Ang1-Akt途径对大鼠体外血-脊髓屏障功能的调节5
脊椎动物的血-脊髓屏障（blood-spinal cord barrier ，BSCB ）是血脑屏障（blood-brain barrier ，BBB ）的延伸，是中枢神经系统特有的屏障结构。
BSCB 由脊髓微血管内皮细胞（spinal cord mi -
crovascular endothelial cell ，SCMEC ）间的紧密连
接及星形胶质细胞周足构成，可有效地阻止血液Ang1-Akt 途径对大鼠体外血-脊髓屏障功能的调节
刘欣春*,李
杰,裴
磊,王
森,彭云飞
（中国医科大学附属第一医院骨科，中国辽宁沈阳110001）
摘
要:检测血管生成素1(angiopoietin1,Ang1)对体外培养脊髓微血管内皮细胞(spinal cord microvascular en ?
dothelial cell ,SCMEC )屏障功能的调节机制。体外分离培养大鼠SCMEC 及胶质细胞,通过双室培养系统建立体
外血-脊髓屏障(blood-spinal cord barrier ,BSCB )模型;分别用Ang1及Ang1+wortmannin (Akt 抑制剂)处理培养
细胞,Western-blot 检测Akt 及连接蛋白质的表达;放射自显影检测Akt 激酶活性变化;测定跨内皮电阻(TEER )反映各组细胞屏障功能;细胞免疫荧光检测连接蛋白在细胞接触面的分布变化;免疫共沉淀实验分析连接蛋白之间的相互作用改变。结果显示,Ang1处理组细胞Akt 活性及TEER 值均有明显升高,Ang1处理后ZO-1及VE-cadherin 在细胞连接处的分布增强,occludin/ZO-1、VE-cadherin/β-catenin 之间的相互作用均较对
照组显著增强,且以上Ang1处理所引起的SCMEC 功能改变均可被wortmannin 所拮抗。表明Ang1通过Akt 活性调节SCMEC 连接蛋白的分布及相互作用,从而影响体外BSCB 的屏障功能。关键词:血-脊髓屏障;血管生成素1(Ang1);Akt 中图分类号:R338.2+1
文献标识码:A
文章编号:1007-7847(2015)03-0218-06
Ang-Akt Pathway Modulates the Function of Blood-Spinal Cord Barrier in Rat
LIU Xin-chun *,LI Jie,PEI Lei,WANG Sen,PENG Yun-fei
(Department of Orthopedics,First Affiliated Hospital,China Medical University,Shenyang 110001,Liaoning,China )
Abstract:To investigate the mechanism through which Ang1regulates the barrier function of cultured
SCMEC.Rat SCMECs and glial cells were isolated and the in vitro BSCB model was established by the bi -cameral culturing system.Cells were treated with Ang1or Ang1+wortmannin (the Akt inhibitor)and the pro -
tein level of pAkt,Akt and junction proteins were detected by Western-blot.Autoradiography was applied to detect the change of Akt activity.TEER in different groups was quantified to reflect the barrier function of SCMEC.The distribution of junction protein at cell contacts was detected by immunofluorescence.Co-im -munoprecipitation was used to detect junction protein interactions.The results showed that both the Akt activ -ity and TEER of the SCMEC increased significantly after Ang1treatment.The distribution of ZO-1and VE-cadhirin at cell junctions and their respective interactions with occludin and β-catenin were also enhanced in Ang1group.Furthermore,all the above effects of Ang1were found to be antagonized by wortmannin.These
results indicate that Ang1could regulate the barrier function of BSCB in vitro through Akt activity.Key words:blood-spinal cord barrier;angiopoietin 1（Ang1）;Akt
（Life Science Research ，2015，19（3）：218~223）
收稿日期:2015-01-24；修回日期:2015-03-12
基金项目:辽宁省自然科学基金资助项目
（2014021062）作者简介:*
刘欣春（1978-），男，辽宁辽阳人，副教授，通讯作者，主要从事干细胞及脊髓损伤研究，E-mail:xcliu@https://www.wendangku.net/doc/639181465.html, 。
第19卷第3期生命科学研究Vol.19No.32015年6月Life Science Research Jun.2015
第3期
中的大分子进入脊髓实质，为中枢神经系统提供稳定的微环境[1]。现有研究表明，多种脊髓病变与
BSCB屏障功能异常有关，如创伤性脊髓损伤[2,3]、放射性损伤[4]、肌萎缩性脊髓侧索硬化症[5,6]、感染[7]等。内皮细胞间的连接蛋白及细胞骨架是构成内皮细胞屏障的主要分子基础，其表达量、分布及相互作用的改变是导致内皮细胞通透性增高的直接原因[8]。
血管生成素（angiopoietin，Ang1）是一种有效的血管生成因子，参与血管生成的各个阶段，许多其他血管生成因子可通过Ang1诱导新血管的生成。在血脑屏障，Ang1作用于Tie-2酪氨酸激酶受体，参与维持屏障完整性及血管稳定[9,10]；近期有研究报道，Ang1可通过上调紧密连接蛋白ZO-2（zonula occludens-2）稳定脑微血管内皮细胞[11]。在非中枢神经系统微血管内皮细胞，Ang1可通过PI3K/Akt途径发挥抗凋亡[12]及维持血管稳定性的作用[13]。本研究以分离培养的大鼠SCMEC为研究对象，在体外建立BSCB模型，探讨Ang1-Akt途径对血脊髓屏障的通透性影响并初步分析其作用机制。1材料与方法
1.1实验动物与试剂
成熟Sprague-Dawley大鼠（275~300g）由中国医科大学实验动物部提供。DMEM/F12培养基为Sigma公司（美国）产品；碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、血管生成素1（Ang1）购自Peprotech公司（美国）；Wort-mannin购自Gene Operation（中国）；蛋白G琼脂糖购自Pierce公司（美国）；PKA抑制肽购自Merck Millipore公司（德国）；组蛋白H2B为Enzo Life Sciences公司（瑞士）产品；[γ-32P]ATP购自北京福瑞生物科技有限公司（中国）；兔IgG、兔抗大鼠occludin、ZO-1、β-catenin抗体、驴抗兔IgG （FITC）、Prolong Gold Antifade封片剂购自Invit-rogen公司（美国）；山羊抗大鼠Akt1、β-actin、兔抗大鼠pAkt抗体、牛抗山羊IgG（HRP）、牛抗兔IgG （HRP）购自Santa Cruz公司（美国）；兔抗大鼠VE-cadherin购自Abcam公司（美国）；DC蛋白定量试剂盒购自Bio-Rad公司（美国）；增强型化学发光试剂盒购自Pierce公司（美国）；其他常规试剂为Sigma公司（美国）产品。
1.2主要仪器设备
Millicell ERS-2细胞电阻仪；Millipore Milli-cell插入式细胞培养皿；Beckman液闪计数仪；Bio-Rad电泳仪及电泳槽；Eppendorf台式低温离心机；苏净VS-1300U超净台；Thermo Scientific Series8000CO2细胞培养箱；Olympus BX51荧光显微镜。
1.3实验方法
1.3.1大鼠脊髓微血管内皮细胞(SCMEC)的分离培养
