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Ang1-Akt途径对大鼠体外血-脊髓屏障功能的调节5

脊椎动物的血-脊髓屏障(blood-spinal cord barrier ,BSCB )是血脑屏障(blood-brain barrier ,BBB )的延伸,是中枢神经系统特有的屏障结构。

BSCB 由脊髓微血管内皮细胞(spinal cord mi -

crovascular endothelial cell ,SCMEC )间的紧密连

接及星形胶质细胞周足构成,可有效地阻止血液Ang1-Akt 途径对大鼠体外血-脊髓屏障功能的调节

刘欣春*,李

杰,裴

磊,王

森,彭云飞

(中国医科大学附属第一医院骨科,中国辽宁沈阳110001)

要:检测血管生成素1(angiopoietin1,Ang1)对体外培养脊髓微血管内皮细胞(spinal cord microvascular en ?

dothelial cell ,SCMEC )屏障功能的调节机制。体外分离培养大鼠SCMEC 及胶质细胞,通过双室培养系统建立体

外血-脊髓屏障(blood-spinal cord barrier ,BSCB )模型;分别用Ang1及Ang1+wortmannin (Akt 抑制剂)处理培养

细胞,Western-blot 检测Akt 及连接蛋白质的表达;放射自显影检测Akt 激酶活性变化;测定跨内皮电阻(TEER )反映各组细胞屏障功能;细胞免疫荧光检测连接蛋白在细胞接触面的分布变化;免疫共沉淀实验分析连接蛋白之间的相互作用改变。结果显示,Ang1处理组细胞Akt 活性及TEER 值均有明显升高,Ang1处理后ZO-1及VE-cadherin 在细胞连接处的分布增强,occludin/ZO-1、VE-cadherin/β-catenin 之间的相互作用均较对

照组显著增强,且以上Ang1处理所引起的SCMEC 功能改变均可被wortmannin 所拮抗。表明Ang1通过Akt 活性调节SCMEC 连接蛋白的分布及相互作用,从而影响体外BSCB 的屏障功能。关键词:血-脊髓屏障;血管生成素1(Ang1);Akt 中图分类号:R338.2+1

文献标识码:A

文章编号:1007-7847(2015)03-0218-06

Ang-Akt Pathway Modulates the Function of Blood-Spinal Cord Barrier in Rat

LIU Xin-chun *,LI Jie,PEI Lei,WANG Sen,PENG Yun-fei

(Department of Orthopedics,First Affiliated Hospital,China Medical University,Shenyang 110001,Liaoning,China )

Abstract:To investigate the mechanism through which Ang1regulates the barrier function of cultured

SCMEC.Rat SCMECs and glial cells were isolated and the in vitro BSCB model was established by the bi -cameral culturing system.Cells were treated with Ang1or Ang1+wortmannin (the Akt inhibitor)and the pro -

tein level of pAkt,Akt and junction proteins were detected by Western-blot.Autoradiography was applied to detect the change of Akt activity.TEER in different groups was quantified to reflect the barrier function of SCMEC.The distribution of junction protein at cell contacts was detected by immunofluorescence.Co-im -munoprecipitation was used to detect junction protein interactions.The results showed that both the Akt activ -ity and TEER of the SCMEC increased significantly after Ang1treatment.The distribution of ZO-1and VE-cadhirin at cell junctions and their respective interactions with occludin and β-catenin were also enhanced in Ang1group.Furthermore,all the above effects of Ang1were found to be antagonized by wortmannin.These

results indicate that Ang1could regulate the barrier function of BSCB in vitro through Akt activity.Key words:blood-spinal cord barrier;angiopoietin 1(Ang1);Akt

(Life Science Research ,2015,19(3):218~223)

收稿日期:2015-01-24;修回日期:2015-03-12

基金项目:辽宁省自然科学基金资助项目

(2014021062)作者简介:*

刘欣春(1978-),男,辽宁辽阳人,副教授,通讯作者,主要从事干细胞及脊髓损伤研究,E-mail:xcliu@http://www.wendangku.net/doc/67c38a0c3186bceb19e8bbe5.html 。

