时间分辨荧光免疫分析法(Time-resolved fluoroimmunoassay)操作

时间分辨荧光免疫分析法(Time-resolved fluoroimmunoassay)是在荧光分析的基础上发展起来的一种特殊的荧光分析。它利用具有长效荧光的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）作标记物，充分利用激发光与发射光之间的降移与发射光较长的半寿期，在激发光后延时测量发射光的强度。从而所测的荧光不受激发光和被检物中的非特异荧光干扰，提高了检测的特异性与灵敏度。在激发光后延时400微秒，测量400微秒，间歇200微秒后进入下一个测量周期，每一个周期为1000微秒。对每一个样品实施1秒钟的测量，意味着完成了1000个周期的测量，测量精确度极高。

（一）Auto DELFIA自动时间分辨荧光免疫分析仪开/关程序

1 开机

1.1 依次打开样品处理器电源，微孔板处理器电源，打印机电源。

1.2 打开计算机显示器。

1.3 启动计算机。

1.4 运行系统软件：Auto DELFIA与Multicalc系统软件在Windows启动后自动运行。Auto DELFIA workstation软件用于控制Auto DELFIA的运行，MultiCalc的主要功能是与主机通讯，对测试结果进行评估和对质控及其他数据处理（可通过双击屏幕上图标不运行）。在MultiCalc Auto DELFIA环境下，只有键盘有效，鼠标无效。

2 开机后准备

1.1 清洗液准备

1.1.1 微孔板处理器洗液（250ml浓缩液＋600ml去离子水混合），每做一块板至少1升用量，洗液在密闭条件可保存2周时间。

1.1.2 准备样品处理器洗液（50ml浓缩液＋5000ml去离子水混合），每做一块板至少需要800ml洗液，洗液在密闭条件下可保存1周时间。

1.2 样品处理器准备

1.2.1 在Wash bottle（清洗液瓶）、Rinse bottle (冲洗液瓶)分别注入足够用量的清洗液和去离子水，倒空废液瓶。拧紧各瓶盖，确保废液瓶管路向下。

1.2.2 如样品需要稀释，放入稀释杯和稀释液。系统安装时已调好有71ml和190ml两种规格的稀释杯，若使用71ml的稀释杯，从最右端开始放置，如有预处理样品，则不能使用190ml 的稀释杯。不能使用多个稀释杯。

1.3 微孔板处理器准备。

1.4 点击Load菜单下的Load System Liquids选项Option-Show Tempareture显示温度和压力。当管路内有压力时，不要打开瓶盖。

1.5 点击Maintenance →Plate Processor →Washer test，检查洗板机功能，系统自动提示检查步骤。

1.6 在试剂舱内插入足量干净、不弯曲的吸嘴。

1.7 装载足量干净的稀释杯，每一稀释杯分为两半，可做两次稀释，总共有24个稀释位。

1.8 检查检测帽（白色）是否放入试剂舱最左边第一个帽架位置，并且其他位置没有黑色防蒸发帽。

1.9 确认传送器下方的废物盘已倒空。

1.10 检查两瓶增强液是否足够（一瓶可做8块板），通常先换右边的瓶子，但如左边瓶内溶液少于1/3，则两瓶均须更换。增强液瓶内有压力，必须拧紧盖子。必要时使用Maintenance 菜单下的Enhancement solution flush 命令灌注管路。

1.11 校准品：每瓶hAFP和βhCG校准品瓶中精确加1.1ml去离子水，轻轻混匀，30min后去除泡沫使用。需再次使用的校准品保存于-20℃。

1.12 Eu/Sm标记物溶液：在使用前1h，根据每条板条（12孔）需30μl标记物和30ml缓液配制标记物溶液。

3 关机

3.1 关闭微孔板处理器电源。

3.2 用探针支架支撑探针架防止损坏，关闭样品处理器电源。

3.3 退出Auto DELFIA系统软件，退出MultiCalc软件。退出Windows。

3.4 关闭电脑电源。

（二）Auto DELFIA自动时间分辨荧光免疫分析仪分析参数设置程序

1 检验项目设置

1.1 在操作主界面点击Settings菜单→选择Assay Protocols（检验项目）。

1.2根据需要选择校准曲线、样品复管数、批号和质控。使用新批号试剂时，则更新批号。如果选择了参考曲线，批号改变后系统自动提示需做一条新的曲线。

1.3 若欲将结果存到LIS系统中，确认在MultiCalc中Protocol的Stored Files里选择Results，并选择Resulte格式。

1.4 如果要做双标，须先做溢出纠正因子校正（详见维护保养部分）。

1.5 如果做新生儿筛查，在Settings菜单系统子菜单下选择新生儿筛查。

编辑检验项目、校准和质控。

1．在主界面鼠标点击Settings菜单，选择Assay protocols →如Screening →AFP-BHCG →Edit 。

2．进入Assay protocol editor 对话框。输入相应的批号，根据试剂说明书上标注输入正确的校准品浓度值。

（三）Auto DELFIA自动时间分辨荧光免疫分析仪校准程序。

1.1选择校准模式：有7种不同的选择，在屏幕左边从上到下依次是①每一测试块均做标准曲线；②第一块测试板做标准曲线，其余的做两点校正；③第一块测试板做标准曲线，其余不做校正和校准；④每一测试板均做两点校正；⑤第一块测试板做两点校正，其余不做校正和校准；⑥不做校正和校准，使用上一次标准曲线；⑦不做校正和校准，使用MultiCalc中设定的参考曲线。

1.2 如果还有其他需要，可更改校准品数目。例如要求第一块板做标准曲线，其余的做3点校正，则选择第二项，然后在“Next Plates”下选择相应的3个标准即可。

1.3 如果做双标（Dual Label Assay ），例如AFP＿βhcg，则无法更改校准品的数目，只能修改浓度值。双标有A-Protocol和B-Protocol两种协议，要更改B-protocol的浓度值，点击屏幕右下角的B-protocol 键。弹出新对话框，可修改校准品和质控浓度值，然后按OK 保存退出。返回到Assay Protocol Editor对话框。

1.4 复管数：在屏幕右下方点击Replicates ,输入校准品、质控品及待检标本的复管数，按OK

保存，返回Assay Protocol Editor对话框。

1.5 在Assay Protocol Editor对话框输入校准品批号，输入正确的校准品浓度值。

1.6 进入Map Of Standards 对话框，拉出校准品抽屉，按屏幕提示顺序依次放入校准品，放好后

合上校准品抽屉，按OK 。

使用后，校准品立即放置于4℃冰箱内保存。校准品打开后最多使用二次。在标准抽屉内一次最多可放8个项目的校准品。

1.6 运行

（四）Auto DELFIA自动时间分辨荧光免疫分析仪室内质控程序

1.1 点击屏幕右边Controls进入Controls 界面，输入质控的允许范围（目标值±2S）、质控代码、质控批号，必要时在Dil中输入质控稀释倍数。

1.2 在屏幕左边Controls栏选择质控做在第一块板或下一块板或最后一块板。在屏幕下部的测试板图上已显示有校准品。在屏幕右边Control Operation 栏中选择所用的质控水平（Low、Medium、High、Control 4～5），然后移动光标到板上所要放置的位置。

1.3 必要时选中Move Control、Delete control对质控进行移动和删除操作。

1.4 然后按OK键完成编辑,按Close键保存。

1.5 运行

三、运行

1 工作前准备

（二）创建工作表

在以上准备工作完成后，有两种方法检测。即点击AutoMate（自动操作）键，系统会按预定的程序执行。或选择Load Worklist 或Create list一步一步运行。在Auto DELFIA软件中创建工作表，还可在已存在的工作表中添加样品：用鼠标点击空位置，然后输入所须的项目即可。（如果试管已经放入样品处理器中，则不能添加项目）。

3．2．1编辑试管架图

1．在主屏点击Create list图出现Analytes & samples 和Sample Racks 两个对话框。

2．进入Sample Racks（样品架图），点击想添加样品的位置，会出现一红方框。注意要确保选择的位置与试管架上样品的实际位置对应。

通过对话框下方的按键可实现以下功能：

●点击Plate Map 看微孔板图。

●选择一试管，然后点击Del Tube删除该管检测。

●Print打印样品信息。

3．在屏幕试管架图最后一排编号为73的单独试管架，是质控架，如已在检验项目中设置了质控品，则自动显示在质控架上。

3．2．2 移动试管架

1．在想插入试管架的编号区输入希望的试管架编号，则该位置上插入了你输入编号的试管架，其余试管架相应后移。

2．如不使用1号试管架，则必须移动试管架或将试管直接编制到适当的试管架上。

3．2．3 移动质控架

如要把质控放到其他试管架，在当前质控架73编号区输入想放质控的编号。如把73号改成40号，则40架号成为质控架而原质控架73号变成普通的样品架73。

3．2．4 移动试管

用鼠标点住想移动的试管，将其拖到需要放的位置，然后释放鼠标。

在试管架图左下角显示出鼠标位置、试管数和稀释液位置（从右到左排列）。完成试管架安排后，点击Close，关闭Sample Racks 对话框。

3．2．5 项目和样品

1．在Analytes & samples对话框中，在Analytes栏中选择检验目的

2．在屏幕右边的下拉菜单中选择测试项目。Screening的下拉菜单中只显示已校准的测试项目。

3．选择合适的试剂盒（1板或4板）及程序（不同温育时间）。

4．选择合适的运行序号，按OK 。进入Sample 对话框。

注意：

l 在设置菜单中选择了新生儿筛查后，才能按需要间歇振荡筛查项目。

l 如果在系统设定中选择了下一管，则需要预处理的实验将不显示。

5．在Sample 对话框的Code区输入相应的样本ID号，连续样本以2个点（..）连接起始ID 号与未尾ID号，即xx..xxx 。点击Accept 或按ENTER键。

6．在样本类型栏中选择合适的试管，否则吸样探针会吸错位。

7．确认前可在项目列表中双击项目名称以删除测试；如果已按Accept键，可在微孔板图中删除管。

8．已经确认后也能增加测试样本。包括使用微管稀释样品添加测试项目，但系统设定中选择下一管或下一架，则不能添加。注意不能更改已确认样品的稀释状态。

9．确认后，样品架图上选中的试管位颜色发生改变，绿色为样品、浅兰色为用来稀释样本的空管或经稀释的质控或经预处理的标准、红色为质控。

10．必要时，在Sample 对话框的Factor栏中输入稀释倍数（5-100），按Accept键。在试管架上会显示出稀释管的位置。所有稀释管标本设定好后，按Accept键。

