血清层粘连蛋白和透明质酸的放射免疫分析
第9卷第2期1996年5月
同 位 素
Jou rnal of Iso topes
V o l.9 N o.2
M ay1996
血清层粘连蛋白和透明质
酸的放射免疫分析
尹石华
(胜利石油管理局胜利医院,东营257055)
采用R I A法对134例肝病患者进行血清LN和HA含量的测定。结果表明:慢性肝病尤其是肝硬化患者血清中LN和HA的含量显著高于对照组(P<0.001),并且与肝功其它指标和肝脏的损伤程度密切相关。提示对血清进行LN和HA的R I A联合测定可以作为判断慢性肝病患者的损伤程度
。
关键词 层粘连蛋白 透明质酸 放射免疫测定
层粘连蛋白(L am in in,LN)和透明质酸(H yalu ron ic A cid,HA)分别属于肝脏细胞外间质成分(Ex tracellu lar M atrix,EC M)中的糖蛋白和蛋白多糖。在肝硬化时血清LN和HA含量显著增加[1-3]。对37例健康人(对照组)和134例肝病患者血清进行LN、HA及常规肝功能的联合测定,以探讨与慢性肝病患者的关系。
1 资料与方法
1.1 检测对象
(1)对照组:37例,其中男22例,女15例,年龄16-58岁,经检查无心、肝、肾等其他疾病。
(2)肝病组:134例,其中男81例,女53例,年龄11-65岁,均为我院传染科和消化内科1994年2-5月的住院及门诊病人。其中急性黄胆性肝炎(A H)28例,慢性迁延性肝炎(CPH) 33例,慢性活动性肝炎(CA H)38例,肝硬化(L C)35例。134例肝病患者均经临床和实验室及其它检查确诊,诊断符合1990年修订的病毒性肝炎防治方案标准。
1.2 方 法
(1)受检者均早晨取空腹静脉血2-3m l,分离血清,-20℃分装保存,一部分用于LN、HA测定,一部分用于肝功能谷丙转氨酶(AL T)、Χ2谷丙转肽酶(GGT)、白蛋白(A)、球蛋白
(G)测定。
(2)血清AL T、GGT、A、G应用美国I L公司生产的M onarch661型全自动生化分析仪测定,试剂由长征公司提供。血清LN、HA检测采用放射免疫法(R I A),试剂由上海海军生物
收稿日期:1994206214 修改稿收到日期:1994208230
医学研究所供给,严格按要求进行操作。用西安262厂生产的FJ 22008P 型全自动Χ免疫计数仪测定LN 的灵敏度为24.7Λg l ,可测范围为50-800Λg l ,非特异结合率为4.8%,批内变异系数为8.4%;HA 的灵敏度为23.7Λg l ,可测范围为50-640Λg l ,非特异结合率为4.1%,批内变异系数为7.2%,数据由微机自动处理。各项技术指标均符合要求。本文数据的统计学方法为方差分析,其数据采用CA S I O fx 23600P 计算器处理。
2 结 果
(1)各组肝病患者血清LN 和HA 的含量测定结果列于表1。由表1可知,A H 组血清LN 、HA 与对照组比较无显著差异(P >0.05);CPH 、CA H 、L C 三组慢性肝病血清LN 、HA 均显著高于对照组和A H 组(P <0.01或P <0.001),并且经统计学方差分析LN 、HA 在各肝病
组间均有显著差异(P <0.05)。
表1 肝病患者血清L N 、HA 含量的结果比较(x θ±s )
组 别例数
Θ(LN ) Λg ?l -1
Θ(HA ) Λg ?l -1
对照组
37284.2±71.354.7±27.9A H 28306.7±86.172.8±49.3CPH 33359.1±89.91)
97.7±41.11)
CA H 38436.6±127.81)281.3±113.21)L C
35
592.4±186.41)
478.4±230.91)
注:1)与对照组比较P <0.01或P <0.001
(2)各组肝病患者血清肝功指标AL T 、GGT 、A 、G 含量测定结果列于表2。经统计学方差分析各组肝病血清AL T 显著高于对照组(P <0.01),且各组间无显著差异(P >0.05);GGT
除CPH 组与对照组比较无显著差异(P >0.05)外,其他三组均显著高于对照组(P <0.05),且CA H 、L C 两组GGT 显著高于A H 和CPH 组;L C 组中的A 、G 与对照组及其他肝病组均有显著差异(P <0.05)。
表2 肝病患者血清AL T 、GGT 、A 、G 含量测定的结果比较(x θ±s )
组 别例数
AL T 含量 I U ?l -1
GGT I U ?l -1
Θ(A ) g ?l -
1
Θ(G ) g ?l -
1
对照组
3726.2±7.418.7±6.4