第19卷第3期生命科学研究Vol.19No.32015年6月Life Science Research Jun.2015

第3期

中的大分子进入脊髓实质,为中枢神经系统提供稳定的微环境[1]。现有研究表明,多种脊髓病变与

BSCB屏障功能异常有关,如创伤性脊髓损伤[2,3]、放射性损伤[4]、肌萎缩性脊髓侧索硬化症[5,6]、感染[7]等。内皮细胞间的连接蛋白及细胞骨架是构成内皮细胞屏障的主要分子基础,其表达量、分布及相互作用的改变是导致内皮细胞通透性增高的直接原因[8]。

血管生成素(angiopoietin,Ang1)是一种有效的血管生成因子,参与血管生成的各个阶段,许多其他血管生成因子可通过Ang1诱导新血管的生成。在血脑屏障,Ang1作用于Tie-2酪氨酸激酶受体,参与维持屏障完整性及血管稳定[9,10];近期有研究报道,Ang1可通过上调紧密连接蛋白ZO-2(zonula occludens-2)稳定脑微血管内皮细胞[11]。在非中枢神经系统微血管内皮细胞,Ang1可通过PI3K/Akt途径发挥抗凋亡[12]及维持血管稳定性的作用[13]。本研究以分离培养的大鼠SCMEC为研究对象,在体外建立BSCB模型,探讨Ang1-Akt途径对血脊髓屏障的通透性影响并初步分析其作用机制。1材料与方法

1.1实验动物与试剂

成熟Sprague-Dawley大鼠(275~300g)由中国医科大学实验动物部提供。DMEM/F12培养基为Sigma公司(美国)产品;碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素1(Ang1)购自Peprotech公司(美国);Wort-mannin购自Gene Operation(中国);蛋白G琼脂糖购自Pierce公司(美国);PKA抑制肽购自Merck Millipore公司(德国);组蛋白H2B为Enzo Life Sciences公司(瑞士)产品;[γ-32P]ATP购自北京福瑞生物科技有限公司(中国);兔IgG、兔抗大鼠occludin、ZO-1、β-catenin抗体、驴抗兔IgG (FITC)、Prolong Gold Antifade封片剂购自Invit-rogen公司(美国);山羊抗大鼠Akt1、β-actin、兔抗大鼠pAkt抗体、牛抗山羊IgG(HRP)、牛抗兔IgG (HRP)购自Santa Cruz公司(美国);兔抗大鼠VE-cadherin购自Abcam公司(美国);DC蛋白定量试剂盒购自Bio-Rad公司(美国);增强型化学发光试剂盒购自Pierce公司(美国);其他常规试剂为Sigma公司(美国)产品。

1.2主要仪器设备

Millicell ERS-2细胞电阻仪;Millipore Milli-cell插入式细胞培养皿;Beckman液闪计数仪;Bio-Rad电泳仪及电泳槽;Eppendorf台式低温离心机;苏净VS-1300U超净台;Thermo Scientific Series8000CO2细胞培养箱;Olympus BX51荧光显微镜。

1.3实验方法

1.3.1大鼠脊髓微血管内皮细胞(SCMEC)的分离培养

按本实验室常规方法分离培养大鼠SCMEC。成熟SD大鼠CO2窒息处死,手术分离椎管后注射冷D-Hanks液以分离脊髓组织,去除脑脊膜及大血管。冷DMEM/F12培养液中剪碎组织至1mm3大小,冰上匀浆后于37℃水浴胶原酶Ⅱ消化30min。消化产物200g离心5min,22%BSA 重悬组织沉淀,2000g离心10min,弃上层髓磷脂成分,DMEM/F12清洗下层血管组织。无菌滤器(BD Falcon,295μm及40μm)依次过滤以进一步去除大血管及血细胞,收集微血管组分。0.1%胶原酶及脂肪酶于37℃消化脊髓微血管30min,间歇搅拌并镜下观察,待内皮细胞出芽呈串珠样时1000×g离心5min终止消化。SCMEC培养液(DMEM/F12、10%胎牛血清、10%马血清、2mmol/L 谷氨酸钠、1g/L肝素、1μg/L bFGF、10μg/L VEGF、50mg/L庆大霉素、3μmol/L嘌呤霉素)重悬消化后的微血管组分,接种于预铺IV型胶原及纤连蛋白(均为5μg/cm2)的培养平板,接种密度为1×104/cm2。培养6d待细胞融合成单层后常规免疫荧光观察因子Ⅷ表达情况,确定SCMEC分离培养纯度﹥95%。

