禽巴氏杆菌C48-3株成熟黏附蛋白基因cpm39的克隆及序列分析

盏ｒＩＴＩ’盘技术通讯…．一一～．１

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ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ

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文章编号：１００９—０００２（２００８）０１—００１７—０３

研究报告

禽巴氏杆菌Ｃ能弓株成熟黏附蛋白基因ｃｐｍ３９的克隆及序列分析

吾鲁木汗?那孜尔别克１，彭清忠１，何翠１，张磊１，严芳１，恩特马克?布拉提白１，２

１．吉首大学生物资源与环境科学学院，省部共建生物工程实验室，湖南吉首４１６０００；

２．新疆大学生命科学与技术学院，新疆生物资源基因工程重点实验室，新疆乌鲁木齐８３００４６

［摘要］目的：对禽巴氏杆菌Ｃ。¨株编码成熟黏附蛋白的基因ｃｐｍ３９进行克隆和序列分析。方法：通过ＰＣＲ从禽巴氏杆菌

Ｃ。＿３基因组ＤＮＡ中扩增出ｃｐｍ３９基因，克隆到ｐＭＤｌ８一Ｔ载体中，转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，并对目的基因进行核苷酸序列测

定；用ＣｌｕｓｔａｌＸ和Ｍｅｇａ２．１软件将测定的序列与ＧｅｎＢａｎｋ中已登录的１６种血清型巴氏杆菌株核苷酸序列进行同源性分

析。结果：测序结果表明ｃｐｍ３９基因大小为１００２ｂｐ，与已知的１６个血清型巴氏杆菌ｃｐｍ３９基因核苷酸序列的同源性为８１．５％～１００％。结论：克隆得到禽巴氏杆菌Ｃ。。株编码成熟黏附蛋白的ｃｐｍ３９基因，该基因在不同血清型巴氏杆菌中具有很高的同源性，该蛋白可以作为研制预防巴氏杆菌病亚单位疫苗的候选抗原。［关键词］

禽巴氏杆菌；成熟黏附蛋白；ｃｐｍ３９基因；克隆；同源性

［中图分类号］Ｑ７８

［文献标识码］Ａ

ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆ

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Ｎ屁喀，Ｅｎｔｏｍａｃｋ

Ｂｏｒｒａｔｈｙｂａｙｌ’２

１．ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｏｌｌｅｇｅ

ｏｆＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＪｉｓｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｓｈｏｕ４１６００；

２．Ｘｉｎｊｉａｎｇ

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ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｓｏｕｒｃｅｓａｎｄＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＸｉｎｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｕｒｕｍｕｑｉ８３００４６；Ｃｈｉｎａ

［Ａｂｓｔｒａｃｔ］０ｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ

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ｍｕｈｏｃｉｄａ；ｍａｔｕｒｅａｄｈｅｓｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎ；ｃｐｍ３９ｇｅｎｅ；ｃｌｏｎｉｎｇ；ｈｏｍｏｌｏｇｙ

多杀性巴氏杆菌（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ）是革兰阴性致病菌，能引发动物的各类疾病，如牛出血性败血症、猪萎缩性鼻炎、兔脓血症、鸟类禽霍乱和肺炎等，以及人类各种与动物叮咬有关的疾病［１－３］。禽霍乱是一种主要由Ａ：Ｉ、Ａ：３和Ａ：４血清型多杀性巴氏杆菌引起的鸡等禽类的接触性传染病，目前该病仍很难控制，给养禽业造成巨大的经济损失。预防该病所使用的灭活苗和弱毒苗均有其各自固有的缺点，灭活疫苗只诱导产生血清型特异性免疫保护，弱毒苗虽能够提供有限的异源保护，但会诱导暴发禽

霍乱闻。因此，研制安全、广谱有效的亚单位疫苗，对禽霍乱的预

防和治疗是极为重要的。

国内对巴氏杆菌的研究主要还停留在传统血清型分析和药物治疗上。恩特马克等通过猪多杀性巴氏杆菌对ＨｅＬａ细胞附着能力的研究表明，猪肺疫的灭活苗株对小鼠的毒力强于弱毒苗株，同时在灭活苗株的细胞表面存在相对分子质量（旭）为３９ｘ１０３的特异蛋白，而此蛋白在弱毒苗株中不存在，证明该蛋白与