按本实验室常规方法分离培养大鼠SCMEC。成熟SD大鼠CO2窒息处死，手术分离椎管后注射冷D-Hanks液以分离脊髓组织，去除脑脊膜及大血管。冷DMEM/F12培养液中剪碎组织至1mm3大小，冰上匀浆后于37℃水浴胶原酶Ⅱ消化30min。消化产物200g离心5min，22%BSA 重悬组织沉淀，2000g离心10min，弃上层髓磷脂成分，DMEM/F12清洗下层血管组织。无菌滤器（BD Falcon，295μm及40μm）依次过滤以进一步去除大血管及血细胞，收集微血管组分。0.1%胶原酶及脂肪酶于37℃消化脊髓微血管30min，间歇搅拌并镜下观察，待内皮细胞出芽呈串珠样时1000×g离心5min终止消化。SCMEC培养液（DMEM/F12、10%胎牛血清、10%马血清、2mmol/L 谷氨酸钠、1g/L肝素、1μg/L bFGF、10μg/L VEGF、50mg/L庆大霉素、3μmol/L嘌呤霉素）重悬消化后的微血管组分，接种于预铺IV型胶原及纤连蛋白（均为5μg/cm2）的培养平板，接种密度为1×104/cm2。培养6d待细胞融合成单层后常规免疫荧光观察因子Ⅷ表达情况，确定SCMEC分离培养纯度﹥95%。
0.125%胰酶（含0.02%EDTA）消化SCMEC，按不同密度进行传代：1)1∶1接种于6孔培养板，用于蛋白样品制备；2)1:5接种于6孔培养板（内预置盖玻片），用于细胞免疫荧光；3)1∶1接种于Millicell插入小室，置于24孔板（预铺胶质细胞）中，用于跨内皮电阻（TEER）测定。所有培养细胞于37℃5%CO2培养箱中培养7d，每2~3d更换培养液。
1.3.2血管生成素1(Ang1)处理培养细胞
为检测Ang1对体外SCMEC屏障功能的影响，于培养第7d用Ang1（0.1mg/L）或Ang1（100mg/L）+Wortmannin（0.1μmol/L）处理细胞12h，于不同时间点（0、4、8、12h）测量Ang1处理后跨内皮电阻变化，并收集SCMEC进行激酶活性测定及免疫印迹等检测。
刘欣春等：Ang1-Akt途径对大鼠体外血-脊髓屏障功能的调节219
生命科学研究2015年
1.3.3Akt激酶活性测定
通过测定Akt底物蛋白H2B的磷酸化状态反映Akt激酶活性，具体如下：收集SCMEC制备蛋白裂解液，蛋白G琼脂糖4℃预孵育30min后加入抗Akt抗体免疫沉淀2h，离心后依次用裂解液、纯水及激酶反应液（50mmol/L HEPES、10mmol/L MnCl2、10mmol/L MgCl2、1mmol/L二硫苏糖醇、1μmol/L PKA抑制剂，pH7.2）清洗沉淀。在反应液中加入20μCi/mL[γ-32P]ATP及0.2g/L组蛋白H2B，30℃孵育10min。取25μL反应液滴于Whatman p81阳离子交换滤纸，5%磷酸溶液终止反应，充分清洗后放入含10mL蒸馏水的液闪瓶内，Beckman 液闪计数仪测定cpm值。
此外，本研究亦采用放射自显影检测Akt激酶活性，即在上述激酶反应液中加入50μCi/mL [γ-32P]ATP及组蛋白底物，30℃孵育30min后用SDS样品缓冲液终止反应，SDS-PAGE分离蛋白成分后放射自显影观察H2B的磷酸化状态。1.3.4跨内皮电阻(TEER)测定
使用Millicell ERS-2细胞电阻仪测量双室培养系统中SCMEC跨内皮电阻值，以反映其内皮屏障功能及通透性。在Ang1处理后不同时间点（每个时间点设置3个平行孔），将正负电极分别置于培养内室及外室，记录待测孔电阻值（Ru），按公式TEER=（Ru-Rc）×S计算各组TEER 值（Ω·cm2），其中Rc为未接种细胞空白孔电阻值，S为培养面积。
1.3.5免疫印迹及免疫共沉淀
收集各组SCMEC，Nonidet P-40裂解液（50mmol/L Tris，150mmol/L NaCl，2mmol/L EG-TA，10%glycerol，1%Nonidet P-40，2mmol/L PMSF，1mmol/L Na3VO4，1μg/mL亮肽素，1mg/L 抑肽酶，pH7.4）处理后提取总蛋白，BCA定量法测定蛋白浓度后制备蛋白样品。每组按30μg上样量进行SDS-PAGE电泳分离蛋白成分，转印至PVDF膜，50g/L脱脂奶粉封闭，依次经一抗、二抗孵育后进行ECL显色（β-actin做为内参照）。
免疫共沉淀实验中每组取400μg蛋白裂解液，用2μg兔IgG进行预处理，加入蛋白A琼脂糖珠离心后，取上清加入2μg IP抗体（ZO-1或VE-cadherin，另设无IP抗体IgG对照），室温于旋转混匀过夜，加入蛋白A琼脂糖珠沉淀抗原抗体复合物，离心后用上样缓冲液处理琼脂糖珠，煮沸变性，SDS-PAGE分离蛋白后按上述方法进行
免疫印迹分析（抗occludin或抗β-catenin抗体）。
1.3.6细胞免疫荧光
4%多聚甲醛固定经Ang1处理12h后的SCMEC，0.1%Triton-100通透，5%牛血清白蛋白封闭，依次经抗ZO-1或VE-cadherin抗体及FITC标记IgG孵育后，Prolong Gold Antifade封片剂（含DAPI）封片，于Olympus BX51荧光显微镜下观察结果。
1.3.7统计学分析
本研究中TEER、免疫印迹、放射自显影等实验结果均采用GB-STAT软件(Dynamic Microsys-tems)进行双因素方差分析及Dunnett’s检验，P< 0.05为差异显著，P<0.01为差异非常显著，有统计学意义。
2结果
2.1Ang1处理增强体外培养SCMEC中Akt激酶活性
体外分离大鼠脊髓微血管内皮细胞（SCMEC），建立体外血-脊髓屏障。由于在培养的内皮细胞系中Ang1可通过Akt-PI3K途径影响内皮细胞活力及血管生成过程[1]，在本研究中我们首先检测了Ang1对SCMEC中Akt活性的影响。分别用Ang1、Ang1+Wortmannin（WM，PI3K/ Akt途径抑制剂）处理传代培养第7d的SCMEC 单层，预处理后0h、4h、8h、12h收集各组细胞。免疫印迹结果显示，Ang1处理4h后，Akt1磷酸化水平与对照组相比有明显升高，Wortmannin则可抑制Ang1引起的Akt1磷酸化（图1A、C）；以组蛋白H2B 为底物，放射自显影（图1B）及液闪计数（图1D）均显示Ang1处理后，Akt活性有显著增高。该结果说明，Ang1在本研究分离培养的SCMEC中可以活化Akt，且该作用可被Wortmannin所抑制。
2.2Ang1通过影响Akt活性增强体外培养SCMEC屏障功能
为确定Ang1-Akt通路对BSCB屏障功能的影响，在Ang1处理双室培养的SCMEC后不同时间点测定跨内皮电阻（TEER）。结果显示，Ang1处理后4h，SCMEC单层上皮TEER值与对照组相比明显升高，即Ang1可增强体外培养SCMEC屏障功能；此外，该效应可被Wortmannin所拮抗，即与Ang1处理组相比，Ang1+WM组TEER值有所下降（图2）。该结果表明，Ang1可能通过影响Akt 活性增强体外培养SCMEC屏障功能。
220
第3期
图1Ang1处理增强培养SCMEC 中Akt 的活性
(A,C)Western 印迹检测各处理组Akt1的磷酸化水平变化;(B,D)以H2B 为底物,放射自显影(B)或液闪计数(D)检测各处理组Akt1的活性改变。**P <0.01,与对照组相比较;#P <0.05,##P <0.01,与Ang1组相比较。WM :Wortmannin 。Fig.1Enhancement of Akt activity in cultured SCMEC after Ang1treatment
(A,C)Western blot analysis of the phosphorylation state of Akt1;(B,D)Autoradiography(B)and scintillation counting (D)to de ?tect Akt1activity using H2B as the substrate.**P <0.01,compared with vehicle control;#P <0.05,##P <0.01,compared with Ang1group.WM:Wortmannin.
2.3Ang1-Akt 通路影响连接蛋白在SCMEC 细胞连接处的分布
为进一步明确Ang1-Akt 途径影响SCMEC
屏障功能的机制，我们检测了几种细胞连接蛋白
（occludin 、ZO -1、VE -cadherin 、β-catenin 等）经Ang1处理后在细胞连接处的分布变化。
为更清晰地观察细胞接触面，我们在细胞免疫荧光试验中
采用1∶5比例进行传代培养，在该培养条件下，
SCMEC 大多（>60%）呈现多角形。结果表明，
紧密连接蛋白ZO-1及粘着连接蛋白VE-cadherin 在
Ang1处理后在细胞连接处的分布显著增强，而Ang1+WM 组则无此改变（图3），提示Ang1可通
过Akt 活性影响连接蛋白在细胞表面的分布，从而增强SCMEC 的屏障功能。2.4Ang1-Akt 通路影响SCMEC 连接蛋白间的
相互作用
在观察到Ang1对ZO-1及VE-cadherin 在
细胞连接处的分布影响后，我们进一步通过免疫共沉淀检测了细胞连接蛋白间的相互作用改变。
在Ang1处理12h 后，收集SCMEC 裂解液，
统计分析Co-IP 结果显示，Ang1可以增强occludin/ZO-1及VE-cadherin/β-catenin 之间的相互作用
分别达200%及150%以上，而Ang1+WM 组与Ang1处理组相比则抑制了连接蛋白间的相互作
用，表明Ang1-Akt 途径可通过促进细胞连接复
合体的形成提高SCMEC 的内皮屏障功能（图4）。
图2Ang1处理对SCMEC 屏障功能的影响**
P <0.01,与对照组相比;#P <0.05,##P <0.01,与Ang1组相比。WM :Wortmannin 。
Fig.2The effect of Ang1on barrier function of the cul 鄄tured SCMEC **
P <0.01,compared with vehicle control;#P <0.05,##P <0.01,compared with Ang1group.WM:Wortmannin.
