EMSA操作说明

非放射性凝胶迁移试剂盒（EMSA）操作手册本说明书适用于产品号为SIDET001, SIDET003与SIDET004的产品

VER. 3.11

2005年2月

目录

1. 简介 (3)

2. 试剂盒包装清单 (3)

3. 自备实验材料与仪器 (4)

4. DNA/蛋白质结合反应 (4)

5. 聚丙稀酰胺凝胶电泳 (5)

6. 电转移 (6)

7. DNA的交联固定 (6)

8. 化学发光反应 (6)

9. 化学发光图像显示 (7)

10．常见问题 (8)

11. 参考文献 (8)

12．注意事项 (9)

2005? Viagene，All rights reserved.

1．简介

EMSA ( Electrophoretic Mobility Shift Assay ) 凝胶迁移实验是一种研究DNA与蛋白质或RNA与蛋白质相互作用的常用技术。这项技术是基于DNA/蛋白质或RNA/蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理。当核转录因子与一条人工合成的特异的DNA或RNA结合后，其在PAGE中的迁移率将小于未结合核蛋白转录因子的DNA，从而检测到活化的与DNA或RNA结合的蛋白转录或调节因子。

本非放射性EMSA成套试剂盒是结合高灵敏度的化学致发光技术建立起来的实验系统。与市场上的EMSA产品比较，Viagene公司的EMSA试剂盒操作更简单迅速，并可得到更好的实验效果；与同位素放射法相比Viagene公司的非放射性EMSA试剂盒解决了探针不稳定、同位素辐射等问题，并具有高灵敏度、快速获得结果、避免材料浪费等优点。目前Viagene公司提供三套非放射性EMSA试剂盒用来检测活化的NF-KB(核转录因子-KB，Cat#; SIDET001)、STAT3(信号转导和转录激活因子3，Cat#; SIDET003)和STAT5(信号转导和转录激活因子5，Cat#; SIDET004)。每种试剂盒均经过多次实验测试，并已优化了DNA-蛋白转录因子的结合条件。

EMSA成套试剂配备足够的材料进行36次活化蛋白转录因子与特定DNA结合的测定；若每片凝胶做9个样品加上一个蛋白标准或指示，可以做四张膜。若每片凝胶做12个样品加上一个蛋白标准或指示，则可以做三张膜。实际应用中，因各个实验室使用的显示仪器与手段不同、感光胶片灵敏度以及胶片冲洗方法不一样，仅做一次曝光可能无法获得