注：定义稀释管时试管类型仍然为样品管，按确定键后，会自动变为稀释管。如果样品处理器类型为1297-014，必须在稀释管槽内从右到左依次放入稀释微管。在稀释杯内加入适当稀释液。

11．预稀释倍数：在此Pre-dilution中输入样品加样前的预稀释倍数，以便MultiCalc能计算出正确的结果。

12．原始标本：选择Use primary，则系统会吸取等量的稀释样品和原样品。否则只吸取稀释样品。该功能只是对选中的项目有效。

13．复管数：如希望样品复管数不同与检验项目中设定的复管数，在# Repl栏中输入需要的复管数。该功能只是对选中的项目有效。

14．增加管：Add tubes显示除样品外的其他和该待测样品有关的试管数，如稀释管、微管等。

15.条形码：选中Barcode ，则以条形码来识别试管。

3．2．6 微孔板图：

1．点击样品架图下方Plate Map按键，显示测试项目的微孔板图。图中黄色为校准品，红色为质控，绿色为样品，浅兰色为稀释液，紫色为稀释质控，深兰色为手动样品，灰色为空管。

2．在微孔板图左下方显示实验板总数、当前第几块板和在浮育器中的位置、试剂盒的总数及位置。

3．按Prev 和Next ，显示前一板和下一块板状态。

4．按Delete test 、Delete Plate 和Delete Well 分别可删除当前测试项目、删除当前测试中的最后一块微孔板、删除选定的微孔，同时与之相应的试管也被删除

5．按Pack Plates ，整理删除后的微孔板。

6．按Rack map 键，系统提示装载微孔板，然后直接进行测量。

3．2．7 结束创建工作表

工作表创建完成后，按仪器上的Load按扭装载样品，然后鼠标点击屏幕上的Close ，结束创建工作表，此时系统会显示出校准品图，装载校准品。

（五）Auto DELFIA自动时间分辨荧光免疫分析仪试剂/材料装载程序

1 样品管/架装载

1.1 锁定加样臂：在装载试管架之前，按Lock键锁定加样臂，装载完毕后按Lock释放加样臂。

1.2 将有红色数字标记的质控试管架和样品架依次放到装载位置，质控架在最前面，从样本运送器最右边的起始端开始装载试管架，将试管架有条形码端向外。关上进样仓盖子，按Load键。

1.3 待质控架检测完成后自动退出，放于样本处理器中央的特定位置，关上盖后按Load键，仪器自动装载样品架。

1.4 如在系统设置中选择了稀释微管，根据系统提示所需的稀释微管量，从右向左装载稀释微管。

1.5 装载完毕，按Close 键

如果样品量非常少，可以手动加样（在Analytes & samples的Tube type列表中Man. Pipetted 或在Worklist 的comment区域中输入M 。待仪器对其他孔完成吸样后，系统提示手工加样到呈深兰色的空孔，操作者拿出板加样，要求每孔加样时间不超过2分10秒，在屏幕上显示倒计时，完成手工加样后，按IN/OUT按钮，或按OK 以确认已手工吸样。否则，到时间后板被自动运送到下一步操作区，并报警为未手工加样）。

9．点击主屏上的Schedule 按钮，在屏幕上显示检测项目的最佳顺序和时间进程。不同的颜色代表不同的功能。黄色表示测试板的加样时间、深兰色表示孵育时间、浅兰色表示稀释时间或预处理时间、红色表示清洗、加液等时间。在Priority 栏下，对不同的项目设置不同的优先级，从而再制时间表。

2 微孔板装载

1．鼠标点击Load plate 图标，样品处理器加样臂自动移到左边以方便操作。这时屏幕出现装板信息。在每行前面的红箭头表示正在装载的微孔板。

2．由于系统的洗板机每次清洗两条板孔，如测试板条为奇数，则用清洁的空板补足成偶数板条。

3．检查每个板孔是否潮湿，可用干净软纸擦干。否则会造成板条感应出错，和测量荧光时计数错误。

4．待微孔板支架到位后，依列表顺序将第一块微孔板放到支架内，微孔板的条形码向右（A 板条在右边），然后按IN/OUT键，系统自动将微孔板送进温育器内。如有第二块板，系统读取完板的批号后，微孔板支架返回装载位置继续装载，直到所有微孔板装载完毕。

5．如板上条码读不出，则显示错误信号。如板放错位，点击Retry 后取出板，以正确方法重新放入支架中，如果是条码的问题，则点击Ignore 并输入板的批号，不必输板的系列号。

6．在装载板时，系统检查每一次板的支架在孵育器中的位置，如有问题，则该板就不能被装入，并需要重新运行系统，启动程序会把支架重新带入孵育器中。

3 试剂装载

1．点击Load reagents 图标，显示需要装载的试剂及相应的信息，每行前面的红箭头表示正在被条码机读取的试剂盒。根据提示检查相应的信息。

2．在试剂杯(cassettes)右边帖上条形码，条形码上的批号要与试剂盒上的一致。在条形码上还标有微孔板的编号，用来定义相应的微孔板。

3．根据屏幕列表所示，在试剂架上从左到右依次放置已开盖的所需试剂，在示踪剂和抗体瓶上放黑色的防挥发帽。示踪剂的位置标记在试剂杯的底部。试剂杯有四种类型，适用于不同的试剂。

4．放好所有试剂后，按OK 键，条形码开始读取试剂条码，完成后提示装载微孔板。

（二）Auto DELFIA自动时间分辨荧光免疫分析仪开始运行

1．点击Start run 图标，开始自动运行，显示试剂架各试剂和消耗品的情况。

2．按照图中的位置检查试剂位置、吸嘴、稀释杯及板条量是否正确，点击OK 。

3．屏幕上显示微孔板处理器和样品处理器的液体量。检查是否达到屏幕所示的最低限度液体量。

注：残留量：

样品处理器：清洗瓶为-2.5L ；去离子水瓶为-1.5L 稀释液瓶为-6mL。

微孔板处理器：清洗液瓶和去离子水瓶均为-1.5L；左边增强液瓶不少于1/3瓶。

4．检查完毕后按OK ，系统开始自检准备运行。确认吸嘴、稀释杯、防蒸发帽是否已经放好，各瓶液量足够、废液瓶有足够的空间等。自检无误后，屏幕显示出测量时间表并开始运行。

5．运行进程

屏幕出现测量进程图，实时显示当前运行的状态及时间。如果运行过程中由于某种原因进程被终止，会在进程图上显示一红叉，可在历史记录中查阅有关信息。注意：出现问题后，下次运行之前请重新启动系统。

（七）运行结束

运行结束后，测出的计数值被保存在计数文件中，计数值由MultiCalc计算后打印出。确保MultiCalc处在计数状态以保证结果会自动输出。

（八）卸载

运行结束后鼠标点击Unload 图标，选择卸载样品/卸载微孔板，点击OK 键，按提示卸载完成后鼠标点击取消键。

（九）查看加样图

加样图是一8×12的矩阵图，对应微孔板的每一孔。在每一孔内有如下信息：序列号、探针号、试管或校准品、计数值和错误信息。其中：探针号：第几根探针进行加样。

试管或校准品：所加样品为血清或校准品。其中R代表试管，S代表校准品，D代表稀释微管，P代表位置。例如：R2P3代表试管架2的第3个试管。

计数值：实际测量出的计数值。

错误信息：L-液体量过少（兰色代表稀释液过少，绿色代表预处理故障）；E-空试管或校准品瓶；C-加样探针堵塞；F-液体表面有气泡；W-交叉污染警告。

鼠标左键点击每一孔，可看每一孔的详细信息。

四、结果

测试结果保存到C:\wiacalc\oaux\Afp-bhcg.a文件中，将该文件拷贝到f:\中。

（二）Auto DELFIA自动时间分辨荧光免疫分析仪维护保养程序

（一）该软件提供了维护计划表。每次维护都会被记入数据库存档。

1．在主屏点击Maintenance 图标的History ，输入用户名OK

2．进入Maintenance History 窗口，显示当前仪器保养情况和下次保养时间。

3．在Maintenance History 窗口，点击Settings键出现Maintenance Settings窗口，激活需做保养检查盒，在Reporting框中可选择off 或overdues或All OK

2．在Maintenance History 窗口点击Register 键，选择所需的保养方式OK 接受。（二）每日保养

5．2.1 Washer test洗板机功能测试

1．点击Maintenance /Plate processor ,进入Plate washer 界面OK

2．把一块96孔空的微孔板平稳地放于微孔板的支架上，按IN/POUT按钮。

3．板被送入仪器内，系统检查板条数并灌满洗液后返回到载板位。

4．用仔细检查每个孔是否均注满，再放入载板位，按IN/OUT按钮。

5．板进入仪器后孔内液体被吸干，然后板被送出。

6．检查各孔是否完全被吸干。可重复操作，检测完成后按Close 键。

7．如有孔没有被加满或吸干液体，可使用洗板机清洗保养程序。

5．2．2 Waste tray 清理废物盘

倒空废物盘内的吸头，用自来水冲洗，晾干。

5．2．3 Sampl e processor tubing 样本处理器管道

1．检查样本处理器管路系统在灌水过程中是否有气泡。如仅有小气泡则没问题；如果是大气泡，可用Maintenance /Sample processor /Rinse 命令冲洗系统将气泡排出；如有大量气泡不能被排除，先检查蠕动泵内管路连接和四个阀门是否有故障。

2．在注射器中偶有小气泡不成问题，但如存在大的气泡，而且经轻轻拍打注射器或拧紧接口、拉直管路也不能排除的，则要考虑更换注射器。

5．2．4 Rinse冲洗（Rinse）

进入Maintenance /Sample processor/Rinse OK 。用去离子水冲洗样本探针并浸泡针管。

通常在运行样本测定后仪器会自动冲洗。

5．2．5 Temperature温度

点击Options /Show temperature ,以检查温度调节功能。通常在下列条件下，温度在25±2℃范围内：室温15-30℃；板处理器合上盖子；在启动后至少二h保持温度稳定，如果不在这一范围联系工程师。

（三）每周保养

5．3．1 Instrument cleaning仪器清洗

进入Maintenance/instrument cleaning，显示消毒或清洗项目及所需的时间，根据需要可选择进行。

1．选择对样本或板处理器清洗、消毒后，拿掉其他样本支架，按Yes 。接着对话框要求倒空废液瓶，把装有50ml 0.2 % 的次氯酸钠溶液（2000PPM Cl ）或70%-80%乙醇溶液的瓶子放入试剂盒子最左边位置，并在试剂架的起始位置放两个吸头，放一空的微孔板，按OK 键或IN/OUT按钮，板进入仪器内开始消毒。完成后板回到装载位，取出。