图3Ang1通过影响Akt 活性增强连接蛋白ZO-1及
VE-cadherin 在SCMEC 细胞连接处的分布标尺=25μm ,WM :Wortmannin 。
Fig.3Ang1intensified the distribution of ZO -1and VE-cadherin at cell junction sites via Akt in SCMEC Bar=25μm,WM:Wortmannin.
Vehicle ctrl Ang1Ang1+WM 048120
4812
04812(h)
Akt1,62kD Actin,42kD
p-Akt1,62kD (A)
(D)
20001000Time after treatment/h
Vehicle ctrl Ang1Ang1+WM 048120481204812(h)
32]-H2B
(B)
(C)
Time after treatment/h
Ang 1+WM
Vrhicle ctrl Ang 1
4
8
12
45
55
65
Time after treatment/h
Vehicle ctrl
Ang1
Ang1+WM
刘欣春等：Ang1-Akt 途径对大鼠体外血-脊髓屏障功能的调节
221
生命科学研究2015年
3讨论
脊髓微血管内皮细胞（SCMEC ）在构成血脊
髓屏障（BSCB ）中的功能与脑微血管内皮细胞（BMEC ）构成血脑屏障（BBB ）中的作用类似，近年来在血中枢神经系统屏障的研究中建立了许多成功模拟BBB 或BSCB 的体外模型[14~16]。本研究通
过分离培养成熟SD 大鼠脊髓微血管，在适当条件下消化培养SCMEC ，经因子Ⅷ特异性抗体检
测，SCMEC 纯度可达95%[14,15]；在此基础上，于双室培养系统中共培养SCMEC 和胶质细胞（已知后者可诱导中枢神经系统血脑屏障的形成[17]），通过每日测定TEER 反映内皮屏障功能，发现在该
培养条件下经6~7d 的培养，TEER 值可达45~60Ω·cm 2，表明成功建立体外BSCB 模型。
Ang 1基因位于染色体8q22，由498个氨基酸组成，主要由周细胞及血管平滑肌细胞表达，作用于内皮特异性酪氨酸激酶受体Tie-2，其同源
蛋白Ang2为其天然的竞争性拮抗剂。转基因研究证实，Ang 1基因缺失或Tie -2基因敲除的小鼠胚胎血管形成障碍、通透性增高且缺乏连续性从而不能形成血管网；而Ang 1过表达的转基因动
物则表现为血管增生变粗且内皮细胞与周细胞的连接完整[18]。Ang1在维持血管稳定性方面发挥重要作用，有报道称其中涉及Akt 介导的抗凋亡效应[9,12]；此外，Ang1可通过激活磷脂酰肌醇激酶（PI3K ）引起柱蛋白（paxillin ）磷酸化，加强内皮-基质间的相互作用，增加内皮管状结构的完整性。在本研究中，我们首先检测了Ang1对体外培养
的脊髓微血管内皮细胞Akt 激酶活性的影响，即用Ang1处理培养SCMEC 后收集细胞裂解液，
采用[32P]-掺入试验测定激酶活性，
放射自显影及液闪计数结果均显示Ang1处理后可引起SCMEC 中的Akt 活性增高。结合以往报道，该结果提示Ang1对PI3K/Akt 途径的调节作用在内皮细胞中
是普遍存在的。在此基础上，我们又进一步检测了Ang1对体外BSCB 屏障功能的影响，TEER 测定
结果表明Ang1处理4h 后，SCMEC 屏障功能显著增强，同时发现该作用可被PI3K/Akt 途径特异性抑制剂Wortmannin 所拮抗，说明Ang1可通过影响Akt 活性调节BSCB 功能，降低其通透性，维持BSCB 的稳定。
在内皮屏障结构中，相邻内皮细胞间的细胞连接的形成及完整性对内皮通透性的维持至关重要。因此，我们检测了Ang1处理后几种连接蛋白
（occludin 、ZO -1、ZO -2、VE -cadherin 、β-catenin ）
的表达情况，免疫印迹结果显示无明显改变，说明Ang1不是通过影响连接蛋白的表达量调节BSCB
的通透性。进一步通过免疫荧光技术发现，Ang1处理后支架蛋白ZO-1与钙黏蛋白VE-cadherin
在细胞接触面的分布明显增加；
此外，紧密连接蛋白occludin 与ZO-1，以及VE-cadherin 与连环蛋白β-catenin 之间的相互作用也在Ang1处理后
增强，
且Ang1所引起的效应均可被PI3K-Akt 途径抑制剂Wortmannin 所抑制。综上结果表明，Ang1可通过Akt 改变连接蛋白在SCMEC 细胞连接处的分布状态，并影响连接蛋白之间的直接作用，从而改变BSCB 的通透性及屏障功能，该结论仍需进一步在体内研究中进行验证。此外，Ang1还可通过其他途径参与维持血管稳定性及诱导新血管生成，如有研究表明Ang1可促进胞浆素和金属基质蛋白酶-2（MMP-2）的分泌和基底膜的降解，从而促进内皮迁移和管状结构生成，还可通过降低血小板内皮细胞粘
附分子（PECAM ）的磷酸化加强内皮间的连接，维持微血管壁的完整性[19]等等，这些信号转导分子
图4Ang1通过影响Akt 活性增强连接蛋白occludin/
ZO-1及VE-cadherin/β-catenin 之间的相互作用**
P <0.01,与对照组相比;##P <0.01,与Ang1组相比。WM :Wortmannin 。
Fig.4Ang1enhances the interactions between occludin and ZO-1and between VE-cadherin and β-catenin via influencing Akt activity **
P <0.01,compared with vehicle control;##P <0.01,compared with Ang1group.WM:Wortmannin.
