几种PCR扩增的比较

普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的基本原理和操作步骤

普通PCR

1概述

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称Taq polymerase), 则是于1976年从温泉中的细菌（Thermusaquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由Dr. KjellKleppe提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与Saiki 等人正式发表了第一篇相关的论文。此后，PCR 的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。

2 PCR原理

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

3. PCR反应体系与反应条件

3.1标准的PCR反应体系

10×扩增缓冲液10μl

4种dNTP混合物200μl

引物10～100μl

模板DNA 0.1～2μg

Taq DNA聚合酶2.5 μl

Mg2+ 1.5mmol/L

加双或三蒸水100 μl

3.2 PCR反应五要素

参加PCR反应的物质主要有五种即引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链)、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+)。

［PCR步骤］标准的PCR过程分为三步：

1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA

2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP 为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。

每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

4 PCR反应特点

4.1特异性强

PCR反应的特异性决定因素为：

②底物与模板DNA特异正确的结合；

②碱基配对原则；

③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；

④基因的特异性与保守性。

其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。

4.2灵敏度高

PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(μg=10-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。

4.3简便、快速

PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。

4.4对标本的纯度要求低

不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。

5 PCR常见问题

5.1假阴性，不出现扩增条带

PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度：M g2+浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率，退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度。

靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

5.2假阳性

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR 扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，

防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

5.3出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+浓度过高、退火温度过低，及PCR 循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。

5.4出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。

原位PCR

在科学研究中，每一项新技术的创立都会带来一系列新的研究成果问世，从而推动着各学科的发展。纵观形态研究领域，50年代电子显微镜引入形态学观察领域，带来了从细胞水平到亚细胞水平的深入研究；60-70年代，免疫组织化学与免疫细胞化学技术的广泛应用，又将观察的水平由亚细胞结构推向了蛋白质分子水平，使细胞内众多的活性物质得以进行细胞或亚细胞水平的定位，对医学生物学的发展无疑产生了深刻的影响。70年代，分子生物学技术在形态学中的广泛应用，随着原位杂交技术的出现，使组织细胞内特定的DNA或RNA序列能够被定位，将蛋白质水平又提高到基因水平即核酸分子的观察和定位，从而使人类对许多生命现象在基因水平上的认识得以深化；80年代，分子生物学领域中一项具有强大生命力的技术PCR——多聚酶链反应技术问世了，很快地就被引入形态学观察的领域，使细胞内低拷贝或单拷贝的特定DNA或RNA得以进行定位及观察。这一技术的问世，必将带来更多的研究成果，使形态学的研究又向前迈出一大步。

1基本原理

原位PCR技术的基本原理，就是将PCR技术的高效扩增与原位杂交的细胞定位结合起来，从而在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定的DNA或RNA序列。PCR技术是在DNA聚合酶的作用下，经过模板的变性、退火和引物延伸三种循

环，将引物引导下的特异性靶序列迅速地进行扩增，经过扩增的靶序列（一般能扩增106倍），很容易在凝胶电泳或Southern印记杂交中显示出来，因此，PCR 技术具有灵敏度高，特异性强的优势，随着热循环自动化的提高与稳定也使得PCR技术的操作简便易行。但是，PCR技术是在液相中进行的，在扩增前，需将细胞破坏，从中提取核酸作为模板，因此很难将PCR的结果与组织细胞的形态结构联系起来，同时，也很难判断含特异性靶序列的细胞类型。

原位PCR技术成功地将PCR技术和原位杂交技术结合起来，保持了两项技术的优势又弥补了各自的不足。原位PCR技术的待检标本一般先经化学固定，以保持组织细胞的良好形态结构。细胞膜和核膜均具有一定的通透性，当进行PCR扩增时，各种成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可进入细胞内或细胞核内，以固定在细胞内或细胞核内的RNA或DNA为模板，于原位进行扩增。扩增的产物一般分子较大，或互相交织，不易穿过细胞膜或在膜内外弥散，从而被保留在原位。这样原有的细胞内单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指数极扩增，扩增的产物就很容易被原位杂交技术检查。