满意结果。当得到的图像太深或太浅时，则需要

调整底物用量与曝光时间。由于用户很可能需要

对同一张膜试用几次底物液，因而很难为EMSA

试剂盒配备标准量的发光底物液。所以本试剂盒

提供的Lighten? HRP-B底物发光系统（产品号；

CHEM004）,可以做四片结合膜的EMSA实验，

不够用时用户因此需要按所需用量另外购买与

EMSA试剂盒配套的化学发光底物（产品号；

CHEM001，CHEM002,CHEM003）。

EMSA成套试剂盒主要用于科学研究，不推荐用于

疾病诊断。

2．试剂盒清单

（1）EMSA试剂盒基本组分：

●10X Binding Buffer（10X 结合反应液）(-20 o C) 1 Vial（支）

●Poly (dI:dC) (dI:dC)（聚核苷酸竞争物）(-20 o C) 1 Vial（支）

●10X Loading Buffer（10X 上样缓冲液）(4 o C) 1 Vial（支）

●Cold oligonucleotides（非标记竞争性寡核苷酸）(-20 o C) 1 Vial（支）

●Biotin-Labeled Probe（生物素标记探针）(-20 o C) 1 Vial（支）

●Streptavidin-HRP（链霉亲核素-HRP）(4o C) 1 Vial（支）

●2×Blocking Buffer（2× 封闭液）(4 o C) 1 Bottle（瓶）

●5×Washing Buffer（5× 洗涤液）(4 o C) 1 Bottle（瓶）

●Equilibration Solution（平衡液）(4 o C) 1 Bottle（瓶）

●Binding-membrane（结合反应膜）(RT) 4 pieces（片）

●User Manual（说明操作手册） 1 set（册）

（2）EMSA化学发光底物系统：

●Lighten? HRP-B Substrate Solution A（底物液A）(4 o C ) *1 Vial（支）

●Lighten? HRP-B Substrate Solution B（底物液A）(4 o C ) *1 Vial（支）

*本试剂盒提供的发光底物系统足够检测试剂盒配套的4片膜的EMSA操作。

（3）EMSA-Plus试剂盒对照组分（需另购）：

●阳性核抽提物对照 (-20 o C ) *1 Vial（支）

●阴性核抽提物对照 (-20 o C ) *1 Vial（支）

*目前，我们为NF-KB、STAT3和STAT5三套试剂盒各自提供3个阳性和3个阴性对照。如果使用者已经有或者可以自己制作阳性或阴性对照，则不必另购对照样品。对照样品因保质期有限，并且需要通过干冰运输供货，价格昂贵。

3. 自备实验材料与仪器：

●聚丙烯酰胺凝胶电泳装置及相关化学试剂。

●细胞培养装置与细胞核蛋白制备试剂。

●电转移装置及相关化学试剂，较厚的用于蛋白转迹用滤纸。

●紫外线交联仪或80o C干燥箱。

● CoolImager 或感光胶片与感光胶片冲印装置。

4. 结合反应

对每个核抽提物样品，按以下步骤于0.5ml离心管中操作。

（1）结合反应体系：

10X 结合反应液 1.0μl

Poly(dI:dC)(dI:dC) 1.0μl

细胞核提取物* ? μl

双蒸水* ? μl

混匀室温静置20 分钟

生物素标记的探针0.5μl

总量10μl

混匀室温静置20分钟或以上。

（2）特异性反应确认竞争反应体系：

10X 结合反应液 1.0μl

Poly(dI:dC)(dI:dC) 1.0μl

细胞核提取物? μl

未标记的竞争性寡核0.5μl

双蒸水* ? μl

混匀室温静置20 分钟

生物素标记的探针0.5μl

总量10μl

混匀室温静置20分钟或以上。

*每次结合反应需1-3μl核蛋白(根据核蛋白浓度而定)，根据不同的核提取物浓度加入核提取物用量，用双蒸蒸馏水将终体积调节到10μl。

5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳

（1）制备6.5%聚丙烯酰胺凝胶（以下用量可以制备2片70x80x1.5mm凝胶板）：

在试管中混合以下组分：

10X TBE 1.0ml

40% Acrylamide（40%聚丙烯酰胺） 3.3ml

50% Glycerol（50%甘油） 1.0ml

dH2O（蒸馏水）14.8ml

TEMED（四甲基乙二氨）20μl

脱气10min

10% AP（过硫酸氨）100μl

总量 20.0ml

注:以上组分为制作两片70×80×1.5mm聚丙烯酰胺凝胶的用量，仅供参考。

（2）制备预冷的0.25XTBE，4oC保存:

10X TBE 30ml

双蒸馏水 1170ml

总量1200ml

（3）预电泳：用预冷的0.25X TBE在冰上120V 预电泳1小时。并在上样前用电泳缓冲液冲洗加样孔3－5次/孔。

（4）制备上样混合液：

结合反应体系10.0μl

10X 上样液 2.0μl

总量12.0μl

充分混匀后，14000rpm 离心1 分钟，加样（尽量在短时间内完成加样并电泳）。

（5）电泳：将全部样品(12ul)加于样品孔中，低温下180V，电泳70分钟。

6. 电转移

（1）配制电转移缓冲液：配制电转移缓冲液0.5X TBE 1200ml。

10X TBE 60ml

双蒸馏水 1140ml

总量1200ml

电转移可在室温下进行。

（2）浸膜：将结合膜，同凝胶大小的厚滤纸和电转移泡沫垫在0.5X TBE浸泡10分钟（注意标记结合膜的方向）。

（3）装配电转移夹：电泳后，慢慢从电泳装置的凝胶上移走一片玻璃片。将凝胶与另一片玻璃一起移入装有0.5X TBE的盒中。在0.5X TBE中让凝胶板与玻璃板分离，使凝胶板漂浮在0.5X TBE 中。取一片预浸湿的滤纸在0.5X TBE中移动到凝胶板下面。小心将滤纸与其上的凝胶板一起从0.5X TBE中移出，置于电转移泡沫垫上并按图示的顺序装配电转移夹。注意凝胶板与结合膜以及与滤纸之间不能有气泡。

（4）电转移：将装配好的电转移夹放入电转移槽中，在0.5X TBE中，390mA电转移40分钟。注意电转移的电极方向不能搞错了。

7. 交联固定DNA

电转移完后，移走滤纸。将结合膜取出。结合面朝上、置紫外灯下约10cm处交联5分钟，或置干燥烘箱中80°C，烘烤2小时。

8. 化学发光反应

(1）准备检测试剂：从4°C取出2×封闭液与5×洗涤液，置于37o C温浴使白色溶解沉。

(2）封闭结合膜：

制备1X 封闭液：

2× 封闭液7.5ml

双蒸馏水 7.5ml

总量15ml

将结合膜浸于15ml 1X 封闭液中，室温孵育30分钟。

（3）Streptavidin-HRP 结合反应：

制备Streptavidin-HRP（1:750）反应液：

2× 封闭液7.5ml

双蒸馏水7.5ml

Streptavidin-HRP 20μl

总量15ml

弃封闭液，将结合膜与新配制的15ml Streptavidin-HRP 反应液在室温孵育20分钟。

（4）膜洗涤：

制备1X 洗涤液：

5× 洗涤液 12ml

双蒸馏水 48ml

总量 (15ml x 4) 60ml

弃反应液，用1X 洗涤液室温洗膜4次，每次15ml，每次5分钟。

（5）膜平衡：结合膜经4次洗涤后与15ml平衡液在室温平衡5分钟。

（6）底物液的化学发光反应：

1）制备底物液

对每一张膜按以下用量临用前混合制备：

Lighten? HRP-B底物液A* 0.2ml

Lighten? HRP-B底物液B* 0.2ml

双蒸馏水 1.0ml

总量 1.4ml

2）将结合膜从平衡液中移出，放于不吸水的平面上，结合面为上面。将底物液均匀覆盖于膜的表面，依所用的图像显示方法按以下操作。

注：Lighten? HRP-B底物化学发光系统覆盖于膜表面后请立即获取不同时间的图象，以免时间太长后化学发光信号减弱，影响成像。本底物在膜表面保持湿润环境下可持续发光约30分钟，一般15分钟后光信号开始减弱，请注意成像时间安排！

9 化学发光图像显示

（1）化学发光数字成像与检测：检测化学发光的数字成像系统需要有极高的灵敏度，能够在短时间

内（5-10分钟）累加处理上万图像。 CoolImager 非常适合用于非同位素EMSA的发光成像与检测。使用化学发光系统时，将底物液加于结合膜表面后不需要去除底物液即可放入仪器中进行成像分析。一般经3-5分钟处理后即可以在显示器上清楚显示图像。使用化学发光数字成像系统不需要暗室与冲印机器设备，亦不需要冲洗液、固定液和感光胶片等耗材。图像的深浅可以调节，并可以对图像进行定量分析。详细操作步骤请参考仪器的说明书。

（2）感光胶片冲印成像：使用感光胶片冲印成像的方法需要准备有暗室，冲印机器设备，以及冲洗液、固定液与感光胶片等耗材。使用感光胶片冲印技术时，需要将底物液覆盖于膜的表面反应1-4

分钟。然后吸掉底物液并用纸巾从膜表面吸走多余的底物液。然后用一张透明纸盖在结合膜表面，其上再盖感光胶片。胶片的曝光时间无法准确决定，每次实验只能多作几张不同曝光度的胶片以获得较佳的图像，但对图像进行定量分析比较困难。

10. 常见问题

11. 参考文献

（1）Crothers, D.M. (1998) Nature 325:464-5.