51.7±4.222.1±4.3A H 2880.2±29.31)24.8±9.21)51.1±5.422.4±4.1CPH 3366.5±59.71)21.8±8.950.3±6.128.0±8.31)CA H 3889.1±34.41)68.9±42.31),2)47.1±8.91),2)28.4±4.71)L C
35
82.2±65.61)
79.7±60.21),2)
35.2±10.41),2)
35.9±9.71),2)
注:1)与对照组比较P <0.01;2)与其它组比较P <0.05
(3)以x θ+s θ-s >A 含量为阳性,表3给出各项指标在不同肝病组的阳性率。由表3可知,LN 、HA 在L C 组的阳性率最高达91%以上,且与CA H 、CPH 组有显著差异(P <0.05),而A 、G 的阳性率只有40%,AL T 在L C 组的阳性率虽然较 9 9 第2期 尹石华:血清层粘连蛋白和透明质酸的放射免疫分析 001同 位 素 第9卷 高,但与CA H组无显著差异(P>0.05)。 表3 血清L N、HA、AL T、GGT、A、G在不同肝病组的阳性率% 组别例数LN HA AL T GGT A G A H2810.7(3)14.3(4)92.8(26)39.2(11)10.7(3)10.7(3) CPH3318.2(6)21.2(7)63.6(21)21.2(7)12.1(4)12.1(4) CA H3860.5(23)71.0(27)86.8(33)71.0(27)26.3(10)28.9(11) L C3594.3(33)91.4(32)82.8(29)60.0(21)40.0(14)40.0(14) 注:括号内值为例数 (4)肝病患者血清LN、HA水平与肝功各项指标之间的相关系数列于表4。肝病患者血清LN和HA的变化与AL T、GGT、G的变化趋势呈正相关,与A呈负相关。另外,LN与HA间的相关系数为0.954。 表4 肝病患者血清L N、HA与AL T、GGT、A、G间的相关系数 项目AL T GGT A G LN0.6150.515-0.8220.847 HA0.6380.527-0.8790.901 3 讨 论 慢性肝病发展下去多数转化为肝纤维化或肝硬变。肝纤维化或肝硬变的主要病理改变是以胶原蛋白为主的EC M大量增生和沉积,最后发展为肝实质被结缔组织所取代。近年国内外的研究结果表明,除胶原外,糖蛋白和蛋白多糖等成分在肝脏发生纤维化时也明显增多[4,5]。 LN是近几年来发现的EC M中的一种重要的非胶原性糖蛋白,分布在各基底膜的透明层中,维持基底膜的功能。正常肝脏内LN含量很少,主要分布于血管壁、胆管壁及淋巴壁等部位。肝窦壁正常时不存在LN,但当肝脏发生慢性损伤时,LN含量增加,肝窦壁上出现大量LN 与I V型胶原等共同构成肝窦毛细血管化改变[6]。HA是发现已久的蛋白多糖成分,属于糖胺多糖。文献[3]报道肝硬变及慢性肝病患者血清中HA含量明显升高,可能与HA合成增加及肝硬变损伤了肝内皮细胞进而阻碍了HA的摄取和分解代谢[7]有关。 高锋等[5]在对肝间质成分层粘连蛋白和透明质酸的体外研究结果表明:在慢性肝病及肝硬变时肝脏异常,合成LN、HA增多。本文134例肝病患者血清的检测结果进一步证明了慢性肝病及肝硬化时LN和HA合成显著增加这一观点。增多的LN和HA一方面加重肝脏的损伤,另一方面可能起负反馈调节作用,对肝细胞的增殖有一定的抑制作用[4]。 本文血清LN和HA在不同肝病中的上升幅度和阳性率依次为A H、CPH、CA H、L C,并且与常规肝功能的指标密切相关。另外,本文35例L C中有7例并发消化道出血的患者血清LN含量均在760Λg l以上,说明血清LN是否可以作为早期诊断肝硬化并发门脉高压的特异指标,值得进一步研究探讨。134例肝病患者血清LN和HA以及肝功常规指标的含量测定结果(表1-4)可以证明慢性肝病和肝硬化时LN和HA的水平显著升高,与国内外报道基本一致[6-8]。联合测定血清LN和HA对判断慢性肝病或肝硬化具有重要的临床意义,且阳性判 断率也明显优于常规肝功能指标,因此LN 和HA 是早期诊断肝纤维化或肝硬变较理想的非损伤性特异指标。 本文得到宋世云和陈光连主任的大力支持,特此致谢。 参 考 文 献 1 P leban iM ,Bu rline A .B i ochem icalM arkers of H epatic F ib ro sis .C lin B i ochem ,1991,24(3):59.2 王杰军,孔宪涛,李 石.血清层粘连蛋白放免检测法的建立及初步应用.中国免疫学杂志,1992,8(1):59.3 李伟道,林 宁,刘兴明,等.血清HA 测定诊断肝病的初步评价.中华内科杂志,1992,31(2):92. 4 F riedm an SL .Cellu lar Sou rces of Co llagen and R egu lati on of Co llagen P roducti on in L iver .Sem in L iver D is ,1990,10(1):20. 