单分子荧光检测在生命科学中的应用
实验技术
单分子光学检测中最广泛应用的手段．一般荧光分子激发态的寿命在纳秒量级，在激光激发下，分子可以反复吸收、发射光子，直到发生各种原因造成的光漂白．在理想情况下，一个稳定的分子在光漂白前大约能发出１０５一１０６个荧光光子，利用高数值孔径物镜和高效单光子计数雪崩光电二极管（ＡＰＤ），能接
收到约５％－－１０％的荧光光子．这样，从一个“表
现”好的荧光分子上可以收集到５０００到５００００个光子，这一数目足以让人们进行单个分子的探测、光谱辨认和对反应的实时监测．对于生物大分子如蛋白质和核酸，可以用荧光分子标记来达到单个分子检
测的目的，常见的荧光分子主要包括有机染料小分子、荧光蛋白、共轭高分子等．近年来，人们还发展出
一些新的荧光物种，如量子点、树枝状高分子，小肽片段等．
根据单分子荧光检测的原理和挺高信噪比的要
求，人们发展出了各种单分子荧光榆测的方法和数据分析手段．单分子荧光检测方法主要可以分为共聚焦和宽场两种方式，如图１所示．
基于共聚焦检测（如图１（ａ），（ｂ））的数据分析手段是以荧光涨落谱（ＦＣＳ）和光子频率统计（ＰＣＨ）为代表．荧光涨落谱是一个相对古老的技术，早在上世纪初，Ｐｅｒｔ＇ｉｎ小组”３在研究布朗运动时就应用了荧光涨落谱的方法，但由于当时实验技术落后，没能得到广泛应用．上世纪７０年代，Ｅｌｓｏｎ，Ｍａｇｄｅ，ｗｅｂｂ－９１１１１在没有体系扰动的情况下，以荧光涨落信号为对象，研究了．溴化乙啶和双链ＤＮＡ之间的化学反应，第一次将这一技术应用于化学反应动力学信息的提取．１９９３年，Ｒｉｇｌｅｒ和他的同事们将荧光涨落谱技术与共聚焦显微镜相结合，应用于单分子检测”ｏ”１，为二者同时带来了新的契机．从荧光涨落谱衍生出来的技术还有荧光互相关光谱（ＦＣＣＳ）、共聚双光子激发、时间相关单光子计数（ＴＣＳＰＣ）、扫描荧光涨落谱（或称图像相关谱）、全内反射荧光涨落谱等．相对于荧光涨落谱，荧光强度分布分析（兀－ＤＡ）和光子频率统计（ＰＣＨ）是近几年发展起来的
技术，它们弥补了荧光涨落谱丢失涨落高低信息的缺陷，二者的结合可以给出复杂体系中的大量统计
信息．
宽场榆测采用的检测器是阵列电荷耦合器件（ＣＣＤ），可以同时收集所有像素的信息，适用于以成像的方式检测生物及化学反应过程，是研究活细胞物质行为的一种常用方法，但时间分辨率主要受读出时间限制．其中一种重要照明方式是全内反射
图１常见单分于荧光检测方法…在共聚焦检测中（图（＾）和
图（ｂ）），激光经过一个高数值孔径的物镜后聚焦于样品中一个
衍射极限的体积内，聚焦体积内样品发出的荧光被同一十物镜收集后，经过双色镜、透镜、滤光片．被一十或几个点检测器
（ＡＰＤ）检测自由扩散的分子（图（ａ））会产生如图１右上所示的不同高度的脉冲信号，固定在表面的分子（图（ｂ））产生的信
号如图１右中所示，可采用扫描的方式获得光学成像．宽场检测方式（图（ｃ）至圈（ｅ））可以分为两种：垒内反射（圈（ｃ）和圈（ｄ））和宽场落射（图（ｅ）），在全内反射检测中，激光聚焦于玻片和溶液的交界面，发生全内反射，光强随着距离迅速衰减（如虚
线所示），以隐逝场的方式照明距界面几百个纳米的距离这种照明方式背景低，可以通过物镜（图（ｃ））或棱镜（图（ｄ））实现．在宽场落射检测中，激光聚焦于物镜的后焦平面，通过面检测器