2基本类型

根据在扩增反应中所用的三磷酸核苷原料或引物是否标记，原位PCR技术可分为直接法和间接法两大类，此外，还有反转录原位PCR技术等。

2.1直接法原位PCR技术

直接法原位PCR技术是将扩增的产物直接携带标记分子，即使用标记的三磷酸腺苷或引物片断。当标本进行PCR扩增时，标记的分子就掺入到扩增的产物中，显示标记物，就能将特定的DNA或RNA在标本（原位）中显现出来。

常用的标记物有放射性同位素35S，生物素和地高辛，用放射性自显影的方法或用亲和组织化学及免疫组织化学的方法去显示标记物所在位置。

直接法原位PCR技术的优点是操作简便，流程短，省时。缺点是特异性较差，易出现假阳性，扩增效率也较低，特别是在石蜡切片上，上述缺点更为突出。因为在制片过程中，无论是固定，脱水还是包埋，都会导致DNA的损害，而受损的DNA可利用反应体系中的标记三磷酸核苷进行修复，这样标记物就会掺入到DNA 的非靶序列中，造成假阳性。若用标记引物的方法进行直接法原位PCR，其扩增的效率比不标记更低。

2.2间接法原位PCR技术

间接法原位PCR技术师现在细胞内进行特定DNA或RNA扩增，再用标记的探针进行原位杂交，明显提高了特异性，是目前应用最为广泛的原位PCR技术。

间接法原位PCR与直接法不同的是，反应体系与常规PCR相同，所用的引物或三磷酸腺苷均不带任何标记物。即实现先扩增的目的，然后用原位杂交技术去检测细胞内已扩增的特定的DNA产物，因此，实际上是将PCR技术和原位杂交技术结合起来的一种新技术，故又称之为PCR原位杂交(PCR in situ hybridization , PISH)。

间接法PCR技术的优点是特异性较高，扩增效率也较高。缺点是操作步骤较直接

法繁琐。

2.3原位反转录PCR技术

原位反转录PCR(in situ reverse transcription PCR, In Situ RT-PCR)是将液相的RT-PC 技术应用到组织细胞标本中的一种新技术，与RT-PCR（液相）不同点在于，进行原位反转录PCR反应之前，组织标本要先用DNA酶处理，以破坏组织中的DNA 酶，这样才能保证扩增的模板是从mRNA反转录合成的cDNA，而不是细胞中原有的DNA。其它基本步骤与液相的RT-PCR相似。

3基本步骤

原位PCR技术的基本步骤包括标本的制备。原位扩增（PCR）及原位检测等基本环节，现分述如下（重点以石蜡切片为例）。

3.1标本的制备

原位PCR技术可应用于细胞悬液、细胞涂片、冰冻切片以及石蜡切片。相比较而言，以悬浮的完整细胞做原位PCR效果最好，石蜡切片效果最差。随着技术方面的一些问题被解决，近年也有从石蜡切片中得到满意的PCR效率的报道。效果不好的原因是多方面的，如：玻片上做PCR，热传导较差，热对流不均匀，TaqDNA 酶被玻璃片吸附等，更为主要的原因，可能是标本经制片后，细胞缺乏完整的胞浆或核膜，扩增产物易发生弥漫而导致扩增的产物在原位不易保留。绝大多数的病理标本都是以福尔马林固定，石蜡包埋的形式保存的，若能很好地解决石蜡切片原位PCR的有关技术问题，意义显然是十分重大的。

组织细胞的固定:一般认为组织细胞以10%的缓冲福尔马林或4%的多聚甲醛固定后进行原位PCR效果较好。固定的时间一般不宜过长，视组织的大小，一般以4℃4-6小时为宜。