0.125%胰酶(含0.02%EDTA)消化SCMEC,按不同密度进行传代:1)1∶1接种于6孔培养板,用于蛋白样品制备;2)1:5接种于6孔培养板(内预置盖玻片),用于细胞免疫荧光;3)1∶1接种于Millicell插入小室,置于24孔板(预铺胶质细胞)中,用于跨内皮电阻(TEER)测定。所有培养细胞于37℃5%CO2培养箱中培养7d,每2~3d更换培养液。

1.3.2血管生成素1(Ang1)处理培养细胞

为检测Ang1对体外SCMEC屏障功能的影响,于培养第7d用Ang1(0.1mg/L)或Ang1(100mg/L)+Wortmannin(0.1μmol/L)处理细胞12h,于不同时间点(0、4、8、12h)测量Ang1处理后跨内皮电阻变化,并收集SCMEC进行激酶活性测定及免疫印迹等检测。

刘欣春等:Ang1-Akt途径对大鼠体外血-脊髓屏障功能的调节219

生命科学研究2015年

1.3.3Akt激酶活性测定

通过测定Akt底物蛋白H2B的磷酸化状态反映Akt激酶活性,具体如下:收集SCMEC制备蛋白裂解液,蛋白G琼脂糖4℃预孵育30min后加入抗Akt抗体免疫沉淀2h,离心后依次用裂解液、纯水及激酶反应液(50mmol/L HEPES、10mmol/L MnCl2、10mmol/L MgCl2、1mmol/L二硫苏糖醇、1μmol/L PKA抑制剂,pH7.2)清洗沉淀。在反应液中加入20μCi/mL[γ-32P]ATP及0.2g/L组蛋白H2B,30℃孵育10min。取25μL反应液滴于Whatman p81阳离子交换滤纸,5%磷酸溶液终止反应,充分清洗后放入含10mL蒸馏水的液闪瓶内,Beckman 液闪计数仪测定cpm值。

此外,本研究亦采用放射自显影检测Akt激酶活性,即在上述激酶反应液中加入50μCi/mL [γ-32P]ATP及组蛋白底物,30℃孵育30min后用SDS样品缓冲液终止反应,SDS-PAGE分离蛋白成分后放射自显影观察H2B的磷酸化状态。1.3.4跨内皮电阻(TEER)测定

使用Millicell ERS-2细胞电阻仪测量双室培养系统中SCMEC跨内皮电阻值,以反映其内皮屏障功能及通透性。在Ang1处理后不同时间点(每个时间点设置3个平行孔),将正负电极分别置于培养内室及外室,记录待测孔电阻值(Ru),按公式TEER=(Ru-Rc)×S计算各组TEER 值(Ω·cm2),其中Rc为未接种细胞空白孔电阻值,S为培养面积。

1.3.5免疫印迹及免疫共沉淀

收集各组SCMEC,Nonidet P-40裂解液(50mmol/L Tris,150mmol/L NaCl,2mmol/L EG-TA,10%glycerol,1%Nonidet P-40,2mmol/L PMSF,1mmol/L Na3VO4,1μg/mL亮肽素,1mg/L 抑肽酶,pH7.4)处理后提取总蛋白,BCA定量法测定蛋白浓度后制备蛋白样品。每组按30μg上样量进行SDS-PAGE电泳分离蛋白成分,转印至PVDF膜,50g/L脱脂奶粉封闭,依次经一抗、二抗孵育后进行ECL显色(β-actin做为内参照)。