2．如用于新生儿疾病筛查中FT3或FT4的检测，则必须对移动盘进行消毒，这只能与洗板

机消毒同时进行。

3．使用高效含氯溶液对板处理器消毒前先倒空废液内液体再消毒，因为增强液会降低废液的PH值而释放氯气。装载板，点击OK或按板边上的IN/OUT按钮，

4．当清洗探针时，把盛有1：20倍稀释的DELFIA Wash液的8支试管放于试管架上，用内径9-14mm的圆底试管，按OK，输入试管架号（系统提供），按OK。

5．当消毒探针时，系统提示放置一个含70%-80%乙醇消毒液的8管洗液和4管水的架子，每管液体量至少3～5ml 。高氯溶液、丙酮、变质酒精会毁坏探针。如果选择了探针清洗和消毒两项，系统会完成清洗后进行消毒，最后会用水清洗。

6．倒空废液瓶并移去微孔板后按Yes键，把工作记录入档。最后用“Unload sample racks”命令取出支架。

5．3．2 Enhancement Solution outlet 增强液出口

检查增强液出口处是否曾有液体溅出，如有用棉签拭干净。

5．3．3 Sample processor bottles 样本处理器瓶

启用“Load menu”菜单下”Load system liqids”命令，要求倒空废液瓶内液体，对洗液瓶和清洗瓶做排空和再灌满，然后按OK 。

（四）每二周保养

5．4．1 Sample processor样本处理器

1、关闭样品处理器电源同时用手托住探针固定器，然后轻轻放低探针，搁置于放有干净纸的水平台上，以防探针突然掉下而损坏。

2、用蘸有70～80%乙醇的软质布擦洗样品处理器上的齿轮。

3、probe Wash wells 探针清洗池：用移液管排空液体后，用小刷子清除异物，同时灌入70～80%乙醇约10min后，用清洗程序用水冲干净。

5．4．2 Plate processor 板处理器

关闭所有应用程序、板处理器电源和计算机电源。然后打开系统电源，先打开样品处理器，再板处理器，最后启动计算机。

5．4.3 Bottles 瓶子

选择“Loading”菜单下“Load system liquids Bottles”命令，按提示倒空洗液瓶和清洗瓶内剩余液体后，各自加满液体；倒空废液瓶内液体后按OK。

（五）每月保养

5．5．1 Bottles 瓶子

1、倒空样品处理器和板处理器的洗液瓶并冲洗干净。

2、倒空废液瓶，必要时可用大约1升的0.1-0.5%的高氯溶液消毒,盖上盖子,摇晃后放置30min,然后用水冲洗。

3、必要时用湿布清除传感器或盖子上的污垢。

5．5．2 Sample processor tubing 样品处理管路

1、用DELFIA洗液（1：20）冲洗样品处理管路系统后用去离子水冲洗。

2、将管路取出后放入盛有70～80%乙醇（不带丙酮）消毒液的瓶子，并使用“Rinse”命令再冲洗。

3、将管路放回各自加满液体的洗液瓶和清洗瓶，用“Rinse”命令冲洗五遍使去离子水充满管路。

5．5．3 Cleaning the covers, racks, and mirrors 擦洗盖子、支架和镜子

1、用70～80%乙醇擦洗板处理器上的塑料盖和样品处理器上的盖子。先用自来水再用去离子水冲洗水平托盘的盖子；

2、同法冲洗试剂架（冲洗后立即擦干，不能浸泡）、样品架；

3、如试剂分配器上套吸头的部分有红色沉淀物，则用湿的纸擦掉；

4、蘸有70～80%乙醇的湿软布擦洗试剂架传动杆；

5、用“Unload plates”命令将板固定器取出，清洗板固定器上的镜子。

5．5．4 Washer cleaning 洗板机清洗

1、启动“Maintenance”菜单下“Plate processor”栏中的“Washer cleaning”命令，可拆下洗板机多头吸嘴进行清洗。（建议由经过培训或公司专业人员操作）

2、待多头吸嘴移动到方便操作的位置，关闭板处理器电源以确保安全，如果操作不方便可移去增强液，但注意一定不要碰到增强液管路，以免污染。

3、将多头吸嘴往上抬高后往左移动，小心地卸下多头吸嘴，避免分配针和吸液针损坏。注意不要在托架上太使劲。

4、先在传送带上铺上纸巾以免水滴进仪器，然后小心地将管路从吸嘴上取下来，不要不正

当地拉伸小直径管子。

5、移去吸嘴上方的橡皮盖子，清洗整个腔室，使用维护盒内提供的相应直径的通针清洁吸液针和分配针。

6、分配腔室上的四个硅胶塞子按以下方法拆下，注意不要损坏四个孔，以免破坏密封性。（1）用小别针移去一边的两个帽子。

（2）在台上铺一块布，用维护盒内提供的清洁刷将腔室里剩余的帽子推出，直到刷子的头能看见。

（3）用布拭净刷子上的异物后抽回刷子。同法清洁其他腔室。

（4）用合适的通针再次清洗分配针，用清洁刷再次清洗腔室。清洁刷不能它用，以免污染。

（5）分配腔室与吸液腔室均应用去离子水灌满后摇动清洗。在装回前先晾干或用干净纸擦干，小心别将纸片留在针上。

（6）将橡皮封塞装回原来合适的位置。

（7）在装新硅胶塞子时必须确保腔内通道干燥及所有内置帽子都在合适位置。最上面的帽子位置稍低于腔室外壁。

（8）检查所有的针是直的，而且定位正确。

（9）重新连接管路，将多头吸嘴放回支架上，检查是否能自由上下移动。

（10）安装完成后，按OK 键，确认多头吸嘴已装好，管路已连接后按OK 。

（11）系统提示打开板处理器电源，并重新启动工作站，运行洗板机测试以保证安装到位。

（六）每季保养

5．6．1 Pipetting precision check 移液管准确性检查

1、将400-600μl（依测试的体积而定）1nmol/L铕溶液分别移入48支9 mm试管中。

2、从“Create List”菜单下“analytes selection”中选“Use made”项。

3、选sample 25、50或100分别为25、50和100μl 。

4、系统提供一个运行号，如有多个试验则另外编号。在样品号框中输入1..48号码。

5、将50ml的增强液放入试剂杯中，将此试剂杯及两个吸嘴放在试剂架最左边的位置。如不止一个测试则再放一套于试剂架。

6、按OK 键，屏幕上显示因没有试剂条形码而出错，按“Ignore”，在对话框中输入试剂盒批号号码为111111和板批号号码为1，按OK 。

7、显示Plate loading 对话框，放入一块清洁板后，按OK ，屏幕上显示因没有板条形码而报警，按“Ignore”，输入板批号号码1和板系列号为零，按OK 键。

8、Multicalc 中的“Probe”程序用来统计对整块板的每根探针的平均值与变异系数。总变异系数必须小于3%，而探针的变异系数应小于2%，如CV%超标，则应检查是否有偏离孔的输出，如有必须重新做以上检查。

9、检查完毕，运行“Instrument cleaning”进行清洗。

10、选择“Disinfect sample processor probers”对探针消毒。

11、在1-8号管中加增强液，9-12管中加水。最后在相同条件下再运行一次。

5．6．2 Accuracy test 准确性检查

1、启动“Maintenance”菜单下“Sample processor”栏中的“Accuracy test”，按OK键，选择要测试的体积（20、25、50、100、150μl）后按OK键。

2、在试剂盒中选择四个空的标准液瓶子称重，把重量输入对话框中，按OK 键。

3、将加有1.1ml达到室温25℃的DELFIA DilutionⅡ的9mm试管放入试管架1-4号位，把已称量过的4个空瓶子放进特定支架后放入板处理器的装载位。按OK 键。

4、输入装试管的试管架号，按OK后仪器自动将试管架移动到吸液位，分别吸取试管中的稀释液到校准品瓶。

5、完成移液后，拿走4个校准品瓶子，按OK键。立即再称重4个校准品瓶并输入对话框中，按OK键。如果在允许范围内（准确度应为±3%）屏幕显示每根探针的实际吸液量并告知结果是否在接受范围内。接着可选择做另一体积的测试。

5．6．3 Carry-over check if the probers 探针的残留检查

方法一：通过检查hCG和TSH Ultra 实验或其它分析来做。

规定用于hCG和TSH Ultra 实验数据进行分析仅用到两条微孔板。使用Muliticalc 的“Carry”程序，不必用标准，数据是从CPS上得到。如想要到更多的板条，必须手动统计分析。

方法二：在“Settings”菜单下“Analyte”栏中设定与“Carry”程序的联系。在“Create list”里，选取“Use made”，再选择“TSHu Carry”或“HCG Carry”，输入ID号与使用的试剂批号号码，输入1..12样品号。

准备8管空白标本与4管高浓度标本，做hCG需用300μl （9mm试管），如做TSH Ultra 需500μl ，先放4管空白管，然后4管高浓度管，再另4管空白管。

运行检查。要求HCG或TSHu 残留体积应小于0.005%，LH残留体积应小于0.01%，如果高这一界限必须更换探针。见“Probe change”。

（七）特别维护当出现以下情况时，必须按相应的步骤维护。

5．7．1 Probe crash 探针碰落

做准确性和残留试验。如结果不可接受，更换探针。

5．7．2 Spillage 液体溢出

如设备内有液体溢出，用干净的布擦干。

5．7．3 Serum spillage血清泼溅

如血清泼溅在样品处理器上，用蘸有清洁剂的布擦洗传送带后用水冲洗，再用70-80%的乙醇擦洗。

5．7．4 Enhancement Solution flush 增强液冲洗

1、如果DELFIA有一两天没有工作，启动“Maintenance”菜单下“Plate processor”栏中的“Enhancement Solution flush”命令，冲洗增强液管路以排除可能存在的气泡；

2、如停用超过一周，必须更换增强液。先换上去离子水并用相同的命令冲洗整个管路。使用前重新换上新的增强液，再用相同命令冲洗换新整个管路。

5．7．5 Sample processor probes 样品处理器探针

样品处理器探针是不能干燥的，当关闭系统时，应用手托住探针并移到灌满去离子水的稀释槽内，用探针托架支撑住探针，在仪器运行前必须拿掉此托架。

（八）其它

5．8．1 Aspirate 吸取

在“Run Menu”菜单下运行。放一块板在微孔板支架上，按IN/OUT按钮，完成对板吸取过程后按“close”结束。

5．8．2 Counter signal level test 计数信号水平测试

1、启动“Maintenance”菜单下“Plate processor”栏中“Counter signal level test”命令对计数信号水平进行测试，在屏幕上选定板的类型和标记物。