（阵列电荷耦台器件）可以平行记录几个单个分子的信号，也可以对单个分子进行轨迹追踪．图Ｉ右下图是利用双色宽场落射
检测得到的成像示意图
照明．如图１中（Ｃ），（ｄ）所示，光线从光密介质射入
光疏介质，当人射角大于布儒斯特角时形成全反射，可以通过隐失场的方式对样品进行激发．激发光的强度随距离指数衰减，特征距离大约为半波长．这种
照明方式激发体积小，集中于分界面，背景低，可以显著提高信噪比．很适合进行细胞膜及其他表面上
的单分子研究．
２
单分子荧光检测在生命科学中的应用
２．１生化分析
以液流中的单分子检测作为分子分选器，可以分析复杂溶液中浓度极低的目标分子．也可以利用
ｈｔｔｐ：／１ｗｗｗ．ｗｕｌｉ．ａｃ．ｃｎ
物理
实验技术
荧光相关分析获得极稀溶液的浓度．例如，ＫｅＵｅｒ等
人”“首先提出利用单分子检测技术进行ＤＮＡ序列
的快速测定，其原理为：用不同荧光标记物标记好的
４种核苷酸，合成长达几千个碱基对的ＤＮＡ片段，
把ＤＮＡ分子与微珠连接，放在缓冲液流的中间．流
体中含有核酸外切酶，每隔一定时间消除一个核苷
酸，剪切下的核苷酸分子流经激光束时就会根据它
们的荧光标记物被一个一个检测和识别．
２．２骨架运输蛋白的工作原理
细胞需要对大的生物分子或复合体进行快速、
定向的运输．其中微丝和微管作为细胞的骨架同时
起到导轨的作用，以引导运输蛋白的运动．骨架运输
蛋白主要有三类：驱动蛋白、动力蛋白和肌球蛋白．
人们通过单分子荧光检测对这些重要的分子马达进
行了一系列研究，发现它们都是以步进方式运动的．
人们通过传统手段了解到，驱动蛋白沿着徽管
运送物质，但对于驱动蛋白在微管上的运动模式，一
直存在着交臂和蠕动两种模型之间的争论．１９９６年，Ｆｕｎａｔｓｕ等人”“用全内反射的光学方法直接观测到单个驱动蛋白沿微管的移动．２００４年，Ｙｉｌｄｉｚ等人”“用Ｃｙ３染料标记单头的驱动蛋白，通过准确定位，确定驱动蛋白在微管上移动的步长为１７．３ｈｉｌｌ，其结果支持了交臂模式（图２）．
肌球蛋白与细胞中许多重要的功能活动有关，如肌肉收缩、变形运动、胞质分裂和细胞信号传递等．它沿着微丝行走，运动速度比沿微管行走的驱动蛋白和动力蛋白慢．１９９５年，Ｆｕｎａｔｓｕ等人””首次观测到单个荧光标记的肌球蛋白分子和单个三磷酸腺苷（Ａｌｐ）转化反应．同年，Ｓａｓｅ等““利用荧光偏振成像观测到滑动着的肌动蛋白细丝在轴向上的转动．体外单分子研究表明，肌球蛋白沿微丝的运动也是步进式的．２００３年，Ｙｉｌｄｉｚ等人““在全内反射的激发下，用荧光成像获得精确到１．５一的步长统计，发现肌球蛋白ｖ的步长为３７ｎｍ，并且也是遵循交臂运动模型…Ｊ．
肾上腺素受体（ＡＲ）属于Ｇ蛋白偶联受体（ＧＰＣＲｓ）家族，因为直接参与交感一儿茶酚胺系统对心血管的功能调控而引起广泛关注．梁璋仪等利用宽场落射显微镜，在活的ＨＥＫ２９３Ａ细胞内，利用单分子技术观测ａ。一ＡＲ和ｎ。。一ＡＲ两种亚型在活细胞内的运输情况”“Ⅲ，发现在受到激动剂刺激后，ｎ，一ＡＲ发生内化，首先通过微丝输运．他们也观察到运输过程中的步进模式，其步长、停留时间与
图２驱动蛋白的运动‘１引（ａ）驱动蛋白前进运动的两个机理，其中交臂机理表示在驱动蛋白头部的染料分子台阻１６．６ｎｍ，０啪，１６．６ｎｍ相互转换地一步一步前进．蠕动机理表示驱动蛋白会以不变的８．３衄步子前进；（ｈ，实验获得的驱动蛋白二聚体运动的位置一时间图数值为步长的大小