猪巴氏杆菌的致病性相关ｔＴ］。曹素芳等对禽多杀性巴氏杆菌Ｃ。株ｏｍｐＨ基因进行克隆及原核表达，并对表达产物进行了免疫学研究，结果显示，ＯｍｐＨ蛋白具有良好的免疫原性，能诱导鸡体产生特异性性抗体，可抵抗强毒菌株Ｃ。的致死性攻毒，免疫保护效果优于禽多杀性巴氏杆菌弱毒疫苗［８－１”。

在国外，对巴氏杆菌免疫原性抗原及其致病机制进行了一系列分子生物学和免疫学研究，这些抗原物质在巴氏杆菌的致病过程中起着重要的作用。Ｌｕｏ等表达及纯化了禽巴氏杆菌Ｘ一

７３

ＯｍｐＨ蛋白，并用于免疫保护试验，结果表明外膜蛋白Ｈ只

对同型巴氏杆菌有保护作用旧。Ｌｕｏ等还对巴氏杆菌其他菌株

［收稿Ｉ／ｔ期］２００％０９—０４

［基金项目］国家自然科学基金项目（３０４４００８４）；

吉首大学引进人才科研启动基金项目（２００６０３１）

［作者简介］吾鲁木汗?那孜尔别克（１９６１－），女，哈萨克族，副教授［通讯作者］恩特马克?布拉提白，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｅｔｍｋｂ＠ｊＳＵ．ｅｄｕ．ａｌｌ

万方数据

１８Ｌ生Ｅｎ纛ＳＩＮ技ＢＩＯＴ术ＥＣＨＮ通ＯＬＯＧ讯Ｙ…Ｖ０１．１—９一一Ｎｏ．１Ｊ—ａｎ．，２…００８一

ｍＲＨ．．．，

（血清型４－１６）的ｏｍｐＨ基因进行了序列分析，并人工合成了部分肽段用作鸡抗ｘ一７３同源性菌株感染的疫苗研究，结果显示，许多合成的肽段可以诱发鸡产生对Ｘ一７３菌株感染７０％的免疫保护㈣。Ｌｅｅ等对巴氏杆菌ｏｍｐＨ全基因及３个小片段进行了克隆及原核表达，并对其进行了免疫学研究，结果表明，ＯｍｐＨ全蛋白可在小鼠体内诱导很强的免疫保护，而ＯｍｐＨ的３个小片段所诱导的免疫保护力相对较低口“。Ｂｏｙｃｅ等对不同血清型多杀性巴氏杆菌荚膜的生物合成、基因结构及其功能进行了分子水平的研究，结果证明不同疵清型多杀性巴氏杆菌的荚膜与其致病性及免疫保护性相关［１５１。

我们运用ＰＣＲ技术从我国分离得到的禽巴氏杆菌Ｃ。。株基因组中克隆出编码成熟黏附蛋白的基因ｃｐｍ３９，并对其进行了同源性分析，为Ｃ。ｃｐｍ３９基因表达及其免疫功能的研究奠定了基础。

１材料和方法

１．１材料

禽巴氏杆菌菌Ｃ。。株购自中国兽医菌种保藏管理中心；克隆载体ｐＭＤｌ８一Ｔ为大连宝生物工程公司产品；大肠杆菌ＤＨ５ｃｔ为本实验室保存。ＡｇａｒｏｓｅＧｅｌＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ、ＭｉｎｉＢｅｓｔＰｌａｓ—ｍｉｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ、ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００、彻ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰｓ，及限制性内切酶ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ均为大连宝生物工程公司产品；ＢＨＩ（ＢｒａｉｎＨｅａｒｔＩｎｆｕｓｉｏｎＢｒｏｔｈ）培养基为Ｂａｃｔｏ公司产品；ＤＳＡ（ＤｅｘｔｒｏｓｅＳｔａｒｃｈＡｇａｒ）培养基为Ｄｉｆｃｏ公司产品；其他试剂均为国产分析纯试剂。