免疫共沉淀实验中每组取400μg蛋白裂解液,用2μg兔IgG进行预处理,加入蛋白A琼脂糖珠离心后,取上清加入2μg IP抗体(ZO-1或VE-cadherin,另设无IP抗体IgG对照),室温于旋转混匀过夜,加入蛋白A琼脂糖珠沉淀抗原抗体复合物,离心后用上样缓冲液处理琼脂糖珠,煮沸变性,SDS-PAGE分离蛋白后按上述方法进行

免疫印迹分析(抗occludin或抗β-catenin抗体)。

1.3.6细胞免疫荧光

4%多聚甲醛固定经Ang1处理12h后的SCMEC,0.1%Triton-100通透,5%牛血清白蛋白封闭,依次经抗ZO-1或VE-cadherin抗体及FITC标记IgG孵育后,Prolong Gold Antifade封片剂(含DAPI)封片,于Olympus BX51荧光显微镜下观察结果。

1.3.7统计学分析

本研究中TEER、免疫印迹、放射自显影等实验结果均采用GB-STAT软件(Dynamic Microsys-tems)进行双因素方差分析及Dunnett’s检验,P< 0.05为差异显著,P<0.01为差异非常显著,有统计学意义。

2结果

2.1Ang1处理增强体外培养SCMEC中Akt激酶活性

体外分离大鼠脊髓微血管内皮细胞(SCMEC),建立体外血-脊髓屏障。由于在培养的内皮细胞系中Ang1可通过Akt-PI3K途径影响内皮细胞活力及血管生成过程[1],在本研究中我们首先检测了Ang1对SCMEC中Akt活性的影响。分别用Ang1、Ang1+Wortmannin(WM,PI3K/ Akt途径抑制剂)处理传代培养第7d的SCMEC 单层,预处理后0h、4h、8h、12h收集各组细胞。免疫印迹结果显示,Ang1处理4h后,Akt1磷酸化水平与对照组相比有明显升高,Wortmannin则可抑制Ang1引起的Akt1磷酸化(图1A、C);以组蛋白H2B 为底物,放射自显影(图1B)及液闪计数(图1D)均显示Ang1处理后,Akt活性有显著增高。该结果说明,Ang1在本研究分离培养的SCMEC中可以活化Akt,且该作用可被Wortmannin所抑制。

2.2Ang1通过影响Akt活性增强体外培养SCMEC屏障功能

为确定Ang1-Akt通路对BSCB屏障功能的影响,在Ang1处理双室培养的SCMEC后不同时间点测定跨内皮电阻(TEER)。结果显示,Ang1处理后4h,SCMEC单层上皮TEER值与对照组相比明显升高,即Ang1可增强体外培养SCMEC屏障功能;此外,该效应可被Wortmannin所拮抗,即与Ang1处理组相比,Ang1+WM组TEER值有所下降(图2)。该结果表明,Ang1可能通过影响Akt 活性增强体外培养SCMEC屏障功能。

220

第3期

Ang1-Akt途径对大鼠体外血-脊髓屏障功能的调节5

图1Ang1处理增强培养SCMEC 中Akt 的活性

(A,C)Western 印迹检测各处理组Akt1的磷酸化水平变化;(B,D)以H2B 为底物,放射自显影(B)或液闪计数(D)检测各处理组Akt1的活性改变。**P <0.01,与对照组相比较;#P <0.05,##P <0.01,与Ang1组相比较。WM :Wortmannin 。Fig.1Enhancement of Akt activity in cultured SCMEC after Ang1treatment

(A,C)Western blot analysis of the phosphorylation state of Akt1;(B,D)Autoradiography(B)and scintillation counting (D)to de ?tect Akt1activity using H2B as the substrate.**P <0.01,compared with vehicle control;#P <0.05,##P <0.01,compared with Ang1group.WM:Wortmannin.