（2）Garner, M.M. &Revzin, A. (1986) T rends in Biochemical Sciences 11:395-6.

（3）Hendrcikson, W. (1985) Bi Techniques 3:198 –207.

（4）Dignam, J.D., Lebovitz, R.M., and Roeder, R.G. (1983) Nucleic Acids Research 11:1475 –1489.

（5）Bannister, A. and Kouzarides, T. (1992). Basic peptides enhance protein-DNA interaction in vitro. Nucl. Acids Res. 20:3523.

（6）Kironmai, K.M., et al. (1998). DNA-binding activities of Hop1 protein, a synaptonemal complex component from Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell Biol. 18:1424-35.

（7）Liu R.Y., Fan C., Garcia R., Jove R., Zuckerman K.S. (1999)..Constitutive activation of the JAK2/STAT5 signal transduction pathway correlates with growth factor

independence of megakaryocytic leukemic cell lines. Blood. 93:2369-79.

（8）Liu R.Y., Fan C., Olashaw N.E., Wang X., Zuckerman K.S. (1999). Tumor necrosis factor-alpha-induced proliferation of human Mo7e leukemic cells occurs via

activation of nuclear factor kppaB transcription factor. J Biol Chem. 274:13877-85.

荧光探针设计原理

荧光化学传感器是建立在光谱化学和化学波导与量测技术基础上的将分析对象的化学信息以荧光信号表达的传感装置。其主要组成部件有三个(图 1.1)：1．识别结合基团(R),能选择性地与被分析物结合,并使传感器所处的化学环境发生改变。这种结合可以通过配位键，氢键等作用实现。２．信号报告基团(发色团, F），把识别基团与被分析物结合引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号。信号报告基团起到了信息传输的作用，它把分子水平上发生的化学信息转换成能够为人感知(颜色变化)或仪器检测的信号（荧光等)。3.连接基团(S),将信号报告基团和识别结合基团连接起来,根据设计的不同连接基团可有多种选择，一般用做连接基团的是亚甲基等短链烷基。连接基团的合适与否将直接影响是否有输出信号的产生。信号表达可以是荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等。 图1．1 荧光探针的结构 1.1.1 荧光探针的一般设计原理 (1) 结合型荧光探针[２1］ +

Analyte Signalling subunit Space Binding subunit Output signal 图1．２ 共价连接型荧光探针 结合型荧光探针是利用化学共价键将识别基团和荧光基团连接起来的一类荧光探针,是比较常见的一类荧光探针。该类探针通过对比加入分析物前后荧光强度的变化、光谱位置的移动或荧光寿命的改变等实现对分析物的检测。在该类荧光化学传感器的设计中,必须充分考虑下列三个方面的因素。(ａ） 受体分子的荧光基团设计、合成:考虑到用于复杂环境体系的荧光检测，要求荧光基团要有强的荧光（高荧光量子产率，有利于提高检测的灵敏性）,Ｓｔｏｋｅs 位移要大（可有效消除常规荧光化合物如荧光素等具有的自猝灭现象)，荧光发射最好要在长波长区(最好位于5０0 nm 以上，可避免复杂体系的常位于短波长区的背景荧光的干扰,另外由于长波长区发射的荧光能量的降低可减少荧光漂白现象的发生而延长传感器的使用寿命）。(b) 受体分子的识别基团：受体分子的识别基团设计以软硬酸碱理论、配位作用以及超分子作用力(如氢键、范德华力等）作为理论指导,多选择含氮、硫、磷杂环化合物作为识别分子。(ｃ) 荧光超分子受体的组装:组装荧光超分子受体就是利用一个连接基将识别基团和荧光基团通过共价键连接在一起,要充分考虑到识别基团和荧光