１．２引物设计

根据ＧｅｎＢａｎｋ中已报到的禽巴氏杆菌Ｐ一１０５９Ｉ株ｃｐｍ３９基因核苷酸序列（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＥＦ２０３９０）设计引物Ｐ１（５７一ＣＡＧＧＡＴＣＣＧＣＡＡＣＡＧＴＩＴｒＡＣＡＡＴＣＡＡＧＡＣ一３７）和Ｐ２（５’一ＣＡＧＴ垡！丛ＴＴＡＧＡＡＧＴＧＴＡＣＧＣＧＴＡＡＡＣＣ一３’），分别引入ＢａｍＨＩ和ＳａｌＩ酶切位点（下划线部分），并加有２个保护碱基。引物由上海生工生物工程有限责任公司合成。

１．３巴氏杆菌基因组ＤＮＡ的制备

将Ｃ＊。株接种于１０ｍＬＢＨＩ液体培养基中，３７℃静置培养１８ｈ，按照ＣＴＡＢ法［１ｑ提取其基因组ＤＮＡ。ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＢｉｏｐｈｏ—ｔｏｍｅｔｅｒ检测结果表明，ＤｍⅡｌ／Ｄ２８‰值为１．８～２．０，符合ＤＮＡ纯度要求。

１．４目的基因的ＰＣＲ扩增和克隆

ＰＣＲ反应混合液包括１０ｘＰＣＲ缓冲液５¨Ｌ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ的

图２重组质粒ｐＭＤｌ８－ｅｐｍ３９的ＰＣＲ鉴定

Ｍ：ＤＬ２０００；１：以菌液为模板的扩增产物；２：以无菌水为模板的阴性对照ＭｇＣｌ２３斗Ｌ、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰｓ２ｔｘＬ、３０ｐｍｏｌ／ｐ，Ｌ的上下游引物各１卜Ｌ、２０ｎｇ／斗Ｌ的基因组ＤＮＡｌ斗Ｌ、５Ｕ／ｐ，Ｌ的ＴａｑＤＮＡ聚合酶０．２５斗Ｌ，加去离子无菌水至５０斗Ｌ，混匀。反应条件为：９４℃预变性５ｍｉｎ，然后以９４℃５ｓ、５５℃１ｒａｉｎ、７２℃１ｒａｉｎ进行３５个循环，最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。用１％琼脂糖凝胶电泳分析ＰＣＲ产物，并用ＤＮＡ回收试剂盒纯化ＰＣＲ产物。将ＰＣＲ纯化产物与ｐＭＤｌ８一Ｔ载体连接，转化大肠杆菌ＤＨ５ａ感受态细胞，然后按常规方法涂在预制备好的含１００｝ｘｇ／ｍＬ氨苄青霉素的ＬＢ琼脂平板上培养１８ｈ。用菌落ＰＣＲ法初步筛选含有目的基因的重组子，再经ＢａｍＨＩ、．ｓ耐Ｉ双酶切鉴定，以获得重组质粒ｐＭＤｌ８－ｃｐｍ３９。

１．６目的基因序列测定及其同源性分析

将鉴定正确的重组质粒ｐＭＤｌ８一ｃｐｍ３９送上海生工生物工程有限责任公司进行序列测定。根据测序结果，用Ｂｌａｓｔ搜索软件从ＧｅｎＢａｎｋ数据库中调出相似性较高的１６个不同血清型巴氏杆菌株的ｃｐｍ３９基因序列，用ＣｌｕｓｔａｌＸｔｌ７１进行多序列匹配比对，通过Ｍｅｇａ２．１软件进行分子进化树的构建和同源性分析。

２结果

２．１ｃｐｍ３９基因的ＰＣＲ扩增

用ｃｐｍ３９基因特异性引物进行ＰＣＲ扩增，扩增产物经１．０％的琼脂糖凝胶电泳分析，显示扩增片段大小约１０００ｂｐ，与预期结果相符（图１）。

２．２重组质粒的ＰＣＲ及酶切鉴定

随机挑取单个白色菌落悬浮于２０斗Ｌ无菌水中，取１恤Ｌ菌液为模板进行ＰＣＲ鉴定，琼脂糖电泳检测结果见图２，出现一

图１ｅｐｍ３９基因片段的ＰＣＲ产物琼脂糖凝胶电泳图谱Ｍ：１００ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒＭａｒｋｅｒ；１：ｃｐｍ３９基因片段的扩增产物