5 高 锋,孔宪涛,谢映华,等.肝间质成分层粘连蛋白和透明质酸的研究及临床应用.第二军医大学学报, 1993,14(5):457. 6 H ahn E ,W ick G ,Pencev D ,et al .D istribu ti on of Basem en t M em b rane P ro tein s in N o rm al and F ib ro tic H um an L iver ,Co llagen T ype I V ,L am in in and F ib ronectin .Gu t ,1980,21(1):63.7 张鲁榕,孔宪涛,张国治.血清HA 在诊断肝硬化中的价值.中华消化杂志,1991,11(2):67. 8 K ropf J ,Gressner AM ,N egw er A .Efficacy of Serum L am in in M easu rem en t fo r D iagno sis of F ib ro tic L iv 2er D iseases .C lin Chem ,1988,34(10):2026.SERU M RAD I O I M M UNOASSAY OF LAM IN IN AND HYAL URON I C AC I D Y in Sh ihua (S heng li H osp ita l ,S heng li P etroleum A dm in istra tion B u reau , D ongy ing 257055) AB STRA CT T he assay of serum LN and HA by R I A in 134hep atop athadic p atien ts reveals that these p atien ts have m uch h igher LN and HA levels than healthy con tro ls (P <0.001);in addi 2ti on ,these h igher levels are clo sely related to the o ther indices of liver functi on and to the degree of hep atic in ju ry .T he resu lts suggest that the level of LN and LA as a sp ecific index can be u sed to diagno se early liver fib ro sis and ch ron ic diseases ,esp ecially cirrho sis .Key words lam in in hyalu ron ic acid radi o i m m unoassay 1 01 第2期 尹石华:血清层粘连蛋白和透明质酸的放射免疫分析 【药品 名称】 碘标记血管紧张素I放射免疫分析药盒 【概述】肾素-血管紧张素系统在机体的血压、水、电解质平衡的调节上起着重要作用。因此血浆肾素活性(PRA)和血管紧张素Ⅱ(AⅡ)浓度的测定已经成为原发性和继发性高血压的诊断及研究的重要指标。血浆肾素活性(PRA)的测定是以血管紧张素I(AI)产生的速率来表示的，血管紧张素I(AI)是由肾素作用于血管紧张素原而生成的10肽，它被血管紧张素转换酶降解成血管紧张素Ⅱ。血管紧张素I正常生理浓度下无生物活性。PRA、AⅡ二者测定均采用酶抑制剂来阻断转换酶和血管紧张素酶的活性，以达到准确测定PRA和AⅡ的目的。该项指标的测定，可作为判断肾素活性和对多种高血压及肾脏疾病诊断、分型的依据。 【测定原理】本试剂盒采用匀相竞争放射免疫分析方法，测定人血浆中AI的含量。先将校准品(或样品)、标记物和抗体按操作程序依次加入试管中，使标记抗原和抗原与限量抗体发生竞争性结合，待反映平衡后，加入分离剂，离心沉淀，使游离抗原与抗原抗体复合物分离，测量沉淀中放射性强度。随AI含量增加，放射性强度减少。 【试剂组成和配制方法】1.校准品 7瓶(冻干品) 每瓶用 ml缓冲液溶解，浓度分别为:0，0.19，0.38，0.75，1.5，3.0，6.0ng/ml 2.125I —AI 1-2瓶(红色冻干品) 每瓶用5.5ml缓冲液溶解，3.5μCi/μg 3.抗体 1瓶(蓝色冻干品) 使用前用 ml缓冲液溶解(如不填写100T 10ml溶解) 4.缓冲液 1瓶(液体) 5.分离试剂 1瓶(悬浮液) 使用前充分摇匀。 6.8-羟基喹啉 1瓶(液体) 7.二巯基丙醇 1瓶(液体) 8.EDTA-Na21瓶(液体) 9.