2、按系统的提示，在试剂架1号位放入装有1nmol/L铕或1nmol/L钐溶液的瓶子，在试剂

架的最左边放1个吸嘴，然后选一块干净的板并放入装载位。

3、吸样器移取200μl溶液加入各孔，仪器测量板及背景，结果将从工作站传送到Multicalc，打出报告。结果应该在1nmol/L±20% 范围内。

5．8．3 Dual label calibration 双标记校正

双标记测定包括铕标记和钐标记在各自界面的测定。但钐标记的结果中有部分是铕标记参与作用的，即过剩。减去铕标记带来的背景，得到纯钐标记的值为双标记校正。详见Wallac 双标记校正试剂盒。过程如下：

1、选择Dual label calibration，在屏上选择使用的板型号，如选Nunc[hAFP/Free hCG Beta ]，同时显示当前的校准值（如装机时没有校准则不显示任何值），按OK键。

2、系统提示将装有50ml的1nmol/L铕标准溶液的试剂瓶放在第一位置，将装有50ml板处理器洗液的试剂瓶（1：25）放在第二位置；同时放两个移液吸嘴于试剂架的1、2号位，然后放一块至少有三条的清洁未包被板，按OK键盘。

3、铕标记液将被加入A条板，洗液被放入C条板，然后测量板孔，过剩值被求出。新的结果与以前的结果同时显示。对于Nunc[hAFP/Free hCG Beta ]经典的空白值小于140；PSA双标记的背景一般小于10，校正因子在0.4-0.6之间。按OK接受新值，按Close取消当前结果。

如果未做校正，就不能做双标记实验。

5．8．4 Fill 冲洗

启动“Maintenance”菜单下“Sample processor”栏中的“Fill”命令，冲洗整个样品处理器管路系统。

5．8．5 Prewash 预洗

在“Run”菜单下选择“Prewash”，可对微孔板的预洗，放一块板后，按IN/OUT ，完成后按“Close”。

5．8．6 probe changing 更换探针

请及时联系公司专业人员。

1、启动“Maintenance”菜单下“Sample processor”栏中的“Probe changing”命令，按OK键，选择是否要检查探针的位置。

2、按Yes键，移去仪器上标准液抽屉盖后按OK键，探针移动到标准盘上方，可通过按“Down”或“Up”键来检查和调整探针位置，每按一次“Down”或“Up”键，探针向下或向上移动1mm，当达到满意位置时点击OK键。

3、如果在更换前不选择检查探针位置，仪器提示你拿掉标准盘及其盖子后按OK键。

4、从第四根探针开始小心地依次卸下各探针。当卸装或安装时不要用力过大，以免损坏探针臂。

5、当4根探针全部卸下后，2、3、4支架上升而1支架下降。此时可从第1根开始安装新的探针。

6、完成安装后，放回校准品抽屉，按OK，探针移动到校准品抽屉上方，检查并调整好探针位置。

7、仪器提示是否需要在其他位置调整探针，如按Yes键，则在微孔板的第1孔、最后孔和洗板位的上方调整探针。最后重新放回标准盘盖子。

5．8．7 Reagent dispenser accuracy test 试剂吸液准确性测试

1、在“Maintenance”菜单下“Sample processor”栏中的“Reagent dispenser accuracy test”命令，选择待测试的分配器，按OK 键。

2、称重瓶子后放入试剂架，输入称量值。

3、仪器提示装载有一个已称重瓶子的试剂架，和10个吸嘴及装有50ml去离子水的缓冲瓶，放在试剂架的最左边，按OK键开始测试。

4、完成后立即称重给液后的瓶子，输入对话框，系统会显示分配的量，评估其是否在可接受的范围内。

5．8．8 Wash 洗板

在“Run”菜单下运行“Wash”命令，以清洗微孔板。清洗次数可根据需要输入，放入一块板后按IN/OUT，仪器将自动进行清洗。

酶联免疫法与时间分辨荧光免疫法检测HBsAg

酶联免疫法与时间分辨荧光免疫法检测HBsAg 陈桂花1a，谭玉华2，罗颖照1b（1.广州经济技术开发区红十字会医院，a检验科,b体检中心，广东广州 510530 ；2.广州市丰华生物工程有限公司，广东广州 510730） 摘要：目的比较2种方法4种试剂乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原（HBsAg）的检测性能，并探讨HBsAg阳性HBV血清标志物（HBV M）模式组间及其与HBsAg阴性模式组间的HBsAg 浓度差异。方法酶联免疫法（ELISA）对1205例标本HBV M进行定性检测。其中定性检测的153例标本再用3个厂家的时间分辨荧光免疫法（TrFIA）定量测试试剂进行HBsAg比对检测，其余经定性检测的1052例标本均再用TrFIA定量测试试剂进行HBsAg定量检测，对HBsAg结果进行统计分析。结果 2种方法4种试剂间HBsAg阳性检出率差异均无统计学(P>0.05)，3个厂家的TrFIA法试剂HBsAg定量检测结果相关性良好，r>0.95。TrFIA法能对0.2ng/ml—1.0ng/ml的低浓度HBsAg标本进行有效检测。研究发现TrFIA法定量检测未经稀释的HBV感染者血标本HBsAg浓度在0.2ng/ml—650ng/ml间。“HBsAg、e抗原（HBeAg）、核心抗体（抗-HBc）”阳性模式组HBsAg浓度与“HBsAg、抗-HBc”阳性、“HBsAg、e抗体（抗-HBe）、抗-HBc”阳性、“HBsAg”单阳性模式组HBsAg浓度差异有统计学意义（P<0.05），“HBsAg、抗-HBc”阳性模式组和“HBsAg、抗-HBe、抗-HBc”阳性模式组间HBsAg浓度差异无统计学意义(P>0.05)，“HBsAg、抗-HBc”阳性模式组、“HBsAg、抗-HBe、抗-HBc”阳性模式组HBsAg 浓度与“HBsAg”单阳性模式组HBsAg浓度差异有统计学意义（P<0.05），“HBsAg”单阳性模式组和“HBsAg阴性模式”组HBsAg浓度差异有统计学意义（P<0.05），“HBsAg阳性模式”组HBsAg浓度与“HBsAg阴性模式”组HBsAg浓度差异有统计学意义（P<0.05）。结论 HBsAg 出现的早晚和它被清除的早晚与感染剂量、感染方式以及病情轻重有关。HBeAg或抗-HBe 的出现与HBsAg的浓度呈一定的关系，HBsAg浓度与病毒的复制存在一定的关系。ELISA法HBV M定性检测结合TrFIA法HBsAg定量检测对HBV感染诊断和防治具有重要意义。 关键词：酶联免疫法；时间分辨荧光免疫法；乙型肝炎病毒，表面抗原 HBsAg是HBV感染后血清中首先出现的标志物HBV M，可作为乙肝的早期诊断和普查项目。HBsAg的检测受到许多研究者的关注[1-6]，随着标记免疫方法学的飞跃发展，HBsAg检测的灵敏度有了进一步提高，并且定量结果取代了定性报告，为临床诊断提供了更多的信息。作者采用了1个厂家的ELISA法定性诊断试剂与3个厂家的TrFIA定量测试试剂对HBsAg 进行了比对检测，结果与分析如下。 一材料与方法 1. 标本标本采自广州市经济技术开发区红十字会医院门诊病人、住院病人和体检人员标本1205例，及时分离血清，-20℃保存备用。 2. 仪器与试剂 ST-360 型酶标仪（上海科华公司），酶联免疫法乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（国药准字S1*******，上海荣盛公司）；Victor2-D1420时间分辨荧光免疫仪（美国PE公司）；时间分辨荧光免疫法乙型肝炎病毒表面抗原定量测试试剂盒[国药准字S2*******，广州丰华公司；国药准字S2*******，苏州新波公司；国食药监械（准）字2007第3401095号，中山大学达安公司]；DEM-Ⅲ型自动酶标洗板机和FWZ-Ⅱ型恒温微量振荡仪（广州丰华公司）。 3. 方法 ELISA法与TrFIA法均严格按试剂盒和仪器说明书操作。ELISA法对以上1205例标本进行定性检测，按说明书结果判断方法判读阴阳性，对弱阳性的HBV M、“HBsAg、抗-HBs”或“e抗原、e抗体”双阳模式的HBVM均须2孔复查，仍为阳性者判为阳性。其中定性检测 作者简介：陈桂花，女，1974年9月生，本科，检验技师，主要从事免疫学检验工作。

时间分辨荧光免疫分析仪特点及性能

时间分辨荧光免疫分析仪特点及性能 时间分辨荧光免疫分析仪采用现代光学、机械、计算机等先进技术，通过标记离子螯合物产生的特异性荧光寿命长、强度高，消除本底干扰荧光；利用激发光波谱宽、荧光发射波谱窄，增强荧光强度，提高分辨率的原理，对临床免疫血样进行定量分析，为临床血样提供灵敏、准确、可靠的数据。 概述 时间分辨荧光免疫法所用的标记物是镧系元素螯合物，利用这类荧光物质荧光寿命长等特点，通过波长和时间两种分辨技术，有效排除了非特异本底荧光的干扰。 特点 1、灵敏度高； 2、标记物制备简单； 3、稳定性好； 4、标准曲线线性范围宽； 5、操作方便。 技术性能 电源：210～240V，50～60Hz；外型尺寸：550mm×600mm×270mm；重量：25 kg；灵敏度：10-13 mol/L；线性度：10-12～10-8 mol/L；快速测试：1秒/样；高稳定性：< ±1 %；工作制：连续运行；安全分类：I类；防电击程度：B型；熔断器：Φ5×20 5A。 应用领域 主要用于对人的血液和其它体液中的各种免疫检测项目进行定量分析，它可以适用与传染病检查、内分泌科检查、细胞学检查、肿瘤科检查等。随着检验医学的发展，对微量、超微量的测定会越来越多，同时RIA的污染问题会越来越被重视，因此，时间分辨荧光分析法具有越来越大的应用空间。 产品特性产品参数 产品特点： 1) 采用进口光源、光学镜片及光电倍增管，保证检测结果的稳定性及可靠性； 2) 测试速度快，1秒／样本； 3) 标本灵活，适合任意份标本量； 4) 全中文软件，操作界面简便； 5) 是国内首家研发出成功，填补国内空白，并获得国家科技进步二等奖。 技术参数： 1) 测定原理：时间分辨 2) 激发光源：进口氙灯 3) 灵敏度: 10 -17 mol／孔（Eu 3+） 4) 线性范围：10 -13 mol／孔～10 -17 mol／孔 5) 高稳定性：＜5 % 6) 电源：AC 198～242V 50～60Hz 7) 外型尺寸：710mm×520mm×320mm