四探针操作手册

南开大学 硅光电子学与储能实验室 Four-Point Probe Operation | 2011 四探针操作手册

四探针操作说明书 Four-Point Probe Operation 第1章引言 (1) 1. 目的 (1) 2. 应用范围 (1) 3. 测试设备 (1) 四探针 (1) 数字电压源表 (2) 第2章原理简述 (3) 1. 薄膜(厚度≤4mm)电阻率： (3) 2. 薄膜方块电阻 (3) 第3章操作方法 (5) 1. 引言 (5) 2. 测试线连接方式 (5) 3. KEITHLEY 2400高压源表设置指南 (6) 4. 探针接触方式 (8) 5. 数据测试指南 (8) 第4章注意事项 (10) 附表 ................................................................................................................................................... I

第1章引言 1.目的 本说明书主要介绍用四探针法测试薄膜方块电阻及电阻率的原理及具体操作方法。 2.应用范围 测量参数：方块电阻，电阻率 测量样品：均匀薄膜，均匀薄片 方块电阻测试范围：0.01?～500M? 电阻率测试范围：10-5??cm～103??cm 样品大小：直径>1cm 精度：<±5% 3.测试设备 四探针 生产厂商： 广州四探针有限公司RTS-2型 基本指标： 间距：1±0.01mm； 针间绝缘电阻: ≥1000MΩ； 机械游移率: ≤0.3％； 探针：碳化钨或高速钢材质，探针直径Ф0.5mm； 探针压力：5～16 牛顿(总力)； 使用环境： 温度:：23±2℃； 相对湿度：≤65％； 无高频干扰； 无强光直射； 基本参数： Fsp=0.1 探针间距：1.0mm

七个基本原理和方法论

七个基本原理和方法论 ?1、矛盾对立统一原理 ?2、矛盾的普遍性原理 ?3、矛盾的特殊性原理 ?4、矛盾的普遍性与特殊性辩证关系原理 ?5、主要矛盾与次要矛盾关系原理 ?6、矛盾的主要方面与次要方面关系原理 ?7、两点论与重点论相统一的原理 一、矛盾对立统一原理 ?原理：矛盾就是对立统一 ?方法论：要求我们必须用一分为二的观点、全面的观点看问题 ?“既……又……、虽然……但是、双赢、双刃剑、成就……困难……、机遇…挑战、相反相成”此类语言哲理是：矛盾是对立统一，要一分为二看问题，坚持两分法、两点论。 ?该原理经常应用于: ?用对立统一原理分析A和B的关系------(通常是一对反义词) ?答题模式： ?（1）矛盾就是对立统一，A与B是对立统一关系 ?（2）一方面，A与B存在一定的对立性，------ ?另一方面，A与B也具有统一性----- ?（3）---既要---又要---（或把---有机结合或兼顾-----） ? ?某些地方政府管理理念错位，为提升城市形象，忽视民生问题，要建“无摊贩城市”。 目前，上海的无证摊贩约5万个，上海市政府经调查研究，一改往日对马路摊点一律封杀的做法，出台《城市设摊导则》，规定：部分市区路段经市民同意，便可设置部分便民摊点，政府颁发临时许可证，这既可扩大就业，方便居民生活，又可规范城市摊点管理。 ?运用矛盾对立统一的观点分析塑造城市形象与解决民生问题的关系。（10分）?①矛盾就是对立统一，要求我们用全面的观点看问题。摊点问题既涉及城市形象又涉及民生问题，二者是对立统一的关系。 ?②一方面，塑造城市形象与解决民生问题存在一定的对立，有时塑造城市形象与民生问题会有冲突；另一方面，塑造城市形象与解决民生问题具有统一性。塑造城市形象必须以人为本，关注民生；民生问题的解决也要有利于维护和塑造城市形象。 ?③在二者关系问题上，应坚持两分法，防止片面性，应将塑造城市形象与解决民生问题有机结合起来。 ? ?2010年3月14日上午，国务院总理温家宝在回答台湾记者关于两岸关系的提问时指出，两岸同胞是兄弟，“虽有小忿，不废懿亲”，这句话是强调，尽管兄弟之间存在分歧，但仍应以血缘关系为重，同心共御外侮。这体现( B ) ?A、联系是普遍的、无条件的 ?B、矛盾是既对立又统一的关系 ?C、事物发展是前进行与曲折性的统一 ?D、集中主要力量，解决主要矛盾 ?解析：“虽有小忿，不废懿亲”，“兄弟之间存在分歧”，说明事物双方存在斗争性，“但应以血缘关系为重，同心共御外侮”，说明事物双方相互联结的趋势，共同体现了矛盾是既对立又统一的关系，所以B项符合题意。A项本身错误，联系时有条件的；C、D材料没有体现。 ?