β-catenin,92kD
IP:
IB:
ZO-1
VE-cadherin
Occludin,65kD lgG L ,23kD
lgG H ,50kD
(B)
222
第3期
在Ang1调节BSCB屏障功能的过程中是否发挥作用仍需进一步的研究阐明。
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刘欣春等：Ang1-Akt途径对大鼠体外血-脊髓屏障功能的调节223
全骨髓法分离培养大鼠MSCs实验指导
大鼠骨髓间充质干细胞培养 干细胞是一类具有自我更新能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，医学界称其为“万用细胞”，干细胞的增殖保证了机体内的动态平衡。 骨髓间充质干细胞是存在于骨髓基质中的非造血干细胞，能在体外或体内分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。 源于自体骨髓的间质干细胞能够很好地避免异体间移植的免疫排斥反应，在临床上，已经成功地将骨髓间充质干细胞移植到患者体内，用于治疗骨组织缺损和心肌梗塞等疾病。 本实验根据骨髓中间充质干细胞的贴壁生长，而血细胞和造血干细胞悬浮生长的特性用贴壁法将其分离开来，此方法得率高、操作简单、无需特殊试剂，已广泛应用于科研工作中。 一、实验前准备 实验开始前，将眼科剪刀、眼科镊子、培养皿，15ml离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射30min。 选取SPF级，体重100~150g左右的SD大鼠，断颈处死。将大鼠置于体积分数为75%的乙醇中浸泡5 min。 工作台紫外消毒后，采用通风机通风3min。以75%酒精擦拭操作台和双手。 无菌条件下，准备好大剪刀、止血钳、眼科剪刀、眼科镊子、干净培养皿。将大鼠仰卧在超净台内的干净培养皿上。 二、全骨髓提取 眼科镊沿腹股沟处提拉大鼠皮肤，眼科剪刀剪开腹股沟皮肤，暴露腿部肌肉，从关节处将大鼠大腿剪下。除去骨表面附着的软组织，置于另一无菌培养皿中。 假如在平时操作中，剪刀不易将骨表面肌肉组织剔除干净，可采用无菌纱布擦拭，可方便的将肌肉组织剔除干净，提高所分离细胞的纯度。 用无菌PBS浸泡清洗。眼科剪剪断两端骨骺，显露骨髓腔，放置于10ml含体积分数为10%胎牛血清的新鲜DMEM完全培养液的无菌培养皿中，取出1mL注射器，用镊子钳起骨头的一端，并用注射器吸取完全培养液冲洗骨髓腔至另一培养皿中，由一段骨髓腔冲出骨髓，重复3次，再反方向冲出骨髓，重复3次。直至骨髓腔冲洗液变清亮后停止。
成年大鼠4种脊髓全横断方法的比较
成年大鼠4种脊髓全横断方法的比较 作者：王春婷，游思维，刘惠玲，陈秉耀，焦西英，孟晓梅，吴宗亮，鞠躬 【关键词】脊髓切断术 关键词: 脊髓切断术;神经纤维;空洞;轴突再生;大鼠 摘要:目的比较成年大鼠4种脊髓全横断方法对后肢运动功能及脊髓组织学的影响. 方法 32只成年SD大鼠分为A，B，C和D4组，每组8只，分别以4种不同方法全横切T9脊髓.A组以尖刀片自左向右横行一次性切断脊髓;B组将尖刀片自脊髓背部中线处垂直插入并分别向两侧缓慢细心切断脊髓;C组将一丝线穿过脊髓腹侧硬膜外腔，以长刃显微剪一次性完全横断脊髓，并将丝线由断端间隙中拉出;D组以尖刀片自脊髓背侧至腹侧分层快速划断脊髓，再抬起脊髓两断端以验证横断的完全性.术后1h肉眼观察脊髓形态变化，8wk时评估截瘫后肢自发性运动功能恢复后，处死动物，取脊髓损伤节段，行连续矢状冰冻切片，小鼠抗神经丝抗体免疫组化染色，光镜下观察有无神经纤维的残留或再生，以及空洞及瘢痕的形成. 结果 A，B两组术后脊髓肿胀、外翻，8wk时分别有50%，38%的动物出现程度不等的功能恢复，镜下可见成束残留纤维和大量空洞.C，D两组术后脊髓外观良好，8wk时无功能恢复和残留纤维，但有少量神经丝免疫反应再生纤维.与D组相比，C组断端间隙较大且空洞较多. 结论经作者创新的D组方法，横断完全、损伤较小，为简便易行、效果可靠的脊髓全横断手术
方法. Keywords:cordotomy;nerve fibers;cavities;axonal regen-eration;rat Abstract:AIM To compare the effects of four spinal cord transecting methods on spontaneous motor recovery in para-plegic hindlimbs and histological changes within the spinal cord in adult rats.METHODS Thirty-two adult male SD rats were divided into Groups A，B，C and D（n=8for each group，which received one of the four methods of spinal cord transection at T9）.In Group A，the spinal cord was tran-sected with a sharp blade along the inner wall of the vertebral channel.The blade in Group B，however，was vertically in-serted through the cord at midline and guided to slowly and carefully cut the bilateral halves of the cord separately.In Group C，the cord was cut with a pair of long-edge microscis-sors，and the completeness of the transection was verified by guiding a surgical suture through the ventral extradural space before and pulling the suture out through the gap between the2stumps of the transected cord.The cord of Group D an-imals was dissected with a sharp blade in quick gashes，and complete transection was checked by uplifting one
大鼠骨髓源神经干细胞的分离培养及鉴定
大鼠骨髓源神经干细胞的分离培养及鉴定 目的：对Wistar大鼠骨髓源神经干细胞进行分离、培养和鉴定，观察其生长方式和分化特征。方法：运用无血清培养基对Wistar大鼠骨髓基质细胞进行培养，对分离获得的悬浮生长的神经球采用免疫组织化学法检测CD133和Nestin 表达情况。用血清诱导其分化，分化7 d后，采用免疫荧光细胞化学染色方法检测分化后GFAP、Map2、β-tubulin Ⅲ、Galc的表达情况。结果：大鼠骨髓基质细胞在无血清培养基中，呈悬浮状态生长，形成细胞球，经免疫荧光检测，细胞球呈CD133和Nestin阳性。将细胞球转入含血清培养基后，转为贴壁生长，经免疫荧光检测大部分已分化细胞呈GFAP阳性，少部分细胞呈MAP-2、β-tubulin Ⅲ及Galc阳性。结论：采用含bFGF、EGF的无血清培养基可培养出呈球状聚集生长、具多向分化潜能的大鼠骨髓源神经干细胞。 脑血管病是威胁全世界人类生命健康的一类疾病，其中缺血性脑梗死作为神经系统的常见病、多发病，其发病率、病死率和致残率均很高。且随着人口结构的老龄化和吸烟人口的增加，脑血管病的发病率有进一步上升的趋势。传统的治疗方法包括药物、康复理疗和功能锻炼等，但效果均不理想。近年来，随着干细胞（Stem cells，SCs）理论的提出，不少研究者相继报道从神经组织、脂肪组织、骨髓等组织中分离并培养出了各自的干细胞，其中神经系统来源的干细胞被称之为神经干细胞（Neural stem cells，NSCs）[1]。近年来，随着神经干细胞研究的不断深入，部分研究者将骨髓基质细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）成功诱导为骨髓源神经干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells-derived neural stem cells，BMSCs-NSCs）[2]。BMSCs-NSCs的开发和应用，克服了从成体脑组织中获取神经干细胞和危险性和局限性，也避免了胚胎来源干细胞移植中存在的伦理、免疫排斥、来源有限等问题。骨髓基质细胞源性神经干细胞的移植治疗修复中枢神经系统损害成为了研究重点，这给脑梗死的细胞移植治疗带来了新思路[1-3]。因此，本研究选用Wistar大鼠骨髓基质细胞，运用含bFGF和EGF的无血清DMEM/F12培养基对其进行诱导培养，拟培养Wistar大鼠骨髓源神经干细胞，为骨髓源神经干细胞的进一步研究打下基础，现具体报道如下。1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物成年Wistar大鼠，雄性，体重（200±50）g，购于兰州大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK（甘）2013-0002。 1.1.2 主要试剂DMEM/F12培养基及0.25%胰蛋白酶（购自Gibco公司）。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自Hyclone公司。B27添加剂购自Invitrogen 公司。表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）购自Peprotech 公司，小鼠抗Nestin抗体、兔抗GFAP抗体、小鼠抗Galc抗体购自Chemicon 公司，小鼠抗MAP2抗体、兔抗β-tubulin Ⅲ抗体购自Abcam公司，兔抗CD133抗体购自Santa Cruz公司。Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG、Alexa Fluor 594标记羊抗兔IgG和Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG购自Molecular Probes公司。DAPI