保温液 1瓶(液体) 10.质控血清 2瓶(冻干品) 使用前用0.5ml缓冲液溶解 【样本要求】1.酶抑制剂的配制:按取血5ml计每支采血管加入50ulEDTA-NA2(如果晶粒析出，可温热溶解)50ul8-羟基喹啉和25ul二巯基丙醇，混匀，备用或2-8℃储存可用一周。 2.标本采集:按常规取静脉血5ml，迅速注入放在冰水浴冷却的酶抑制抗凝试管中，摇匀，立即放回冰水浴中冷却，待离心时取出。1000rpm离心5分钟(最好4℃离心机)，分离取出血浆，此操作应该在15分钟内完成，血浆备检或-25℃保存，可用2个月。 3.标本处理:测定前将冰冻的血浆标本在流动的冰水浴中快速融化，快速取双份标本，每份分别加入10ul保温液。作对照管的一份标本放在冰水浴中，作为测定管的一份标本放在37℃水浴中温育1小时，取样后放入冰水浴中。 【适用 仪器】 GC-2010γ放射免疫计数器、DMF-96型多管放射免疫计数器、γ放射免疫单管分析仪等。 【操作方法】将圆底聚苯乙烯试管编号(按复管操作)，按下表程序操作: AI加样测定程序表单位:μl 试剂NSB管S0-S6校准管对照管样品管生理盐水100 100 100 100 缓冲液200 ――― 校准品―100 ―― 待测血浆标本――100 100 125I―AI 100 100 100 100 AI抗血清―100 100 100 混匀，4℃放置15小时以上，任取3管测量，作为总放射性T(cpm)。 分离试剂1000 1000 1000 1000 第9卷第2期1996年5月 同 位 素 Jou rnal of Iso topes V o l.9 N o.2 M ay1996 血清层粘连蛋白和透明质 酸的放射免疫分析 尹石华 (胜利石油管理局胜利医院,东营257055) 采用R I A法对134例肝病患者进行血清LN和HA含量的测定。结果表明:慢性肝病尤其是肝硬化患者血清中LN和HA的含量显著高于对照组(P<0.001),并且与肝功其它指标和肝脏的损伤程度密切相关。提示对血清进行LN和HA的R I A联合测定可以作为判断慢性肝病患者的损伤程度 。 关键词 层粘连蛋白 透明质酸 放射免疫测定 层粘连蛋白(L am in in,LN)和透明质酸(H yalu ron ic A cid,HA)分别属于肝脏细胞外间质成分(Ex tracellu lar M atrix,EC M)中的糖蛋白和蛋白多糖。在肝硬化时血清LN和HA含量显著增加[1-3]。对37例健康人(对照组)和134例肝病患者血清进行LN、HA及常规肝功能的联合测定,以探讨与慢性肝病患者的关系。 1 资料与方法 1.1 检测对象 (1)对照组:37例,其中男22例,女15例,年龄16-58岁,经检查无心、肝、肾等其他疾病。 (2)肝病组:134例,其中男81例,女53例,年龄11-65岁,均为我院传染科和消化内科1994年2-5月的住院及门诊病人。其中急性黄胆性肝炎(A H)28例,慢性迁延性肝炎(CPH) 33例,慢性活动性肝炎(CA H)38例,肝硬化(L C)35例。134例肝病患者均经临床和实验室及其它检查确诊,诊断符合1990年修订的病毒性肝炎防治方案标准。 1.2 方 法 (1)受检者均早晨取空腹静脉血2-3m l,分离血清,-20℃分装保存,一部分用于LN、HA测定,一部分用于肝功能谷丙转氨酶(AL T)、Χ2谷丙转肽酶(GGT)、白蛋白(A)、球蛋白 (G)测定。 (2)血清AL T、GGT、A、G应用美国I L公司生产的M onarch661型全自动生化分析仪测定,试剂由长征公司提供。血清LN、HA检测采用放射免疫法(R I A),试剂由上海海军生物 收稿日期:1994206214 修改稿收到日期:1994208230 放射免疫分析技术 摘要RIA 是一种微量分析法, 就是利用放射性核素标记抗原或抗体, 然后与被测的抗体或抗原结合, 形成抗原抗体复合物的原理来进行分析的。它兼有放射性同位素的灵敏性和抗原、抗体反应的特异性两大特点。该法还具有准确性高和精密度好, 便于标准化以及操作简便、经济等优点。由于RIA具有灵敏度高，特异性强，测量简单，成本低等优点，RIA在应用方面具有一定的生命力。但是，又因为它最致命的弱点就是使用放射性核素，此外标记物有效使用时间短，难以实现操作和测量的自动化等，它的进一步发展受到一些局限。现在免疫分析技术都在朝着非同位素标记免疫分析的方向发展，自动化仪器已经投入到临床常规项目的检测中，使得传统的RIA使用市场逐渐缩小。不过第五代RIA技术的出现，使得现在的RIA 技术较其他方法在方法学有了更多的优势，尤其是纳米磁性固相的应用，为RIA自动化的研制提供了很大帮助。此外，在生命科学的实验领域，非放射标记免疫技术始终不能代替RIA。