２：以无菌水为模板的阴性对照

图３重组质粒ｐＭＤｌ８一ｃｐｍ３９的酶切鉴定

Ｍ：ＤＬ２０００；１，２：ｐＭＤｌ８一ｃｐｍ３９的酶切产物万方数据

吾鲁木汗?那孜尔别克等：禽巴氏杆菌Ｃ。¨株成熟黏附蛋白基因ｃｐｍ３９的克隆及序列分析

条约ｌ０００ｂｐ的片段。重组质粒ｐＭＤｌ８一ｃｐｍ３９的ＢａｍＨＩ、Ｓ耐

Ｉ双酶切鉴定结果见图３，出现约２．６ｋｂ的ｐＭＤｌ８一Ｔ线性片段

与１．０ｋｂ左右的插入片段，均与预期结果相一致，初步证明重组

质粒构建成功。

２－３序列测定及其同源性分析

测序结果表明，禽多杀性巴氏杆菌Ｃ。。株成熟黏附蛋白

ｃｐｍ３９基因核苷酸序列（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＥＦ６３５５９６）长ｌ００２

ｂｐ，编码３３３个氨基酸残基，预期胆约为３６ｘ１０３，接近于巴氏杆

菌天然黏附蛋白。将其与从ＧｅｎＢａｎｋ数据库调集的１６个血清型

巴氏杆菌株的ｃｐｍ３９序列比较，采用ＣｌｕｓｔａｌＸ进行多序列匹配

对比，通过Ｍｅｇａ２．１软件构建系统进化树如图４。结果表明，Ｃ。

，株与血清型１４株处于一个分支，二者与血清型１形成一个独

立的进化分支，Ｃ鹏。株ｃｐｍ３９序列与其他血清型巴氏杆菌株的

ｃｐｍ３９核苷酸序列的同源性为８１．５％～１００％，说明该基因在不同

血清型巴氏杆菌中具有很高的保守性。

３讨论图４巴氏杆菌ｃｐｍ３９基因的分子进化树分析

ｓｅｒｏｔｙｐｅ

５

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Ｃ４８－３

ｓｅｒｏｔｙｐｅ

１

恩特马克等的研究证明，禽巴氏杆菌血清型Ａ菌株的荚膜厚度和尬为３６ｘ１０３的蛋白含量与该菌对鸡胚成纤维细胞的黏附和致病力直接相关，即尬为３６ｘ１０３的蛋白的特异性抗体显著地抑制巴氏杆菌对宿主细胞的附着［１８］。恩特马克等为了克隆和表达编码Ｃｐｍ３９蛋白的基因，构建了Ｐ一１０５９Ｉ株的表达型基因组文库，以该蛋白的特异性抗体为探针，从文库中筛选得到编码尬为３９ｘ１０３的荚膜蛋白ｃｐｍ３９基因，同源性分析结果表明，Ｐ一１０５９１株ｃｐｍ３９基因序列与Ｘ一７３株ｏｍｐＨ基因序列完全相同，表达的Ｃｐｍ３９蛋白仍有黏附因子功能口犁９－２０］。Ｈｕｓｓａｍ等为了定位该蛋白在细菌细胞中的位置，用尬为３９ｘ１０３的蛋白的单克隆抗体，采用免疫电镜技术观察该蛋白在细菌细胞中的定位时发现，弘为３９ｘ１０３的蛋白定位在细胞壁外层的荚膜中（２ｌ－９。以上研究结果证明，尥为３９ｘ１０３的蛋白是巴氏杆菌对鸡胚成纤维细胞的黏附因子，其定位在细胞壁外层的荚膜中，因此，我们将该蛋白命名为胆为３９ｘ１０３的荚膜蛋白（ｃａｐｓｕｌａｒｐｒｏｔｅｉｎ３９，Ｃｐ３９）。

