四川农业大学本科毕业论文(基因克隆及序列分析)
编号：
四川农业大学本科毕业论文（设计）
（2014届）
题目：齐口裂腹鱼GtH-RⅡ基因的克隆及其序列分析
院别：动物科技学院水产系
专业：水产养殖教育
姓名：刘永贵
指导教师：
完成日期：2013 年12 月14 日
齐口裂腹鱼GtH-RⅡ基因的克隆及其序列分析
动物科技学院水产养殖教育刘永贵
指导老师：姜冬梅实验师
摘要：【目的】通过对齐口裂腹鱼垂体组织中GtH-RⅡ基因的克隆及测序，研究齐口裂腹鱼促性腺激素Ⅱ受体基因的序列特征及功能特性。【方法】将提取的总RNA进行反转录PCR扩增，并用回收的扩增产物来完成克隆及测序。【结果】本试验获得的齐口腹裂鱼GtH-RⅡ目的片段长度为696 bp，其核酸序列与斑马鱼的相似性达93%，而氨基酸序列相较于斑马鱼，相似性也高达97%；通过蛋白质的序列分析发现：GtH-RⅡ蛋白质中α螺旋结构占61.43%；β折叠结构占15.24%；无规则卷曲结构占23.33%。【讨论】试验得出齐口裂腹鱼GtH-RⅡ基因的保守性高，为进一步研究齐口裂腹鱼的繁殖调控机制提供了一些基础数据。
关键词：齐口裂腹鱼；促性腺激素；促性腺激素Ⅱ受体；序列分析
Cloning and sequence analysis GtH-RⅡgene in the Schizothorax prenanti Animal science and technology of college Aquaculture education Liu Yong–Gui
Guidance teachers: Jiang Dong–Mei Experimental teachers
Abstract: [Objective] By cloning and sequence analysis GtH-R Ⅱgene of Schizothorax prenanti pituitary tissue , study of Schizothorax prenanti gonadotropin hormone receptorⅡgene sequence features and functional properties. [Method] The total RNA was extracted and amplified by reverse transcription PCR, the amplified product recovery to complete for cloning and sequencing. [Results] Schizothorax prenanti GtH-RⅡ objective fragment length obtained in this experiment is 696 bp, the nucleic acid sequence similarity with Danio rerio as 93%, while the amino acid sequence compared to Danio rerio, similarity is as high as 97%; protein sequence analysis showed: 61.43% alpha helix structure of GtH-R II protein; beta folding structure for 15.24%; random coil structure accounted for 23.33%. [Conclusion] The results show Schizothorax prenanti GtH-RⅡgene conservative high, also provides some basic data for further
study of Schizothorax prenanti reproductive regulation mechanism.
Key words: Schizothorax prenanti; g onadotropin hormone; gonadotropin hormone receptor Ⅱ; sequence analysis