2.3Ang1-Akt 通路影响连接蛋白在SCMEC 细胞连接处的分布

为进一步明确Ang1-Akt 途径影响SCMEC

屏障功能的机制,我们检测了几种细胞连接蛋白

(occludin 、ZO -1、VE -cadherin 、β-catenin 等)经Ang1处理后在细胞连接处的分布变化。

为更清晰地观察细胞接触面,我们在细胞免疫荧光试验中

采用1∶5比例进行传代培养,在该培养条件下,

SCMEC 大多(>60%)呈现多角形。结果表明,

紧密连接蛋白ZO-1及粘着连接蛋白VE-cadherin 在

Ang1处理后在细胞连接处的分布显著增强,而Ang1+WM 组则无此改变(图3),提示Ang1可通

过Akt 活性影响连接蛋白在细胞表面的分布,从而增强SCMEC 的屏障功能。2.4Ang1-Akt 通路影响SCMEC 连接蛋白间的

相互作用

在观察到Ang1对ZO-1及VE-cadherin 在

细胞连接处的分布影响后,我们进一步通过免疫共沉淀检测了细胞连接蛋白间的相互作用改变。

在Ang1处理12h 后,收集SCMEC 裂解液,

统计分析Co-IP 结果显示,Ang1可以增强occludin/ZO-1及VE-cadherin/β-catenin 之间的相互作用

分别达200%及150%以上,而Ang1+WM 组与Ang1处理组相比则抑制了连接蛋白间的相互作

用,表明Ang1-Akt 途径可通过促进细胞连接复

合体的形成提高SCMEC 的内皮屏障功能(图4)。

图2Ang1处理对SCMEC 屏障功能的影响**

P <0.01,与对照组相比;#P <0.05,##P <0.01,与Ang1组相比。WM :Wortmannin 。

Fig.2The effect of Ang1on barrier function of the cul 鄄tured SCMEC **

P <0.01,compared with vehicle control;#P <0.05,##P <0.01,compared with Ang1group.WM:Wortmannin.

图3Ang1通过影响Akt 活性增强连接蛋白ZO-1及

VE-cadherin 在SCMEC 细胞连接处的分布标尺=25μm ,WM :Wortmannin 。

Fig.3Ang1intensified the distribution of ZO -1and VE-cadherin at cell junction sites via Akt in SCMEC Bar=25μm,WM:Wortmannin.

Vehicle ctrl Ang1Ang1+WM 048120

4812

04812(h)

Akt1,62kD Actin,42kD

p-Akt1,62kD (A)

(D)

20001000Time after treatment/h

Vehicle ctrl Ang1Ang1+WM 048120481204812(h)

32]-H2B

(B)

(C)

Time after treatment/h

Ang 1+WM

Vrhicle ctrl Ang 1

4

8

12

45

55

65

Time after treatment/h

Vehicle ctrl

Ang1

Ang1+WM

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生命科学研究2015年

Ang1-Akt途径对大鼠体外血-脊髓屏障功能的调节5

Ang1-Akt途径对大鼠体外血-脊髓屏障功能的调节5

3讨论

脊髓微血管内皮细胞(SCMEC )在构成血脊

髓屏障(BSCB )中的功能与脑微血管内皮细胞(BMEC )构成血脑屏障(BBB )中的作用类似,近年来在血中枢神经系统屏障的研究中建立了许多成功模拟BBB 或BSCB 的体外模型[14~16]。本研究通

过分离培养成熟SD 大鼠脊髓微血管,在适当条件下消化培养SCMEC ,经因子Ⅷ特异性抗体检

测,SCMEC 纯度可达95%[14,15];在此基础上,于双室培养系统中共培养SCMEC 和胶质细胞(已知后者可诱导中枢神经系统血脑屏障的形成[17]),通过每日测定TEER 反映内皮屏障功能,发现在该