时间分辨荧光免疫技术和酶联免疫吸附试验检测抗-HCV结果分析

时间分辨荧光免疫技术和酶联免疫吸附试验检测抗-HCV结果分析 发表时间：2015-10-09T16:57:53.750Z 来源：《医药前沿》2015年第21期供稿作者：陈华根刘小花宋强 [导读] 成都市新都区人民医院四川成都 HCV-RNA检测对于判断急慢性感染、复制水平、明确诊断和疗效观察具有重要意义，但受实验条件限制，难以常规应用。 陈华根刘小花宋强 （成都市新都区人民医院四川成都 610500） 【关键词】时间分辨；荧光免疫技术；酶联免疫吸附试验；抗-HCV 【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）21-0081-02 丙型肝炎的病原体是HCV,主要经血液传播[1]。HCV有6种基因型，感染人体后，血液中出现抗-HCV,而HCV-RNA浓度相对较低，所以临床实验室常通过检测抗-HCV来判断HCV感染，诊断丙型肝炎[2-3]。可用酶联免疫吸附试验（ELISA）、化学发光、凝集试验、金免疫层析试验等检测，应用广泛的ELISA检测抗-HCV灵敏度，准确度能满足临床诊断丙型肝炎需要，但缺乏全自动酶免疫分析仪的实验室却显繁琐。近年来，时间分辨荧光免疫技术(TRFIA)逐步在临床实验室用于抗-HCV检测，我们利用TRFIA检测，同时与ELISA方法比较，评价其检测效果，报道如下。 1.资料与方法 1.1 一般资料 收集本院2013年至2014年经ELISA检测抗-HCV阳性标本299例，其中男163例，女136例，年龄18至89岁。 1.2 方法 1.2.1试剂、仪器和质控品抗-HCV ELISA试剂分别购于厦门新创公司，MK3酶标仪和Well Wash Plus型洗板机系上海热电产品。TRFIA试剂、前处理仪和荧光测定仪购于苏州新波公司。质控品购于北京康彻思坦公司。仪器皆经过维护校准且通过技监局年度强检，质控品和试剂在效期内使用。 1.2.2方法采集患者静脉血3～5ml,自然收缩或37℃温育30分钟后，3000转/分离心15分钟，立即检测或置冰箱2℃～8℃保存2日。严格按照标准作业指导书操作。厦门新创公司ELISA检测阳性者，再用TRFIA检测。 2.结果 ELISA检测抗-HCV阳性299例，经TRFIA检测阳性299例，符合率100%。 3.讨论 丙型肝炎是由丙肝病毒所致的流行广泛，危害严重的传染性疾病。病原体检测是疾病诊断必不可少的手段，病原体诊断标志是抗-HCV 和HCV-RNA。HCV-RNA检测对于判断急慢性感染、复制水平、明确诊断和疗效观察具有重要意义，但受实验条件限制，难以常规应用。抗-HCV ELISA检测，仅需洗板机、酶标仪等一般实验设施，并且现在所用第三代试剂，所选抗原包括C区、NS3区、NS4区和NS5区，提高了检测的灵敏度和特异性，缩短了“窗口期”，反应性样本可不用重组免疫印迹试验（RIBA）验证，因此ELISA检测抗-HCV是各级实验室运用最多的丙型肝炎病原标志检测项目。但实验类型多采用间接二步法，检测周期较长。虽然选用抗原，试剂工艺有所改进，但酶免疫检测结果，受类风湿因子、补体、异嗜性抗体、用鼠抗诊疗诱导产生的抗鼠抗Ig、自身抗体、溶菌酶等内源性影响因素和溶血、细菌污染、标本收缩不充分、存贮过久、反复融冻等外源性影响因素干扰难以完全避免[4]。通过利用TRFIA法检测299例ELISA法检测抗-HCV阳性结果完全一致，说明利用TRFIA检测抗-HCV准确可靠，且智能化程度较高，值得推广应用。 【参考文献】 [1] 李梦东主编.实用传染病学[M].第2版.北京：人民卫生出版社.2000年，127-134. [2] 中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝脏病学分会.病毒性肝炎防治方案[J].中华肝脏病杂志，2000，16(8)：324-329. [3] 李金明主编.临床酶免测定技术[M].北京:人民军医出版社，2008：87-90. [4] 黄学斌,陈华根,刘冰.金免疫层析试验检测丙型肝炎抗体应用评价[J].检验医学与临床，2009,6（18）：1531-1532.

时间分辨荧光分析技术

1.1 时间分辨荧光分析技术 时间分辨荧光生化分析技术是基于稀土荧光配合物特殊的荧光性质而建立起来的，自1978年提出以来[1]，已广泛的应用于免疫分析、核酸测定、荧光显微镜成像、细胞识别、单细胞原位测定、生物芯片等生化领域，并发展出了相应的时间分辨荧光免疫测定法、时间分辨荧光DNA 杂交测定法、时间分辨荧光显微镜成像测定法、时间分辨荧光细胞活性测定法及时间分辨荧光生物芯片测定法等分支。 本节主要对稀土荧光配合物的发光机理、荧光性质，时间分辨荧光测定的原理，时间分辨荧光免疫分析技术，时间分辨荧光显微镜成像技术的研究进展等加以介绍。 1.1.1 稀土荧光配合物的发光机理及荧光性质 稀土元素指的是元素周期表中IIIB 族的镧系元素以及钪和钇，共17种元素。其中镧系元素的外层电子结构为4f 0-145d 0-106s 1-2，由于5s 和5p 电子对4f 电子的屏蔽作用，导致这些金属及其离子的性质十分相似。图1.1给出了四种三价稀土离子的基态及激发态电子能级图[2]。 1020 152530355 E N E R G Y ,103c m -1 6 H 5/2 G 5/2 6 H 15/2 7 F 0 F 2D 0 5D 1 7F 6 F 5 4 5D 3 13/2 4 9/2 Sm 3+ Eu 3+ Tb 3+ Dy 3+ H 9/2 图1.1 部分三价稀土离子的电子能级图 Fig. 1.1 Electronic energy levels of certain lanthanide(III) ions 大部分稀土离子本身是不具有荧光性质的，只有Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+和Dy 3+的水溶液在紫外光或可见光的激发下能够发出微弱的荧光。当Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+和Dy 3+与某些有机配位体形成配合物时其荧光强度会显著增强，这种发光是基于配合物内由配位体到中心稀土离子的能量转移所产生的[3-8]。以铕(III)配合物为

新生儿促甲状腺素的时间分辨荧光免疫分析及其试剂盒研修订版

新生儿促甲状腺素的时间分辨荧光免疫分析及其试剂盒研修订版 IBMT standardization office【IBMT5AB-IBMT08-IBMT2C-ZZT18】

新生儿促甲状腺素的时间分辨荧光免疫分析及其试剂盒研制 谭玉华，冯健明，卢顺舵，罗建安，李建国，季涛，李贵情 （广州市丰华生物工程有限公司，广州 510730 ） 摘要：目的利用时间分辨荧光免疫分析（TrFIA）技术，建立新生儿促甲状腺素（Neonatal TSH）微量检测法，并研制其检测试剂盒。方法采用了一株TSH单克隆抗体用于固相包被，另一株TSH单克隆抗体用于标记铕（Eu3+），固相双抗体夹心时间分辨荧光免疫分析法检测Neonatal TSH。结果自建的Neonatal hTSH TrFIA法灵敏度高可达2.28μU/ml，且在测量范围内，自制试剂盒剂量-反应曲线的相关系数r达0.9987。与hLH、hFSH、HCG无明显交叉反应。分析内或分析间质控结果在靶值±25%内，室内低质控、高质控分析内和分析间变异系数(CV)分别为7.12%和6.09%，7.82%和7.03%。与DELFIA ? Neonatal TSH试剂标准品进行准确性比对实测值与标示效价比平均值为1.05。与DELFIA ? Neonatal TSH试剂比对试验符合率一致，相关性系数r可达0.9822。试剂盒室间质评能力比对成绩100%。结论自建的Neonatal TSH TrFIA法具有灵敏度高，特异性强，准确度高，精密性好和非放射性等优点，具有良好的临床应用价值。 ?基金项目：科技型中小企业技术创新基金（08C26114411281），广州市科技计划项目（2006V42C0051）。 作者简介：谭玉华，1980年10月，男，医学学士，检验技师，主要从事标记免疫试剂的研发、应用和医学检验工作。 Email:tanywhy@https://www.wendangku.net/doc/6b3409610.html,

时间分辨荧光免疫分析法(Time-resolved fluoroimmunoassay)操作

时间分辨荧光免疫分析法(Time-resolved fluoroimmunoassay)是在荧光分析的基础上发展起来的一种特殊的荧光分析。它利用具有长效荧光的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）作标记物，充分利用激发光与发射光之间的降移与发射光较长的半寿期，在激发光后延时测量发射光的强度。从而所测的荧光不受激发光和被检物中的非特异荧光干扰，提高了检测的特异性与灵敏度。在激发光后延时400微秒，测量400微秒，间歇200微秒后进入下一个测量周期，每一个周期为1000微秒。对每一个样品实施1秒钟的测量，意味着完成了1000个周期的测量，测量精确度极高。 （一）Auto DELFIA自动时间分辨荧光免疫分析仪开/关程序 1 开机 1.1 依次打开样品处理器电源，微孔板处理器电源，打印机电源。 1.2 打开计算机显示器。 1.3 启动计算机。 1.4 运行系统软件：Auto DELFIA与Multicalc系统软件在Windows启动后自动运行。Auto DELFIA workstation软件用于控制Auto DELFIA的运行，MultiCalc的主要功能是与主机通讯，对测试结果进行评估和对质控及其他数据处理（可通过双击屏幕上图标不运行）。在MultiCalc Auto DELFIA环境下，只有键盘有效，鼠标无效。 2 开机后准备 1.1 清洗液准备 1.1.1 微孔板处理器洗液（250ml浓缩液＋600ml去离子水混合），每做一块板至少1升用量，洗液在密闭条件可保存2周时间。 1.1.2 准备样品处理器洗液（50ml浓缩液＋5000ml去离子水混合），每做一块板至少需要800ml洗液，洗液在密闭条件下可保存1周时间。 1.2 样品处理器准备 1.2.1 在Wash bottle（清洗液瓶）、Rinse bottle (冲洗液瓶)分别注入足够用量的清洗液和去离子水，倒空废液瓶。拧紧各瓶盖，确保废液瓶管路向下。 1.2.2 如样品需要稀释，放入稀释杯和稀释液。系统安装时已调好有71ml和190ml两种规格的稀释杯，若使用71ml的稀释杯，从最右端开始放置，如有预处理样品，则不能使用190ml 的稀释杯。不能使用多个稀释杯。 1.3 微孔板处理器准备。