切片的厚度:一般而言，切片若厚一些，原位PCR的效果也较好一些，因为切片越厚，靶DNA的含量也就越多，同时膜结构也较多，防止扩增产物弥散的作用也越明显。但厚切片细胞重叠多，形态学观察的效果就差了，分辨率也将下降。玻片的处理:为防止石蜡切片在PCR和原位杂交过程中脱落，在玻片应作防脱片处理，常用的方法是涂以多聚赖氨酸或用硅烷化处理，一般能防止组织脱落。蛋白酶的消化作用:在进行原位扩增之前，组织标本需经蛋白酶处理。经蛋白酶消化的组织细胞，可增加其通透性，充分允许反应体系中的各成分进入细胞内，并能很好的暴露靶序列，以利于扩增。常用的蛋白酶有蛋白酶K，胰蛋白酶或胃蛋白酶。蛋白酶消化的程度就要根据组织固定的程度进行调整。蛋白酶消化后，要注意加热以灭活酶的活性或通过充分的洗涤将酶完全去除，因为只要有少量的残留酶存在，都将对随后进行的PCR反应体系的数量TaqDNA酶产生毁灭性的影响。蛋白酶消化处理组织细胞可提高通透性，有利于后续进行的各反应成分进入细胞内或核内，但同时也使得扩增产物的弥散机会增多，有可能带来假阳性或假阴性的结果。

原位扩增（PCR）

原位扩增即在组织细胞标本上进行PCR反应，其基本原理与液相PCR完全相同。

引物:PCR所用的引物一般为15-30bp为宜，扩增的片断为100-1000bp左右。原位PCR宜用较短的引物。从石蜡切片中提取的DNA很少超过400bp，RNA很少超过200bp，较长序列的扩增易引起引物与模板的错配而导致非特异性反应的出现。

反应体系:原位PCR的反应体系与常规的液相PCR基本相同，由于是在经过固定的组织切片上进行，为获得较好的扩增效果，有人主张反应体系中的引物，TaqDNA聚合酶以及Mg2+的浓度均应高于液相的PCR反应体系。在反应体系中要加入牛血清白蛋白（BSA）,以防止TaqDNA聚合酶与玻片的结合而降低了扩增效率。

热循环:原位PCR的热循环可在专门的热循环仪上进行，操作简便。也可在一般的PCR热循环仪上进行，通常在样品台上覆盖一层铝箔，制成平台，样品台上的空间用矿物油或水充填，将载玻片至于平台上，即可进行热循环的步骤。

为了保证进行充分的扩增，原位PCR热循环中每一步骤的时间可比常规PCR略长些，另外，也可采用热启动（hot start）的方法，即玻片加热到80-94℃时，再立即加入TaqDNA聚合酶。为了保证反应体系在热循环过程不过多丢失，可用清亮的指甲油，矿物油或PAP笔把盖片四周封闭起来。

洗涤:原位扩增结束后，标本应清洗，以除去弥散到细胞外的扩增产物。洗涤不充分，会导致扩增产物在检测时显现，造成背景过深或假阳性结果的出现。但是，洗涤过度，也会造成细胞内扩增的产物被洗脱，是阳性信号减弱或丢失。有作者在扩增后用4%多聚甲醛2小时或2%戊二醛5分钟进行后固定，以使扩增的产物在检测时能很好地保留在细胞内，提高检测的敏感性和特异性。