关键字RIA IRIA 基本原理第五代RIA技术 1959 年，美国科学家Berson 和Yalow 将放射性同位素测量的高灵敏度与抗原抗体的高特异性巧妙地结合起来，创立了放射免疫分析( radioimmuoassay，RIA) 技术。RIA 经过半个多世纪的发展，可以分析成百上千种物质，包括激素、维生素、肿瘤相关抗原、抗体、药物、病毒等。使那些曾认为无法检测的微量而又具有重要生物活性的物质得以精确定量，为医学、生命科学的发展做出划时代的贡献。因此，1977 年Yalow荣获诺贝尔生理学或医学奖。随后，各国学者发展了酶免疫分析( EIA) 、荧光( FIA) 、时间分辨荧光( TRFIA) 和化学发光( CLIA) 等非同位素标记免疫分析技术。 1. RIA基本原理 放射免疫分析法的本质是一种分子相同的被侧物质和同位素标记物质, 同另一种浓度有限的特异性结合试剂进行的竞争性结合。当同位素标记化合物和特异性结合试剂的量保持一定时, 加入的被侧物或标准物的量与标记物的量之和多于特异性结合试剂有效结合的数目时, 被测物或标准物与标记物一特异性结合试剂复合物之间就呈现一种函数关系。即被测物的量越多, 则标记物的被稀释程度也就越大, 使标记物一特异性结合试剂复合物的量逐渐减少, 放射性强度侧定就越低。根据这种原理来对生物体内的微量物质进行定量测定。 以标记化合物为P* . , 非标记化合物为P , 特异性结合试剂为Q, 其反应式构成了放射 层粘连蛋白（LN）测定试剂盒（化学发光免疫分析法） 适用范围：用于体外定量测定人血清或血浆中的层粘连蛋白含量。 1.1 产品规格 试剂盒规格为48人份/盒、96人份/盒。 1.2 主要组成成分 表1 层粘连蛋白（LN）测定试剂盒（化学发光免疫分析法）主要组成成分 a) 酶结合物 以含20%小牛血清的磷酸盐缓冲液(PH7.4)配制的联接HRP的层粘连蛋白单克隆抗体，0.5%ProClin300作为防腐剂。 b) 校准品 校准品以含50%小牛血清的0.9%Nacl为稀释液，0.5%ProClin300作为防腐剂，校准品A～F中层粘连蛋白的目标浓度分别约为0、6.0μg/L、24μg/L、84μg/L、300μg/L、780 μg/L。 校准品具体浓度详见标签及试剂盒参数IC卡。 c) 发光液 发光液A主要成份为鲁米诺，发光液B主要成份为过氧化脲，两者均以pH8.6的Tris-HCl缓冲液配制。 d) 包被微孔板 包被有层粘连蛋白单克隆抗体白色聚苯乙烯微孔板，用铝箔袋真空包装。 e) 质控品（选配） 以100%正常人血清为基质制备的冻干品，其中含0.5%ProClin300做为防腐剂，其靶值浓度范围QCⅠ为10 μg/L～60 μg/L，QCⅡ为700 μg/L～900 μg/L。 质控品具体浓度详见质控品参数表。 f) 洗涤剂 使用500ml的蒸馏水溶解后为0.02mol/L磷酸盐缓冲液，含0.5‰吐温。 g) 盖板膜 h) 试剂盒参数IC卡 不同批号试剂盒中的相同组分不能互换。 2.1 外观 a）液体组分应澄清，无沉淀或絮状物，实际装量应不小于标示装量； b）冻干组分呈白色或淡黄色疏松体，加水后应在3分钟内完全溶解； c）所有组分均无包装破损，标示清楚。 2.2 准确度 将使用纯品配制的1000ng/ml的样品加入基质血清中，回收率应在80%～120%之间。 层粘连蛋白(laminin, L N) 产品编号 品名 规 格 库存 GTO321 层粘连蛋白 1mg，5mg 现货 特殊规格请询货 层粘连蛋白(laminin, LN)一般分为，人源和鼠源两种。 层粘连蛋白描述： 层粘连蛋白是基膜主要的糖蛋白成分，相对分子质量为850KD。小鼠层粘连蛋白是从EHS(Engelbreth-Holm-Swarm)小鼠肉瘤中提取，并且浓度为 0.5-2.0mg?m l。 层粘连蛋白主要功能包括: ?调节细胞粘着、细胞传播、细胞生长和运动 ?将自身附着于其它基质化合物 ?促进上皮细胞分化 ?改变白细胞的功能 ?刺激神经轴突生长 本产品以Tris-HCL 缓冲盐溶液(Tris-HCL，pH 7.4, 0.15 M NaCl 溶液)的形式提供，浓度为1mg/50mM。性能鉴定(细胞粘着):37°C: ≤ 20 ug?m l 细胞浓度条件下，半数MG63 细胞发生粘着。 层粘连蛋白（fibronectin）系在动物细胞表面、结缔组织以及血液中存在的亚单位分子量20—25 万的糖蛋白。粘连蛋白又称纤维连接蛋白、纤粘蛋白，纤维连接蛋白（英文缩写FN）是1974年国外开始研究发现的一种高分子糖蛋白，具有多种生物学功能。 层粘连蛋白主要存在于基膜(basal lamina)结构中，是基膜所特有的非胶原糖蛋白, 相对分子质量为820kDa, 含13-15%的糖，有三个亚单位, 即重链(α链，400kDa)和β1(215kDa)、β2(205kDa)两条轻链。 