早期研究认为，鱼类中只有一种类似LH的促性腺激素，直到20世纪70年代中期，加拿大学者Idferlz等人在改进促性腺激素(Gonadotropin Hormone,GtH)的纯化技术后，从鲤鱼、大麻哈鱼等鱼的脑垂体中发现了两种不同类型的GtH，即GtHⅠ和GtHⅡ，功能研究表明，GtHⅠ和GtHⅡ分别对应于哺乳动物的FSH和LH[1]；而到1999年Yuichi Oba等用纯化的GtHⅠ和GtHⅡ证明大麻哈鱼的性腺存在着两种类型的GtH受体（Gonadotropin Hormone Receptor, GtH-R），分别称为GtH-RⅠ和GtH-RⅡ[2,3]，随后的研究进一步证实了鱼类GtH-R 的二元性，结构和功能分析显示，它们分别对应于哺乳动物的促卵泡激素受体（FSH-R）和促黄体素受体（LH-R）[4-8]。LH在鱼类称为促性腺激素Ⅱ(Gonadotropin HormoneⅡ, GtHⅡ)，它的主要功能是促进卵母细胞的成熟、排卵和卵巢类固醇激素的合成；参与调控精巢中类固醇激素的生成及间质细胞的分化，在精子发生的最后几个时期起主要作用[9-11]。对其它鱼的研究表明，GtHⅡ在体内的重要生理功能由促性腺激素Ⅱ受体(Gonadotropin Hormone Receptor Ⅱ,GtH-RⅡ)介导，性腺中GtHⅡ主要在排卵前期滤泡的膜细胞层和颗粒细胞层以及精巢的间质细胞中表达[12-14]。
目前，编码FSH和LH这两种受体的基因已经从一些硬骨鱼类的性腺中得到克隆，例如罗非鱼（Oreochromis niloticus）、斑点叉尾鮰（Letulurus pinctatus）、非洲鲶鱼（Clarias gariepinus）、斑马鱼（Danio rerio）、日本鳗鲡（Anguilla japonica）、草鱼（Ctenopharyngodon idellus）和鳙鱼（Hypophthalmichthys nobilis）
等[15]。令人感兴趣的是，鱼类中GtHⅡ基因除了在性腺中有丰富的表达外，在非性腺组织中也有少量或微量表达[3,16]；但迄今为止还尚未见有对齐口裂腹鱼GtH-RⅡ基因的克隆及序列研究，因此，本试验通过对齐口裂腹鱼GtH-RⅡ基因的克隆及序列分析，阐明促性腺激素受体在齐口裂腹鱼生殖周期的生理作用, 以期为阐明齐口裂腹鱼繁殖调控机制提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
选取的齐口裂腹鱼平均体长为30～40cm；平均体重为0.5～1.0kg。采集齐口裂腹鱼垂体样品，置于液氮中速冻，然后转移至-80℃超低温冰箱中保存备用。
1.2 试剂和仪器
DNA回收试剂盒、pMD18-T载体、DL2000 bp DNA Marker，反转录酶和Taq酶购自宝生物公司；-80℃低温冰箱(Thermo)、PCR 仪(Bio-Rad)、高速冷冻离心机(Thermo)、凝胶成像系统(Bio-Rad)、DYY-III-68型稳压流电泳仪、紫外分光光度计(Shimadzu)。Typtone、Yeast Extract、NaCK琼脂糖、琼脂粉、氨节青霉素、IPTG、X-Gal、DEPC及其他生物试剂均为进口或国产分析纯试剂。本实验引物由华大基因有限公司合成。
1.3 总RNA的提取
用Trizol法按照试剂盒说明书的步骤提取总RNA，本实验所用离心管、枪头和水均经0.1 %焦碳酸二乙酯（diethyl
pyrocarbonate，DEPC）过夜处理，高压灭菌后烘干处理。用DEPC 处理水配置溶液。提取时取出样品后立即在低温下研磨裂解组织，本实验提取RNA的过程要求快速准确，避免总RNA的过度降解，试验操作过程中要保证无菌，带上口罩，手套确保RNA不被核酸酶降解。
1.4 引物设计与合成
根据NCBI上斑马鱼GtH-RⅡ的cDNA序列，选取保守区序列，运用Premier 5.0 软件设计引物。GtH-RⅡ基因上游引物为5′CATCCGTCGAGGACACTTTCGGTA3′，下游引物为5′ACACATAGCATCCGCAAATCACGAG3′，PCR产物长度为696 bp。委托华大基因科技有限公司进行特异性引物合成。
1.5 反转录反应
反转录按Invitrogen公司的反转录试剂盒要求进行，得到的cDNA置于-20 ℃冰箱中保存备用或直接用于PCR扩增；此次采用Invitrogen公司生产的MMLV进行反转录反应。
1.6 PCR扩增目的基因片段
以cDNA为模板，进行PCR扩增。电泳检测扩增产物，根据检测结果对扩增条件作进一步调整，以获得最佳的目的片段。最终确认PCR产物后，将扩增效果最好的样品产物用于胶回收。
1.7 PCR产物回收及克隆测序
用Omega凝胶回收试剂盒纯化回收PCR产物，将稀释的DNA保存在-20℃冰箱中备用。将PCR回收产物导入到pMD18-T载体中，
将其转入大肠杆菌中进行复制，经酶切、PCR鉴定，然后将克隆的产物送华大基因公司测序。
1.8 序列分析
测序产物经NCBI网站上的VecScreen软件修剪载体序列，获得GtH-RⅡ基因编码区序列，应用Blast软件进行相似性比对。利用BioEdit软件进行蛋白质组成、疏水性以及抗原决定簇等相关分析；利用HNN在线软件分析预测氨基酸的二级结构；应用NetPhos2.0分析预测蛋白质的磷酸化位点。