原位检测:原位PCR的扩增产物检测方法，取决于原位PCR的设计方案，直接法则根据标记分子的性质对扩增产物直接进行原位检测。间接法则需用原位杂交的方法进行检测。

4原位PCR技术的应用

原位PCR技术的突出优势，就是能在组织细胞原位检测出拷贝数较低的特异性基因序列。按照待测基因的性质，可将原位PCR的应用分为检测外源性基因和内源性基因两方面。

4.1用于外源性基因的检测

4.1.1病毒基因的检测

感染病毒的细胞常无较好的检测手段，但当原位PCR技术应用后，使这一极为困难的问题有望解决。

对HIV、HPV、HSV、HBV、HCV等多种病毒的检测，使我们能够成功等观察到这些病毒在艾滋病、生殖系统肿瘤、肝炎及肝癌中的作用，能够及时发现受感染的人群。

4.1.2细菌基因的检测

最突出的应用是在结核杆菌的检测上，当结核病变不够典型时，经过特殊染色的方法很难在镜下找到结核杆菌，而应用原位PCR技术可帮助明确诊断，当结核杆

菌很少时仍能在镜下被很容易地找出来。

4.1.3导入基因的检测

在转基因动物的研究中，是否导入了基因，在接受基因治疗的患者体内，是否接受了导入的基因，均可用原位PCR技术来证实。因此，原位PCR技术成为重要的检测手段。

4.2 用于内源性基因的检测

4.2.1异常基因的检测

机体内基因的突变、重排、也可用原位PCR技术进行检测，原癌基因，抑癌基因的突变，恶性淋巴瘤免疫球蛋白重链基因的重排，对肿瘤的研究和诊断无一均提供了广阔的应用前景。

4.2.2固有基因的检测

对于机体细胞内只有单个或几个拷贝的低表达固有基因，原位杂交技术因基因拷贝数太少而无能为力，液相PCR虽可进行扩增检测出来，但不能确定含有该基因的细胞类型，原位PCR技术则弥补了上述两种技术的不足，使得我们能够对人类各种基因进行检测，而完成人类基因图的绘制。

反向PCR

反向PCR(reverse PCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段.实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究.

反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。反向PCR可用于研究与已知DNA 区段相连接的未知染色体序列，因此又可称为染色体缓移或染色体步移。这时选择的引物虽然与核心DNA区两末端序列互补，但两引物3’端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA 分子，通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段；现已制备了酵母人工染色体（YAC）大的线状DNA片段的杂交探针，这对于转座子插入序列的确定和基因库染色体上DNA片段序列的识别十分重要。

PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，反向PCR可扩增中间一段已知序列，而两端序列未知的基因片段不扩增。

反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。反向PCR可用于研究与已知DNA 区段相连接的未知染色体序列，因此又可称为染色体缓移或染色体步移。这时选择的引物虽然与核心DNA区两末端序列互补，但两引物3’端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA 分子，通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段；现已制备了酵母人工染色体（YAC）大的线状DNA片段的杂交探针，这对于转座子插入序列的确定和基因

库染色体上DNA片段序列的识别十分重要。

该方法的不足是：①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。

②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。

利用反向PCR可对未知序列扩增后进行分析，探索邻接已知DNA片段的序列，并可将仅知部分序列的全长cDNA进行分子克隆，建立全长的DNA探针。适用于基因游走、转位因子和已知序列DNA旁侧病毒整合位点分析等研究。

用传统的缓冲液和其他提供者推荐的条件裂解DNA。反向PCR所扩增的片段的大小由PCR扩增片段的大小决定，目前，PCR扩增的实际上限为3-4kb。在许多情况下，首先需要进行Southern杂交来确定内切酶用以产生大小适于环化及反向PCR的片段的末端片段。能裂解核心区的内切酶使反向PCR只能扩增引物所定模板(依赖于引物)的上游或上游区，而不裂解核心区的酶则使两上边侧序列都扩增，并带有由内切酶和环化类型决定的接点(例如，互补突头连接与钝头连接)。对于扩增左翼或右翼序列，初试时最好靠近识别上个碱基位位的酶，并已知在核心区有其方便的裂解位点。如果用反向PCR从含有大量不同的克隆片段的同一载体中探测杂交探针，建议事先在载体中引入合适的酶切位点。