层粘连蛋白(结构上呈现不对称的十字形，由一条长臂和三条相似的短臂构成。这四个臂均有棒状节段和球状的末端域。β1 和β2 短臂上有两个球形结构域, α链上的短臂有三个球形结构域，其中有一个结构域同Ⅳ型胶原结合，第二个结构域同肝素结合，还有同细胞表面受体结合的结构域。正是这些独立的结合位点使LN 作为一个桥梁分子，介导细胞同基膜结合。 纤维蛋白原（fibrinogen）一种由肝脏合成的具有凝血功能的蛋白质，是纤维蛋白(fibrin)的前体纤维粘连蛋白(fibronectin, FN) 属非胶原糖蛋白的一种。纤粘连蛋白以可溶的形式存在于血浆和各种体液中,称为血浆纤维粘连蛋白；以不溶的纤维存在于细胞外基质、细胞之间及某些细胞表面, 称为细胞纤粘连蛋白. 纤维蛋白: 一类主要的不溶于水的蛋白质，通常都含有呈现相同二级结构的多肽链,多存在于血液中，当我们为了不让新鲜的猪血凝固，而搅拌猪血，就是破坏了纤维蛋白。许多纤维蛋白结合紧密，并为单个细胞或整个生物体提供机械强度，起着保护或结构上的作用。细胞中，包围着各种细胞器的并不仅仅是细胞质基质，还有由蛋白质纤维构成的支架，称为细胞骨架。纤维蛋白分为结构蛋白（胶原和弹性蛋白）、粘合蛋白（纤连蛋白和层粘连蛋白）。其中以胶原和蛋白聚糖为基本骨架在细胞表面形成纤维网状复合物，这种复合物通过纤连蛋白或层粘蛋白以及与其他的连接分子直接与细胞表面受体连接；或附着到受体上，由于受体多数是膜整合蛋白，并与细胞的骨架蛋白相连，所以细胞外基质通过膜整合蛋白将细胞外与细胞内连成了一个整体。 胶原蛋白: 胶原蛋白是一种细胞外蛋白质，它是曲3条肽链拧成螺旋形的纤维状蛋白质，胶原蛋白是人体内含量最丰富的蛋白质，占全身总蛋白质的30%以上。一个成年人的身体内约有3公斤胶原蛋白，主要存在于人体皮肤、骨骼、眼睛、牙齿、肌腱、内脏（包括心、胃、肠、血管）等部位，其功能是维持皮肤和组织器官的形态和结构，也是修复各损伤组织的重要原料物质。在人体皮肤成分中，有70%是由胶原蛋白所组成。当胶原蛋白不足时，不仅皮肤及骨骼会出现问题，对内脏器官也会产生不利影响。也就是说，胶原蛋白是维持身体正常活动所不可缺少的重要成分。同时也是使身体保持年轻、防止老化的物质。另外，胶原蛋白还可以预防疾病，改善体质，对美容和健康都很有帮助。 放射免疫分析仪技术参数 *1、对125I的探测效率≥78% *2、本底计数≤60CPM 3、探头不一致性≤2% *4、8小时稳定性：探测效率的附加误差不大于3% *5、计数精密度：γ计数器的计数精密度与幅射统计涨落的理论期望值无显著性差异。用X2双测检验法重复测量21次，应符合（10.851≤X2≤31.410）6、探头数量：5个 *7、一次装样容量：380个样品，测量过程中可随时添加 8、仪器工作方式：全自动测量、机械手抓取样品 *9、具有多核素选择测量功能，可选择125I、57Co、59Fe、75Se、ICo-I等多种放射性核素标记物测量。 10、自动排队测量，采用条码阅读自动识别技术，一次最多可设置10个检 测项目。 11、具有断电续测功能、浓度反查功能、标准曲线调用功能等。 12、具有复管测量功能，复管数最高可设置4个，提高检测准确度。 13、仪器智能化程度高，可自动进行坪、谱曲线的测量、故障自诊断提示等， 操作维护简单。 14、六种检测模式选择：放射免疫（RIA）、免疫放射（IRMA）、肝炎、TG.TM、 胰岛素系列、纯计数测量。 15、七种数据处理方式：线性内插方程、样条函数、三次多项式方程、Log-logit 方程、3/2次方程、四参数、五参数。 16、五种结合率方式：B/T、B/B0、B/Bm、F/B、B/F。 17、可编辑打印多种报告单样式，不同项目的检测结果可综合打印在一张报 告单上。 18、质控分析功能：提供批间质控、批内质控、精密度图、质控图等。 19、数据可网上传输，实现资源共享。 20、同步皮带传送样品，进样、退样不打滑。 21、利用多组光电传感器，控制机械手抓样、放样可靠方便。 22、采用条码阅读技术，实现了多项目测量的自动排队。 23、多核素的选择测量，计算机自动识别，无需旋钮调节。 24、5个探头的测量误差小于2%。 25、电路采用高度集成的模块化设计，维护方便，维修简单。注：本参数无指向性、排它性，仅为满足医院需要。 放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是以放射性核素为标记物的标记免疫分析法。于1960年由美国学者Yalow和Berson创立，并首先用于糖尿病患者血浆胰岛素含量的测定。这是医学和生物学领域中方法学的一项重大突破，开辟了医学检测史上的一个新纪元。它使得那些原先认为是无法测定的极微量而又具有重要生物学意义的物质得以精确定量，从而为进一步揭开生命奥秘打开了一条新的道路，使人们有可能在分子水平上重新认识某些生命现象的生化生理基础。