2 结果与分析
2.1 总RNA提取
以齐口裂腹鱼垂体组织提取齐口裂腹鱼垂体组织基因组总RNA采用常规酚-氯仿抽提法，1%琼脂糖凝胶下电泳抽提产物，并于紫外透射仪上进行观察，然后在凝胶成像系统上进行扫描，从图1可见齐口裂腹鱼垂体组织基因组总DNA条带明亮、整齐无拖带。其中28S RNA和18S RNA的条带亮度比值约为l～2:1，表明28S 的条带比18S的条带亮度高，总RNA降解较少；抽提基因组RNA 的纯度和浓度均满足PCR扩增要求。
图1 齐口裂腹鱼垂体组织总RNA 1%琼脂糖凝胶电泳图
Fig. 1 Total RNA 1% agarose gel electrophoresis of Schizothorax prenanti pituitary tissue
2.2 RT-PCR产物检测
图2 齐口裂腹鱼GtH-RⅡ基因PCR电泳检测图
Marker: DL2000 GtH-RⅡ基因引物PCR扩增产物
Fig. 2 Electrophoresis pattern of Schizothorax prenanti GtH-RⅡgene
Marker: DL2000 GtH-RⅡgene primer PCR products
经1%琼脂糖凝胶电泳检测GtH-RⅡ基因引物PCR扩增结果，之后采用凝胶成像系统扫描结果可见图2，显示目的扩增片段长度为696 bp，与引物设计的产物大小一致并且特异性较好；可以满足后续实验的要求。
2.3 GtH-RⅡ核酸序列比对
齐口裂腹鱼
斑马鱼
鲤鱼
齐口裂腹鱼
斑马鱼
鲤鱼
齐口裂腹鱼
斑马鱼
鲤鱼
齐口裂腹鱼
斑马鱼
鲤鱼
齐口裂腹鱼
斑马鱼
鲤鱼
齐口裂腹鱼
斑马鱼
鲤鱼
齐口裂腹鱼
斑马鱼
鲤鱼
图3 齐口裂腹鱼GtH-RⅡ基因cDNA部分编码序列及序列分析
Fig. 3 The coding sequence analysis of Schizothorax prenanti GtH-RⅡa part cDNA 应用生物信息学软件Lasergene对GtH-RⅡ基因编码核酸序列的测序结果与Genbank上斑马鱼序列进行相似性分析，相似性达93.0%；与鲤鱼的相似性为92.6%。
2.4 氨基酸相似性比对
齐口裂腹鱼
斑马鱼
齐口裂腹鱼
斑马鱼
齐口裂腹鱼
斑马鱼
齐口裂腹鱼
斑马鱼
图4 齐口裂腹鱼GtH-RⅡ氨基酸序列及序列分析
Fig. 4 Amino acid sequence analysis of Schizothorax prenanti GtH-RⅡ
应用生物信息学软件Lasergene对GtH-RⅡ基因编码氨基酸序列的测序结果与Genbank上斑马鱼的序列进行相似性分析，相似性达97%以上。
2.5 GtH-RⅡ氨基酸组成分析
图5 齐口裂腹鱼GtH-RⅡ基因编码的氨基酸组成
Fig. 5 Amino acid of Schizothorax prenanti GtH-RⅡ gene encoding
由图5可知在齐口裂腹鱼GtH-RⅡ基因编码的氨基酸组成中，其中亮氨酸（Leu）含量为最高，达到了16.45%，赖氨酸（Lys）含量最低，只有0.87%；其它具体的氨基酸组成类型及酸值见下表1。
表1 齐口裂腹鱼GtH-RⅡ基因编码的氨基酸组成
Table 1 Amino acid of Schizothorax prenanti GtH-RⅡ gene encoding
Amino Acid Single letter
abbreviations
Acid Number Mol%Amino Acid
Single letter
abbreviations
Acid Number Mol%
Ala A 18 7.79Met M 6 2.60 Cys C 11 4.76Asn N 4 1.73 Asp D 11 4.76Pro P 6 2.60 Glu E 7 3.03Gln Q 10 4.33 Phe F 11 4.76Arg R 10 4.33 Gly G 15 6.49Ser S 16 6.93 His H 6 2.60Thr T 13 5.63
Ile I 20 8.66Val V 16 6.93 Lys K 2 0.87Trp W 4 1.73 Leu L 38 16.45Tyr Y 7 3.03
2.6 GtH-RⅡ的氨基酸疏水性分析
图6 齐口裂腹鱼GtH-RⅡ氨基酸的平均疏水性比例
X轴表示氨基酸残基数，Y轴表示代表疏水性平均值