细胞外实验一致，为交臂模式．结果如图３所示
２．３其他分子马达的研究
利用单分子荧光偏振成像的方法，Ｎｏ舀等人０１将荧光标记的肌动蛋白和Ｆ１一Ａ１甲酶的＇亚基结合，结果表明，当有ＡＴＰ时，标记物会沿逆时针方向转动１００次以上．Ｋｉｎｏｓｉｍ等人…０１又详细地分析了单个荧光基团Ｃｙ３标记下Ｆ１一ＡＩＰ酶的运动轨迹，进一步说明这种旋转是分步进行的，每步转动１２０。．２００５年，Ａｂｂｏｎｄａｎｚｉｅｆｉ等人”ｏ利用光镊技术测定出ＲＮＡ聚台酶的移动步长为３．７±０，６Ａ．
２．４离子通道
２０００年，Ｓｃｈｆｌｔｚ等人”１将与Ｋｖｌ．３通道有高亲和力的Ｈｏｎｇｏｔｏｘｉｎ标记，在宽场照明下进行单分子成像，沿：轴连续移动焦点，通过基于高斯分布的点扩散方程（ＰＳＦ）拟合，得到４０ｎｍ的定位精度，从而得到了Ｋｖｌ．３通道的三维图像．
２００１年，Ｈａｎｎａ等人Ⅲ１将增强黄色荧光蛋白转染到离子通道，在宽场照明下，实现了单个Ｌ类型钙离子通道在活细胞内的成像，通过光强的计算和
黯ｌ
实验技术
比较，推断出Ｌ类型钙离子可能在
细胞膜上形成可以移动的较大聚集
体，并用相关函数拟合出其扩散系
数．
Ｓｏｎｎｌｅｉｔｎｅｒ等人”ｏ在活细胞内
用四甲基罗丹明标记单个压控钾离
子通道．研究荧光强度随膜电压的改
变，观察到了离子通道的重排．Ｉｄｅ
等人…１设计出可以同时观察单离子
通道电流和其单分子成像的方法，但
这个工作是在人工脂质膜上进行的．
上，２００１年，Ｕｅｄａ，Ｓａｋｏ等人汹１用全图３“ｔ＾一＾Ｒ在细胞内运输的情况ｍ１（。）灰色表示微管阻断ｊ
Ｊ秋水仙素处理前后，肾内反射显微镜对进行趋化运动的ｇ占ｒ－．ｔｌ上腺豪受体激动剂刺激带銮竺：－－“Ｒ运动速率竺布?二者相近正峰均为０‘２卜“ｓ；（６）兰箍黧墨黧翟舞罴麓麓篡ｉ黧嚣结合解离循环在细胞的头部较快，暗
示着ｃＡＭＰ受体可以感受ｃＡＭＰ的梯
度进行极化．２００２年，ｈｏｈ等人一。刺用两种荧光蛋白
分别标记Ｒａｃ和Ｃｄｃｄ．２，通过荧光共振能量传递（ＦＲＥＴ）现象观测二者的活性，发现二者的分布与细胞的运动方向密切相关．２００４年。Ｍｕｒａｋｏｓｈｉ等人”“
用有机染料ｂｏｄｉｐｙ标记三磷酸鸟苷，与构建的黄色荧光蛋白——陆蛋白构成荧光共振能量传递对，利用全内反射显微镜观察Ｒａｓ蛋白的活化作用．他们发现，在活化状态下，Ｒａｓ的扩散被大幅度抑制，这一现象支持形成更大的有活性的Ｒａｓ信号复合物这一假设．
２．６生物大分子构象变化
ＤＮＡ的复制、转录、翻译，蛋白的折叠、聚集、活化，ＤＮＡ一蛋白和蛋白一蛋白相互作用等，几乎每一
８８２个重要过程都与生物分子本身自）构象变化有关，利用单分子荧光检测为进一步了詹这些过程提供了有力的手段．近年来，在这些方面乜取得了较大的进展，现列举一些有代表性的例子．
Ｈａ等人啪”１在共焦显微镜下结合ＦＲＥＴ和偏振检测的技术，对葡萄球菌核酎酶（ＳＮａｓｅ）进行了研究，发现ＦＲＥＴ效率的涨落来自于蛋白自身的构象变化．他们还利用ＦＲＥＴ技术研究了ＲＮＡ三链结合体的构象变化ｍ】．