培养条件下经6~7d 的培养,TEER 值可达45~60Ω·cm 2,表明成功建立体外BSCB 模型。

Ang 1基因位于染色体8q22,由498个氨基酸组成,主要由周细胞及血管平滑肌细胞表达,作用于内皮特异性酪氨酸激酶受体Tie-2,其同源

蛋白Ang2为其天然的竞争性拮抗剂。转基因研究证实,Ang 1基因缺失或Tie -2基因敲除的小鼠胚胎血管形成障碍、通透性增高且缺乏连续性从而不能形成血管网;而Ang 1过表达的转基因动

物则表现为血管增生变粗且内皮细胞与周细胞的连接完整[18]。Ang1在维持血管稳定性方面发挥重要作用,有报道称其中涉及Akt 介导的抗凋亡效应[9,12];此外,Ang1可通过激活磷脂酰肌醇激酶(PI3K )引起柱蛋白(paxillin )磷酸化,加强内皮-基质间的相互作用,增加内皮管状结构的完整性。在本研究中,我们首先检测了Ang1对体外培养

的脊髓微血管内皮细胞Akt 激酶活性的影响,即用Ang1处理培养SCMEC 后收集细胞裂解液,

采用[32P]-掺入试验测定激酶活性,

放射自显影及液闪计数结果均显示Ang1处理后可引起SCMEC 中的Akt 活性增高。结合以往报道,该结果提示Ang1对PI3K/Akt 途径的调节作用在内皮细胞中

是普遍存在的。在此基础上,我们又进一步检测了Ang1对体外BSCB 屏障功能的影响,TEER 测定

结果表明Ang1处理4h 后,SCMEC 屏障功能显著增强,同时发现该作用可被PI3K/Akt 途径特异性抑制剂Wortmannin 所拮抗,说明Ang1可通过影响Akt 活性调节BSCB 功能,降低其通透性,维持BSCB 的稳定。

在内皮屏障结构中,相邻内皮细胞间的细胞连接的形成及完整性对内皮通透性的维持至关重要。因此,我们检测了Ang1处理后几种连接蛋白

(occludin 、ZO -1、ZO -2、VE -cadherin 、β-catenin )

的表达情况,免疫印迹结果显示无明显改变,说明Ang1不是通过影响连接蛋白的表达量调节BSCB

的通透性。进一步通过免疫荧光技术发现,Ang1处理后支架蛋白ZO-1与钙黏蛋白VE-cadherin

在细胞接触面的分布明显增加;

此外,紧密连接蛋白occludin 与ZO-1,以及VE-cadherin 与连环蛋白β-catenin 之间的相互作用也在Ang1处理后

增强,

且Ang1所引起的效应均可被PI3K-Akt 途径抑制剂Wortmannin 所抑制。综上结果表明,Ang1可通过Akt 改变连接蛋白在SCMEC 细胞连接处的分布状态,并影响连接蛋白之间的直接作用,从而改变BSCB 的通透性及屏障功能,该结论仍需进一步在体内研究中进行验证。此外,Ang1还可通过其他途径参与维持血管稳定性及诱导新血管生成,如有研究表明Ang1可促进胞浆素和金属基质蛋白酶-2(MMP-2)的分泌和基底膜的降解,从而促进内皮迁移和管状结构生成,还可通过降低血小板内皮细胞粘

附分子(PECAM )的磷酸化加强内皮间的连接,维持微血管壁的完整性[19]等等,这些信号转导分子

图4Ang1通过影响Akt 活性增强连接蛋白occludin/

ZO-1及VE-cadherin/β-catenin 之间的相互作用**

P <0.01,与对照组相比;##P <0.01,与Ang1组相比。WM :Wortmannin 。

Fig.4Ang1enhances the interactions between occludin and ZO-1and between VE-cadherin and β-catenin via influencing Akt activity **

P <0.01,compared with vehicle control;##P <0.01,compared with Ang1group.WM:Wortmannin.

β-catenin,92kD

IP:

IB:

ZO-1

VE-cadherin

Occludin,65kD lgG L ,23kD

lgG H ,50kD

(B)

222

第3期

在Ang1调节BSCB屏障功能的过程中是否发挥作用仍需进一步的研究阐明。

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(上接第212页)

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