基线为疏水性平均值，基线以上为疏水区；基线以下为亲水区Fig. 6 The average hydrophobicity scale of Schizothorax prenanti GtH-RⅡ amino acid X axis represents the number of amino acid residues,Y axis Represents of the average hydrophobicity The baseline for the average hydrophobicity,Above the baseline for the hydrophobic region,Baseline following for hydrophilic region
由上图可知，本试验获得的GtH-RⅡ基因编码的氨基酸疏水性中存在4个疏水区，分别位于第37～76、76～104、119～144、和164～207氨基酸残基区间，分别位于第57、90、132和186氨基酸残基附近。
2.7 抗原决定簇预测
图7 齐口裂腹鱼GtH-RⅡ蛋白抗原决定簇预测
Fig. 7 Protein epitope prediction of Schizothorax prenanti GtH-RⅡ由上图可知，本试验获得的GtH-RⅡ基因编码的氨基酸序列中存在4个抗原决定簇，分别位于第25～29、31～38、105～118、和153～166氨基酸残基区间，分别位于第27、34、112和159氨基酸残基附近。
2.8 蛋白质二级结构的预测
图8 齐口裂腹鱼GtH-RⅡ蛋白质二级结构预测
h表示α螺旋；e表示β折叠；c表示无规则卷曲
Fig. 8 protein two level structure prediction of Schizothorax prenanti GtH-RⅡ
H is the alpha helix;E is the beta sheet;C is the random coil
对氨基酸序列进行二级结构预测。如上图所示，GtH-RⅡ蛋白质中α螺旋结构占61.43%；β折叠结构占15.24%；无规则卷曲结构占23.33%。
2.9 蛋白质磷酸化位点分析
图9 齐口裂腹鱼GtH-RⅡ蛋白磷酸化位点预测
Fig. 9 Protein phosphorylation site prediction of Schizothorax prenanti GtH-RⅡ由上图可知，GtH-RⅡ蛋白中含有4个磷酸化位点，其中Ser （Serine丝氨酸）位点有4个，没有Thr（threonine苏氨酸）、Tyr （tyrosine酪氨酸）的磷酸化位点。
3 讨论
3.1 齐口腹裂鱼GtH-RⅡ的序列特征
应用设计引物对GtH-RⅡ基因进行PCR扩增，GtH-RⅡ目的片段长度显示为696 bp。试验获得的GtH-RⅡ基因编码的氨基酸疏水性中存在4个疏水区，分别位于第57、90、132和186氨基酸残基附近；GtH-R Ⅱ基因编码的氨基酸序列中存在4个抗原决定簇，分别位于第27、34、
112和159氨基酸残基附近。GtH-RⅡ蛋白质中α螺旋结构占61.43%；β折叠结构占15.24%；无规则卷曲结构占23.33%；只有4个丝氨酸（Ser）的磷酸化位点；齐口裂腹鱼GtH-RⅡ基因CDS区序列编码的氨基酸由20种组成，其中赖氨酸（Lys）酸值最低，亮氨酸（Leu）含量为最高。
3.2 齐口腹裂鱼GtH-RⅡ的功能预测
此次试验得到的结果显示：齐口腹裂鱼GtH-RⅡ核酸序列与Genbank上斑马鱼序列进行相似性分析，相似性达93.0%，与鲤鱼的相似性为92.6%；说明齐口腹裂鱼促性腺激素Ⅱ受体基因（GtH-R Ⅱ）具有典型的G-蛋白偶联受体结构，包含N-末端序列，GpHR家族特有的7次跨膜螺旋区和C-端胞外区。对齐口腹裂鱼GtHⅡ受体基因即GtH-RⅡ进行编码氨基酸序列的测序，将GtH-RⅡ编码氨基酸序列的测序结果与斑马鱼的序列进行相似性分析，相似性达97%以上具有较高的保守性，说明了促性腺激素Ⅱ受体基因在齐口裂腹鱼进化的过程中以及在调控繁殖性能的过程中都具有重要的作用和相对的稳定性。
另外通过氨基酸和蛋白质分析显示：齐口裂腹鱼的GtH-RⅡ基因编码的氨基酸组成中，其中亮氨酸（Leu）含量为最高，达到了16.45%，赖氨酸（Lys）含量为最低，只有0.87%；说明亮氨酸在GtH-RⅡ形成的过程中可能起重要的作用。氨基酸序列中存在4个抗原决定簇，分别位于第25~29、31~38、105~118、和153~166氨基酸残基区间；说明GtH-RⅡ蛋白可能是油溶性受体蛋白较大。
GtH-RⅡ蛋白质中α螺旋结构占61.43%，β折叠结构占15.24%，无规则卷曲结构占23.33%；说明GtH-RⅡ蛋白柔性较好，作为膜受体蛋白，较好的柔性能够使GtH-RⅡ蛋白在膜上更好的流动，以确保细胞膜的流动性。
试验得出齐口裂腹鱼GtH-RⅡ基因的保守性高，同时为进一步研究齐口裂腹鱼的繁殖调控机制也提供了一些基础数据，而具体的繁殖调控机制有待进一步研究。