则用偏磷

第六章酸类物质的测定

《食品分析与检测》教案 上课班级：应用化学021、022班 授课时数：3课时 授课题目：第六章酸度的测定 教学目的及要求： 1．了解食品中有机酸的来源、酸度测定的意义以及果蔬和某些食品中常见的有机酸及其含量 2．掌握总酸度、挥发酸、有效酸度测定的操作、计算以及注意事项。 3．理解总酸度、挥发酸、有效酸度、牛乳酸度等相关概念。 重点和难点：总酸度、挥发酸、有效酸度测定的操作、计算。 实施方法：课堂讲授法、启发法、问答法 板书内容 第六章酸度的测定 第一节引言 食品中有机酸的来源：固有的；发酵产生的；人为添加的。 一测定酸度的意义 ⑴有机酸影响食品的色、香、味及其稳定性； ⑵食品中有机酸的种类和含量是判断其质量好坏的一个重要指标； ⑶利用有机酸和糖的含量之比，可判断果蔬的成熟度。见教材。 二果蔬和某些食品中常见的有机酸及其含量 1 存在形式： 有机酸：部分呈游离态、部分呈酸式盐状态存在。果蔬中主要是果酸(苹果酸、柠檬酸、酒石酸)、草酸、鞣酸、苯甲酸、乙酸、蚁酸等。其中最为常见的是果酸。 无机酸：无机酸呈中性盐化合态存在。 某些酸性有机物：单宁、蛋白质分解产物和果胶质分解产物等。 2 含量：取决于品种、成熟度、气候条件等因素。其中果蔬中含酸量通常以主要的酸含 量来表示。 第二节总酸度的测定 一几个不同概念的酸度 1 总酸度： 2 有效酸度： 3 挥发酸： 4 牛乳酸度： ⑴外表酸度： ⑵真实酸度： 外表酸度与真实酸度之和即为牛乳的总酸度，其大小可通过标准碱滴定来测定。 ⑶表示方法： ①用T0表示。T0表示的含义见教材。 ②以牛乳的百分数表示。用乳酸来表示牛乳的酸度。 二原理及应用：酸碱中和，适用于各类色浅的食品中总酸量的测定。 RCOOH + NaOH = RCOONa + H2O

实验十五 抗坏血酸含量测定

实验十五抗坏血酸含量测定（2,6-二氯酚靛酚法） 一、目的 学习维生素C的生理功能和性质，掌握用2，6-二氯酚靛酚法测定维生素C 的原理和方法。 二、原理 维生素C是一种水溶性维生素，是人类营养中最重要的维生素之一，人体缺乏维生素C时会出现坏血病，因此它又被称为抗坏血酸。此外维生素C还具有预防和治疗感冒以及抑制致癌物质产生的作用。 维生素C的分布很广，尤其在水果（如弥猴桃、橘子、柠檬、山植、袖子、草莓等）和蔬菜（觅菜、芹菜、青椒、菠菜、黄瓜、番茄等）中的含量更为丰富。 不同栽培条件、不同成熟度和不同的加工贮藏方法，都可以影响水果、蔬菜的抗坏血酸含量。测定抗坏血酸含量是了解果蔬品质高低及其加工工艺成效的重要指标。 维生素C在金属铜和抗坏血酸氧化酶存在下极易氧化，因此，在用铜制品做食品时，维生素C易丢失。此外在碱性溶液中，维生素C也易被破坏，而在酸性溶液中比较稳定。利用它具有的还原性质可测定其含量。还原型抗坏血酸能被染料2，6-二氯酚靛酚氧化为脱氢型，该染料在碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈红色，被还原后变为无色。因此用2，6-二氯酚靛酚滴定含有维生素C的酸性溶