本研究以自我国内蒙古禽霍乱鸡分离得到的血清型Ａ：Ｉ的强毒株Ｃ。为材料，从Ｃ。。株基因组中成功地克隆得到编码成熟黏附蛋白基因ｃｐｍ３９，而且在１６种血清型巴氏杆菌中具有很高的同源性，为进一步研究该蛋白的原核表达及其免疫功能奠定了基础。参考文献

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ｔｅｃｔｉｖｅ

ｉｍｍｕｎｉｔｙａｇａｉｎｓｔ

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ａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｓ［Ｊ］．ＪＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０００，８３：１５３一１６０．『１７１ＴｈｏｍｐｓｏｎＪＤ，ＧｉｂｓｏｎＴＪ，Ｐ１ｅｗｎｉａｋＦ．ＴｈｅＣｌｕｓｔａｌＸｗｉｎｄｏｗｓｉｎｔｅｒｆａｃｅ：ｆｌｅｘｉｂｌｅｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒｍｕｌｔｉｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔａｉｄｅｄｂｙｑｕａｌｉｔｙａｎａｌｙｓｉｓｔｏｏｌｓ［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，１９９７，２４（４）：８７６－８８８．［１８］ＢｏｒｒａｔｈｙｂａｙＥ，ＳａｗａｄａＴ，ＫａｔａｏｋａＹ，ｅｔａ１．Ｃａｐｓｕｌｅｔｈｉｃｋｎｅｓｓａｎｄａｍｏｕｎｔｏｆａ３９ｋＤａｐｒｏｔｅｉｎｏｆａｖｉａｎＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｈｏｃｉｄａｔｙｐｅＡｓｔｒａｉｎｓｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｉｒｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｆｏｒｃｈｉｃｋｅｎｓ［Ｊ］．ＶｅｔＭｉ—ｃｒｏｂｉｏｌ，２００３ａ，９７：２１５－２２７．

［１９］ＢｏｒｒａｔｈｙｂａｙＥ，ＳａｗａｄａＴ，ＫａｔａｏｋａＹ，ｅｔ０１．Ａ３９ｋＤａｐｒｏｔｅｉｎｍｅｄｉａｔｅｓａｄｈｅｓｉｏｎｏｆａｖｉａｎＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｈｏｃｉｄａｔｏｃｈｉｃｋｅｎｅｍｂｒｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＶｅｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００３ｂ，９７：２２９－２４３．

［２０】ＢｏｒｒａｔｈｙｂａｙＥ，ＳｕｚｕｋｉＫ，ＳａｗａｄａＴ，ｅｔⅡｆ．Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｇｏｆｃｐ３９ｇｅｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａｃａｐｓｕｌａｒｐｒｏｔｅｉｎａｓａｎａｄｈｅｒｅｎｃｅｆａｅｔｏｒ［Ｊ１．ＢｕｌｌｅｔｉｎＮｉｐｐｏｎＶｅｔＺｏｏｔｅｃｈｎｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，２００４，５３：８９．

［２１］ＨｕｓｓａｍＡｌ－ｈａｊＡｌｉ，ＳａｗａｄａＴ，ＮｏｄａＫ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｉｔｙｏｆａｎｉｍ—ｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ—ｐｕｒｉｆｉｅｄ３９ｋＤａｃａｐｓｕｌａｒｐｒｏｔｅｉｎｏｆａｖｉａｎＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｈｏｃｉｄａｉｎｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，２００４，６６（１２）：１６０３—１６０４．

【２２］ＨｕｓｓａｍＡ１一ｈａｊＡｌｉ，ＳａｗａｄａＴ，ＨｉｔｏｓｈｉＨ，ｅｔ０１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａ３９ｋＤａｃａｐｓｕｌａｒｐｒｏｔｅｉｎｏｆａｖｉａｎＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａｕｓｅｍＯＢ—ｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ［Ｊ］．ＶｅｔＭｉｃｒｏｂｉ０１．２００４．１００：４３—５３．

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