用T4连接酶在稀DNA浓度下环化更容易形成单环。在一些实验中，为产生对反向PCR大小适当的DNA片段需要两种内切酶，但这样所产生的片段末端则不适于连接，环化前需用Klenow或噬菌体T4DNA聚合酶修理(钝化)。连接前，需用酚或热变性使内切酶失活。

聚合酶链反应条件与经典所用的相同，例如，94℃-30秒变性，58℃-30秒引物退火，Taq聚合酶70℃延伸3分钟，进行30个循环。可改变PCR条件以生产特异产物。将反向PCR用于测序时，与核心区末端后部结合的扩增引物更为有用，它使测序引物扩增部分的核心序列与未知边侧序列间的接点更近，减少了扩增引物的干扰。

描述一种大聚合酶链反应应用的方法，使在已知序列的核心区边侧的未知成几何级数扩增用适当的限制性内切裂解含核心区的，以产生适合于扩增大小的片段，然后片段的末端再连接形成环状分子的引物同源于环上核心区的末端序列，但其方向性，使链的延长经过环上的未知区而不是分开引物的核心区这种反向方法可用于扩增本来就在核心区旁边的序列，还可应用于制备未知序列探针或测定边侧区域本身的上下游序列。

逆转录PCR

1概念

RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转

录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。

由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。

RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR 广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。（检测基因表达的方法，参见Northern Blot法。）

RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。时实PCR，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。

real time PCR 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。一种是在ds DNA中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。

real time PCR 与reverse transcription PCR 相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种RT PCR的组合又被称之为“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）”

2、PCR各步骤的目的

2.1预变性：

破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。使DNA充分变性，减少DNA 复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板，最好不要吝啬这个步骤。此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反应得以顺利进行。

2.2变性--退火--延伸循环：

2.2．1模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

2．2.2模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

2.2.3引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

3用PCR仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因：3.1.延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度。（当然是在反应体系一定的条件下）例如，使用taqDNA聚合酶，72度时的碱基掺入率为35-100bp/s，因此延伸速率为1kb/min。

3.2.根据延伸速率推得，扩增1kb以内的dna片段1min即可，而3-4kb则需要

3-4min，依次照推。通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min，这样做是使pcr反应完全以提高扩增产量。

3.3.继续72度延伸了10分钟除了可以使pcr反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：在用普通taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行。

限制性片段长度多态性

限制性片段长度多态性 (Restriction Fragment of Length Polymorphism,RFLP) 一基本原理 各种限制性酶能识别特定的碱基序列，并将其切开。碱基的变异可能导致切点的消失或新切点的出现，从而引起DNA片段长度和数量的差异。用特定的限制性内切酶消化目标DNA并通过电泳将长度不同的片断分开，并印记于硝酸纤维滤膜上，再与相应的探针杂交，就可以检测限制性片段长度多态性(RFLP). 二主要材料 DNA抽提用试剂，限制性内切酶，dNTP及Taq聚合酶电泳用琼脂糖或聚丙烯酰胺配制试剂，PCR扩增仪，水浴锅，电泳仪和电泳槽，硝酸纤维素滤膜或尼龙膜，探针标记物等。 三方法步骤(图1) 图1

(一) 样本DNA制备 采用常规DNA抽提的方法或DNA抽提试剂盒提取样本DNA，置低温下保存。对大多数样本而言，用于分析的样本DNA片段须先从总DNA中分离获取，并制备足够的量。为此，RFLP分析常先用PCR方法扩增目标片段。无论怎么做，必须保证DNA样本的纯度，这一点是非常重要的。 (二) 限制性内切酶降解样本DNA 根据不同的目标DAN，选择合适的限制性内切酶。目前常用的限制性内切酶有EcoRⅠ和HindⅢ等。该步骤必须保证酶解完全。如果有必要，可以用琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭分析酶解结果。酶解的时间根据实际情况而定。 (三) 电泳 电泳的主要目的是把DNA片段按大小(长短)分离开来，得到一个根据分子量排列的连续带谱。电泳可采用琼脂糖凝胶电泳，也可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳。时间由几小时到24小时不等。 (四) 转印 所谓转印，就是将已经电泳的DNA片段通过一定的方法转到固相支持物上。常用的固相支持物有硝酸纤维素滤膜或尼龙膜。转印前需经过碱变性溶液处理，将双链DNA变性为单链DNA。转印的方法一般有三种。根据DNA分子的复杂度转移2―12小时。 1 盐桥法；也叫毛细管转移法。先把硝酸纤维素滤膜放在20×SSC 溶液中浸透，然后把滤膜平铺在凝胶上，再在滤膜上放上浸过20×

