DNA和蛋白质甲基化酶与发育
甲基化是细胞内普遍发生的一种修饰过程和反应，包括核酸甲基化和蛋白质甲基化等，甲基化在基因表达调控以及细胞分化等生命过程中起着重要的作用。
ＤＮＡ甲基化是由甲基转移酶介导，将胞嘧啶（Ｃ）变为５－甲基胞嘧啶（５ｍＣ）的一种反应。哺乳动物细胞中已知有活性的ＤＮＡ甲基化酶（ＤＮＭＴ）有３种，它们是ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３ａ和ＤＮＭＴ３ｂ。维持型甲基化酶ＤＮＭＴ１保持甲基化形式的遗传；重新甲基化酶ＤＮＭＴ３ａ和ＤＮＭＴ３ｂ可以改变甲基化的形式［１］。ＤＮＡ甲基化在基因表达调控、细胞增殖、分化、发育、基因组印迹以及基因突变等方面都起着重要作用［１－４］。
蛋白质甲基化（如组蛋白甲基化）是基因调控的重要途径，它可以调控染色质结构，在基因转录过程中起重要的调节作用［５，６］；另外组蛋白的甲基化还同Ｘ染色体的失活和异染色质的形成有关［７］。蛋白质甲基化通常发生在特定的氨基酸残基上，比较常见的是在精氨酸和赖氨酸残基上。精氨酸甲基化有２种模式：一种是单甲基化；另一种是双甲基化（也称二甲基化），而双甲基化又可以分为非对称甲基化（ａＤＭＡ）和对称甲基化（ｓＤＭＡ）［８］。赖氨酸的甲基化模式分为３种：单甲基化、双甲基化和三甲基化。蛋白质精氨酸甲基化酶（ＰＲＭＴ）和蛋白质赖氨酸甲基化酶是催化组蛋白甲基化的２种主要酶。
蛋白质精氨基酸甲基化酶按照他们催化的产物分为２类，第１类蛋白质精氨酸甲基化酶催化的产物为不对称的二甲基精氨酸，第２类蛋白质精氨酸甲基化酶催化的是对称的二甲基精氨酸［８］。第１类包含至少５种酶：ＰＲＭＴ１、ＰＲＭＴ２、ＰＲＭＴ３、ＣＡＲＭ１（ＰＲＭＴ４）和ＰＲＭＴ６；ＰＲＭＴ５属于第２类。第１类酶在ＤＮＡ的复制、信号转导、ＤＮＡ修复以及蛋白质的翻译中的作用很早就被发现了，最近的研究还发现其与蛋白质的细胞定位也有密切关系［９］。第２类酶的一个重要的作用是催化Ｓｍ蛋白甲基化形成小核糖核蛋白（ｓｎＲＮＰｓ），参与细胞内前体ＲＮＡ的剪切。另外小鼠ＰＲＭＴ５和果蝇Ｄａｒｔ５（人ＰＲＭＴ５同源基因）在生殖细胞的发生和形成以及维持雄性生育能力等方面起着重要的作用［１０，１１］。
１ＤＮＡ甲基化酶
１．１ＤＮＭＴ１
ＤＮＭＴ１的主要作用是在细胞分裂过程中新合成并维持ＤＮＡ的甲基化模式，是ＤＮＡ复制中保持甲基化模式所必需的，在维持ＤＮＡ甲基化和保持基因组稳定性方面有着重要作用。ＤＮＭＴ１优先作用于半甲基化的ＤＮＡ，对于未甲基化的ＤＮＡ亦具有甲基化能力。如果抑制Ｄｎｍｔ１基因在细胞中的表达，细胞ＤＮＡ的复制受到抑制。Ｄｎｍｔ１的缺失激活了一系列基因毒性应激检验点蛋白，导致检验点激酶１和２（Ｃｈｋ１，－２）的磷酸化，γＨ２ＡＸ焦点形成，胞分裂控制蛋白２５ａ（ＣＤＣ２５ａ）降解［３］。
１．２ＤＮＭＴ３ａ和ＤＮＭＴ３ｂ
ＤＮＭＴ３ａ和ＤＮＭＴ３ｂ是从头甲基化酶，主要作用是建立新的甲基化模式，在体外具有将甲基加到未甲基化ＤＮＡ上的功能［１，２］。Ｄｎｍｔ３ａ和３ｂ均含有多个转录起始点（ＴＳＰ），分别受到多个启动子的调控，这些启动子均缺少典型的ＴＡＴＡ序列。Ｄｎｍｔ３ａ至少含有４个ＴＳＰ，受控于３个不同的启动子。Ｄｎｍｔ３ｂ至少含有２个ＴＳＰ，受控于２个启动子。ＤＮＭＴ３ａ和ＤＮＭＴ３ｂ常在胚胎细胞或一些新生细胞的生长发育阶段大量表达。除从头甲基化作用，ＤＮＭＴ３ａ和３ｂ还会在ＤＮＡ复制过程种将一些ＤＮＭＴ１遗漏的ＤＮＡ甲基化。Ｄｎｍｔ３ａ普遍存在于大部分成人的组织细胞中；而Ｄｎｍｔ３ｂ，除了睾丸、甲状腺和骨髓，在其他各种组织中表达很少。Ｄｎｍｔ３ａ和Ｄｎｍｔ３ｂ的缺失和异常都会造成胚胎的发育异常和疾病的产生［１，１３］。ＤＮＭＴ３家族还有一个新的成员ＤＮＭＴ３Ｌ，与ＤＮＭＴ３ａ和３ｂ具有高度同源性，但缺乏甲基化转移酶活性，其主要作用是促进ＤＮＭＴ３ａ和３ｂ的甲基化作用［１２］。１．３ＤＮＡ甲基化酶与早期胚胎发育
ＤＮＡ甲基化酶在胚胎的发育过程中起着重要的作用。Ｄｎｍｔ３ａ和Ｄｎｍｔ３ｂ在胚胎发育的不同时期均有表达，Ｄｎｍｔ３ｂ在胚泡内细胞团和外胚胎层细胞均有表达，而Ｄｎｍｔ３ａ则存在于胚胎发育过程的１０ｄ以后所有细胞中。在已分化细胞和成体组织中Ｄｎｍｔ３ａ和Ｄｎｍｔ３ｂ都是低表达的，而且Ｄｎｍｔ３ｂ的表达水平明显低于Ｄｎｍｔ３ａ。Ｄｎｍｔ１纯合子突变的小鼠胚胎，会出现胚胎的异常发育以及死亡，其原
ＤＮＡ和蛋白质甲基化酶与发育
陈伟伟曹梦西杨玉慧赵浩斌＊
（华中师范大学生命科学学院遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室，湖北武汉４３００７９）
摘要甲基化在ＤＮＡ分子和蛋白质中普遍存在，是细胞中一种普遍而重要的修饰方式，分别由ＤＮＡ甲基化酶和蛋白质甲基化酶完成。ＤＮＡ甲基化酶不仅在维持ＤＮＡ甲基化和基因组稳定性等方面起着重要的作用，还在哺乳动物的早期胚胎发育过程中扮演着重要的角色。蛋白质甲基化酶目前了解比较多的是蛋白质精氨酸转移酶和赖氨酸转移酶，它们都参与组蛋白甲基化，在基因转录过程中起着重要的调节作用。蛋白质精氨酸转移酶还在ＲＮＡ加工、信号传导、蛋白质定位以及生殖细胞发生过程中起着重要的作用。
关键词ＤＮＡ甲基化酶；蛋白质精氨酸甲基化酶；组蛋白甲基化；发育
中图分类号Ｑ５５５文献标识码Ａ文章编号１００７－５７３９（２００８）１４－０１９５－０２
基金项目教育部留学回国人员科研启动基金。
作者简介陈伟伟（１９８２－），男，湖北黄冈人，硕士研究生。研究方向：发
育生物学。
＊通讯作者
收稿日期２００８－０５－２２
１９５
因是ＤＮＡ甲基化水平降低、甲基化模式紊乱以及等位基因丢失。缺失Ｄｎｍｔ３ａ和Ｄｎｍｔ３ｂ的小鼠均出现不同的发育缺陷，Ｄｎｍｔ３ｂ的缺失会造成严重的表型缺陷，而Ｄｎｍｔ３ａ影响相对较小［１３］。
２蛋白质精氨酸甲基化酶
２．１ＰＲＭＴ１
在哺乳动物中，ＰＲＭＴ１是最主要的第１类蛋白质精氨酸甲基化酶，约３００－４００ＫＤ。ＰＲＭＴ１与细胞分裂有关。它与Ｂ细胞转位基因１（Ｂ－ｃｅｌｌｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｇｅｎｅ１，ＢＴＧ１）以及ＢＴＧ２结合发挥作用，ＢＴＧ１和ＢＴＧ２可以调节ＰＲＭＴ１的活性，ＢＴＧ１和ＢＴＧ２是细胞生长的负调节因子，其过量表达会导致细胞生长的停滞。在酵母中，当ＨＭＴ１（ＰＲＭＴＩ同源）发生突变时会导致酵母细胞死亡［１４］。
ＰＲＭＴ１在信号传导过程中也起着一定的作用。ＩＦＮａ／ｂ受体通过ＪＡＫ－ＳＴＡＴ途径转导ＩＦＮ信号，主要导致细胞生长抑制和抗病毒效应。当ＳＴＡＴ被磷酸化后，发生聚合成为活化的转录激活因子，进入胞核内与靶基因结合，促进ＩＦＮａ／ｂ转录。ＰＲＭＴ１能够结合并催化ＳＴＡＴ１、Ａｒｇ－３１的甲基化。ＭＴＡ（ＰＲＭＴ１抑制剂）抑制ＰＲＭＴ１的作用，ＩＦＮａ／ｂ转录水平下降，说明ＰＲＭＴ１催化的ＳＴＡＴ１甲基化是ＩＦＮａ／ｂ转录的首要条件［１５］。
在蛋白质的细胞定位中，ＰＲＭＴ１也发挥作用。精氨酸甲基化可以调控ＲＮＡ螺旋酶Ａ（ＲＨＡ）的核质转位。ＲＨＡ的Ｃ端包含１个由１１０个氨基酸组成的细胞核转运结构域（ＮＴＤ），其中含有精氨酸残基。ＲＨＡ和ＰＲＭＴ１可以物理的结合在一起而甲基化。精氨酸甲基化抑制剂可以消除ＮＴＤ引导的蛋白质进入核内；但体外甲基化的ＮＴＤ－ＧＳＴ融合蛋白不受抑制剂的影响，所有的ＮＴＤ－ＧＳＴ结合蛋白都能进入细胞核。去除ＲＨＡ的Ｃ端精氨酸残基可以使ＮＴＤ进入细胞核而不受甲基化抑制剂的影响［９］。
２．２ＰＲＭＴ５
ＰＲＭＴ５可催化Ｓｍ蛋白Ｂ／Ｂ＇、Ｄ１、Ｄ３和类Ｓｍ蛋白ＬＳｍ４甲基化，Ｓｍ蛋白的甲基化影响其与ＳＭＮ蛋白的Ｔｕｄｏｒ结构域结合。降低ＰＲＭＴ５的水平会导致Ｓｍ蛋白ｓＤＭＡ水平的降低［１０］。Ｓｍ蛋白是小核糖核蛋白（ｓｎＲＮＰｓ）的重要组成部分，表明ＰＲＭＴ５在前体ＲＮＡ的剪切中发挥作用。
ｄａｒｔ５是ｐｒｍｔ５在果蝇中的同源基因，ｄａｒｔ５对于雄性精母细胞的成熟和雌性生殖细胞的形成是必需的。ｄａｒｔ５的突变会导致极细胞不能形成，Ｔｕｄｏｒ的定位遭到破坏。雌性生殖细胞系细胞中ｄａｒｔ５的特异表达可以挽救极细胞的形成。非特异的广泛表达ｄａｒｔ５可以挽救Ｓｍ蛋白的ｓＤＭＡ修饰，并可以挽救雄性的育性［１０］。
Ｐｒｍｔ５在小鼠生殖细胞分化中也起重要作用，它与生殖细胞的转录调控有关。Ｂｌｉｍｐ１已经被证实是鼠原生殖细胞（ＰＧＣ）发生的重要的决定基因，研究发现，ｂｌｉｍｐ１的作用是通过Ｐｒｍｔ５而实现的。Ｂｌｉｍｐ１和Ｐｒｍｔ５相互作用，使组蛋白Ｈ２Ａ和Ｈ４甲基化。在胚胎发育的８．５ｄ，Ｂｌｉｍｐ１－Ｐｒｍｔ５引起ＰＧＣＨ２Ａ／Ｈ４Ｒ３处于高水平的甲基化。但在生殖细胞非遗传再程序化强烈进行的１１．５ｄ，Ｂｌｉｍｐ１－Ｐｒｍｔ５从细胞核转移到细胞质，导致ＰＧＣＨ２Ａ／Ｈ４Ｒ３甲基化消失［１１］。
３组蛋白甲基化
组蛋白甲基化是指发生在Ｈ３和Ｈ４组蛋白Ｎ端精氨酸或者赖氨酸残基上的甲基化，由组蛋白甲基转移酶介导催化。
Ｈ３Ｋ９是Ｈ３组蛋白的主要甲基化位点，Ｓｕ（ｖａｒ）３－９蛋白是在研究果蝇位置花斑效应（ＰＥＶ）时发现的一些抑制子，是果蝇中发现的第１个组蛋白赖氨酸甲基转移酶，能特异地使Ｈ３Ｋ９甲基化［１６］。在鼠中，ＳＵＶ３９ｈ１和ＳＵＶ３９ｈ２可使Ｈ３Ｋ９在异染色质上发生甲基化，这一修饰募集异染色质蛋白１（ＨＰ１）。表明ＳＵＶ３９ｈ１／ＳＵＶ３９ｈ２的甲基化作用与异染色质的形成有关，同时还发现如果ＳＵＶ３９ｈ１／ＳＵＶ３９ｈ２同时发生突变，会导致有丝分裂过程中染色体分离的缺陷［１７］。组蛋白甲基转移酶亦参与Ｘ染色体的失活。在胚胎干细胞中，组蛋白Ｈ３赖氨酸２７三甲基化（Ｈ３Ｋ２７ｍ３）和Ｈ４赖氨酸２０单甲基化（Ｈ４Ｋ２０ｍ１）与Ｘｉｓｔ的表达相关联，并标示Ｘ染色体失活的开始［７］。