热休克蛋白具有分子伴侣的功能，能防止蛋白的错误折叠．关英华等利用ＦＲＥ”技术，在宽场下对小热休克蛋白ＭｊＨＳＰｌ６．５进行：’单粒子追踪，给出了ＭｊＨＳＰｌ６．５裂分和高温下亚ｊ自元交换的机理”ｏ．结果表明，蛋白裂开的过程是ｊ一多步的，并以偶数
ｈｔｔｐ：，，ｗｗｗ．Ｍ出．ａｃ．ｃｎ物理
实验技术
产物为主，如图４（ａ）和４（ｂ）所示．通过热力学、动力学分析发现，在温度较低的区间（７５℃以下），亚单元之间的交换决速步为单个蛋白分子的裂分；当温度升高以后，蛋白逐渐以解离的状态存在，温度继续升高的结果是二聚体之间发生交换，即单体交换．
图４小热休克蛋白ＭｊＨＳＰｌ６５裂分的机理ｍ
（ａ）和（ｂ）为
ＭｊＨＳＰｌ６．５蛋白分子的裂分示意图，其中（ａ）为三重轴和四重轴结构示意图，（ｂ）为裂分过程的推测；（ｃ），（ｄ）．（ｅ）为ＭｊＨＳＰ１６．５蛋白分子的裂分过程及碎片数目统计．其中（ｃ）为Ｃｙ３染料
标记的单个ＭｊＨＳＰｌ６．５蛋白分子裂分轨迹选图图中比例足为１“皿．数字为收图的帧数，每张图的曝光时间为５０唧．（ｄ）为裂分第一步的碎片数统计，以两个碎片为主，（ｃ）为最终的碎片数
统计，以偶数产物为主
２．７蛋白质折叠
蛋白折叠是蛋白维持自身生存、履行生物功能
的重要行为，一直受到人们的广泛关注．单分子荧光
方法在这个领域显示出了巨大的优势，并取得了很大的进展．其中胰凝乳蛋白酶抑制剂２（Ｃ１２）和冷休克蛋白（ｅｓｐ）是两个典型蛋白，下面以这两个蛋白的研究情况为例进行简要介绍，
Ｄｅｎｉｚ等人Ⅲ１利用共焦显微镜，通过统计不同变性剂浓度下ＦＲＥＴ效率，得到了Ｃ１２两态的分布
信息．２００４年，Ｋａｐａｎｉｄｉｓ等人Ｈ”发展出转换激光激
发（ＡＬＥＸ）的方法，可以精确得到ＦＲＥＴ效率，对
Ｃ１２进行了更细致的研究．Ｓｃｈｕｌｅｒ等人”。将ｅｓｐ的
３６卷（２００７年）１１期
Ｎ端和Ｃ端突变为半胱氨酸，特异性标记上两种可以发生ＦＲＥＴ的荧光染料，得到不同变性剂浓度下的ＦＲＥＴ效率分布．与Ｃ１２不同的是，他们还观察到了蛋白坍塌的过程，如图５所示．在后来一系列的研究中，他们使用囊泡包裹ｅｓｐ进行跃时间观察，对ｃｓｐ构象变化的动力学进行了描述…”１．
图５冷休克蛋白ｃｓｐ的去折叠过程ｍ１（ａ）脯氨酸６（左）．脯氨酸２０（中），Ｃｓｐ（右）在不同变性剂浓度下的ＦＲＥＴ效率分布统计；（ｂ）ｃ印的ＦＲＥＴ效率平均值对变性剂浓度的依赖性．上方的实心点对应不同变性剂｛扛度下高ＦＲＥＴ效率峰（天然状态），下方的实心点对应不同变性剂浓度下低ＦＲＥＴ峰（变性状态）空心点是从系综实验得到的表观ＦＲＥＴ效率Ｃｓｐ低ＦＲＥＴ
效率（变性状态）随变性剂浓度的位移反映了多肚链的坍塌过程
最近，霍夫曼等人…１将发生ＦＲＥＴ的染料标记在整个肽链的不同位置，在单分子水平上研究了不同变性剂浓度下不同位点之间的距离分布，结果表明，蛋白质的疏水塌缩分布于整个肽链中．他们还用高斯链模型较好地拟合了平均ＦＲＥＴ效率随标记位点距离变化的关系，得到一个衡量链刚性的参数Ｌｐ．在不同变性剂浓度下，不同标记点之间链断的Ｌｐ值相同，说明蛋白在折叠过程中处于各向同性的无规线团状态．
ｈｔｔｐ：１１ｗｗｗ．’岫．∽．ｅｎ
８８３
单分子荧光检测在生命科学中的应用
作者：曲鹏， 赵新生， QU Peng， ZHAO Xin-Sheng 作者单位：北京大学化学学院化学生物学系,北京,100871刊名：