BBB(大鼠脊髓损伤)评分标准
BBB(大鼠脊髓损伤)评分标准： 0分： 无可见后肢运动 1分： 一或两个关节轻微运动，通常为髋和/或膝关节 2分： 一个关节广泛活动或一个关节广泛活动且有另一关节轻微活动3分：两个关节广泛活动 4分： 后肢全部三个关节可轻微活动 5分： 两个关节轻微活动，第三个关节可广泛活动 6分： 两个关节广泛活动，第三个关节可轻微活动 7分： 后肢全部三个关节可广泛活动 8分： 非承重情况下可以爪掌面着地 9分： 间或爪掌面承重支撑或爪背面承重移动，无爪掌面支撑移动10分：偶见爪掌面承重移动；无前后肢协调动作
11分： 可较多的见到掌面承重移动，但无前后肢协调动作 12分： 可较多的见到掌面承重移动，偶见前后肢协调动作 13分： 常见掌面承重移动，可常见前后肢协调动作 14分： 有持续性掌面承重移动和前后肢协调动作；或出现常见的掌面移动，持续型前后肢协调动作，偶有爪背侧移动 15分： 持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中无或欧有抓地；初接触时主动爪位置与身体平行 16分： 步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中常见爪抓地；初接触时主动爪位置与身体平行，负重转移后旋转。 17分： 步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中常见爪抓地；初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行。 18分： 步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中可持续性爪抓地；初接触时主动爪位置均与身体平行，负重转移后旋转。 19分：
步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中可持续性爪抓地；初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行。尾巴有时或总是下垂。 20分： 持续性掌面移动，持续性协调步态，足趾持续抓地，初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行，躯干不稳定，尾巴持续翘起。 21分： 持续性掌面移动，持续性协调步态，足趾持续抓地，活动过程中主动爪位置始终与身体平行，躯干持续稳定，尾巴持续翘起。 关于BBB评分，的确有很大的主观性，我目前把BBB评分分三大块，0-7主要看关节动否？有几个关节动？ 8-14看脚掌能否着地？着地后能否运动？运动协调不？ 15-18看脚尖能否抓地？脚尖与前进方向是否一致？前后肢运动是否协调19-21看运动时躯干稳不稳定？尾巴翘不翘？
2.常见血液病的骨髓检查
常见血液病的骨髓检查 贫血 一、定义 在一定容积的循环血液内红细胞计数、血红蛋白量以及红细胞压积均低于正常标准者称为贫血。其中以血红蛋白最为重要，成年男性低于120g/L（12.0g/dl），成年女性低于110g/L(11.0/dl)，一般可认为贫血。 根据血红蛋白降低程度的不同，临床上将贫血分为下列4级。 贫血的临床分级 二、贫血分类 贫血可以根据红细胞的形态特点或发生的原因和发病机理加以分类。 根据红细胞形态特点分类，主要是根据患者的红细胞平均体积（MCV）及红细胞血红蛋白平均浓度（MCHC）。 贫血可分为三类： （一）、大细胞性贫血 红细胞MCV＞95fI。此类贫血大多为正常色素型，如叶酸或维生素B12缺乏引起的巨幼细胞性贫血和贫血伴网织红细胞大量增多时。 （二）、正细胞正色素性贫血 红细胞MCV＝80～95fI，MCHC＝0.32～0.36(32～36%)。属此类贫血者有再生障碍性贫血，多数溶血性贫血、急性失血后贫血及慢性系统性疾病（慢性炎症、感染、尿毒症、肝病、结缔组织病、恶性肿瘤、内分泌病等）伴发的贫血等。（三）、小细胞低色素性贫血 红细胞MCV＜80fI，MCHC＜0.31(31%)。属于此类贫血者有缺铁性贫血、海洋性贫血、铁粒幼细胞性贫血等。
根据病因和发病机理的分类，贫血可分类如表
三、贫血的实验室检查 1．血常规检查有无贫血及贫血严重程度，是否伴白细胞或血小板数量的变化。据红细胞参数（MCV、MCH及MCHC）可对贫血进行红细胞形态分类，为诊断提供相关线索。 网织红细胞计数间接反映骨髓红系增生及代偿情况，网积红细胞计数，校正网织红细胞计数＝患者的红细胞压积／0.45/L×网织红细胞（％）。 外周血涂片可观察红细胞有无异形红细胞，如球形红细胞、靶形红细胞、裂殖细胞，有无红细胞大小不均，低色素和多染性红细胞，嗜硷性点彩、卡伯特氏球、豪一周氏小体等。观察白细胞、血小板数量或形态改变，有否疟原虫和异常细胞等。 2．骨髓检查 骨髓细胞涂片检查对诊断不可缺乏，反映骨髓细胞的增生程度、细胞成分、比例和形态变化。 必要时应作骨髓活检。 骨髓活检反映骨髓造血组织的结构、增生程度、细胞成分和形态变化。骨髓检查对某些贫血，白血病，骨髓坏死、骨髓纤维化或大理石变，髓外肿瘤细胞浸润等具有诊断价值。必须注意骨髓取样的局限性，骨髓检查与血常规有矛盾时，应做多部位骨髓检查。
大鼠骨髓间充质干细胞的分离方法和培养
大鼠骨髓间充质干细胞的分离方法和培养 发表时间：2015-07-24T10:18:58.373Z 来源：《医药前沿》2015年第13期供稿作者：邹瑾1 李雅2 尹进3 [导读] 骨髓间充质干细胞是中胚层来源的干细胞，是具有多向分化潜能的成体干细胞之一。 邹瑾1 李雅2 尹进3 （1湖南科技职业学院湖南长沙 410014） （2湖南中医药大学湖南长沙 410004） （3湖南疾病预防控制中心湖南长沙 410007） 【摘要】目的：探索在体外培养和纯化SD大鼠的骨髓间充质干细胞（BMSCs）的方法。方法：采用改良全骨髓贴壁方法，分离和纯化3～4周的大鼠BMSCs，镜下连续观察细胞的形态变化。流式细胞仪鉴定其表面抗原CD11b、CD45和CD90的表达情况。结果：原代培养的细胞呈圆形和梭形等，24小时后大部分细胞均贴壁。8～10天可达80%～90%融合，纯化后传代周期为6～8天。流式细胞术鉴定表明 CD11b和CD45阴性，CD90阳性。结论：改良全骨髓贴壁法可有效分离培养大鼠的骨髓间充质干细胞，是一种比较理想的分离培养方法。 【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养大鼠 【中图分类号】R730.5 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）13-0026-02 Rat bone marrow mesenchymal stem cells‘s separation methods and to cultivate Zou Jin. Hunan Vocational College of Science and Technology, Hu’nan Province, Changsha 410014, China; Li Ya. Hu’nan University of Chinese Medicine, Hunan Province, Changsha 410004, China; Yin Jin. The Centers for Disease Control and Prevention of Hu’nan, Hu’nan Province, Changsha 410007, China 【Abstract】Objective To explore the in vitro culture and purification of SD rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) method. Methods Using improved the whole bone marrow adherent method, separation and purification of rat (for 3 ～ 4 weeks )of BMSCs, microscopically continuous observation of cell morphology change. To identification cells surface antigen CD11b, CD45 and CD90 expression using flow cytometry. Results The original generation of cultured cells is circular and spindle, after 24 hours, most of the cells are attached. 