组蛋白甲基化和ＤＮＡ甲基化这两个过程怎样协同调控基因表达尚无合理的解释。Ｈ３Ｋ９的甲基化与ＤＮＡ的甲基化在基因的沉默机制中具有协同作用，而Ｈ３Ｋ４的甲基化拮抗ＤＮＡ甲基化所产生的基因沉默［１８］。最近的研究发现，哺乳动物等位常染色体基因Ｈｐ１蛋白能促进它们的协同作用，Ｈｐ１蛋白和ＤＮＡ甲基转移酶（ＤＮＭＴ），即ＤＮＭＴ１之间也存在相互作用，它可激发ＤＮＡ甲基化活性。ＤＮＭＴ１可依次加强Ｈｐ１蛋白与甲基化组蛋白相结合［１９］。
４甲基化与肿瘤
肿瘤的发生与ＤＮＡ的甲基化有着密切关系，肿瘤组织通常都存在ＤＮＡ甲基化紊乱，包括与细胞周期密切相关的癌基因低甲基化和抑癌基因高甲基化。Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ等发现在人的正常组织中，ＤＮＭＴ１，３ａ和３ｂ正常表达，但在肿瘤组织中过量表达［１］。Ｄｎｍｔ１的一个重要作用就是维持ＣｐＧ的正常甲基化，Ｄｎｍｔ１过表达导致ＣｐＧ岛甲基化紊乱而引起基因表达调控的紊乱［２０］。Ｓｕｖ３９ｈｌ／２剔除的鼠基因不稳定，染色体错误分离，导致Ｂ细胞淋巴瘤。Ｓｕｖ３９ｈ１／２与视网膜胶质瘤蛋白（Ｒｂ）共同调节周期蛋白Ｅ的基因表达，Ｓｕｖ３９ｈ１／２的功能下调可能导致增殖失控而发生癌变［１７］。ＳＭＹＤ３也是组蛋白甲基化酶，它在结直肠癌和肝癌细胞中也过量表达。把ＳＭＹＤ３基因引入培养的ＮＩＨ３Ｔ３细胞，细胞生长增强，而该基因表达的降低导致细胞生长的显著抑制［２１］。
ＤＮＡ的甲基化和蛋白质甲基化在细胞内具有广泛的调节作用，在生物生殖、发育中也起重要作用。随着研究的深入，越来越多的甲基化酶及甲基化的功能将被发现，将使人们对基因表达调控以及生殖、发育、癌症发生等有更深层次的生物学认识，为肿瘤等疾病治疗提供一条新的思路。
５参考文献
［１］ＲＯＢＥＲＴＳＯＮＫＤ，ＵＺＶＯＬＧＹＩＥ，ＬＩＡＮＧＧ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｈｕｍａｎ
（下转第１９９页）
１９６
组别增重ｋｇ每头耗料ｋｇ饲料单价元／ｋｇ饲料成本元／千克增重增加纯收入
元／头１
４．６９９．６８１．６３３．３６０．９３２５．１５１０．４４１．６４３．３３３．３７３５．３２１０．０７１．６５３．１２５．７６４５．３８９．９９１．６６３．０９６．３４对照
４．５４
９．６１．６０３．３８０
注：仔猪料１．６０元／ｋｇ，仔猪价９元／ｋｇ。
表３经济效益分析
饲料单价影响不大，每千克增重饲料成本因添加锌而有所下降，加上可减少用药，经济效益明显提高，分别较对照组提高３．６％、１４．６％、２２．６％和２４．９％。３讨论
３．１添加锌对断奶仔猪生长发育的影响
饲料中添加锌能显著促进增重，提高饲料的利用率，减少腹泻。在饲料中添加３０００ｍｇ／ｋｇ和３５００ｍｇ／ｋｇ锌时分别提高增重１７．２％和１８．５％，饲料转化率均高于对照组。３．２添加锌对血清生物化学指标的影响
各组仔猪血清钙、磷和尿素氮含量均在正常范围内，各组间无显著差异。这表明日粮中添加锌不影响钙、磷代谢和蛋白质合成，说明锌可通过提高血清锌的含量，进而促进仔猪的生长。因为试验中血清锌水平显著高于对照组。３．３添加锌制剂的经济效益
锌制剂生产成本低，使用方便，可直接混入饲料，提高养殖业的经济效益。本试验采用的基础日粮水平较低；若采用高水平日粮时，锌制剂在３５００ｍｇ／ｋｇ以内短期有效，且减少耗料量，但增重和提高饲料转化率。因此，建议防治锌的沉积，短期应用，无副作用。４参考文献
［１］上海医学化验所．临床生化检验［Ｍ］．上海：上海科学技术出版社，１９８２．（上接第１９７页）
联产物的量很少，从这也可说明有部分偶联产物已交联成功。３参考文献
［１］蔡勤仁，曾振灵，杨桂香．兽药残留免疫检测技术应用进展［Ｊ］．动物医
学进展，２００２，２３（２）：２５－２８．［２］赵肃清，孙远明，乐学义，等．农药人工抗原合成的研究进展［Ｊ］．农药，２００２，４１（３）：９－１１．
［３］国家药典委员会．中华人民共和国药典２００５年版．二部［Ｍ］．北京：化学工业出版社，２００５
［４］葛宝坤，
王云凤，常春艳，等．测定鸡肉、水产品中４种硝基呋喃类药物残留量的固相萃取一液相色谱法［Ｊ］．分析测试学报，２００３，２２（５）：９１－９３．
［５］ＲＯＢＥＲＴＪ，ＭＣＣＲＡＣＫＥＮＤ＇ＧＬＥＮＮＫＥＮＮＥＤＹ．ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｆｕｒａｚｏｌｉｄｏｎｅｉｎａｎｉｍａｌｆｅｅｄｓｕｓｉｎｇｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｗｉｔｈＵＶａｎｄｔｈｅｒｍｏｓｐｒａｙｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＡ，
１９９７（７７１）：３４９－３５４．［６］张心会，
冯玉明，蔡根法．ＨＰＬＣ法测定动物源性食品中呋喃唑酮残留的研究［Ｊ］．中国卫生检验杂志，２００４，１４（３）：３１０－３１１．［７］ＣＯＮＮＥＥＬＹＡ，ＮＵＧＥＮＴＡ，Ｏ＇ＫＥＥＦＥＭ，ｅｔａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｂｏｕｎｄｒｅｓｉｄｕｅｓｏｆｎｉｔｒｏｆｕｒａｎｄｒｕｇｓｆｒｏｍｔｉｓｓｕｅｂｙｓｄｉｄ－ｐｈａｓｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｗｉｔｈｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｂｙｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｗｉｔｈＵＶａｎｄｔａｎｄｅｍｍａｓｓ
ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＡｎａｌｙｔｉｃａＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ，
２００３（４８３）：９１－９８．［８］郭德华，
汪国权，王东辉，等．高效液相色谱一串联质谱法测定动物源性食品中的硝基呋喃类代谢产物残留量［Ｊ］．化学计量分析，２００５，１４（４）：１６－１８．
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
（上接第１９６页）
ＤＮＡｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ（ＤＮＭＴｓ）１，３ａａｎｄ３ｂ：ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｍＲＮＡ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｎｏｒｍａｌｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｔｕｍｏｒｓ［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，１９９９，２７（１１）：２２９１－２２９８．
［２］ＢＡＣＨＭＡＮＫＥ，
ＲＯＵＮＴＲＥＥＭＲ，ＢＡＹＬＩＮＳＢ．Ｄｎｍｔ３ａａｎｄＤｎｍｔ３ｂａｒｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓｔｈａｔｅｘｈｉｂｉｔｕｎｉｑｕｅｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｔｏｈｅｔｅｒｃｈｒｏｍａｔｉｎ［Ｊ］．ＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００１，２７６（３４）：３２２８２－３２２８７．［３］ＵＮＴＥＲＢＥＲＧＥＲＡ，ＡＮＤＲＥＷＳＳＤ，ＷＥＡＶＥＲＩＣ，ｅｔａｌ．ＤＮＡｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ１ｋｎｏｃｋｄｏｗｎａｃｔｉｖａｔｅｓａｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｔｒｅｓｓｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ［Ｊ］．ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ，２００６，２６（２０）：７５７５－７５８６．
［４］ＧＥＮＤＲＥＬＡＶ，
ＬＩＰＰＭＡＮＺ，ＹＯＲＤＡＮＣ，ｅｔａｌ．ＤｅｐｅｎｄｅｎｃｅｏｆｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｃｈｉｓｔｏｎｅＨ３ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓｏｎｔｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｇｅｎｅ
ＤＤＭ１［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２００２（２９７）：１８７１－１８７３．［５］ＤＡＶＩＤＹ，ＣＡＴＨＥＲＩＮＥＴＥＹＳＳＩＥＲ，ＢＲＩＡＮＤ，ｅｔａｌ．Ｒｏｌｅｏｆｐｒｏｔｅｉｎｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ［Ｊ］．ＥｎｄｏｃｒｉｎｅＲｅｖ，２００４，２６（２）：１４７－１７０．
［６］ＴＡＣＨＩＢＡＮＡＭ，ＵＥＤＡＪ，ＦＵＫＵＤＡＭ．ＨｉｓｔｏｎｅｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓＧ９ａａｎｄＧＬＰｆｏｒｍｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃｃｏｍｐｌｅｘｅｓａｎｄａｒｅｂｏｔｈｃｒｕｃｉａｌｆｏｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｏｆｅｕｃｈｒｏｍａｔｉｎａｔＨ３－Ｋ９［Ｊ］．Ｇｅｎｅｓ，２００５（１９）：８１５－８２６．［７］ＫＯＨＬＭＡＩＥＲＡ，ＳＡＶＡＲＥＳＥＦ，ＬＡＣＨＮＥＲＭ．ＡｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｍｅｍｏｒｙｔｒｉｇｇｅｒｅｄｂｙＸｉｓｔｒｅｇｕｌａｔｅｓｈｉｓｔｏｎｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｉｎＸｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＰｌｏＳＢｉｏｌ，２００４，２（７）：９９１－１００３．
［８］ＧＡＲＹＪＤ，
ＣＬＡＲＫＥＳ．ＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｍｏｄｕｌａｔｅｄｂｙｐｒｏｔｅｉｎａｒｇｉｎｉｎｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＰｒｏｇＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓＭｏｌＢｉｏｌ，１９９８（６１）：６５－１３１．［９］ＷＥＮＤＥＬＬＡ，ＢＲＡＮＤＯＮＴ，ＦＬＯＳＳＩＥＷＯＮＧ－ＳＴＡＡＬ，ｅｔａｌ．ＡｒｇｉｎｉｎｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｏｆＲＮＡｈｅｌｉｃａｓｅａｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓｉｔｓｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ
ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＢｉｏＣｈｅｍ，
２００４，２７９（２２）：２２７９５－２２７９８．［１０］ＧＲＡＹＤＯＮＢ，ＲＡＪＥＮＤＲＡＴＫ，ＬＩＰＩＮＧＴＩＡＮ，ｅｔａｌ．ＴｈｅＳｍ－
Ｐｒｏｔｅｉｎｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，Ｄａｒｔ５，ｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｇｅｒｍ－ｃｅｌｌｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ａｎｄｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ［Ｊ］．ＣｕｒｒＢｉｏ，
２００６（１６）：１０７７－１０８９．［１１］ＫＡＴＩＡＡＮＣＥＬＩＮ，ＵＬＲＩＫＥＣ，ＰＥＴＲＡＨＡＪＫＯＶＡ，ｅｔａｌ．Ｂｌｉｍｐ１
ａｓｓｏｃｉａｔｅｓｗｉｔｈＰｒｍｔ５ａｎｄｄｉｒｅｃｔｓｈｉｓｔｏｎｅａｒｇｉｎｉｎｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｉｎｍｏｕｓｅｇｅｒｍｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＮａｔｕｒｅＣｅｌｌＢｉｏ，２００６，８（６）：６２３－６３０．［１２］ＩＳＡＯＳＵＥＴＡＫＥ，ＦＵＭＩＮＯＲＩＳＨＩＮＯＺＡＫＩ，ＪＵＮＩＣＨＩＭＩＹＡ－
ＧＡＷＡ，ｅｔａｌ．ＤＮＭＴ３ＬｓｔｉｍｕｌａｔｅｓｔｈｅＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＤｎｍｔ３ａａｎｄＤｎｍｔ３ｂｔｈｒｏｕｇｈａｄｉｒｅｃｔｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００４，２７９（２６）：２７８１６－２７８２３．
［１３］赵冬梅，
金帆，黄荷凤．ＤＮＡ甲基转移酶与早期胚胎发育［Ｊ］．浙江大学学报，２００５，３４（３）：２８１－２８４．［１４］ＭＡＣＩＥＪＲ，ＣＨＲＩＳＴＩＮＡＡ，ＳＣＨＥＲＥＲ，ｅｔａｌ．ＡｒｇｉｎｉｎｅＮ－Ｍｅｔｈｙｌ－
ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ１ｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｅａｒｌｙｐｏｓｔｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎｍｏｕｓｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｂｕｔｃｅｌｌｓｄｅｆｉｃｉｅｎｔｉｎｔｈｅｅｎｚｙｍｅａｒｅｖｉａｂｌｅ［Ｊ］．ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ，２０００，２０（１３）：４８５９－４８６９．
［１５］ＫＥＲＲＩＡ，
ＪＩＥＴＡＮＧ，ＷＥＩＺＨＵ，ｅｔａｌ．ＡｒｇｉｎｉｎｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｏｆＳＴＡＴ１ｍｏｄｕｌａｔｅｓＩＦＮａ／ｂ－Ｉｎｄｕｃｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２００１（１０４）：７３１－７４１．
［１６］ＴＳＣＨＩＥＲＳＣＨＢ，ＨＯＦＭＡＮＮＡ，ＫＲＡＵＳＳＶ．Ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｅｎｃｏｄｅｄ
ｂｙｔｈｅＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｐｏｓｉｔｉｏｎ－ｅｆｆｅｃｔｖａｒｉｅｇａｔｉｏｎｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｇｅｎｅＳｕ（
ｖａｒ）３－９ｃｏｍｂｉｎｅｓｄｏｍａｉｎｓｏｆａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃｒｅｇｕｌａｔｏｒｓｏｆｈｏｍｅｏｔｉｃｇｅｎｅｃｏｍｐｌｅｘｅｓ［Ｊ］．ＥＭＢＯＪ，１９９４（１３）：３８２２－３８３１．
［１７］田筱青，
房静远．组蛋白甲基化研究进展［Ｊ］．生物化学与生物物理进展，２００６，３３（６）：５１１－５１６．
［１８］ＫＯＮＤＯＹ，
ＳＨＥＮＬ，ＩＳＳＡＪＰ．Ｃｒｉｔｉｃａｌｒｏｌｅｏｆｈｉｓｔｏｎｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｉｎｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｉｎｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ，２００３，２３（１）：２０６－２１５．［１９］李建许，刘红林．ＤＮＡ甲基化与组蛋白甲基化的关系［Ｊ］．遗传，２００４，
２６（２）：２６７－２７０．
［２０］ＢＩＲＤＡＰ．ＣｐＧ２ｒｉｃｈｉｓｌａｎｄｓａｎｄｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．
Ｎａｔｕｒｅ，１９８６，３２１（６０６７）：２０９－２１２．［２１］ＨＡＭＬＭＯＴＯＲ，ＦＵＲＵＫＡＷＡＹ，ＭＯＲＩＴＡＭ．ＳＭＹＤ３ｅｎｃｏｄｅｓａ
ｈｉｓｔｏｎｅｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｃａｎｃｅｒｃｅｌｌ［Ｊ］．ＮａｔＣｅｌｌＢｉｏｌ，２００４，６（８）：７３１－７４０．１９９
DNA甲基化和肿瘤的关系