时间分辨荧光免疫分析法产前筛查原理与操作规程

时间分辨荧光免疫分析法产前筛查原理与操作规程 一、产前筛查定义及其原理 产前筛查（Prenatal Screening)是指通过经济、简便和较少创伤的检测方法，从孕妇群体中发现怀有某些先天缺陷胎儿的高危孕妇，以便进而进行诊断，以最大限度地减少异常儿的出生。血清学标志物产前筛查已成为非侵入性产前诊断的重要方法。目前产前筛查的两种主要疾病是唐氏综合征（Down’s Sydrome，DS；又称21三体综合征）和胎儿神经管缺陷（Neural Tube Defects，NTDs），也包括一部分18三体综合征。产前筛查可以在妊娠早期（7～13周）或中期（14～21周）进行。目前用于产前筛查的血清学标志物有：甲胎蛋白（AFP）、游离β- ）、妊娠相关血浆蛋白（PAPP-A）、绒毛膜促性腺激素（F-β-hCG）、游离雌三醇（uE 3 抑制素A（inhibin A）等。产前筛查实验测量通用评价指标为中位值倍数（MOM），正常妊娠特定的MOM=标本检测浓度/相应孕周中位值浓度。产前筛查系统由体外诊断试剂、检测仪器和筛查分析软件组成。检测仪器配合体外诊断试剂检测出孕妇血清中标记物（AFP、F-β-hCG、PAPP-A等）的浓度，将检测数据及孕妇相关因素输入筛查分析软件中，即可得出唐氏综合征（DS）和神经管缺陷（NTD）筛查的结果。由于目前的技术水平的限制，产前筛查技术都不能做到筛查100%正确。假阴性病例因此会误诊，假阳性病例一般在产前诊断实验时被纠正。 二、唐氏综合征的产前筛查 唐氏综合征是人类最常见的一种染色体病，发病率约1/800～1/600，男性多于女性。1866年英国医生Langdom Down 首次对此病进行临床描述，因此命名称为Down，s Syndrome，简称DS。1959年Lejeune首先发现本病的病因是多了一条21号染色体，故又将其命名为21三体综合征。唐氏综合征的主要临床表现：严重智力低下、愚型面容，约50%伴有先天性心脏病、小头畸形等发育异常。目前对DS尚未有治疗方法，因此通过产前筛查找出高危孕妇，对其进行产前诊断是防止患儿出生的重要手段。 1.以孕妇年龄作为筛查指标 最早用于DS的筛查指标为孕妇年龄。早期研究发现，DS的发病率随孕妇年龄增高而增高，1977年Hook和Chambers报道了孕妇年龄在20～30岁之间，发病率呈线性增加，而在33岁左右呈对数增加，孕妇年龄为35岁时，发病率约1/384，40岁时约1/110，比30岁时增加了8倍，如图1。一般认为35岁以上

时间分辨荧光CRP-poct试纸条的设计

时间分辨荧光CRP-POCT 试纸条的设计 本试剂条内部采用侧向流免疫层析的三明治方法，装置包括一个样品垫、一个结合物释放垫、一个反应膜和一个吸收垫（图1）。其中样品垫用于加样（血清或全血）；结合物释放垫中含过量的CRP 抗体A 和Eu 的复合物(α-CRPA-Eu)；反应膜上有两道线：检测线，又称T 线:，含过量的CRP 抗体B(α-CRPB)；对照线，又称C 线，含定量的CRP 抗体A 的抗体（α-α-CRPA ）。 在测试中，血清样品在试纸条的毛细管 作用带动下流经结合物释放垫，血清中的 CRP 在此与CRP 抗体A-Eu 复合物结合，形 成CRP-抗体A-Eu 复合物（图2-A ），并在 流经反应膜上的捕获线时被捕获分子（CRP 抗体B ）结合，形成抗体B-CRP-抗体A-Eu 的三明治复合物，产生T 线信号（图2-B ）。 而结合物释放垫中过量的CRP 抗体A-Eu 复合物在流经反应膜上的捕获线时不能被捕获分子捕获，越过捕获线继续前行。当到达对照线（C 线）时，被其抗体捕获，产生C 线信号（图2-C ）。将T 、C 线进行整合，去除信噪比后，即可判定血清中CRP 的含量（图3）。 图1 ：CRP-POCT 试纸条的结构 1=样品垫，2=结合物释放垫，3=检测线，4=反应膜， 5=对照线，6=吸收垫 图2：铕标记的CRP 抗体与CRP 及本身抗体的结合 A. CRP 抗体A 与CRP 在结合物释放垫上结合； B. CRP 抗体A 与CRP 的结合物在T 线处与CRP 的另一抗体B 结合，被捕获于T 线； C. CRP 抗体A 与其本身的抗体被捕获于C 线 图3：时间分辨荧光CRP-POCT 试纸 条的检测结果

化学发光免疫技术与时间分辨技术的异同点

化学发光免疫技术与时间分辨技术的异同点 概念 化学发光免疫分析(chemiluminescenceimmunoassay,CLIA),是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。 时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是以镧系元素标记抗原或抗体，并与时间分辨测定技术结合而建立起来的一种新型非放射性微量免疫分析技术，它根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。 原理 化学发光免疫分析包含两个部分, 即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化, 形成一个激发态的中间体, 当这种激发态中间体回到稳定的基态时, 同时发射出光子(hM) , 利用发光信号测量仪器测 量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上, 或酶作用于发光底物。鲁米诺(1umino1)、异鲁米诺(isolumino1)及其衍生物、吖啶酯(acIidinim ester)衍生物、辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)是目前CLIA中使用最多的四类标记物。 时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）基本原理 用三价稀土离子及其鳌合剂作为示踪物，代替荧光物质、同位素或酶，标 记蛋白质、激素、抗原、抗体、核酸探针等物质，当免疫反应体系发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点，用时间分辨荧光分析仪测定免疫反应最后产物中荧光强度。根据荧光强度或相对荧光强度比值，来判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析之目的。 应用 化学发光免疫分析技术（CLIA） 各种激素、病毒抗原抗体、肿瘤标志物、感染性疾病、心脏标志物、治疗药物检测等各种抗原、抗体和半抗原 时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）应用广泛 1.多肽类：蛋白质、激素（甲状腺激素、甾体类激素）。 2.病原体抗原/抗体 3.病毒性肝炎标志物 4.肿瘤相关抗原 5.药物 6.核酸 优缺点

时间分辨荧光免疫分析的原理

一、前言 近百年来，“特效试剂”一直是分析化学家追求的目标。所谓“特效试剂”，就是指的是只与一种待测物质反应的试剂。事实上，目前使用的所谓的“铜试剂”、“铁试剂”、“硝酸试剂”等等，都是“盛名之下，其实难副”的。20世纪40-50年代追求合成特效试剂的狂热，早已降温。正在分析化学家心灰意冷之际，人们从免疫学与生物化学的成就看到了这一理想的曙光：免疫系统简直就是天然存在的一部特异性试剂的合成机器。抗原与抗体之间的免疫反应具有高度的特异性，这种识别的专一性超过酶对底物的识别水平，抗原-抗体复合物的稳定常数一般为109，有些高达1010-1015，具有很高的稳定性。免疫反应的特点使得免疫分析已成为一个跨学科的新型分析技术，广泛应用于临床体液分析、药物分析、环境分析、食品分析和生物化学研究，尤其在毒品的鉴定、吸毒人员的认定和疾病的诊断方面，发挥了重要作用。 时间分辨荧光免疫分析技术（TRFIA）是自80年代以来新发展起来的一种新型分析技术，与其它免疫分析技术相比，有其独特的优点。它克服了放射性免疫分析法（RIA）中放射性同位素带来的污染问题；克服了酶免疫分析法（EIA）中酶不稳定的缺点；而且，由于TRFIA法能够很好的消除背景荧光的干扰，使其灵敏度比普通荧光法（FIA）高出几个数量级。正是由于TRFIA的独特优点，使得它成为免疫分析中最有发展潜力的一种分析方法。 二、时间分辨荧光免疫分析的原理 时间分辨荧光免疫分析的原理就是使用三价稀土离子（如Eu3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+）作为示踪物，通过这些稀土离子与具有双功能结构的螯合剂以及抗原形成稀土离子-螯合剂-抗原螯合物。当标记抗原、待测抗原共同竞争抗体，形成免疫复合物，由于免疫复合物中抗原抗体结合部分就含有稀土离子，当采取一些办法将结合部分与游离部分分开后，利用时间分辨荧光分析仪，即可测定复合物中的稀土离子发射的荧光强度，从而确定待测抗原的量。 正常情况下，免疫复合物中的稀土离子自身荧光信号很微弱，若加入一种酸性增强液，稀土离子从免疫复合物中解离出来，和增强液中的β-二酮体、三正辛基氧化膦、Triton X-100等成分形成一种微囊。后者被激发光激发后，则稀土离子可以发出长寿命的极强的荧光信号，使原来微弱的荧光信号增强将近100万倍。 采用时间分辨技术测量荧光，采用了门控技术，它是使背景荧光信号降低到零以后，再测定长寿命标记物的荧光。 三、时间分辨荧光分析的测量方法 （1）解离增强测量法 解离增强测量法是解离增强稀土离子荧光方法，简称DELFIA法。通过双功能基团把Eu3+或Sm3+螯合到抗原、抗体或SA上，免疫反应后，部分标记物结合到固相载体上，未结合的标记物被洗掉。最后用低pH值的增强液，把Eu3+或Sm3+

(SOP)时间分辨荧光免疫分析实验操作指南

时间分辨荧光免疫分析实验操作指南以及注意事项

第一节时间分辨反应过程图 TRFIA的操作要点 优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证TRFIA检测结果准确可靠的必要条件。 下面列出TRFIA各个操作步骤的注意要点，严格遵照规定操作. 1、样本的采取和保存 TRFIA测定的样本一般为血清。不能使用含抗凝剂EDTA和柠檬酸的样本，因为二者可以螯合铕，使测定值降低。血清样本可按常规方法采集,溶血和脂血样本可能会影响测值。 样品在2℃-8℃可以保存3-5天，如果需要长期保存，请－20℃保存，避免反复冻融。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，宜轻缓充分混匀，避免气泡，可上下颠倒混和。不要把样本保存在室温，室温放置48小时可能会导致结果不稳定。 2、试剂的准备 整个实验过程应尽量在干净无尘的环境下进行 实验前应检查试剂盒的出厂日期以确定试剂盒是否过期，一般自产品检验合格出厂日期起有效期为一年。 按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。TRFIA中用的去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的去离子水。从冰箱中取出的试验用试剂应待其温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。 试剂盒中的标准品或铕标试剂若是冻干的状态，第一次开盒做实验在加去