8 ～ 10 days later, the fusion of up to 80% ～ 90%. After purification，extend the period is 6 ～ 8 days. Using flow cytometry assay, CD11b and CD45 were negative, CD90 is positive. Conclusions Improved the whole bone marrow adherent method, which can effectively the isolation and culture of rat bone marrow mesenchymal stem cells, is an ideal method of cultivation. 【Key words】Bone marrow mesenchymal stem cells; Cell culture; The rat 骨髓间充质干细胞是中胚层来源的干细胞，是具有多向分化潜能的成体干细胞之一[1]。在不同诱导条件下，可以分化为成骨细胞、肌细胞和脂肪细胞，还可以跨胚层分化为神经元、肝细胞和内皮细胞等，是目前组织工程的重点种子细胞。分离培养高纯度和高活力的BMSCs是组织工程的关键。本实验目的在于采用改良全骨髓贴壁法对大鼠BMSCs进行分离培养，为组织工程技术提供种子细胞。 1.材料与方法 1.1材料 雄性SPF级SD大鼠，5～7周，体重110±20g，购自湖南中医药大学动物实验中心。L-DMEM培养基（Gibco公司），胎牛血清（Hyclone公司）。PBS平衡盐溶液、胰蛋白酶（Sigma公司），EDTA二钠（上海生物工程有限公司），FITC标记CD11b、CD90、CD45抗体（Serantec公司）等。 1.2方法 1.2.1原代培养BMSCs 将经过高压灭菌的手术器械准备好，大鼠采取颈椎脱臼法处死后，放在75%的酒精中浸泡10分钟。在无菌的环境下，快速取出大鼠的股骨、胫骨，并剔除其周围的组织，然后切除大鼠的股骨、胫骨的两端。使用5mL剂量的注射器，抽取DMEM液，给大鼠的骨髓腔进行反复冲洗，然后把冲洗液收集起来，放在离心管里，1500转/分，离心5分钟后将上清液丢弃。放进有15%的胎牛血清的DMEM培养液中，反复吹打，经过细胞计数之后，按照109/mL的密度，在50cm2的培养瓶里接种，放置温度在37摄氏度、湿度饱和、体积分数是0.05的CO2的培养箱里，进行培养。使用倒置的显微镜，进行日常观察其细胞的生长状态。48个小时之后开始换液，并丢弃未贴壁的细胞，之后每隔两天进行一次换液。 1.2.2传代、纯化BMSCs 当原代培养的细胞增殖，能够在瓶底的融合情况大致到达80%左右时，用0.25%浓度和0.01%浓度的EDTA混合消化酶，进行细胞消化，使用有15%的胎牛血清的培养基进行消化反应的终止处理，然后使用吸管，进行轻轻的吹打，让细胞能够完全脱壁，再将其放入离心管里，1200转/分，离心3分钟，将上清液丢弃，放入新的培养基，吹散后按一比二的比例，进行传代培养，将P1设为其标记，之后进行日常观察细胞的生长状态，直到贴壁细胞的融合现象能够有80%左右的时候，再重复上述的操作步骤，进行反复传代。 1.2.3测定BMSCs的生长曲线选择生长良好的P1、P3、P5的细胞，消化后以1×104/mL接种在二十四孔板中，每日均选取三孔，并计算其细胞的数量，按照一孔计算三次的方式，取其平均数，共计连续培养七天，将培养的时间设为横轴，将细胞数设为纵轴，进行生长曲线的绘制。 1.2.4鉴定BMSCs 选择P3的细胞，用混合消化液将细胞进行消化，然后配成细胞的悬液，使用1%浓度的BSA，将封闭液进行10min的封闭处理，然后洗涤PBS三次后，放入FITC荧光标记的CD11b、CD90、CD45抗体中，对照组再放入PBS，在4摄氏度的环境下，进行30min的孵育，1500转/分，离心5分钟，冲洗PBS三次，使用1%浓度的多聚甲醛进行固定，使用FACScan流式细胞仪，进行细胞表面抗原的检测。 2.结果 2.1 BMSCs细胞培养的形态 BMSCs在接种24小时后，就能够看到细胞有贴壁的现象。48个小时后，细胞的贴壁现象更加趋于明显，其中细胞的形状主要是椭圆形、圆形这两种。在第三天到第五天的时候，细胞形状变成多边形、二角形、短梭形，并变成集落的生长方式。在第六天到第十天的时候，细胞能够形成80%到90%的融合现象，而且已经将瓶底铺满，分布形状呈现旋涡状，并且能够进行传代。在刚传代的细胞形状为圆形，且传代的细胞，和原代细胞相比，其生长速度更快，在四个小时的时间内，就出现了贴壁的细胞，在二十四个小时内，所有的细胞已经全部贴壁，并且呈现伸展的生长状态，在6天到8天后，就能够进行传代，传代的细胞生长均匀分布，且大部分细胞的形状是梭形。
SD大鼠脊髓损伤模型的制备及功能的评定
SD大鼠脊髓损伤模型的制备及功能的评定作者：程方圆沈程肖贵虎杨明英杨金梅罗川南 指导老师：荣成 （四川省成都市成都医学院，610500） 摘要目的：通过对SD大鼠脊髓顿挫损伤（Spinal cord injury，SCI）模型进行功能评价，观察SD大鼠脊髓恢复情况。方法：将SD大鼠随机分成实验组、对照组两组，将实验组用 Allens法进行T9脊髓顿挫损伤，制成大鼠脊髓损伤模型。对所有大鼠的后肢运动功能进行BBB评分和脊髓组织学观察。结果：实验组大鼠BBB评分一周后最高达到14分，最低达到3分。BBB功能评分显示实验组大鼠运动功能明显低于对照组，并逐渐恢复或增强。结论：脊髓顿挫导致大鼠后肢功能障碍，通过BBB评分显示，大鼠后肢功能逐渐增强。 【关键词】脊髓顿挫损伤；后肢运动功能；BBB评分 Objective: observe the recovery situation of the SD rats through the abortive on spinal cord injury in SD rats (spinal cord injury, SCI) function evaluation model .methods: SD rats were divided into two groups randomly, including normal group and experimental group. SD rat model of acute spinal cord injury were established by using Allens method at 9th spinal cord, evaluate the hind limb motor of all rats and observe the histology of spinal. Result: the experimental rats’ BBB score up to 14 points after one week, the lowest reach 3 points. The BBB score of experimental rat s showed that the rats’ motor function was significantly lower than the normal rats, and gradually restored or enhanced. Conclusion: aborting spinal cord leads to hind limb dysfunction, the BBB score showed that the hind limb function of rats is enhancing gradually。Key words: spinal cord injury; hind limb motor function; BBB score 前言：脊髓损伤是由于各种原因引起的脊髓结构和功能的损害，是脊柱损伤最严重的并发 症，往往导致损伤节段以下肢体严重的功能障碍，是中枢神经系统严重的致残性疾病。随着世界各国经济水平的发展，脊髓损伤发生率呈现逐年增高的趋势。脊髓损伤不仅会给患者本人带来身体和心理的严重伤害，还会对整个社会造成巨大的经济负担。针对脊髓损伤的预防、治疗和康复已成为当今医学界的一大课题。有研究表明脊髓损伤后有一定修复能力，为此我们设计了此实验。通过对照实验将SD大鼠随机分为脊髓损伤与否两组大鼠，对脊髓损伤的大鼠模型进行功能评价，从而找到更好的治疗脊髓损伤的办法。经过实验，我们发现SD大鼠在脊髓损伤后功能逐步恢复。 1 材料与方法 1.1主要仪器 鼠台、橡胶圈、玻璃分针、烧杯、10g金属棒、粗剪刀、手术器械、婴儿磅秤、缝合针、棉线、棉签、注射器、脊髓打击装置。 1.2 主要试剂 3.6%水合氯醛、青霉素、葡萄糖、1.5%戊巴比妥溶液。 1.3 实验动物 健康成年雌性大鼠10只，体重200±50g。饲养两周后进行实验。
4、血脑屏障
blood brain barrier；血脑屏障是指脑毛细血管壁与神经胶质细胞形成的血浆与脑细胞之间的屏障和由脉络丛形成的血浆和脑脊液之间的屏障，这些屏障能够阻止某些物质（多半是有害的）由血液进入脑组织。血液中多种溶质从脑毛细血管进入脑组织，有难有易；有些很快通过，有些较慢，有些则完全不能通过，这种有选择性的通透现象使人们设想可能有限制溶质透过的某种结构存在，这种结构可使脑组织少受甚至不受循环血液中有害物质的损害，从而保持脑组织内环境的基本稳定，对维持中枢神经系统正常生理状态具有重要的生物学意义。