DNA 甲基化与肿瘤 一、DNA甲基化与基因表达 5-甲基胞嘧啶是天然存在的修饰碱基，甲基化的 mCpG ，在DNA 双链中对称出现。哺乳类动物基因组约60 %的表达基因5′端启动子存在未被甲基化的CpG岛,而启动子区域外的CpG岛大都为 mCpG。正常情况下，非活化的X染色体、印迹基因等的启动子区域的CpG岛为甲基化状态，而看家基因的 CpG岛则是去甲基化状态。 DNA 甲基化状态与基因表达呈负相关。其调控作用主要在转录水平抑制基因表达。 DNA甲基化的检测方法 经过亚硫酸盐处理后的DNA中胞嘧啶（C）转变为胸腺嘧啶（T）,但是甲基化的中的CpG二核苷酸C 未转变为T，而无甲基化的CpG二核苷酸则发生这种转变，由此可以推断DNA是否发生甲基化。TATAGGGCGAATTGGGCCCTCTAGATGCATGCTCGAGCGG CCGCCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTGCCCTTTAGTAT TGTTTGGTGAAATGGTACGTGTTTATAATTTTAGTTATTTAG GAGGTTGAGGTAGGAGGATTTTTTGAGTTTAGGAGTTTAA GTTTAGTTTGGGTAATATAGTTTAGTGGTTATATTAAAAAA AGTAAAATAGTCGGGCGCGGTGGTTTACGTTTGTAATTTTA GTATTTTGGGAGGTCGAGGCGGGTGGATTACGAGGTTAGG AGGTTGAGATTATTTTAAGGGCAAT
DNA 甲基化抑制基因转录的分子机制 ①DNA 双螺旋结构的大沟为DNA 与多种转录因子的作用部位，mCpG的甲基化胞嘧啶突入大沟，抑制转录因子的结合而抑制转录。②mCpG 激活阻遏蛋白因子，如DMAP1、TSG101、 Mi2等，通过阻遏蛋白因子的作用抑制转录。③DNA甲基化与组蛋白乙酰化的研究发现，组蛋白H3、H4 的赖氨酸去乙酰化后带负电荷,与带正电荷的DNA 结合更紧密,不利于转录过程中的聚合物解聚，从而抑制基因转录。甲基化的CpG 结合蛋白(MeCPs) 与DNA 的mCpG结合,并与组氨酸去乙酰化酶(HDAC) 形成复合物共同抑制转录。 二、DNA甲基化与肿瘤 以往的研究认为癌基因激活、抑癌基因失活主要是基因突变、缺失导致的DNA 序列改变。在肿瘤研究中，检测到许多肿瘤的重要基因并未发生突变、缺失，基因表达的异常主要通过DNA 甲基化实现。癌基因的去甲基化和抑癌基因的甲基化状态，可导致癌基因激活、抑癌基因的失活。癌基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化改变是肿瘤细胞的一个重要特征。 DNA 甲基化状态的改变导致基因结构和功能的异常，与肿瘤发生的关系是近年来研究的热点。 DNA甲基化的异常与基因突变、缺失等基因组异常也有密切的关系
酸性蛋白酶的作用机理
酸性蛋白酶与碱性蛋白酶生产工艺的不同之处？ 酸性蛋白酶是一种在酸性环境下（pH 2.5-4.0）催化蛋白酶水解的酶制剂，适用于酸性介质中水解动植物蛋白质。可用于毛皮软化，酒精发酵，啤酒、果酒澄清，动植物蛋白质水解营养液，羊毛染色，废胶片回收，饲料添加剂等等。本品在酸性条件下有利于皮纤维松散，且软化液可连续使用，是当前理想的毛皮软化酶制剂；在酒精发酵中，添加酸性蛋白酶，能有效水解原料中的蛋白质，破坏原料颗粒粒间细胞壁的结构，有利于糖化酶的作用，使原料中可利用碳源增加，从而可提高原料出酒率；另一方面，蛋白质的水解提高了醪液中α-氨基态氮的含量，促进酵母菌的生长与繁殖，提高发酵速度，从而缩短发酵周期和提高发酵设备的生产能力。 碱性蛋白酶碱性蛋白酶是在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类,是一类非常重要的工业用酶,最早发现于猪胰脏。碱性蛋白酶广泛存在于动、植物及微生物中。微生物蛋白酶均为胞外酶,不仅具有动植物蛋白酶所具有的全部特性,还有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、易于实现工业化生产等诸多优点。1945年瑞士M等在地衣芽孢杆菌中发现了微生物碱性蛋白酶。 碱性蛋白酶是由细菌原生质体诱变选育出的地衣芽孢杆菌2709，经深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，其主要酶成分为地衣芽孢杆菌蛋白酶，是一种丝氨酸型的内切蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力，广泛应用
于食品、医疗、酿造、洗涤、丝绸、制革等行业。 1、碱性蛋白酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，属于丝氨酸型内切蛋白酶，应用在食品行业可水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，形成具有独特风味的蛋白质水解液。 2、碱性蛋白酶成功应用于洗涤剂用酶工业，可添加在普通洗衣粉、浓缩洗衣粉和液体洗涤剂当中，既可用于家庭洗衣，也可用于工业洗衣，可以有效的去除血渍、蛋类、乳制品、或肉汁、菜汁等蛋白类的污渍，另外也可作为医用试剂酶清洗生化仪器等。 3、在生物技术领域，碱性蛋白酶可作为工具酶用于核酸纯化过程中的蛋白质（包括核酸酶类）去除，而对DNA无降解作用，避免对DNA 完整性的破坏。 酸性蛋白酶如何灭活第一种方法几乎所有酶都适用，就是加热。第二种，既然是酸性酶，加入强碱应该也是可以的。 酸性蛋白酶产生菌的筛选方法？酸性蛋白酶是一种能在酸性环境下水解蛋白质的酶类，其最适作用pH值为2.5-5.0。由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。目前用于工业化生产的酸性蛋白酶大多为霉菌酸性蛋白酶，此类酶的最适作用pH值为3.0左右，当pH值升高时，酸性蛋白酶的酶活会明显降低，且此类酶不耐热，当温度达到50℃以上时很不稳定，从而限制了酸性蛋白酶的应用范围。因此，本研究以开发耐温偏酸性蛋白酶为目标，进行了以下几方面的研究：(1)偏酸性蛋白酶产生菌的分离筛选。(2)偏酸性蛋白酶粗酶酶学性质的
DNA甲基化功能汇总
Functions of DNA methylation: islands, start sites, gene bodies and beyond DNA甲基化功能：岛，起始位点，基因体和其他 peter a. jones 摘要 DNA甲基化通常被描述为一个“沉默”的表观遗传标记，的确，5-甲基胞嘧啶的功能最初是在20世纪70年代提出。现在，归功于甲基化绘图的基因组规模的改良，我们可以评估在不同的基因组背景下的DNA甲基化：在基因体上，在调控元件和重复序列上，转录起始位点有或者没有CpG岛。新出现的图片是DNA甲基化功能似乎随背景而改变，DNA甲基化和转录的关系比我们最先认识到的更为微妙。有必要提高我们对DNA甲基化的功能的理解，为了解释这个疾病标记中观察到的变化，比如癌症。 两篇重要的文章在1975年分别表示胞嘧啶残基的甲基化在CpG二核苷酸背景中能作为表观遗传标记。这些文章提出序列可以被重新甲基化，即甲基化通过一种机制的体细胞分裂能够被遗传，包括一种能识别半甲基化CpG回文的酶，甲基基团的存在，可以由DNA结合蛋白和DNA甲基化直接沉默基因解释。虽然这些关键原则中的几个被证明是正确的，解开DNA甲基化与基因沉默的关系已被证明是具有挑战性的。 在CpG序列背景下，在动物身上的大部分工作都集中在5-甲基胞嘧啶（5mC）。据报道，在哺乳动物的其他序列的甲基化广泛分布在植物和一些真菌中。在哺乳动物中，非CpG甲基化的功能目前未知。在这里我主要集中在哺乳动物基因组中的CpG甲基化，包括在其他动物和植物中观察到的差异的讨论。 理解DNA甲基化的功能需要通过基因组考虑甲基化的分布。超过一半的基因脊椎动物的基因组包含短（约1 kb）CpG丰富的区域称为CpG岛（CGIS），其余的基因组因为CpGs而耗尽。当5mC通过自发或酶胸腺嘧啶脱氨基作用被转换成胸腺嘧啶，认为基因组的损失是由于甲基化的序列在种族中的脱氨基；认为CGI存在是因为他们可能是从来没有或只有瞬时甲基化。然而，有很多关于准确定义CGI是什么的讨论，虽然在
DNA甲基化
DNA甲基化概述 在哺乳动物基因组中，甲基化是一种表观遗传机制，包括将甲基转移到胞嘧啶的C5位置形成5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通过招募参与基因抑制的蛋白或通过抑制转录因子与DNA的结合来调节基因表达。在发育过程中，DNA甲基化的模式在基因组中发生变化，这是DNA从头甲基化和去甲基化的动态过程的结果。 DNA甲基化是被一个甲基转移酶家族所催化，转移S腺苷甲硫氨酸(SAM)的一个甲基到第五个碳胞嘧啶残基形成5mc , Dnmt3a和Dnmt3b可以建立一个新的DNA甲基化模式来去修饰DNA，被称为从头甲基化。另一方面，Dnmt1在DNA复制过程中起作用，将亲代DNA链上的甲基化模式复制到新合成的子链上。这三种DNA都广泛参与胚胎的发育。这三种DNA都广泛参与胚胎的发育。当细胞到达终末分化时，Dnmt的表达大大降低。这似乎表明有丝分裂后细胞的DNA甲基化模式是稳定的。 大部分DNA的甲基化发生在鸟嘌呤核苷酸或CpG位点之前的胞嘧啶上。总的来说，哺乳动物基因组中CpG位点的减少可能是由于5 - mc可脱氨成胸腺嘧啶的诱变潜力。剩余的CpG位点分布在整个基因组中，除了CpG岛外，它们都被严重甲基化。DNA甲基化对沉默逆转录病毒分子、调节组织特异性基因表达、基因印记和X染色体失活至关重要。不同基因组区域的DNA甲基化可能根据潜在的遗传序列对基因活动产生不同的影响。 