此后30年，内分泌学科的飞速进展充分证明了这一超微量分析技术的巨大推动力。1977年，这项技术的发明者荣获诺贝尔生物医学奖。随后这一崭新的技术迅速渗透到医学科学的其他领域，如病毒学、药理学、血液学、免疫学、法医学、肿瘤学等，以及与医学生物学相关的学科，如农业科学、生态学及环境科学等。放射免疫分析的物质，由激素扩大到几乎一切生物活性物质。我国放射免疫分析研究起步于1962年，并迅速发展与普及，对我国生物医学的进展起了很大的促进作用。 放射免疫分析由于敏感度高、特异性强、精密度高、并可测定小分子量和大分子量物质，所以在检验医学中应用极为广泛，常用于测定各种激素（如甲状腺激素、性激素、胰岛素等）、微量蛋白质、肿瘤标志物（如AFP、CEA、CA—125、CA—199等）和药物（如苯巴比妥、氯丙嗪、庆大霉素等）等。各种检测项目均有试剂盒供应，而且仪器设备并不昂贵，所以在国内被广泛采用。但由于核素的放射性对人体有一定的危害性，必须加以防护，核素实验室的建设须经防疫部门的监督，操作人员须经过特殊训练。另外，由于核素有半衰期，试剂盒的货存期较短，因而放射免疫分析在应用中有诸多不便之处。特别是近年来其他标记免疫分析技术如酶免疫分析、发光免疫分析等在技术上有飞跃的进展，高级仪器的自动化程度已可与生化自动分析仪相媲美，因此从长远前景看，放射免疫分析有被取代的趋势。但在目前，从所需的设备和检测的费用上，放射免疫分析还有一定的优越性，还将在一定时期内被医学检验实验室所采用。 一、放射免疫分析的基本试剂 （一）标准品 标准品是放射免疫分析法定量的依据，由于以标准品的量用来表示被涮物质的量，故标准品与被测物质应当化学结构一致并具有相同免疫活性。标准品作为定量的基准。应要求高度纯化。标准品除含量应具有准确性外，还应具备稳定性，即在合理的贮存条件下保持原来的特性。 按实验要求，将标准品用缓冲液配成含不同剂量的标准溶液，用于制作标准曲线。 （二）标记物 标记抗原应具备：①比放射性高，以保证方法的灵敏度；②免疫活性好；③所用的核素的半衰期尽可能长，标记一次可较长时间使用，这对来之不易的抗原尤其重要；④标记简便、易防护。 要准确测量B与F的放射性，必须有足够的放射性强度。所选用的标记抗原的量，在使用125I时达5000～15000cpm。 （三）抗体 应选择特异性高、亲和力强及滴度好的抗体，用于放射免疫测定。 根据稀释曲线，选择适当的稀释度，一般以结合率为50%作为抗血清的稀释度。 （四）B与F分离剂 以2%加膜活性炭溶液为例，2%加膜活性炭溶液的配制： 活性炭2g（杭州木材厂生产，森工牌732型） 右旋糖酐T200.2g 纤维粘连蛋白介绍 又称纤维连接蛋白、粘连蛋白、纤粘蛋白，英文名fibronectin，英文缩写FN。它是1974年国外开始研究发现的一种高分子糖蛋白，具有多种生物学功能。FN广泛存在于动物组织和组织液中，是一种大分子糖蛋白，分子量约为450KD，具有多种生物活性。大量国内外的研究结果证明，FN 分子在进化过程中保守性很强，各种动物体液中的FN具有非常相近的结构、性质和生物学功能，因而不同来源的FN可以相互替代使用。 我国对FN的应用研究起步较晚，目前国内纤维连接蛋白（FN）主要从国外进口，我国的郑州德福恩生物技术有限公司对纤维连接蛋白（FN）进行了多年研究，现已取得了纤维连接蛋白（FN）方面的多项国家发明专利。 FN的功能主要表现在两个方面： 1、作为生化试剂，为细胞培养和生物工程的工业化应用提供基础。 2、应用于多种疾病的诊断和治疗（如伤口的修复和愈合，癌症的诊断和治等）。（一）作为生化试剂，为细胞培养及生物工程的工业化应用提供基础。FN的很多功能中，最基本最重要的一项是促进细胞的黏连生长，而细胞的黏连是机体结构得以维持、细胞生长完成的必要条件。因此，FN 是细胞培养基的重要成分之一。郑州德福恩生物技术有限公司与中国医学科学院共同应用猪血浆FN研究结果表明：FN作为细胞培养的基质，可以使多种细胞的贴壁率达到90%以上（对照组为10%），细胞形态结构良好，细胞的代谢率增强，DNA、RNA及蛋白质合成速度提高约５倍，细胞的集落率升高几倍，原代培养的成活率明显提高，细胞生长时间缩短，这对建立人体疾病的体外模型是非常有益的。研究还证明，FN能提高细胞的融合率，缩短融合周期，可应用于许多科研中，如应用于细胞杂交瘤技术等。将FN 涂到微球载体上作为细胞大量生产的介质，可以节省空间，节省原材料，成为应用培养细胞技术来生产新药品的基础物质。细胞培养技术是当今生物学研究中经常使用的方法之一，也是生物工程必不可少的手段之一。FN 产品的开发，将为细胞培养的广泛应用及生物工程的应用和发展起到积极的推动作用。FN作为生化试剂的使用量将与日俱增，市场潜力很大。