介于血液和脑组织之间的对物质通过有选择性阻碍作用的动态界面，由脑的连续毛细血管内皮及其细胞间的紧密连接、完整的基膜、周细胞以及星形胶质细胞脚板围成的神经胶质膜构成，其中内皮是血脑屏障的主要结构。 血脑屏障是血-脑、血-脑脊液和脑脊液-脑三种屏障的总称。 与其他组织器官的毛细血管相比，脑毛细血管及其邻近地区在结构上确有一些明显的特点（正常情况下）： ①脑毛细血管缺少一般毛细血管所具有的孔，或者这些孔既少且小。内皮细胞彼此重叠覆盖，而且连接紧密，能有效地阻止大分子物质从内皮细胞连接处通过。 ②内皮细胞还被一层连续不断的基膜包围着。 ③基膜之外更有许多星形胶质细胞的血管周足（终足）把脑毛细血管约85%的表面包围起来。这就形成了脑毛细血管的多层膜性结构，构成了脑组织的防护性屏障。在病理情况下，如血管性脑水肿时，内皮细胞间的紧密粘合处开放，由于内皮细胞肿胀重叠部分消失，很多大分子物质可随血浆滤液渗出毛细血管，这会破坏脑组织内环境的稳定，造成严重后果。 20世纪初发现，给动物静脉注射苯丙胺后，此药可以分布到全身的组织器官，唯独脑组织没有它的踪迹。注射台盼蓝（锥虫蓝）涂料以
正常骨髓象
正常骨髓象 由于正常骨髓内各细胞系及其各阶段百分率范围较大，因此凡分类符合下列情况者均可视为正常骨髓象。 1、骨髓增生活跃。 2、粒细胞系约占有核细胞的40%～60%，其中原粒细胞<2%，早幼粒细胞<5%、中、晚幼粒细胞各<15%，杆状核粒细胞多于分叶核细胞，嗜酸粒细胞一般<5%，嗜碱粒细胞<1%，细胞大小、形态、染色基本正常。 3、幼红细胞总百分率约占有核细胞的20%左右，其中原红细胞<1%，早幼红细胞<5%，中、晚助红细胞约各占10%，细胞形态、染色基本正常。 4、粒、红比值正常约为2～4:1。 5、淋巴细胞百分率约为20%(小儿可达40%)，均为成熟淋巴细胞。 6、单核细胞一般<4%，浆细胞<3%，均为成熟阶段者。 7、巨核细胞系通常于1.5×3cm2骨髓片膜上可见巨核细胞7～35个，多为成熟型。 8、可见少量网状细胞、内皮细胞、组织嗜碱细胞等。虽然它们各占百分率很低，但却均为骨髓成分的标志. 9、核分裂细胞不易见到，仅约为1‰。 10、成熟红细胞大小、形态、染色大致正常。
二、 1、骨髓有核细胞计数：参考值为10——10*109/L。 （1）增多：见于骨髓增生时（如白血病、溶血性贫血、脾功能亢进等）。 （2）减少：见于造血组织功能减退（如再生障碍性贫血等）。 2、骨髓增生程度，分五级： （1）增生极度活跃：成熟红细胞有核细胞的比例为2：1，常见于各类白血病。 （2）增生明显活跃：成熟红细胞有核细胞的比例为5：1——10：1，见于增生性贫血和各类白血病。 （3）增生活跃：成熟红细胞与有核细胞的比例为27：1，见于正常骨髓及某些贫血。 （4）增生减低：成熟红细胞与有核细胞的比例为90：1，见于再生障碍性贫血。 （5）增生极度减低：成熟红细胞与有核细胞的比例为200：1，见于再生障碍性贫血或取材不良。 3、粒细胞系统与有核红细胞的比例：参考值为2：1——5：1。 4、巨核细胞计数：参考值为单位面积（1.5*3cm），有7——35个巨核细胞。 （1）增高：见于原发性血小板增多症，真性红细胞增多症，慢性粒细胞白血病，骨髓纤维化症，脾功能亢进和大出血后。 （2）减低：见于再生障碍性贫血，急性白血病。
大鼠的骨髓间充质干细胞提取
大鼠的骨髓间充质干细胞提取 第一步，SD大鼠麻醉处死，75%乙醇皮肤消毒，无菌条件下迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉，取股骨及胫骨，浸泡在PBS中。 心得体会：①鼠龄4周，重量在160-200g之间的雄性SD大鼠。老鼠太老了，骨髓都分化的太厉害，没有年幼老鼠的骨髓这么有活力。雌的也行，但是雌的比较厉害，咬人。Wistar 大鼠行不行，也行，但是就品种而言，SD的生存力更强大。 ②我个人认为引颈处死不人道。麻醉药品为氯胺酮、安定、阿托品各一支混到一起，腹腔麻醉，保证30秒老鼠躺倒，安乐死。如果你水平够高，可以直接用注射器抽取心脏内的血液，可以减少手术中老鼠出血较多而影响术野不清的问题。 ③老鼠的两支前肢取下来也行，但老鼠太小，前肢更小，如果你的确需要大量的细胞取下来也无妨。浸泡的15ml的一次性离心管中（也可以用培养皿），管中提前加好含有青链霉素的PBS 10ml就行了，青链霉素的浓度为500U／ml，这样是区别于生长液中青链霉素浓度，组织抑菌是200-500U／ml，生长液抑菌是20-100U／ml。就当初步的消毒吧！ ④整个手术过程要快，一般控制在20分钟之内，时间长了，骨髓会凝，不利于后期的冲洗。老鼠浑身都是宝，可以叫上研究脂肪的，嗅鞘的，心肌的其他人员一起来，把剩下不要的老鼠尸体给别人，做实验要巧花钱。一般老鼠一条腿的一根股骨就够种在一个60mm的皿里了，具体根据个人经验而言。 第二步，⑴将装有骨头的离心管置于紫外线下消毒30分钟后移至超净台，倒掉PBS后，再用含青链霉素的PBS清洗骨头三遍。 ⑵去掉骨头两侧的骨骺端，暴露出骨髓腔，用5ml的一次性注射器吸取5.2ml的细胞生长液，用针头插到骨头的一端冲洗，然后换另一端接着冲。将骨髓冲出的细胞生长液至60mm培养皿中（皿最好倾斜45度），冲洗数次直至将绝大部分骨髓冲出。 ⑶换1ml注射器的针头，反复在培养皿中吹吸细胞悬液2-3次后再全部吸到无菌容器中，大约此时的细胞悬液为5ml。 心得体会： ①离心管中得骨头要用无菌的镊子夹取，放到一次性培养皿的皿盖上，皿是用来承装细胞悬液的，这样可以节省一个皿。 ②5.2ml的细胞生长液经过冲骨髓后或多或少都会有一些残留在骨髓中，所以到最后可能就剩下5ml细胞悬液了，甚至更少，如果不够5ml，可以加至5ml，这样是方便你计数用的。冲洗的过程中以骨腔颜色变白为标准，基本3-4次就差不多。培养皿倾斜45度是为了在冲洗和吹打过程让较大的杂质停留，方便去除的，相对保持细胞悬液的清晰度。 ③换用1ml的针头是为了能更好的打散细胞，当然这个过程要轻柔，避免用力破坏细胞。无菌容器最好是光滑的，因为在转移细胞悬液的时候会存在细胞的丢失，临床上经常使用的抗生素瓶子就非常好用，但是要经过严格的清洗和消毒。 ④以上的细胞生长液5ml具体配制为 DMEM(90%)+胎牛血清(10%)+L-VC(忽略不计)+青链霉素(忽略不计) 低糖DMEM液（含有glutamine的，Gibco公司的，500ml一瓶，大约60元）浓度90%，5ml 细胞生长液中大约需要4.5ml
脊髓形态
脊髓形态 椎动物背部正中从前向后走行的白色素状物。与脑相连，并和脑一起构成中枢神经系统。它和脑都是由神经管分化产生的。其中心有纵行的连接脑室的中央管（analis centralis），围着中央管的灰质构成脊髓的内层，外层由白质构成。在脊髓的横切面上，灰质呈H形，由连结左右两角的灰质和中央部的中央灰质（substantia grisea centralis）组成。前者又分为背腹二部，分别称为前角（cornu ven－trale）=前灰柱（columna ventralis），后角（cornu dorsale）=后灰柱（columna dorsa－lis）。此外，有些情况，两角间有发达的侧角（co－rnu laterale）=外侧柱（columna lateralis）。由位于前灰柱的前柱细胞发出运动神经纤维形成的前根（腹根），从后灰柱发生的感觉神经形成的后根（背根），按脊髓的节段出入脊髓，构成脊神经的末梢神经。在外侧柱有属于植物性神经系统的神经细胞。整个脊髓外面为与脑膜相连的脊髓膜包围，进而被保藏在纵贯整个脊柱的椎管内。脊髓的横切面，头索类的呈三角形，圆口类的呈扁椭圆形，高等脊椎动物医学教`育网搜集整理的为椭圆形。板鳃类，由于其髓鞘发达，故其灰质与白质可明显地区分开来。两栖类以上的脊椎动物，在其发出前、后肢神经的部位已变为粗大，分别形成颈膨起（intumesentia cervicalis）和腰膨起（intu－mensentia lumbalis）。脊髓的长度与椎管的长度并不一致，人的脊髓终止于第1―2腰椎、第3腰椎以下，腰神经、骶神经和尾神经在椎管的不同 高度的位置上伸出椎间孔，呈束状走向末梢。 脊髓的解剖功能 脊髓是神经系统的重要组成部分，其活动受脑的控制。来自四肢和躯干的各种感觉冲动，通过脊髓的上行纤维束，包括传导浅感觉，即传导面部以外的痛觉、温度觉和粗触觉的脊髓丘脑束、传导本体感觉和精细触觉的薄束和楔束等，以及脊髓小脑束的小脑本体感觉径路。这些传导径路将各种感觉冲动传达到脑，进行高级综合分析；脑的活动通过脊髓的下行纤维束，包括执行传导随意运动的皮质脊髓束以及调整锥体系统的活动并调整肌张力、协调肌肉活动、维持姿势和习惯性动作，使动作协调、准确、免除震动和不必要附带动作的锥体外系统，通过锥体系统和锥体外系统，调整脊髓神经元的活动。脊髓本身能完成许多反射活动， 但也受脑活动的影响。 脊髓发生急性横断损伤时，病灶节段水平以下呈现弛缓性瘫痪、感觉消失和肌张力消失，不能维持正常体温，大便滞留，膀胱不能排空以及血压下降等，总称为脊髓休克。损伤一至数周后，脊髓反射始见恢复，如肌力增强和深反射亢进，对皮肤的损害性刺激可出现有保护性屈反射。数月后，比较复杂的肌反射逐渐恢复，内脏反射活动，如血压上升、发汗、排便和排尿反射也能部分恢复。膀胱功能障碍一般分为三个阶段，脊髓横断后，由于膀胱逼尿肌瘫痪而使膀胱括约肌痉挛，出现尿潴留；2～3周以后，由于逼尿肌日益肥厚，膀胱内压胜过外括约肌的阻力，出现溢出性尿失禁；到第三阶段可能因腹壁肌挛缩，增加膀胱外压而出 现自动排尿。 脊髓半侧切断综合症表现为病灶水平以下，同侧以上运动神经元麻痹，关节肌肉的振动觉缺失，对侧痛觉和温度觉消失；在病灶侧与病灶节段相当，有节段性下运动神经元麻痹和感觉障碍。由于切断后索，病灶节段以下，同侧的本体感觉和两点辨别觉消失。由于切断锥体束，病灶节段水平以下，同侧出现上运动神经元瘫痪；由于锥体外系统的抑制作用被阻