基因多态性

基因多态性 多态性（polymorphism）是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型（genotype）或等位基因（allele），亦称遗传多态性（genetic polymorphism）或基因多态性。从本质上来讲，多态性的产生在于基因水平上的变异，一般发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域。对于一个体而言，基因多态性碱基顺序终生不变，并按孟德尔规律世代相传。 基因多态性分类生物群体基因多态性现象十分普遍，其中，人类基因的结构、表达和功能，研究比较深入。人类基因多态性既来源于基因组中重复序列拷贝数的不同，也来源于单拷贝序列的变异，以及双等位基因的转换或替换。按引起关注和研究的先后，通常分为3大类：DNA片段长度多态性、DNA重复序列多态性、单核苷酸多态性。 DNA片段长度多态性DNA片段长度多态性（FLP），即由于单个碱基的缺失、重复和插入所引起限制性内切酶位点的变化，而导致DNA片段长度的变化。又称限制性片段长度多态性，这是一类比较普遍的多态性。 DNA重复序列多态性DNA重复序列的多态性（RSP），特别是短串联重复序列，如小卫星DNA和微卫星DNA，主要表现于重复序列拷贝数的变异。小卫星（minisatellite）DNA由15~65bp的基本单位串联而成，总长通常不超过20kb，重复次数在人群中是高度变异的。这种可变数目串联重复序列（VNTR）决定了小卫星DNA长度的多态性。微卫星（microsatellite）DNA 的基本序列只有1~8bp，而且通常只重复10~60次。 单核苷酸多态性单核苷酸多态性（SNP），即散在的单个碱基的不同，包括单个碱基的缺失和插入，但更多的是单个碱基的置换，在CG序列上频繁出现。这是目前倍受关注的一类多态性。 SNP通常是一种双等位基因的（biallelic），或二态的变异。SNP大多数为转换，作为一种碱基的替换，在基因组中数量巨大，分布频密，而且其检测易于自动化和批量化，因而被认为是新一代的遗传标记。 遗传背景知识遗传和变异各种生物都能通过生殖产生子代，子代和亲代之间，不论在形态构造或生理功能的特点上都很相似，这种现象称为遗传（heredity）。但是，亲代和子代之间，子代的各个体之间不会完全相同，总会有所差异，这种现象叫变异（variation）。遗传和变异是生命的特征。遗传和变异的现象是多样而复杂的，正因为如此，才导致生物界的多种多样性。