一、DNA甲基化的位置 1.1 基因间区 大约45%的哺乳动物基因组由转座因子和病毒因子组成，这些因子被大量甲基化而沉默。这些元素中的绝大多数是通过DNA甲基化或随着时间的推移由于5mC的破坏而产生的突变而失活的。如果表达，这些元素是潜在的有害的，因为它们的复制和插入可以导致基因损坏和DNA突变。胞内颗粒(IAP)是小鼠基因组中最具侵袭性的逆转录病毒之一。在整个生命过程中，IAP在配子形成、发育和成年阶段都被高度甲基化。甚至在胚胎内部，当基因组其余部分相对低甲基化时，Dnmtl维持对IAP元件的抑制。当Dnmtl被基因突变耗尽，导致广泛的低甲基化时，IAP元素被表达。这表明，在基因间区，DNA甲基化的主要作用之一是抑制潜在有害基因元素的表达。 1.2 CpG岛 CpG岛是大约1000个碱基对长度的DNA延伸，它们的CpG密度比基因组的其他部分高，但通常不会甲基化。大多数基因启动子，大约70%，在CpG岛。特别是，管家基因的启动子常常嵌入到CpG岛。CpG岛，尤其是那些与启动子相关的基因在小鼠和人类之间高度保守。在整个进化过程中，CpG岛屿的位置和保存意味着这些区域具有重要的功能。 CpG岛通过调控染色质结构和转录因子的结合来促进基因表达。DNA有规律地包裹在组蛋白周围，形成被称为核小体的小段。DNA与组蛋白的联系越紧密，对基因表达的宽容程度就越低。CpG岛的一个共同特征是，它们比其他DNA片段包含更少的核团。与CpG 岛相关的少数核小体常含有组蛋白，其修饰涉及增强基因表达。尽管约50%的CpG岛包含已知的转录起始位点，但CpG岛往往缺乏常见的启动子元件，如TATA boxes 。由于许多转录因子结合位点富含GC, CpG岛可能会增强对转录起始位点的结合。CpG岛虽然缺乏共同的启动子元件，但却能增强DNA的可达性，促进转录因子的结合。 CpG岛的甲基化导致了稳定的基因表达沉默。在配子发生和胚胎早期发育期间，CpG 岛经历了差异甲基化。通过CpG岛调控基因表达的甲基化能力对建立很重要。印迹基因仅由两个遗传亲本染色体中的一个表达，它们的表达由遗传亲本决定。除了印迹基因外，CpG
转化酶研究进展
转化酶研究进展 摘要转化酶是生物体内糖代谢的关键酶,综述了转化酶多态性及其活性表达调控、转化酶基因等方面的研究;用分子生物学手段研究了转化酶基因对植物糖分积累的直接作用;研究了逆境下转化酶多态性表达及生理调节、调控。 关键词转化酶;多态性;糖代谢;基因;活性 ResearchAdvanceonPlantInvertase GAO Yun (Pingliang Medical College,Pingliang Gansu 744000) AbstractInvertase plays an important role during the sugar metabolism in higher plant. The varieties,distribution,invertase expression,gene expression of the invertase in higher plant were introduced in this paper. The research on the direct function about invertase gene to plant sugar accumulation by molecule biology means and the research on invertase expression,physiological regulation under adversity stress were summarized. Key wordsinvertase;polymorphism;sugar metabolism;gene;activity 转化酶(invertase),又称蔗糖酶或β-D-呋喃果糖苷酶,是生物体内糖代谢的关键酶,在蔗糖代谢中催化如下反应:蔗糖+H2O→果糖+葡萄糖。由于糖代谢是生物体内物质代谢的中心,蔗糖是高等植物光合作用的主要产物,是碳运输、“库代谢”、糖积累、果实品质形成中的重要因子,还是细胞代谢的调节因子,可能通过影响基因表达发挥作用。因此,与蔗糖代谢和积累密切相关的转化酶是近年来生理生化、生理生态及分子生物学研究的热点之一。 1转化酶的多态性及在蔗糖代谢中的作用 转化酶是高度多态的,包括酸性转化酶(Acid Invertase,AI)、中性转化酶(Neutral Invertase,NI)和碱性转化酶。许多报道将中性转化酶和碱性转化酶看作同一种转化酶。酸性转化酶主要存在于液泡或束缚于细胞壁上,其最适pH值在3.0~5.0;中性和碱性酶位于细胞质中,最适pH值在7.0左右。报道的转化酶的分子量大小为50~80 kD,为单体或二聚体。生殖器官中均有液泡转化酶表达。栽培番茄、野生番茄及转基因番茄研究表明,在果实成熟后期,液泡转化酶的表达与否决定着果实可溶性糖的组分[1]。原位杂交研究表明,胞壁转化酶可能存在于维管束
DNA甲基化
DNA甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。这些方法概括起来可分为三类：基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。 近15年来，人们越来越认识到DNA甲基化研究的重要性，开发出一系列检测DNA的方法。根据研究目的这些方法分为：基因组整体水平的甲基化检测，特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。根据研究所用处理方法不同可以分为：基于PCR的甲基化分析方法；基于限制性内切酶的甲基化分析方法；基于重亚硫酸盐的甲基化分析方法和柱层法等。 DNA甲基化的分析方法很多，可分为总基因组甲基化的检测和单基因序列特异性甲基化分析的研究。总基因组甲基化的检测又分为全基因组序列特异性甲基化分析和基因组非特异性甲基化水平的研究。前者包括甲基化差异性杂交显示(differential methylation hybridization，DMH)、寡核苷酸微阵列法和基因组限制性酶切扫描法(restriction landmarkgenomescanning，RLGS)；后者包括3H—SAM掺人后液闪检测法和高压液相色谱法。 对单基因序列特异性甲基化分析包括传统的甲基化敏感的限制性内切酶(methylation sensitive restriction endonucleases，MSREs)分析、比较简洁的甲基化特异性PCR(methylation specific PCR，MSP)、全面反映甲基化情况的亚硫酸氢钠变性后测序(bisulfitegenomic sequencing)、甲基化敏感性单核苷酸引物扩增(methylation sensitive single nucleotide primer extension，Ms—SnuPE)、较新颖的甲基化荧光检测(methylight)、结合亚硫酸氢钠变性的限制性酶分析(combined bisulfite restrictionan alysis，COBRA)、酶的区域性甲基化特异性分析(enzymatic regional methylation assay，ERMA)和变性高压液相色谱法(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)。 甲基化敏感的单核苷酸的扩增(Ms—SnuPE) Ms—SnuPE即甲基化特异的单核苷酸扩增，它能对不同甲基化特异位点进行快速定量，是一种快速估计特异性CpG位点甲基化不同情况的定量方法。 先用重亚硫酸盐处理基因组DNA，未甲基化的胞嘧啶全部转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。进行PCR扩增，然后取等量扩增产物置于2管中，分别作为Ms—SnuPE单核苷酸引物延伸的模板。设计用于Ms—SnuPE延伸的引物的3’端紧邻待测碱基。同时于2个反应体系中加入等量的Taq酶、引物、同位素标记的dCTP或dTTP。这样，如果待测位点被甲基化，则同位素标记的dCTP会在反应延伸时连于引物末端；若是未被甲基化，则标记的dTTP参与反应。末端延伸产物经电泳分离和放射活性测定后可得出C／T值，即为甲基化与非甲基化的比值，从而分析得到待测片段中CpG位点甲基化情况。 甲基化敏感限制性内切酶(MSRE)法 methylation sensitive restriction endonuclease，MSRE是一类对其识别位点含有甲基化碱基敏感的限制性内切酶，目前至少已发现320种。此类酶如在其切割位点中含有一个甲基化碱基，则它们中的绝大多数就不能切割DNA。MSRE法是基于甲基化敏感Ⅱ型限制性内切酶不能切割含有一个或多个甲基化切点序列的基本原理。用甲基敏感Ⅱ型内切酶及其同工酶(对甲基化不敏感)切割含有一个或多个甲基化CpG序列的片段，然后用DNA印迹法分析。此法
酸性转化酶(AI)活性检测试剂盒说明书 可见分光光度法