液时，维生素C尚未全部被氧化时，则滴下的染料立即使溶液变成粉红色，当溶液中的抗坏血酸全部被氧化成脱氢抗坏血酸时，滴入的2，6-二氯酚靛酚立即使溶液呈现淡红色。用这种染料滴定抗坏血酸至溶液呈淡红色为滴定终点，根据染料消耗量即可计算出样品中还原型抗坏血酸的含量。 三、仪器、试剂和材料 1．仪器 （1）天平 （2）组织捣碎机 （3）微量滴定管（5ml） （4）容量瓶（50ml） （5）刻度吸管（5ml，10ml） （6）锥形瓶（100ml） 2．试剂 （1）l％草酸溶液：草酸1g溶于100ml蒸馏水中 （2）2％草酸溶液：草酸2g溶于100ml蒸馏水中 （3）抗坏血酸标准溶液（0.1 mg／ml）：精确称取10mg纯抗坏血酸（应为洁白色，如变为黄色则不能用）用1％草酸溶液溶解并定容至100ml。此溶液应贮存于棕色瓶中，最好临用前配制。 （4）0．05％2, 6-二氯酚靛酚溶液：称取500mg 2, 6-二氯酚靛酚溶于300ml 含104mg碳酸氢钠（A.R）的热水中，冷却后用蒸馏水稀释至1000ml，滤去不溶物，贮存于棕色瓶中，4℃冷藏可稳定一周，临用前以标准抗坏血酸标定。 3．材料 新鲜水果或蔬菜 四、操作步骤 1．提取抗坏血酸 取新鲜水果或蔬菜50g，加入50ml 2％草酸溶液，用组织捣碎机打成匀浆。过滤取得滤液，滤饼可用少量2％的草酸洗几次，合并滤液，记录滤液体积。2．2, 6-二氯酚靛酚溶液的标定 准确吸取4.0 ml抗坏血酸标准液（含0.4g抗坏血酸）于100ml锥形瓶中，加16ml 1％草酸溶液，用2, 6-二氯酚靛酚滴定至淡红色（15秒内不褪色即为终点）。记录所用染料溶液的体积，计算出lml染料溶液所能氧化抗坏血酸的量。 3．样品滴定 准确吸取样品提取液两份，各20ml，分别放入两个100ml锥形瓶中，滴定方法同2中的操作，另取20ml 1％草酸作空白对照滴定。 五、结果处理 取两份样品滴定所耗用染料体积的平均值，代入下式计算100g样品中还原型抗坏血酸的含量： 杭坏血酸含量（mg／100g样品）＝（V1－V2）·V·M·100/V3·W 式中，V1为滴定样品所耗用的染料的平均毫升数；

酸类物质的测定

酸度的分析测定 一、填空题： 1.食品中的酸度可分为总酸度、有效酸度(pH) 和挥发酸。 2.测定酸度的标准溶液是氢氧化钠；测定酸度的指示剂是酚酞 3. 总酸度测定时，若样液颜色过深或有混浊，需用酸度计确定滴定终点。酸度计使用前要预热30 分钟，新电极或很久没用的干燥电极必须先浸泡在蒸馏水或0.1molHCl 中至少24 小时以上。pH计在不用时，其电极一般需置于氯化钾饱和溶液中进行保护；测食品中挥发酸时，加入磷酸的目的是使结合态的酸变为游离态的酸。 5.天然食品中所含的酸主要是有机酸；面包食品中酸度突然增高，往往预示食品发生变质。 二、判断： 1.（×）总酸高的食品尝起来肯定酸。 2.（√）有效酸含量高的食品尝起来肯定酸。 3.（√）在测定总酸度时，实验所用的水必须进行除CO2处理。 三、选择题 1. 测定pH值的指示电极为( B )。 (A) 标准氢电极 (B) 玻璃电极 (C) 甘汞电极 (D) 银-氯化银电极 2.食品中所有的酸性成分的含量称为 B ，食品中易挥发的有机酸是 D ，食品中呈游离状态的氢离子浓度，常用pH值表示称为 C 。 A．有机酸B．总酸度C．有效酸度D．挥发酸 四、简答题 1.总酸度，有效酸度，挥发酸的概念和常用测定方法？ 答：总酸度：食品中所有酸性成分的含量，用酸碱滴定测出。 有效酸度：样品中呈游离状态的H﹢的浓度，常用pH表示，用的pH计检测。挥发酸：食品中易挥发的部分有机酸，用酸碱滴定测定。 五、综合题 1.有一白酒酒样，欲测试其总酸、挥发酸、非挥发酸，请问应如何进行？请写出原理、操作步骤及注意事项。（12分） 答：测白酒中酸的原理：白酒中总酸以中和法测定，挥发酸用水蒸气蒸馏馏出液以中和法滴定，总酸与挥发酸之差即为非挥发酸。 (1)总酸的测定：吸取50mL白酒于锥型瓶→加100mL水→加0.5%酚酞2d →用0.1mol/LNaOH滴定微红色。总酸（以乙酸计g/100ml）=(c*V)*0.06*100*1/50 (2)挥发酸100mL 白酒+100mL水蒸馏→接收100mL馏液→取25mL馏液→加2d酚酞→用0.1mol/LNaOH滴定微红色.挥发酸（以乙酸计g/100ml）=(c*V)*0.06*100*1/25 (3)非挥发性酸（以乙酸计g/100ml）=总酸-挥发酸（以乳酸计）=总酸（以乳酸计-挥发酸（以乳酸计）

谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性检测试剂盒说明书 微量法

谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px/GPX）活性检测试剂盒说明书微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。货号:BC1195规格:100T/48S 产品简介： 谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px 或GPX）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。GPX 能够催化还原型谷胱甘肽（GSH）生成氧化型谷胱甘肽（GSSG），使有毒的过氧化氢还原成无毒的羟基化合物。 GPX 催化H 2O 2氧化GSH，产生GSSG，GSH 能与DTNB 生成在412nm 处有特征吸收峰的化合物，412nm 下吸光度的下降即可反应GPX 的活性。试验中所需的仪器和试剂： 可见分光光度计/酶标仪、天平、台式离心机、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、EP 管。产品内容： 提取液：液体80mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入5.5mL 蒸馏水溶解；试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入3.3mL 蒸馏水溶解备用； 试剂三：液体10μL×1支，临用前按1μL 试剂三：499μL 蒸馏水的比例稀释试剂三，4℃保存。现用现配； 试剂四：液体30mL×1瓶，4℃保存；瓶底若有结晶可50℃水浴溶解，此溶液为饱和溶液，若底部最终还有结晶，吸取上清使用即可； 试剂五：液体5mL×1瓶，4℃保存； 试剂六：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入5mL 蒸馏水溶解备用； 标准品：粉剂×1支，10mg 还原型谷胱甘肽，4℃保存。临用前加入1.62mL 蒸馏水溶解为20μmol/mL 的标准溶液备用。

操作步骤： 一、粗酶液的提取： 1、组织：按照组织质量（g）:提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取0.05g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆。10000rpm，4℃离心10min，取上清置冰上待测(如上清不清澈，再离心3min)。 2、细菌、真菌：按照细胞数量104个：提取液体积（mL）500~1000:1的比例，建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（率300w，超声3s，间隔7s，总时间3min）然后10000rpm，4℃，离心10min，取上清置冰上待测(如上清不清澈，再离心3min)。 3、血清（浆）等液体：直接测定。 二、测定步骤： 1、分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。 2、将20μmol/mL标准液用提取液稀释为0.3125μmol/mL的标准溶液。再吸取20μL各标准溶液与80μL 试剂四混匀待用，此标准液混合物的浓度为0.0625μmol/mL。标准液混合物现用现配。 3、将30μL样本与30μL试剂一混合后室温放置5min。 4、操作表：(在1.5mL离心管中依次加入下列试剂) 测定管对照管样品混合物（μL）20- 试剂二（μL）2020 37℃下预热5min 试剂三（μL）2020 37℃下反应5min 试剂四（μL）200200 样品混合物（μL）-20 4000rpm常温离心5min，取上清于EP管或者96孔板中。 试剂名称(μL)测定管对照管标准管空白管上清液100100--标准液混合物--100-试剂四---100 试剂五40404040 试剂六40404040 蒸馏水20202020

抗坏血酸含量测定

抗坏血酸含量测定 试剂配制： 6%和10% (wt/vol) TCA（三氯乙酸），室温放置（~20℃） 43% (vol/vol) H3PO4 (1:1稀释85% H3PO4)，室温放置 3% (wt/vol) FeCl3，室温放置 75 mM phosphate buffer (pH 7.0)，用磷酸氢二钾和磷酸氢二钾配制 10 mM DTT，冰浴 0.5% (wt/vol) NEM，冰浴 4% (wt/vol) α-α-bipyridyl，用70%乙醇溶解，冰浴 ASA标品根据样品浓度配制（标曲） 试验步骤： 1.植物材料（约40mg）分装到离心管中，并立即在液氮中冷冻； 2.加入1mL 6% TCA 到2 mL离心管中，离心（13000 g, 4℃5min），并将上清 液转移到一个新的2mL离心管中。（所有提取物保持在冰上并立即开始测定）； 3.抗坏血酸试验测定空白、标准和样品，同时测定还原型AA和总AA（每个 样品四次测定）； 4.加入10μl 75mM磷酸盐缓冲液和20μl 6% TCA（空白），AA标准品(0.15 -10mM)或20μl 上清至96 孔板； 5.加10μl 10mM DTT到离心管中，室温孵育10分钟； 6.加10 0.5% NEM到提取总AA管中除去多余的DTT并孵育至少30 s； 7.加20μl水至还原型AA测定管中，将DTT和NEM的体积加到总AA测定试 管中； 8.加入50μl 10% TCA, 40 μl 43% H3PO4, 40 μl 4% α-α-bipyridyl 和20 μl 3% FeCl3至所有测定管中； 9.37℃孵育1 h； 10.测定525nm下吸光值。 计算：