物理
英文刊名：PHYSICS
年，卷(期)：2007，36(11)
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图像处理与分析是单分子荧光成像研究的关键性内容。单分子荧光成像的图像处理与图像分析贯穿整个实验过程，但又是一项繁琐而艰巨的任务。免费开源软件Image J软件使用起来方便、快捷，在提高图像分析可靠性的同时，大大节约了数据分析的时间，为单分子荧光成像分析提供了重要的工具。基于此，本章主要研究了Image J软件在识别单个生物大分子的吸附/解吸附事件、计算单分子的吸附个数、测定单个分子的荧光强度和单个分子的漂白步骤(漂白曲线)等方面的应用，重点讨论了单分子荧光成像分析中图像叠加的帧数、二维旋转球法扣除背景中小球半径、粒子计数分析中阈值和单个光斑像素大小的正确选取对单分子吸附个数计算结果可靠性的影响。以单个藻红蛋白分子在界面吸附成像为例，证明了这些参数的选取和优化对单分子荧光成像分析结果可靠性有很大的影响。
(2) DNA在琼脂糖修饰的玻璃表面行为的单分子荧光成像研究
琼脂糖凝胶常用于凝胶电泳中分离和纯化核酸、蛋白质等生物大分子。分离过程中固定相和单个生物分子之间的动态相互作用正是色谱和电泳等生物分离方法最优化的基础。本论文应用物镜型全内反射荧光显微镜，以YOYO-1为探针研究了琼脂糖的表面性质，主要考察了不同的pH值、离子强度和琼脂糖浓度对DNA吸附动力学行为的影响。得出的结论为：DNA分子在琼脂糖表面的吸附量和吸附形式随pH值和离子强度的变化是不同的；DNA在不同浓度琼脂糖表面的吸附行为可归结为静电作用、疏水作用和琼脂糖表面粗糙度三重作用的影响，主导作用是静电作用、疏水作用，琼脂糖表面的构形在某种程度上也影响着DNA的吸附。
(3)巯基乙醇对藻红蛋白单分子行为影响的荧光成像研究
荧光团的光致漂白和闪烁现象严重影响单分子荧光成像研究。在单分子荧光研究中，加入巯基乙醇(2-Mercaptoethanol，BME)可以降低荧光团的漂白速率、减弱闪烁现象，从而提高单分子荧光检测的分辨率和灵敏度。然而，BME对单分子其它行为如吸附和荧光强度的影响并未得到充分研究。本论文应用宽场荧光成像技术，以藻红蛋白( B-phycoerythrin，B-PE)为模型蛋白，从单分子角度系统地研究了BME对蛋白在固-液界面吸附的影响，并对其机理进行了探讨。结果表明：BME浓度的增加可增强B-PE在盖玻片表面的吸附，吸附个数大约可增加到最初的16.0倍，同时也可使其荧光强度增强，但是更高浓度(5.00 mmol/L)的BME可使蛋白部分变性使其吸附个数降低，光斑的平均荧光强度降低；这些结果与荧光光谱的结果相一致。
通过以上研究实现了准确、快速的单分子荧光成像分析，并通过实时观测固-液界面分子的动力学过程，成功研究了影响生物大分子表面吸附机理的基本相互作用，为探测色谱和电泳的分离机制，DNA芯片和生物芯片的制作提供了更加详细的基础理论依据。
引证文献(1条)
1.杨新星.赵新生生物过程化学机制的单分子荧光探测[期刊论文]-生命科学 2008(1)
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下载时间：2011年4月17日