酸性转化酶（AI）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。 货号:BC0560 规格:50T/24S 产品内容： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：液体60mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入30mL试剂一充分溶解备用；用不完的试剂4℃保存； 试剂三：液体35mL×1瓶，4℃保存。 标准品：粉剂×1支，4℃保存，10mg无水葡萄糖。临用前加入1mL蒸馏水溶解,制备10mg/mL葡萄糖标准液备用。 产品说明： 蔗糖转化酶（Invertase，Ivr）催化蔗糖不可逆地分解为果糖和葡萄糖，是高等植物蔗糖代谢关键酶之一。根据最适pH，将高等植物Ivr分为酸性转化酶（AI）和中性转化酶（NI）两种类型。AI(EC3.2.1.26)主要存在于细胞液泡或自由空间中，最适pH为4.5~5.0（酸性），通过降解液泡中蔗糖，调节液泡中蔗糖的利用和果实内糖类的积累。 AI催化蔗糖降解产生还原糖，进一步与3,5－二硝基水杨酸反应，生成棕红色氨基化合物，在540nm 有特征光吸收，在一定范围内540nm光吸收增加速率与AI活性成正比。 试验中所需的仪器和试剂： 可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水。 操作步骤： 一、粗酶液提取： 按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。12000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
二、标准曲线绘制 将标准品稀释成1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0mg/mL葡萄糖标准液，分别测定1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0mg/mL葡萄糖标准液在540nm下的吸光度（A），以各浓度下吸光值减空白管（浓度为0mg/mL）的吸光度为y轴，葡萄糖浓度为x轴绘制标准曲线。 三、测定步骤及加样表： 按下表操作： 试剂名称（μL）测定管对照管标准管 样本200200- 试剂一-800- 试剂二800-800 标准液--200 混匀，37℃准确水浴30min后，煮沸10min左右（盖紧，以防止水分散失），流水冷却后充分混 匀（以保证浓度不变），12000g，4℃离心5min，取上清。 试剂三500500500 混匀，煮沸10min左右（盖紧，以防止水分流失），流水冷却后充分混匀，540nm处蒸馏水调零，记录各管吸光值A，ΔA=A测定-A对照。 四、注意事项： 1、如果加入试剂三，煮沸10min后有混浊物出现，建议离心除去沉淀后，取上清测定吸光度； 2、如果吸光值大于1，可以用蒸馏水将样本稀释后测定（计算公式中乘以相应稀释倍数） 五、A I活性计算： 标准条件下测定的回归方程为y=kx+b；x为标准品浓度（mg/mL），y为吸光值。 1、按蛋白浓度计算 单位定义：37℃每mg蛋白每分钟产生1μg还原糖定义为一个酶活性单位。 AI活性（U/mg prot）=(x×V1×1000)÷(V1×Cpr)÷T=33.3×x÷Cpr 2、按鲜重计算 单位定义：37℃每g组织每分钟产生1μg还原糖定义为一个酶活性单位。 AI活性（U/g）=(x×V1×1000)÷(W×V1÷V2)÷T=33.3×x÷W
组蛋白甲基化转移酶G9a对NK细胞功能调节作用的研究
中文摘要 目的： 自然杀伤细胞（Natural Killer cell，NK细胞）作为一种固有免疫细胞，在免疫系统中发挥着重要作用。目前关于NK细胞的研究主要集中于NK细胞表面受体以及相关信号通路对其发育和功能的影响等方面，我们研究发现NK细胞在发挥功能时，会伴随着染色质及其组蛋白修饰状态的变化，而组蛋白甲基化转移酶G9a 在组蛋白修饰中具有重要的作用，并且组蛋白甲基化转移酶G9a对造血干细胞以及T细胞发育有着重要的影响，另外组蛋白甲基化转移酶G9a是否会影响NK 细胞的发育及其功能尚未报道，因此探讨组蛋白甲基化转移酶G9a在NK细胞的作用具有重要意义，本研究主要从表观遗传学的角度探讨G9a如何影响NK 细胞的功能及其作用机制。 方法： 第一部分：从GEO数据库中分析相关数据，在NK细胞免疫信号通路被激活的情况下，寻找表达水平变化最显著的组蛋白甲基化酶和去甲基化酶，发现G9a 在NK细胞激活之后显著下调，并用qPCR实验验证G9a的变化。从外周血中分选获得原代NK细胞，加入抑制G9a酶活性的小分子抑制剂，采用western blot 方法检测加入小分子抑制剂后，G9a修饰的NK细胞中IFN-γ启动子区域H3K9me2的修饰水平；并用流式细胞术分析NK细胞在被激活的情况下，抑制G9a的酶活性后IFN-γ的表达变化。 第二部分：采用qPCR在转录水平检测不同条件激活的NK细胞系的IFN-γ的表达变化，并用流式细胞术和ELISA等技术检测IFN-γ在蛋白水平的表达变化；ChIP-qPCR检测在抑制G9a酶活性前后，NK细胞系中IFN-γ启动子区域H3K9me2的修饰水平变化。 结果： 第一部分：高通量分析结果显示，NK细胞在被激活的情况下，G9a的表达量下调；在抑制NK细胞中G9a甲基转移酶活性后，可以增强NK细胞分泌IFN-γ的能力。 第二部分：通过在转录水平和蛋白水平两个层次上的检测发现，抑制NK细胞G9a甲基转移酶活性后，NK细胞分泌IFN-γ的能力增强；ChIP-qPCR实验结果 I
转化酶的测定
转化酶的测定 转化酶又称蔗糖酶，是一种水解酶，植物体的库组织中，一般含有较高活性的转化酶，它能将植物体内的主要同化产物——蔗糖不可逆的水解为葡萄糖和果糖，为细胞的可溶性糖贮库提供可利用六碳糖，以用于细胞壁、贮藏多糖及果聚糖的生物合成，并通过与呼吸作用偶联的氧化磷酸化产生能量，所以，转化酶与植物组织的生长有密切关系，是衡量同化产物的转化和利用、植物细胞代谢及生长强度的指标。 试剂：1、10%蔗糖溶液 2、葡萄糖标准液（500μg/ml） 3、0.05mol/l的磷酸缓冲液 4、（DNS）3，5二硝基水杨酸：将6.3g二硝基水杨酸和262 ml 2mol/l NaOH溶液，加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。 方法：1、酶的提取：1g样品剪碎后，用预冷的蒸馏水在冰浴中研磨成匀浆，定容至100ml，在冰箱中浸提3小时，4000转离心15分钟，上清液即为酶的粗提液。 2、酶活性的测定：吸酶液2ml，放入试管中，再加入pH6.0的缓冲液5ml及10%蔗糖溶液1ml，在37度水浴中保温30分钟，取出后立即按3，5二硝基水杨酸法测定还原糖的含量。以煮沸酶液10分钟钝化酶的试管作对照。 3、还原糖标准曲线的制作及还原糖含量的测定 ①标准曲线：取6支20ml刻度试管，编号，按下表配置不同浓度的葡萄糖标准液： 管号 1 2 3 4 5 6 葡萄糖原液量（ml）0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 加蒸馏水量（ml） 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0 葡萄糖浓度（μg/ml）0 100 200 300 400 500 在上述各管中分别加入1.5ml 3，5二硝基水杨酸试剂，在沸水浴中加热5分钟，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，加蒸馏水定容至20ml，混匀，以1号管为空白，测540nm 波长下的OD值。以OD值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。 ②酶反应液中还原糖的含量的测定：吸取2ml反应液，加入1.5ml 3，5二硝基水杨酸试剂，沸水浴中煮沸5分钟，冷却定容至20ml ，测定540nm波长下的OD值，查标准曲线得酶反应液中还原糖的浓度。 4、结果计算： A=(N-N’)*V/(T*W*1000) A：转化酶的活性(mg/gfw/h) N：酶反应液中还原糖的浓度(μg/ml) N’：钝化酶反应液中还原糖的浓度(μg/ml) V：酶反应液的总体积 T：反应时间W：材料鲜重
m6A甲基化酶的种类及功能盘点——m6A专题
m6A甲基化酶的种类及功能盘点| m6A专题 图1 m6A甲基化加工过程 m6A这种甲基化修饰被证明是可逆化的，包括甲基化转移酶、去甲基化酶和甲基化阅读蛋白等共同参与。其中甲基化转移酶包括METTL3/14、WTAP和KIAA1429等，主要作用就是催化mRNA上腺苷酸发生m6A修饰。而去甲基化酶包括FTO和ALKHB5等，作用是对已发生m6A修饰的碱基进行去甲基化修饰。阅读蛋白主要功能是识别发生m6A 修饰的碱基，从而激活下游的调控通路如RNA降解、miRNA加工等。 表1 RNA甲基化酶类型总结