离子水溶解标准品或铕标后，请不要立刻开始使用，静置10分钟左右待其溶解完全后再开始。 板条若未能一次用完，剩余板条用塑料袋（内有干燥剂）封口后密封保存。 TRFIA受反应温度的不恒定、操作误差以及铕标记物的稳定性等因素的影响，不同日期的荧光值会有所波动，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。 3、加样 在TRFIA中一般有3次加样步骤，即加样本，加铕标记物，加增强液。加样时应将所加物加在微孔板的底部，避免加在孔壁上部，不可溅出，不可产生气泡。 加样本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。加不同的样本应更换吸嘴，以免发生交叉污染。加铕标记和增强液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。 连续加样器使用时要连续流畅，并不是加样越慢越好！ 加样时检测吸嘴是否堵塞，加量是否足够，注意吸头之间是有差异的。 加样品时把样品按12个一排排好，做时每加样一个，就把它前移一排，这样不容易出错。 注意按操作步骤计算试剂的量是否充足，特别是使用全自动仪器时！ 使用干净的一次性容器配制铕标记物。铕标记物的污染是造成实验本底增高的首要原因。注意铕标记物的瓶盖不要与标准品瓶盖混用；所有接触过铕标记物的用品使用完毕应该丢弃，不能重复使用。注意铕标记物原液和工作不要污染实验台面、加样枪及试剂盒中的其他组份。 4、孵育 在TRFIA中一般有一次或两次抗原抗体反应，即加样本和铕标记物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为孵育，或者温育。 目前TRFIA常用模式在微孔板中进行，属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的样本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗体结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的

新生儿促甲状腺素的时间分辨荧光免疫分析及其试剂盒研精编版

新生儿促甲状腺素的时间分辨荧光免疫分析及 其试剂盒研 文件编码（008-TTIG-UTITD-GKBTT-PUUTI-WYTUI-8256）

新生儿促甲状腺素的时间分辨荧光免疫分析及其试剂盒研制 谭玉华，冯健明，卢顺舵，罗建安，李建国，季涛，李贵情 （广州市丰华生物工程有限公司，广州 510730 ） 摘要：目的利用时间分辨荧光免疫分析（TrFIA）技术，建立新生儿促甲状腺素（Neonatal TSH）微量检测法，并研制其检测试剂盒。方法采用了一株TSH单克隆抗体用于固相包被，另一株TSH单克隆抗体用于标记铕（Eu3+），固相双抗体夹心时间分辨荧光免疫分析法检测Neonatal TSH。结果自建的Neonatal hTSH TrFIA法灵敏度高可达μU/ml，且在测量范围内，自制试剂盒剂量-反应曲线的相关系数r达。与hLH、hFSH、HCG无明显交叉反应。分析内或分析间质控结果在靶值±25%内，室内低质控、高质控分析内和分析间变异系数(CV)分别为%和%，%和%。与DELFIA Neonatal TSH试剂标准品进行准确性比对实测值与标示效价比平均值为。与DELFIA Neonatal TSH试剂比对试验符合率一致，相关性系数r可达。试剂盒室间质评能力比对成绩100%。结论自建的Neonatal TSH TrFIA法具有灵敏度高，特异性强，准确度高，精密性好和非放射性等优点，具有良好的临床应用价值。 关键词：新生儿；促甲状腺素；时间分辨荧光免疫分析 Time-resolved Fluoroimmunoassay of Neonatal Hypothyropin and Preparation of It’s Test Reagent Tan Yu-hua,Feng Jian-ming, Lu Shun-duo, Luo Jian-an, Li Jian-guo, Ji Tao,Li Gui-qing 基金项目：科技型中小企业技术创新基金（08C281），广州市科技计划项目（2006V42C0051）。 作者简介：谭玉华，1980年10月，男，医学学士，检验技师，主要从事标记免疫试剂的研发、应用和医学检验工作。

时间分辨荧光免疫分析方法的光谱研究

第24卷,第5期 光谱学与光谱分析Vol 124,No 15,pp5962599 2004年5月 Spectroscopy and S pectral Analysis May ,2004　 时间分辨荧光免疫分析方法的光谱研究 郭周义,田　振,贾雅丽 华南师范大学激光生命科学研究所,广东广州　510631 摘　要　时间分辨荧光免疫分析法是用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物,标记蛋白质、激素、抗体、核 酸探针或生物活性细胞,待反应体系(如:抗原抗体免疫反应、生物素亲合反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等)发生后,用时间分辨荧光技术测定反应体系中分析物的浓度,达到定量分析的目的。它之所以能够继放射性同位素标记、酶标记、化学发光、电化学发光后成为一种更新、更灵敏的检测方法,主要取决于它所用标记物三价稀土离子螯合物独一无二的物理及化学性质。主要报导了对使用的长寿 命荧光团Eu 3+ 螯合物的光谱研究结果,时间分辨技术及荧光增强技术的原理。实验表明:选择336～337nm 的激发波长,有利于Eu 3+ 的配位二酮体的激发及能量转移。 主题词　免疫分析;荧光增强技术;时间分辨光谱技术;Eu 3+螯合物中图分类号:O657132 文献标识码:A 文章编号:100020593(2004)0520596204 　收稿日期:2003203226,修订日期:2003206228 　基金项目:广东省科技攻关重点项目(2002C60113);广州市天河区科技计划项目(2002XGP06);广东省自然科学基金项目(No 1015012, No.031518);教育部科学技术研究重点项目(No 102113)资助 　作者简介:郭周义,1965年生,华南师范大学激光生命科学研究所教授,博士生导师 引　言 最近几年发展起来的时间分辨荧光免疫分析方法(TR 2 FIA )是超微量免疫检定法的一大突破。由于使用了时间分辨光谱技术和荧光增强技术,使荧光免疫分析的灵敏度得到了极大提高。1983年Petterson [1]和Eskola [2]首先将时间分辨荧光光谱技术应用于免疫分析的研究中。目前,TRFIA 的最低检出值已达10-19mol ?well -1,远远超过酶标记免疫分析法(EIA )的10-9mol ?well -1,放射免疫分析法(RIA )的10-15mol ?well -1和发光免疫分析法(L IA )的10-15mol ?L -1。 稀土离子是金属离子,若用来直接标记抗原、抗体,标记率很低,一般使用含有双功能基团的螯合剂,形成稀土离子2螯合剂2抗原(或抗体)的螯合物。稀土离子的荧光,不仅与自身的能级结构有关,而且与螯合剂的性质有关。螯合物不同,稀土离子的激发光和发射光也会有所不同。 1　稀土离子的吸收光谱 镧系离子的电子排布为 1s 2 2s 22p 63s 23p 63d 104s 24p 64d 104f n 5s 25p 6(n =0～14),其主要价态有二价、三价和四价。三价态是特征氧化态,其 基组态是4f n (n =0～14),下一个激发态是4f n -15d [3]。 稀土离子吸收光谱[4]的产生可归因于三种情况。111　f —f 跃迁光谱 指f n 组态内,不同J 能级间跃迁所产生的光谱。它的特点是: (1)发光弱。这主要是因为f —f 跃迁是宇称选择规则禁 阻的。虽然在溶液和固态化合物中,由于配体场微扰,也能 观察到相应的光谱,但相对于d —d 跃迁来说,也是相当弱的。 (2)类线性的光谱。谱带的尖锐原因是处于内层的4f 电子受到5s 2,5p 6电子的屏蔽,受环境的影响较小。 (3)谱带的范围较广。在近紫外,可见区和近红外区内 都能得到稀土离子(Ⅲ )的光谱。112　f —d 跃迁光谱 4f n 向4f n -15d 的跃迁是组态间的跃迁。这种跃迁是宇称选择规则允许的,因而4f —5d 的跃迁是较强的;三价离子的吸收带一般在紫外区出现;由于5d 能级易受周围离子的配体场影响,相对于f —f 跃迁来说,谱带变宽。113　电荷跃迁光谱 稀土离子的电荷跃迁光谱,是指配体向金属发生电荷跃迁而产生的光谱,是电荷密度从配体的分子轨道向金属离子轨道进行重新分配的结果。镧系络合物能否出现电荷跃迁带取决于配体和金属离子的氧化还原性。一般在易氧化的配体 和易还原为低价离子(Sm 3+,Eu 3+ ,Te 3+,Yb 3+和Ce 4+)的络合物光谱中易见到电荷跃迁带。谱带的特点是有较强的强度和较宽的宽度。