常见血液病的诊断与鉴别诊断
常见血液病的诊断与鉴别诊断 Hb<120g/L ，女性 <110g/L ，孕妇 <100g/L Hb ：≤ 30g/L Hb ：31～60g/L Hb ：61～90g/L Hb ：<90g/L 贫血是一组症状，不是疾病名称。贫血的病因诊断非常重要。 、贫血的分类 三、缺铁性贫血的诊断与鉴别诊断 （一）诊断 ： 1、存在缺铁的病因 ：慢性贫血、需要量增加摄入不足、吸收不良 2、缺铁的临床表现：贫血、毛发、反甲、异食癖等 3、血象特点：小细胞低色素性贫血 4、骨髓象特点：铁染色（－） 、幼红细胞 5、铁代谢检查：血清铁↓、总铁结合力↑、转铁蛋白饱和度↓ <15 ％ 6、贮备铁缺乏：骨髓外铁（－） 、血清铁蛋白（ SF ） <14μ g/L 、贫血概论 贫血的标准：成人男性 贫血程度：极重度贫血 重度 中度 轻度
7、红细胞原扑啉升高 8、铁剂治疗有效 四、巨幼细胞性贫血的诊断和鉴别诊断 （一）诊断 1、病史：叶酸和VitB12 缺乏的病因 （1）摄入不足：婴幼儿、喂养不当、素食者、食品加工不当等 （2）需要量增加：婴幼儿、妊娠、甲亢、肿瘤、溶血等（3）吸收不良：内因子缺乏、胃肠疾病、手术 2、临床表现：（1）贫血（2）消化道症状及体征：口炎、舌炎、牛肉舌（3）神经系统表 现：末梢神经炎、椎体束征（少）；恶性贫血多见 3、血象特点：（1）大细胞性贫血：MCV↑（2）白细胞、血小板减少（3）中性粒细胞分 叶过多 4、骨髓特点：巨幼红、巨幼粒（幻灯122、126） 5、叶酸和VitB12 测定：降低 6、治疗观察 （二）鉴别诊断1、再障2、溶贫3、MDS 五．阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH ）（一）诊断标准：１．临床表现：夜间发作性酱油色尿；贫血 ２．实验室检查：（１）酸化血清溶血试验（Hams 试验），糖水试验，蛇毒因子溶血试验，尿潜血（或尿含铁血黄素）等试验中凡符合下列任何一项即可诊断: 1）两项以上阳性. 2）一项阳性，但须具备下列条件：①两次以上阳性，或一次阳性，但结果可靠．②有溶血的其他证据（如网织红细胞增高，血中间接胆红素增高等）．③能除外其他溶血（如球形红细胞增多症，自身免疫性溶血性贫血，G6PD 酶缺乏症，阵发性冷性血红蛋白尿等）． （２）流式细胞仪检查发现：外周血中CD59或CD 55阴性，中性粒细胞或红细胞>10%. 临床表现符合，实验室检查结果具备（１）或（２）项者皆可诊断． （二）鉴别诊断：１．其他溶血性贫血２．再障３．MDS 六．骨髓增生异常综合（ＭＤＳ） （一）诊断要点１．临床表现常以贫血为主，可伴有发热或出血，早期可无症状．２．外周血一系或多系减少．３．骨髓有核细胞常增多，髓系细胞一系或多系呈病态造血形态学表现．４．能除外巨幼贫，溶贫，中毒，病毒感染等引起的血细胞发育异常．５．其他检测：如骨髓组织切片，染色体，癌基因等．（二）分型： １．FAB 分型：难治性贫血（RA）；难治性贫血伴环状铁粒幼细胞（RARS）；难治性贫血伴有原始细胞过多（RAEB）；转化中的RAEB （RAEB-t）；慢性粒单核细胞白血病（CMML）２．WHO 分型：取消RAEB-t ，归为AML;取消CMML ，增加一个难治性血细胞减少伴有多系发育异常（RCMD ）新亚型;增加５q-综合征;MDS 不能分类亚型． 七、再生障碍性贫血的诊断和鉴别诊断 （一）诊断 1、贫血、出血、感染的症状、体征（慢性与急重症再障不同） 2、骨髓增生低下，非造血组织增多，巨核少或无 3、全血细胞减少，网织红细胞绝对值减少 4、能除外其他全血细胞减少的疾病 5、一般贫血药物治疗无效 6、再障分型：急性型：重Ⅰ、Ⅱ型慢性型：包括重Ⅱ型急、慢性再障的鉴别
大鼠骨髓巨噬细胞的分离_纯化_培养以及鉴定_李静
文章编号:0253-3626(2003)04-0436-04 大鼠骨髓巨噬细胞的分离,纯化,培养以及鉴定 李静,王亚平 (重庆医科大学基础医学院组胚教研室,重庆400016) =摘要>目的:为深入研究骨髓巨噬细胞的生物学功能,探索一种简便的骨髓巨噬细胞的分离,纯化和培养的方法。方法:分离获取大鼠骨髓细胞,在60%DM EM培养液,20%马血清,20%(v/v)L929培养上清的诱导条件下进行体外贴壁培养,6~7天时获得纯度较高的贴壁细胞。采用倒置显微镜下观察生活状态、Wr ight c s染色光镜观察、电子显微镜观察检测贴壁细胞形态学;酸性磷酸酶及非特异性酯酶染色测定细胞内酶的表达;吞噬鸡红细胞及墨汁颗粒实验检测其吞噬功能;免疫细胞化学染色观察细胞表面标志等生物学技术鉴定培养的贴壁细胞性质。结果:获得高纯度的巨噬细胞,且具有良好的吞噬功能,并且具备巨噬细胞的形态特征,特有的水解酶类及特有的表面标志-CD68。结论:本法是一种简易实用的体外分离、纯化、培养骨髓巨噬细胞的方法。 =关键词>骨髓巨噬细胞;分离;纯化;鉴定 =中国图书分类法分类号>R32.43=文献标识码>A=收稿日期>2002-09-24 Methodology of separation,purification,cultivation an d identification of rat bone marrow macrophage LI Jing,et al (Dep artment o f Histolo gy and Embry ology,College of Basic Medical Sciences,Chongqing Medical University) =Abstract>Obj ective:T o study t he biolo gical functions of bone marrow macrophage(BM M5)and to establish the methodolog y of separation,purification,cultivation and identification of BM M5.M ethods:Using the techniques of anchorage-dependent culture of separated r at bone marrow cell(rBM C)in DM EM culture media(contain20%horse serum,20%(v/v)L929conditioned media)in v itro,a lo t o f purified anchor cells were obtained,and t hese cells were identified wit h specifically biological mar ker of macrophage, such as1,morpholog ical obser vation:invert phase contrast microscopy,light and electron microscopy;2,enzyme cytochemistr y:acid phosphatase(A CP),A-acet ic acid naphthol esterase(A-AN E);3,phagocytic exper iment:phag ocy tosis of chicken er ythrocy tes and prepared Chinese ink;4,immunocytochemistry:surface specific antig en of macrophage(CD68stain).Results:T he cells w er e purified having functional satisfactory macrophage acco rding to morphological observation,enzyme cytochemistr y,phag ocyt ic ex periment and immunocytochemistry.Conclusion:T his is a simple and easy method for separation,purification,cultivation and identificat ion of rat marro w macrophage. =Key w ords>Bone marr ow macro phag e;Separation;Purification;I dentification 巨噬细胞是机体的重要防御细胞。大量研究已证明[1,2],巨噬细胞在吞噬与清除异物和衰老死亡细胞、分泌生物活性物质,调节血细胞生成与参与免疫应答等方面发挥着广泛的生物学作用。深入研究巨噬细胞的生物学功能不仅能阐述诸多生理与病理生理学机理,而且对临床相关疾病的治疗也有重要价值。深入探讨巨噬细胞生物学功能的前提或核心 作者介绍:李静(1973-),女,讲师,硕士, 主要研究方向:血细胞发生及其调控机理。问题是如何获得高纯度、高活性的巨噬细胞。尽管国内外不少文献报道[3,4]已能从多种组织和器官中分离、纯化巨噬细胞,但这些方法十分繁琐、复杂,且所需时间较长,耗资较大。为研究一种既简便又经济的巨噬细胞分离与纯化的方法,我们通过诱导骨髓细胞分化,成功的建立了骨髓巨噬细胞的分离、纯化、培养和鉴定方法,为研究巨噬细胞的生物学功能奠定了基础。