1．m6A甲基化转移酶 甲基化转移酶（methyltransferase）也叫Writers，是一类重要的催化酶，能够让mRNA上的碱基发生m6A甲基化修饰。METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1492都属于m6A甲基化转移酶的核心蛋白。这些蛋白并不是各自孤立的，而是会形成复合物（complex）共同行使催化功能。由于酵母和线虫等生物缺少这四种核心蛋白中的一种或几种，所以m6A甲基化修饰属于高等真核生物独有的碱基修饰反应。 图2 METTL3-METTL14蛋白复合物晶体结构示意图 结构生物学研究表明，METTL3和METTL14这两种蛋白有关键的催化结构域，两者之间会形成杂络物（hetero complex）。其中METTL3是具有催化活性的亚基，而METTL14会在底物识别上起到关键作用。另外WTAP、Vir以及其他类型的factors也是杂络物的重要组成部分。其中WTAP在招募METTL3和METTL14起到十分重要的作用。这些蛋白无论在体内（in vivo）还是体外（in vitro）都会一起对腺苷酸进行甲基化修饰。除了人和小鼠等哺乳动物，果蝇、酵母甚至拟南芥中也发现了类似的同源蛋白（homologous protein）。 2．m6A去甲基化酶 在真核生物中，已发现的m6A去甲基化酶主要包括FTO和ALKBH5等。FTO蛋白全称Fat mass and obesity-associated protein，属于Alkb蛋白家族中的一员并且与肥胖相关。1999年，FTO基因首次在小鼠中被克隆。2007年，三项独立的队列研究分别证实当FTO基因产生突变时，会增加肥胖的风险。同样在小鼠模型中，FTO被敲除或过表
土壤酸性转化酶(Solid-Acid invertase, S-AI)试剂盒说明书
货号：MS2930 规格：100管/48样土壤酸性转化酶（Solid-Acid invertase, S-AI）试剂盒说明书 微量法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： S-AI在pH 为4.5~5.0（酸性）条件下催化蔗糖不可逆地分解为果糖和葡萄糖，是土壤微生物蔗糖代谢关键酶之一。 测定原理： S-AI催化蔗糖降解产生还原糖，进一步与3,5－二硝基水杨酸反应，生成棕红色氨基化合物，在510nm有特征光吸收，在一定范围内510nm光吸收增加速率与AI活性成正比。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。 试剂组成和配制： 试剂一：液体50mL×1瓶，4℃保存; 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入25mL试剂一充分溶解备用；用不完的试剂4℃保存; 试剂三：液体10mL×1瓶，4℃避光保存； 样品处理： 新鲜土样自然风干或37度烘箱风干，过30~50目筛。 处，记录各管吸光值A，如果吸光值大于2，可以用蒸馏水稀释后测定(计算公式中乘以相应稀释倍数)，ΔA=A测定-A对照。 S-AI活性计算： a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下 标准条件下测定的回归方程为y = 0.0016x -0.001；x为标准品浓度（μg/mL），y为吸光值。单位的定义：每天每g土样中产生1mg还原糖定义为一个S-AI活力单位。 S-AI活力（mg/d /g土样）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V反总÷W÷T ÷1000=240×(ΔA+0.001) V反总：反应体系总体积：0.4mL；T：反应时间，1/48d； W：样本质量，0.05g；1mg=1000μg。 b.用96孔板测定的计算公式如下 第1页，共2页
DNA甲基化的总结
DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNMTs)的催化下,将甲基基团转移到胞嘧啶碱基上的一种修饰方式。它主要发生在富含双核苷酸CpG岛的区域,在人类基因组中有近5万个CpG岛[5]。正常情况下CpG岛是以非甲基化形式(活跃形式)存在的，DNA甲基化可导致基因表达沉默。DNMTs的活性异常与疾病有密切的关系,例如位于染色体上的DNMT3B基因突变可导致ICF综合征。有报道[6]表明，重度女性侵袭性牙周炎的发生与2条X染色体上TMP1基因去甲基化比例增高有关。DNMT基因的过量表达与精神分裂症和情绪障碍等精神疾病的发生也密切相关。风湿性疾病等自身免疫性疾病特别是系统性红斑狼疮(SLE)与DNA甲基化之间关系已经确定[7]，在SLE病人的T细胞发现DNMTs活性降低导致的异常低甲基化。启动子区的CpG岛过度甲基化使抑癌基因沉默,基因组总体甲基化水平降低导致一些在正常情况下受到抑制的基因如癌基因被激活[8],都会导致细胞癌变。 甲基化作用是转录水平上表达调控的基本方式之一。由于宿主细胞基因组DNA中不 同位点的甲基化程度存在某种平衡，并形成一定的空间结构特点。一旦转基因的整合破坏了这种平衡及空间特征，破坏后的结构便成为宿主基因组防御系统识别的信号，使新整合的DNA 序列发生不同程度的甲基化，甲基化基因序列则通过抑制甲基化DNA结合蛋白(MeCP2)的结合而抑制转录的顺利进行Ⅲo。在拟南芥中发现了DNA甲基化可以导致基因沉默汹埘]。在基因沉默过程中，外源或内源性信号引起部分DNA序列中CpG的甲基化，甲基化CpG结合域蛋白2(MeCP2)结合到甲基化的胞嘧啶上聚集HDACs使组蛋白去乙酰化，该蛋白与去乙酰化的组蛋白通过聚集更多的DNA 甲基转移酶来加强沉默信号，从而引起基因沉默H?。 ?。DNA甲基化对染色质结构和基因表达的作用很可能是通过一组蛋白介导的，这些蛋白可能含有共同的高度保守的甲基化的CpG结合结构域(MBD)L45 J。DNA甲基化在基因印记、x染色体失活、某些疾病的发生发展中发挥重要作用。其直接作用机制可能是CpG岛甲基化干扰了一些转录因子(transcription factor，TF)与基因调控区的结合，使甲基从DNA分子大沟中突出，从而阻止转录 因子与基因相互作用。间接机制可能是由于甲基化DNA与甲基化DNA结合蛋白结合或DNA甲基化改变染色质结构，这2种情况都间接阻碍TF与DNA结合从而抑制转录m1。DNA甲基化一般是通过转录抑制机制来调节特定基因的，具体的机制可能有：5一MeC伸入DNA双螺旋大沟，影响转录因子的结合；序列特异的甲基化DNA结合蛋白(MDBP一1，MDBP一2)与甲基化的启动子序列特异性结合而抑制转录因子与靶序列的结合；甲基化CpG结合蛋白(MeCPl，MeCP2)与甲基化的二核苷酸CpG结合，发挥类似转录抑制蛋白的作用H“。一般DNA甲基化会通过干扰转录因子与识别位点结合和招募组蛋白乙酰转移酶(histon acefltransfeI"SeS，HATs)、组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)形成辅助阻遏复合体，使基因沉默而抑制其表达，而去甲基化则使沉默的基因重新激活Ⅲ卜 ＤＮＡ甲基化尤其是基因启动子区ＣｐＧ岛的高甲基化，会导致基因表达的下降或沉默。甲基化抑制基因的表达目前认为要有两个方面，一方面甲基化引起的基因结构改变可直接阻碍一些转录因子与其结合位的结合；另一方面可能与一些甲基化
甲基化综述
DNA甲基化及其在食用菌中的研究潜力 前言 DNA甲基化是在DNA上添加甲基基团的一种化学修饰作用，作为一种表观遗传行为，DNA甲基化状态的改变可导致基因结构和功能异常，进而引起生物体表型的变化。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达，其对遗传物质的影响主要是通过抑制基因表达来起作用。同时，有研究表明，亲代遗传、激素、miRNA、年龄等内源性因素以及温度、湿度、盐离子浓度、重金属等环境因素都对生物体DNA甲基化水平及模式有影响。目前，DNA 甲基化的检测方法种类较多，如甲基化特异性PCR、亚硫酸测序法、限制性内切酶PCR、变性液相高效色谱法等。然而，目前DNA甲基化的研究主要集中在动、植物领域，在应用前景广泛并处于方兴未艾阶段的食用菌领域研究较少。同时，食用菌生长发育容易受到内源性物质以及环境因素的影响，并有研究报道DNA甲基化对蕈菌生长发育有影响。所以，对DNA甲基化在食用菌领域进行深入地研究是十分有必要和有意义的。 什么是DNA甲基化 DNA甲基化是指，在甲基转移酶的作用下，甲基基团从供体转移到DNA的碱基上。在动物中，DNA甲基化主要发生在胞嘧啶的第五位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶，而几乎所有的5-甲基胞嘧啶都发现与CG 二核苷酸序列中，这种CG二核苷酸序列经常成串存在，俗称CG岛，并
且大约70–80%的CG二核苷酸序列都被甲基化；在植物中，甲基化的胞嘧啶主要出现在B型DNA的沟内,而该部位正是DNA结合蛋白相互作用的部位。 DNA甲基化是被属于一个基因家族的一系列甲基转移酶所催化，这些酶中常见的有Dnmt1，Dnmt3a和Dnmt3b等。Dnmt1是一种维持性甲基化酶，它只作用于只有一条链发生甲基化的DNA链，主要通过对亲本甲基化模式进行复制。在减数分裂时，Dnmt1识别DNA双链中只有亲代链发生甲基化的半甲基化位点，并催化甲基基团从供体转移到未甲基化的胞嘧啶上，使该位点双链全甲基化；Dnmt3a和Dnmt3b属于从头甲基化酶，它们则能够使之前没发生甲基化的区域进行甲基化，从而对细胞分化起调控作用。 甲基化的生物学效应及其作用机理 DNA甲基化精确的功能有待进一步研究，目前学术界公认的两类功能是：宿主防御模型和基因调控模型。 宿主防御模型是指，生物体基因组内转座子的甲基化和外源DNA 的甲基化。由于转座子大量地存在于基因组中，并且转座效应对生物体大部分是有害的，而转座子发生甲基化能抑制其转座活性，因此转座子甲基化能够保护生物体免受转座效应带来的威胁；同时，生物体在遭受外源DNA侵袭时，例如病毒基因组和基因片段整合到宿主基因组中，容易产生对机体有害的蛋白质或造成基因结构紊乱。而宿主细胞内甲基转移酶能通过对外源DNA序列进行甲基化，以抑制其对宿主基因组造成伤害。
