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微载体上MRC-5细胞扩大培养的研究

微载体上MRC-5细胞扩大培养的研究

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BIOTECHWORLD 生物技术世界mrc-5细胞是来源于一个27岁的健康妇女(瑞典)的14周男性胚胎,该细胞核型为46XY,衰老期为48群体倍增代。MRC-5原始种子库为7代细胞,共481支。2005年该委员会向WHO建议并被批准建立了新的细胞库,细胞代次为12代。MRC-5细胞株是世界卫生组织(World Health Organization,WHO)推荐的可以用于人用疫苗生产的标准人二倍体细胞株,其免疫原性好,具有良好的耐受性,无异种移植致癌性,无外源因子污染,其规模化培养适宜生产多种病毒性疫苗。到目前为止,mrc-5细胞被世界各地很多疫苗生产厂家用于疫苗生产,比如人二倍体细胞狂犬疫苗(HDCV)。

1 材料

1.1 生物反应器

中国广州奇志公司生产的BC-15L(工作体积12L)以及BC-100L型(工作体积80L)微载体培养系统。

1.2 细胞

中国成都康华生物制品有限公司MRC-5工作细胞库细胞,23代。

1.3 微载体

GE公司的cytodex I 型,按照厂家指导进行制备和灭菌处理,使用浓度5g/l-15g/l。

1.4 培养液

日本株式会社的MEM培养液,补加10%的小牛血清(山西太原润生),0.03%L-谷氨酰胺,1%非必须氨基酸(Gbico)。

1.5 消化液

0.01%EDTA-0.25%胰蛋白酶溶液。

1.6 细胞洗涤液

pH7.2 0.01mol/l PBS溶液

2 方法

2.1 mrc-5细胞的准备

将MRC-5细胞复苏,并在2000ml K氏瓶中培养扩增,培养条件为pH7.2—7.4、36-37℃、3%-5%CO2、待细胞长成致密单层后,消化、收集细胞悬液。

2.2 微载体培养mrc-5细胞

2.2.1 微载体处理

cytodex I型微载体,按照GE公司说明将微载体用pH7.2 0.01mol/LPBS水化膨胀,高压灭菌,用培养液置换1-2次后,浸泡2小时以上,备用。

2.2.2 细胞接种

将细胞悬液接种到BC-15L细胞培养罐内,接种密度(1×105个/ml),培养浓度5g/L。设置好培养参数(温度37℃,pH7.2,DO50%,转速40rpm)进行培养,每天更换营养液,细胞在微载体上长

满单层后可进行二级放大。

2.2.3 微载体培养二级放大

种子罐细胞长满后,用PBS洗涤细胞三次,加入0.01%EDTA-0.25%胰蛋白酶溶液(30ml/g)消化细胞,转速150rpm,消化5、10、15、20分钟后取样观察细胞状态并测定细胞活力,细胞从载体上脱离下来后,按比例将细胞悬液转入到BC-100L细胞培养罐扩增,设置好培养参数进行培养。

2.3 台盼蓝染色法计细胞密度和活力

健康的细胞能够排斥台盼蓝,而死亡细胞被台盼蓝染成蓝色,依据此原理可通过血球计数板在显微镜下直接计数,来判断细胞的存活率。

3 结果

消化cytodex1上的细胞,5min,10min,15min,20min时取样观察细胞消化状态并拍照,测定细胞活力(图1)。

加入消化液后,高速搅拌使消化液均匀作用于每个微载体上的细胞,同时也对微载体上的细胞产生剪切力,至细胞损伤,降低细胞的活力,所以选择一个可接受的消化状态对微载体的二级放大是非常重要的,因为如果载体上的细胞未完全脱落时,或是细胞成团状而未成单个细胞悬液时,又或是细胞消化过度活力降低时都会影响细胞的再次贴壁和培养。

从上图我们可以发现,当加入消化液5min微载体大多聚集在一起,成团状,细胞有回缩现象,仅少数细胞脱离载体,处理10min,载体上80%的细胞已经脱落,细胞活力95%,处理15min,细胞95%从微载体上脱落,且形成单个分散的悬液,细胞活力92%,处理20min,细胞完全脱离微载体,此时的细胞活力为85%。因此,选择0.01%EDTA-0.25%胰蛋白酶消化液作用15min作为mrc-5细胞微载体消化的最佳时间。

4 讨论

生物反应器微载体培养过程从实验室规模放大到中试甚至于

工业化生产规模的过程中,如何有效的放大一直是生产中的难点(1)。有报道研究是在微载体培养过程中直接将上一级培养物(长满细胞的微载体)作为种子接入到下一级生物反应器中,通过在旧球和新球的重新分配而实现扩大培养(2),这种培养方法的优点在于操作简单,污染机会小,微载体利用率高,可以连续使用,但是新旧载体上的细胞处于不同的生长状态,最终旧载体上长满细胞而新载体尚未长满,空球率高,细胞生长没有明显的对数生长期,这反应了细胞群体中细胞的生理状态有明显的差别,细胞代次不一致,不符合于药品生产的要求。试验结果表明使用0.01%EDTA-0.25%胰蛋白酶消化液在BC-15L生物反应器内150rpm,消化10-15钟可获得活力高且分散均匀的mrc-5细胞悬液。参考文献

[1] Kunitake R,Suzuki A,Lchihashi H,et al.Fully-automated roller bottle handling system for large scale culture of mammalian cells(j).J Biotechonology,1997,52(6):289-191.

[2] Wang Y.Quyang F.Bead-to-bead transfer of Vero cells in microcarrier cultrure(J).Cytotechology,1999,31(31):221-224.

微载体上MRC-5细胞扩大培养的研究

陈余娟

(四川大学生物治疗国家重点实验室 四川成都 610100)

摘要:通过研究摸索微载体上人二倍体细胞mrc-5的扩大培养,以期达到规模化生产病毒性疫苗的目的。本文对mrc-5细胞在微载体上的持续放大提出了一种新的思路,即“球转球”

微载体上MRC-5细胞扩大培养的研究

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,这就是将微载体上长满的mrc-5细胞全部消化下来,制备成细胞悬液,按照合适的比例转入到新的微载体上继续扩大培养。

微载体上MRC-5细胞扩大培养的研究

关键词:

微载体上MRC-5细胞扩大培养的研究

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mrc-5细胞 微载体 规模化培养 cytodex I

微载体上MRC-5细胞扩大培养的研究

中图分类号:Q2-3

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文献标识码:A

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文章编号:1674-2060(2015)05-0001-01

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作者简介:陈余娟(1983—),四川成都人,研究生,成都康华生物制品有限公司,研究方向:生物医学。

5min 10min 15min 20min

图2