目前，FN生化试剂主要由美国Sigma公司生产（人、牛、鼠血浆FN等），我国应 放射免疫分析 摘要：放射免疫技术（radio immunoassay ,RIA）类型主要包括经典的放射免疫分析(radioimmunoassay, RIA)和免疫放射分析或免疫放射度量分析( immunoradiometric assay，IRMA)。由于受接触放射性物质，损害操作人员的身体，测定完成后放射性材料的处置等问题的存在,再加上80年代初出现的非同位素标记技术得到了极大的发展和广泛应用，放射免疫技术的应用有下降的趋势。 0引言：放射性核素依衰变方式分α、β、γ三种，用于放射性标记的有β和γ两类;分别用液体闪烁计数器及γ计数器测定。目前常用的是γ型放射性核素，如125I、131I、51Cr和60Co，以125I最常用；β型放射性核素有3H、14C和32P，以3H最常用。 关键词：结构，原理，临床应用 1检测的基本结构原理、结构及其探测原理 核射线探测仪器由射线探测器和后续电子学单元两大部分组成。核射线探测器是个能量转化器，其检测原理是当射线作用于闪烁体，闪烁体吸收了射线的能量而引起闪烁体中的原子或分子激发，当受激的原子或分子退激时，则发出光子进入光电倍增管光阴极，转换为光电子，光电子在光电倍增管电场作用下到达阳极，形成电脉冲。转换模式是放射能→光能→电能→脉冲。 液体闪烁测量是在闪烁杯内进行的，放射性样品主要被溶剂和闪烁剂分子包围，射线能量先被溶剂分子吸收，受激溶剂分子退激时释放出能量激发闪烁剂，当激发态回到基态时释放出光子到达光阴极，光阴极产生光电子，在光电倍增管的电场作用下，在阳极获得大量电子，形成脉冲信号，输入后读分析电路形成数据信号，最后由计算机数据处理，求出待测抗原含量。 放射性活度测定方法放射免疫分析中经抗原抗体反应和B、F分离后通过检测放射性量来反映待测物的含量。放射性量的检测需特殊的仪器，放射免疫分析仪实际上就是进行放射性量测定的仪器。测量仪器有两类，即晶体闪烁计数仪（主要用于检测γ射线，如125I、131I、57Cr等）和液体闪烁计数仪（主要用于检测β射线，如3H、32P、14C等）。无论是晶体闪烁计数仪还是液体闪烁计数仪都是将射线（放射能）与闪烁体的作用转换成光脉冲（光能），然后用光电倍增管将光脉冲转换成电脉冲（电能），电脉冲在单位时间内出现的次数（即仪器记 第七章放射免疫分析 第一节放射免疫技术 第二节放射免疫分析 第三节免疫放射分析 第四节放射免疫分析技术的应用 第一节放射免疫技术 放射免疫分析是利用放射性核素可探测的灵敏性、精确性和抗原抗体反应特异性相结合的一种免疫技术。 早期的放射免疫技术是基于竞争性结合反应原理的放射免疫分析（RIA），稍后又发展了非竞争性结合的免疫放射分析（IRMA）。 一、基本类型及原理 1.放射免疫分析（RIA） 是以放射性核素标记的抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体为基本原理来测定待检样品中抗原量的一种分析法。 2.免疫放射分析（IRMA） 是用放射性核素标记的过量抗体与待测抗原直接结合，采用固相免疫吸附载体分离结合与游离标记抗体的非竞争放射免疫分析法。 二、常用的放射性核素 放射免疫技术常用的放射性核素有125Ⅰ、131Ⅰ、3H、14C等。使用最广泛的是125Ⅰ。 三、标志物制备及鉴定 采用放射性碘（如125Ⅰ）制备标志物的基本原理是以放射性碘原子通过取代反应置换被标志物分子中酪氨酸或酪胺残基以及组胺残基上的氢原子。 （一）标记及类型 1.直接标记法 最常用于肽类、蛋白质和酶的碘化标记，其原理是采用化学或酶促氧化反应直接将125Ⅰ结合于被标志物分子中酪氨酸残基或组胺残基上。 其特点是标记方法操作简便，容易将较多的125Ⅰ结合到被标记蛋白分子上，易得到比放射性较高的标志物。常用的方法为：①氯胺T（ch-T）法；②乳过氧化物酶标记法。 2.间接标记法 也称连接标记法（Bolton-Hunter法），是最常用的间接碘标记方法。该法主要用于甾体类化合物、环核苷酸、前列腺素等缺乏碘标记基团的小分子化合物的标记。 纯化标志物的方法有利用分子筛机制的凝胶过滤法、利用游离125Ⅰ与标志物分子极性差异进行吸附解离的离子交换层析法、按分子所带电荷和直径不同在电场作用下分子迁移速率不同进行分离纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）以及高效液相色谱法。 （二）标志物的纯化 125Ⅰ标志物反应后，标志物需进行分离纯化以去除游离125Ⅰ和其他杂质。纯化标志物的方法有利用分子碘标记血管紧张素Ⅰ放射免疫分析药盒说明书
血清层粘连蛋白和透明质酸的放射免疫分析
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初级检验士考试(临床免疫学和免疫检验)讲义第七章放射免疫分析