DNA甲基化研究综述
DNA甲基化研究综述 The summarize of the research on DNA methylation 郭文媛 （生物技术 1353227） 摘要：DNA 甲基化是真核生物表观遗传学中一种重要的基因表达调控方式，是一种酶催化的修饰过程。其是在DNA 甲基转移酶催化下，将甲基基团转移到胞嘧啶的5 位碳原子上，使之转变成5-甲基胞嘧啶的化学修饰过程。在人类和其他哺乳动物中，此修饰过程通常发生在5'-CpG-'二核苷酸的胞嘧啶上。大量相关研究表明，DNA 甲基化与人类疾病密切相关。 Abstract:DNA methylation is an important epigenetic regulation of gene expression in eukaryotes．It is a kind of enzyme catalysis modification process: refers to the chemical modification process of DNA methyltransferase catalysis，the transfer of methyl groups onto cytosine carbon atom 5，making them into 5-methyl cytosine．In humans and other mammals，the modification process usually occurs in 5＇CpG -＇dinucleotide cytosine．A large number of relevant studies have shown that DNA methylation is closely related to human diseases． 关键词: DNA 甲基化; 甲基转移酶;表观遗传学; CpG 岛; Dnmt1; Dnmt3a; Dnmt3b; 基因沉默; DNA甲基化结合蛋白; 人类表观基因组计划 Key words:DNA methylation; Methyltransferase; Epigenetics; CpG island; Dnmt1; Dnmt3a; Dnmt3b ; Gene Silencing ;MBD; human epigenomeproject 表观遗传学研究的是不改变DNA 的一级结构而改变表型的一种基因表达调控机制，主要包括DNA 甲基化、组蛋白修饰、染色体重构、RNA 干扰等。 DNA甲基化是重要的表观遗传修饰之一，在大多数真核生物中广泛存在。DNA 甲基化水平受到环境、疾病、年龄和性别等因素的影响，处于动态的变化过程中。不同的细胞、组织或个体之间，甚至同一细胞或个体的不同发育时期，其DNA 甲基化状态和程度都可能存有差异。 2003 年10 月，人类表观基因组计划委员会正式宣布投资和启动人类表观基因组计划( human epigenomeproject，HEP) 。HEP 的主要目标是研究人类所有基因在主要组织以及200 多种细胞中正常和疾病状态下的甲基化模式，并在基因组水平绘制不同组织正常和疾病状态时的甲基化变异位点图谱[4]，本文结合2013年至今DNA甲基化研究文献，综述了DNA甲基化分布特点和与疾病关系等方面的研究情况。 1.DNA甲基化 1.1DNA甲基化与DNA去甲基化 DNA 甲基化是表观遗传( Epigenetic) 的一种重要表现方式，指在DNA 甲基转移酶( DNA methyltransferase，DMT) 的催化下，以s －腺苷甲硫氨酸( SAM) 为甲基供体，将甲基转移到特定碱基上的过程。 DNA 去甲基化也被称为DNA 甲基化丢失(lossof DNA methylation), 即甲基基团从胞嘧 啶上消失的过程。包含主动去甲基化与被动去甲基化2 种模式。 1.2DNA甲基化分布 DNA 甲基化在生物体内的分布并不是随机的，而是呈现一定的规律性。
DNA甲基化原理
DNA甲基化 甲基化检测服务-亚硫酸氢钠处理后测序法(bisulfite genomic sequencing PCR, BSP)是利用未甲基化的胞嘧啶可以被亚硫酸氢钠发生脱氨基变为尿嘧啶的原理，用两一特异性引物扩增后测序。测序法克服了只能针对单个位点检测，并且这些位点必须是限制性内切酶识别位点的缺点，可以对任何基因序列的甲基化状态进行检测。 甲基特异性的PCR扩增（MS-PCR）示意图 DNA甲基化（英语：DNA methylation） DNA甲基化是一种表观遗传修饰，它是由DNA甲基转移酶（DNA methyl-transferase, DNMT）催化S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶（mC）的一种反应，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位点，它在基因组中呈不均匀分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的区域，在哺乳动物中mC约占C总量的2－7％。DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式，能在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。为外遗传编码（epigenetic code）的一部分，是一种外遗传机制。DNA甲基化过程会使甲基添加到DNA分子上，例如在胞嘧啶环的5'碳上：这种5'方向的DNA甲基化方式可见於所有脊椎动物。在人类细胞内，大约有1%的DNA碱基受到了甲基化。在成熟体细胞组织中，DNA甲基化一般发生於CpG双核苷酸（CpG dinucleotide）部位；而非CpG甲基化则於胚胎干细胞中较为常见。植物体内胞嘧啶的甲基化则可分为对称的CpG（或CpNpG），或是不对称的CpNpNp形式（C与G是碱基；p是磷酸根；N指的是任意的核苷酸）。特定胞嘧碇受甲基化的情形，可利用亚硫酸盐定序（bisulfite sequencing）方式测定。DNA甲基化可能使基因沉默化，进而使其失去功能。此外，也有一些生物体内不存在DNA甲基化作用。
甲基化
Dam、Dcm和CpG甲基化 原文地址:https://www.wendangku.net/doc/6d12935623.html,/biotech/exp/TechArticle/2010/c819172778.html DNA 甲基转移酶（MTases）普遍存在于原核和真核生物中，能将S-腺苷甲硫氨 酸上的甲基转移到腺嘌呤或者是胞嘧啶上。 当使用限制性内切酶消化DNA 时，要考虑是否有甲基化的问题，这是因为如果识别序列中某个特定碱基被甲基化后，切割就会被完全或者不完全阻断。 原核生物甲基化 在原核生物中，DNA 甲基化酶作为限制修饰系统的一个组成部分广泛存在，它们的作用是保护宿主菌不被相应的限制性内切酶切割。大多数实验室使用的大肠杆菌包括三种位点特异性的DNA 甲基化酶。 ?由dam 基因（Dam 甲基化酶）编码的甲基化酶能将甲基转移到GATC 序列中的腺嘌呤N6 位点上（1，2）。 ?由dcm 基因编码的Dcm 甲基化酶，能在CCAGG 和CCTGG （1，3）序列内部的胞嘧啶C5 位置上甲基化。 ?EcoKI 甲基化酶，即M.EcoKI 可将AAC（N6A）GTGC 和GCAC（N6A）GTT 上的腺嘌呤进行甲基化修饰。 如果限制性内切酶的识别位点是从表达Dam或Dcm 甲基化酶的菌株中分离而得，并且其甲基化识别位点与内切酶识别位点有重叠，那么该限制性内切酶的部分或全部酶切位点有可能不被切割。例如，从dam+ E.coli 中分离的质粒DNA 完全不能被识别序列为GATC 的MboI 所切割。 E.coli 菌株中的DNA 甲基化程度并不完全相同。pBR322 DNA 能被完全修饰（因此完全不能被MboI 切割），而λDNA 只有大约50% 的Dam 位点被甲基化，这是因为在λDNA 被包装到噬菌体头部之前，甲基化酶还没来得及将DNA 完全甲基化。因此，被Dam 或Dcm 甲基化完全阻断的酶却能对这些λDNA 进行部分切割。 被Dam 或Dcm 甲基化的限制性位点可以通过克隆DNA 至dam- /dcm- 菌株【如dam- /dcm- E.coli 感受态细胞（NEB #C2925）】进行去甲基化。 如果出现重叠位点，内切酶酶切也会被阻断。在这种情况下，Dam 或者Dcm 序列一部分来自内切酶识别序列，另一部分为识别序列左右旁侧的序列。在设计限制酶酶切时也应考虑到这种情况。 真核生物甲基化 在高等真核生物（如Dnmt1）中发现的CpG 甲基转移酶（CpG MTases），将甲基基团转移至胞嘧啶残基上的C5 位点。 CpG 甲基化形式受遗传因素的影响，具有组织特异性，并与基因表达相关。因此，我们推测CpG 甲基化在基因分化和表达中起了一定的作用（4）。 注意：在消化真核基因组DNA 时尤其要关注CpG甲基化的影响。需要注意的是，一旦DNA 被克隆到宿主菌中，将不存在CpG 甲基化形式。 甲基化敏感性