扩增片段长度多态性

扩增片段长度多态性(AFLP，Amplified restriction fragment polymorphism)，是1993年荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的分子标记技术。文章主要讲述该技术的原理、流程及特点，并从以下三个方面讲述该技术的应用情况：动物学方面，讲述其在动物遗传学，动物系统学，性别鉴定与繁殖行为研究上的应用；植物学方面，讲述其在种质资源鉴定，作物育种上的应用；医学方面，讲述其在肿瘤，遗传病，流行病学方面的进展。文章还分析了AFLP技术的优缺点并展望了其应用前景。 关键词：AFLP，分子标记技术，应用 目前遗传标记主要有4种类型，即形态标记(Morphological Markers)、细胞标记(Cytological Markers)、生化标记(Biochemical Markers)和分子标记(Mo1ecular Markers) [1]。分子标记一般指DNA标记。分子标记依据所用的分子生物学技术,大致分为三大类：(Ⅰ)以电泳技术 （Ⅱ）和分子杂交技术为核心,其代表性技术有RFLP和DNA指纹技术(DNA Fingerprinting) 。 以电泳技术和PCR技术为核心,其代表性技术有RAPD( Random amplified polymorphism DNA) 、SSLP(Simple sequence length polymorphism ,或称Sequence-tagged microsatellitesite, STMS)和AFLP。（Ⅲ）基于DNA芯片技术的分子标记,即SNP[ 2-4 ]。其中，扩增片段长度多态性(AFLP，Amplified restriction fragment polymorphism)，是1993年荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的方法，已获欧洲专利局的发明专利。该技术具有多态性丰富、灵敏度高、稳定性好、可靠性高、不易受环境影响等优点，近年来广泛应用于生命科学各项研究中。 1. AFLP分子标记技术原理、流程及特点 1.1. AFLP分子标记技术原理 AFLP技术是基于PCR反应的一种选择性扩增限制性片段的方法。由于不同物种的基因组DNA大小不同，基因组DNA经限制性内切酶酶切后，产生分子量大小不同的限制性片段。使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接作为扩增反应的模板，用含有选择性碱基的引物对模板DNA进行扩增，选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上DNA指纹的有无来检验多态性[5]。Vos等(1995)曾对AFLP的反应原理进行了验证，结果检测到的酶切片段数与预测到的酶切片段数完全一致，充分证明了AFLP技术原理的可靠性。

生活中的DNA科学作业答案

1、朊粒病的共同特征中不包括（） 1.潜伏期长，达数月、数年甚至数十年 2.一旦发病呈慢性、进行性发展，以死亡告终 3.表现为海绵状脑病或蛋白质脑病 4.产生严重反应和免疫病理性损伤 2、下面哪种酶是在重组DNA技术中不常用到的酶（） 1.限制性核酸内切酶 2.DNA聚合酶 3.DNA连接酶 4.DNA解链酶 3、长期接触X射线的人群，后代遗传病发病率明显升高，主要原因是该人群生 殖细胞发生（） 1.基因重组 2.基因突变 3.基因互换 4.基因分离 4、抗VD佝偻病属于：（） 1.常染色体显性遗传病 2.常染色体隐性遗传病 3.X连锁显性遗传病 4.X连锁隐性遗传病 5、法医DNA技术中的三大基本技术指（） ①DNA 指纹技术②荧光显微技术③PCR 扩增片段长度多态性分析技术④线 粒体DNA 测序 1.①②③ 2.②③④ 3.①②④ 4.①③④ 6、相互连锁的两个基因位于（）上 1.同源染色体 2.同一染色体 3.非同源染色体 4.不同对染色体 7、关于核糖体的移位，叙述正确的是（） 1.空载tRNA的脱落发生在“A”位上

2.核糖体沿mRNA的3’→5’方向相对移动 3.核糖体沿mRNA的5’→3’方向相对移动 4.核糖体在mRNA上一次移动的距离相当于二个核苷酸的长度 8、Western blot是（） 1.检测DNA的方法 2.检测RNA的方法 3.检测蛋白的方法 4.检测酶的方法 9、针对耐药菌日益增多的情况,利用噬菌体作为一种新的抗菌治疗手段的研究 备受关注。下列有关噬菌体的叙述,正确的是（） 1.利用宿主菌的氨基酸合成子代噬菌体的蛋白质 2.以宿主菌DNA为模板合成子代噬菌体的核酸 3.外壳抑制了宿主菌的蛋白质合成,使该细菌死亡 4.能在宿主菌内以二分裂方式增殖,使该细菌裂解 10、a和b是不同顺反子的突变，基因型ab/++和a+/+b的表型分别为（） 1.野生型和野生型 2.野生型和突变型 3.突变型和野生型 4.突变型和突变型 11、法医DNA科学涉及的学科有（） 1.分子遗传学 2.生物化学 3.生物统计学 4.以上都是 12、下列哪种碱基不属于DNA/RNA的碱基（） 1.腺嘌呤 2.鸟嘌呤 3.次黄嘌呤 4.胸腺嘧啶 13、要使两对基因杂合体自交后代群体纯合率达到96%以上，至少应该连续自交 （） 1.4代 2.5代 3.6代 4.7代