免疫层析技术的发展及在POCT中的应用

综一一述 免疫层析技术的发展及在P O C T中的应用 黄德智综述,蒲晓允?审校 (陆军军医大学新桥医院检验科,重庆４０００３７) 一一摘一要:免疫层析技术因其简单二方便二易操作二快速,价格相对低廉,已广泛应用于即时检测(P O C T).随着P O C T检测项目的增多和对已有项目检测定量二灵敏度二特异度等要求的提高,本文就免疫层析技术的最新发展及其应用,作以下综述. 关键词:免疫层析技术;一即时检测;一量子点 D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１６７３Ｇ４１３０．２０１９．０５．０２２中图法分类号:R４４６ 文章编号:１６７３Ｇ４１３０(２０１９)０５Ｇ０５９４Ｇ０４文献标识码:A D e v e l o p m e n t o f i m m u n o c h r o m a t o g r a p h y a n d i t s a p p l i c a t i o n i nP O C T HU A N GD e z h i,P UX i a o y u n? (D e p a r t m e n t o f C l i n i c a lL a b o r a t o r y,X i n q i a oH o s p i t a l,A r m y M e d i c a l U n i v e r s i t y,C h o n g q i n g４０００３７,C h i n a) A b s t r a c t:I m m u n o c h r o m a t o g r a p h y h a sb e e nw i d e l y u s e d i nP O C Tb e c a u s eo f i t s s i m p l i c i t y,c o n v e n i e n c e, e a s y o p e r a t i o n,r a p i d i t y a n d r e l a t i v e l y l o w p r i c e．W i t h t h e i n c r e a s eo fP O C Tt e s t i n g i t e m s a n d t h e i n c r e a s eo f t h e r e q u i r e m e n t s f o r q u a n t i f i c a t i o n,s e n s i t i v i t y,a n d s p e c i f i c i t y o f e x i s t i n g p r o j e c t s,t h i s p a p e r r e v i e w s t h e l a t e s t d e v e l o p m e n t s a n d a p p l i c a t i o n s o f i m m u n o c h r o m a t o g r a p h y． K e y w o r d s:i m m u n o c h r o m a t o g r a p h y;一P O C T;一q u a n t u md o t s １一免疫层析技术简介 一一免疫层析技术是在２０世纪６０年代在发达国家兴起并被用于检测血清蛋白的一种结合了免疫技术和色谱层析技术的快速检测分析方法,利用胶体金二胶体碳二磁性纳米材料二稀土纳米材料二量子点等着色标记物,在层析时,标记物与待测物的络合物被相应的配体捕获而浓集显色于硝酸纤维素膜上的检测线,以纤维膜上显色条带的有无二颜色深浅和反射光线来定性或定量,在即时检测(P O C T)中应用极为广泛.免疫层析试纸条由样品垫二结合垫二硝酸纤维素(N C)膜二检测线(T线)二质控线(C线)二吸水垫二聚氯乙烯(P V C)底板等部分组成,根据待检测物的大小和抗原抗体结合的方式,分为双抗体夹心法和竞争法[１Ｇ２].２一免疫层析技术发展及应用 一一免疫层析技术关键在于依靠标记抗体的免疫标记材料,而纳米材料由于优越的信号放大作用,能达到良好的灵敏度和特异度而备受青睐.下面主要从胶体碳二量子点二稀土纳米材料二上转换发光技术和超顺磁性纳米材料以及适配体等方面进行介绍.２．１一胶体碳一与胶体金相比,胶体碳的优点包括更高的颜色强度,即更高的灵敏度和标记效率,动力学检测范围更广,成本低廉,制作工艺简单,可大规模生产且更环保,但由于其标记和封闭时间长,并未体现出对胶体金的绝对优势,故其商业化程度较低[３Ｇ４].何卓等[３]利用碳纳米颗粒制作的胶体碳试纸条用于检测疟原虫,并可通过扫描检测带灰度值以定量.最近,Y U等[４]利用一种新的胶体碳材料氧化石墨烯作为标记物,成功制作出用于检测黄曲霉素B１的试纸条,肉眼最低检测限可达０．３n g/m L.材料学的进步能促进检测的进步,诸如碳量子点和石墨烯量子点等材料也是免疫层析研究中可以利用的标记材料.２．２一量子点一量子点被认为是免疫层析中最有前途的荧光半导体纳米材料,与一般荧光染料相比,量子点具有尺寸可调的荧光,发射光谱窄而对称,高量子产率,宽吸收光谱,荧光强度高,耐光漂白和稳定性好等优点[５Ｇ６].水溶性量子点表面富含羧基或氨基以用于连接蛋白质.表面是羧基的量子点被１Ｇ(３Ｇ二甲氨基丙基)Ｇ３Ｇ乙基碳二亚胺盐酸盐(E D C)和NＧ羟基琥珀酰亚胺(N H S)激活,并且这些激活的羧基和抗体的氨基相连接.这些特性使得量子点是一个可以达到高灵敏度和同时对多种检测物定量的免疫层析标记物[７].为了检测样本中不同的物质,有两种不同模式的检测方法.第一种模式是不同的T线去检测与之对应的分析物;第二种模式是一条T线去检测不同的分析物.例如,第一种模式,T A R A N O V A等[８]设计了一种 交通信号灯 式的竞争性免疫层析方法,他们 ４９５ 国际检验医学杂志２０１９年３月第４０卷第５期一I n t J L a bM e d,M a r c h２０１９,V o l．４０,N o．５ ?一通信作者,EＧm a i l:１５８０９３２０＠q q．c o m. 一一本文引用格式:黄德智,蒲晓允．免疫层析技术的发展及在P O C T中的应用[J]．国际检验医学杂志,２０１９,４０(５):５９４Ｇ５９７．

时间分辨荧光免疫分析技术及临床应用

时间分辨荧光免疫分析技术及临床应用 武学成1,2(综述),何　林1,周克元2(审校) (1.深圳人民医院检验医学部,广东深圳518001;2.广东医学院,广东湛江524001) 中图分类号:R44616 文献标识码:A 文章编号:100622084(2006)0720434203 摘要:标记免疫分析技术的出现使临床生化分析由常量分析向微量分析转变。20世纪80年代出现的时间分辨荧光免疫分析技术,以其独特的优势成为最有发展前途的非放射免疫标记技术。本文主要介绍时间分辨荧光免疫技术基本原理、基础试剂、基本技术以及近年来临床应用。 关键词:时间分辨荧光免疫分析技术;铕;标记技术 The R esearch and C linical Application of Time2resolved F luoroimmunoassay　WU Xue2cheng1,2,HE Lin1, ZHOU K e2yuan2.(1.The Medical Laboratory Department o f Shenzhen People′s Hospital,Shenzhen518001,China; 2.Guangdong Medical College,Zhanjiang524001,China) Abstract:The marked immunoassay technique gives the changes from macroanalysis to microanalysis.T ime2 res olved fluoroimmunoassay technology is a non2radio2immunity labeling technique having m ost perspective future because of its unique advantage since1980s.This article reviewed s ome aspects about it including fundamental principle,basic reagent,basic technique and the its clinical application in recent years. K ey w ords:T ime2res olved fluoroimmunoassay;Europium;Labeling technique 随着生物标记技术的不断进步,免疫分析技术得到了长 足的发展。免疫分析技术逐步由放射免疫分析技术向非放射 免疫技术转变。在此期间,涌现了一大批非放射免疫技术,例 如酶免分析技术、化学发光免疫分析技术、时间分辨荧光免疫 分析技术(time2res olved fluoreimmuoassay,TRFI A)等。但是从灵 敏度来说只有时间分辨荧光免疫分析技术可与放射免疫媲 美。TRFI A是20世纪80年代迅速发展起来的的一种公认的 最有发展前途的非放射免疫标记技术。 1　时间分辨荧光免疫分析技术的基本原理 TRFI A是用镧系金属离子作为示踪物标记蛋白质、多肽、 激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞,与其螯合剂、增强液 (有一部分不需要)在待反应体系(如:抗原抗体免疫反应、生 物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀 伤反应等)发生反应后,用时间分辨荧光仪测定最后产物中的 荧光强度,根据荧光强度和相对荧光强度比值,推测反应体系 中分析物的浓度,达到定量分析的目的。 2　时间分辨荧光分析技术简介 TRFI A的基础试剂包括示踪剂、稀有元素双功能螯合剂、 分析缓冲液、增强溶液。基本技术包括包被技术、标记技术、 反应模式。 2.1　基础试剂 2.1.1　示踪剂的选择和使用　所使用的稀土元素主要位于 元素周期表中的ⅢB族,包括钪(scandium,SC)、钇(yttrium,Y) 和镧系元素。到目前为止,只有铕(europium,Eu)、铽(terbium, Tb)、钐(samarium,Sm)、钕(neodymium,Nd)、镝(dysprosium,Dy) 等5种被用作TRFI A示踪剂,尤以Eu3+常用。一般用Eu2O3 制备成EuCl 3 ,再经纯化和常温真空抽干,然后干燥保存。用 Eu3+等镧系元素作为示踪剂有以下特点:①荧光物质激发光 谱曲线的最大吸收波长和发射光谱的最大发射波长之间的 差,称为S tokes位移。普通荧光物质荧光光谱的S tokes位移 只有几十纳米,激发光谱和发射光谱通常有部分重叠,互相干 扰严重。游离铕的荧光信号虽然相当微弱,但当Eu3+与螯合剂形成螯合物时,产生分子内和分子间能量传递,使Eu3+的荧光强度显著增强,S tokes位移达200nm,很容易分辨激发光和发射光,从而排除激发光干扰;②镧系元素与普通的荧光团比较,镧系元素离子螯合物荧光的衰变时间(decay time)长,为传统荧光的103～106倍。稀土离子及一些常见荧光物质的荧光寿命(见表1)。镧系元素的荧光不仅强度高,而 且半衰期也很长,介于10～1000μs之间。这样,用时间分辨荧光仪测量Eu3+螯合物的荧光时,在脉冲光源激发之后,可以适当的延迟一段时间,待血清、容器、样品管和其他成分的短半衰期荧光衰变后再测量,这时就只存Eu3+标记物的特异性荧光,即通过时间分辨,极大地降低了本底荧光,实现了高信噪比,这是TRFI A高灵敏度和低干扰的原因之一。如果在使用链霉亲合素2生物素系统,可更好地降低非特异性荧光的干扰[1];③镧系螯合物激发光光谱较宽,最大激发波长在300～500nm,可通过增加激发光能量来提高灵敏度。而它的发射光谱带很窄,甚至不到10nm,可采用只允许发射荧光通过的滤光片,进一步降低本底荧光;④Eu3+等镧系标记物与放射性同位素相比不受半衰期的影响。如125I标记试剂最长可用3个月,酶标记物常因其纯度、显色底物不稳定等问题,使其应用受到限制。Eu3+与双功能螯合剂螯合,可形成稳定的螯合物,稳定性很高,2年内能保证质量。再者,Eu3+标记物体积很小(为原子标记),标记后不会影响被标记物的空间立体结构,这既保证了被检测物质的稳定性(尤其对蛋白质影响更小),又可实现多位点标记[2]。标记物稳定就可以对标记物进行多次激发,通过对每次激发的荧光信号累加后取平均值的办法,可大大减少偶然误差,提高准确度。同时多位点标记技术,不仅使检测更灵敏,也使一个试剂盒能够同时检测出两种或两种以上的项目。 2.1.2　稀有元素双功能螯合剂　稀土元素作为金属离子,很难直接与抗原抗体结合,因此在标记时需要有一种双功能基团的螯合物,它们分子内或带氨基和羧基或带有异硫氰酸基和羧酸基,一端与稀土离子连接,一端与抗原或抗体的自由氨基(组氨酸、酪氨酸)连接。目前常用镧系元素标记的双功能螯合剂有异硫氰酸2苯基2二乙胺四乙酸(IC B2E DT A)、β2萘甲酰三氟丙酮(β2NT A)、二乙基三胺五乙酸环酐(DTPAA)、4,72二氯磺基苯21,102菲罗啉22,9二羧酸(BCPDA)及对2异硫氰酸2苄基2二乙三胺四乙酸(P2IC B2DTT A)等5种。Y uan等[3]合成出一种稳定的能发出强烈荧光的Eu3+络合剂4,4′2二(1,1′,2,2′,