《生命科学研究进展》复习—题目和答案

王义权老师（6题） 1、什么是DNA分子标记？ DNA是生物遗传信息的载体，任何生物的遗传信息都具有种属特异性。生物体一切具有其种属特异性的特征，均可作为标记。DNA分子标记是DNA分子中能够反映生物种属特异性的序列特征，这种特征可以用多种方法揭示。 2、DNA分子标记的种类有哪些？ DNA分子标记有：限制性长度多态性RFLP、PCR-RFLP、CAPS、DNA指纹、随机扩增多态性RAPD、序列特征扩增区SCAR、位点特异性PCR（AS-PCR）、单链构象多态性SSCP、扩增片段长度多态性AFLP、序列分析、单核苷酸多态性SNP、表达序列标签EST、序列标签位点STS、简单序列重复SSR、简单序列长度多态性SSLP、微卫星序列DNA、VNTR等。 3、DNA分子标记有哪些用途？ 在基因组研究中的作图； 动植物遗传育种中的应用； 医学遗传学和疾病的诊断； 传染病的病原生物检测：如SARS，禽流感病毒； 生物样品的检验如海关检疫、法医鉴定、中药材鉴定等； 在动物学研究中的应用。 4、简要说明RFLP的原理并举例说明其应用。 RFLP的原理是限制性内切酶（II型酶）对特定序列的识别，并在识别位点专一性地将双链DNA切开。多数限制性内切酶识别的是DNA分子中4~6 bp的特征序列，而基因组DNA分子中散布着多种内切酶的识别序列，故可将不同生物的DNA分子切成长短不一的DAN片段。每4n bp处有一切点，理论上切点的频率为基因组总长/ 4n bp，因此对某一特定基因组，识别位点碱基数多的限制酶，在该基因组中的识别位点数就少；反之就多。切点的多少可由酶切后的DNA片段长度检验。可以应用于物种遗传多样性分析。 5、举例说明DNA分子标记在动物学研究中的应用。 DNA分子标记在动物学研究中的应用包括估算遗传距离、重建系统发生树、分析种群结构及分子生态学、测定种群遗传多样性及应用于保护生物学、系统地理学、鉴定物种或种群等。 例：厦门海域文昌鱼的研究：通过设计Cytb和12S rRNA基因扩增引物，PCR扩增，测序和序列比对、MEGA数据分析，得出结论厦门有2种文昌鱼，二者的遗传距离达到21.13%；其中有一种(来自黄厝)与来自日本海域的文昌鱼的遗传距离只有0.56%；详细的观察、测量与比较，进一步确定其作为2个不同的物种在厦门海域的存在。 6、名词解释 随机扩增多态性RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)：根据在庞大的基因组DNA中存在的许多短的颠倒重复序列。用单一引物，在较低的复性温度下，可以将基因组中两个相邻的颠倒重复序列间的DNA片段扩增出。通过琼脂糖凝胶电泳等分离手段，可将扩增产物按片段大小分离，形成特定的电泳谱带。 单链构象多态性SSCP(Single Strand Conformational Polymorphism)：DNA单链在变性凝胶电泳中的迁移速率不仅与DNA片断长度有关，还与特定序列形成的特定空间构象有关。 扩增片段长度多态性AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)：用限制酶切基因组DNA后，装上适当接头，再用选择性引物扩增，可得到长度多态性很好的DNA片段。 表达序列标签EST(Expressed Sequence Tag)：从一个随机选择的cDNA 克隆进行5’端