甲基化引物探针设计方法

本文叙述了一种用于甲基化分析的探针法定量PCR的引物和探针设计方法，目前用于甲基化检测的引物探针设计工具非常多，都有使用成功的案例，经过初步多方尝试，本文中叙述的为本人认为较为靠谱的方法。Oligo7的优势在于专业，参数详尽且可自由设置，模块化设计，学会后使用便利。专业的活就是要专业的用专业的工具干。

首先是进行序列转换，有较多的在线工具和联机软件都可实现，这里使用https://www.wendangku.net/doc/6013704114.html,/methprimer/，较为简单直观。

直接将目标序列放入如上图的编辑框中，此也可直接用于相关引物的设计，不过本人没使用过，因为不能设计探针。submit后就有转化后的序列信息，如下图： 以上详细标记了CpG位置和非CpG位置的C，可直接复制到Word标注使用，下面就可以使用Oligo7利用上边的序列设计引物和探针了，如果是设计非甲基化引物探针，则使用原始序列。

关于引物和探针的一些主要参数，主要参考invtrogen的建议： Primer设计的基本原则： a)引物长度一般在18-35mer。 b)G-C含量控制在40-60%左右。 c)避免近3’端有酶切位点或发夹结构。 d)如果可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C。 e)如果可能避免在3’端最后1个碱基为A。 f)避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。 g)退火温度Tm控制在58-60C左右。 h)如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。 T aqMan 探针设计的基本原则： a)T aqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。 b)长度一般为18-40mer 。 c)G-C含量控制在40-80%左右。 d)避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。 e)在引物的5’端避免使用G。 f)选用比较多的碱基C。 g)退火温度Tm控制在68-70℃左右。 另：目标变异碱基最好在3’末端或3’末端-1位置，保证扩增特异性，对于甲基化，则最好是C。

原理及方法论

一、物质与意识的辩证关系原理及方法论 1、物质决定意识，意识是对物质的反映。要求坚持一切从实际出发，实事求是。 2、意识对物质具有能动性，意识对改造客观世界具有指导作用。人们在意识的指导下能动地改造客观世界，即通过实践把观念的东西变成现实的东西，创造出没有人的参与永远也不可能出现的东西。正确（错误）的意识促进（阻碍）事物的发展。意识对于人体生理活动具有调节和控制作用。要求重视意识的作用，重视精神的力量，树立正确的思想意识，克服错误的思想意识。 二、尊重客观规律与发挥主观能动性的辩证关系原理及方法论 1、规律是客观的。要求我们尊重规律，按客观规律办事。 2、发挥主观能动性是认识和利用客观规律的必要条件。要求我们充分发挥主观能动性，认识和利用规律。 3、要把发挥主观能动性和尊重客观规律结合起来。 三、实践与认识的辩证关系原理及方法论 1、实践是认识的基础，实践是认识的来源，实践是认识发展的目的，实践是检验认识的真理性的唯一标准。实践是认识的目的。要求树立实践第一的观点，自觉参与实践活动。 2、认识对实践具有反作用。正确的认识，科学的理论对实践有巨大的指导作用；错误的认识，不科学的理论则会把实践引向歧途。要求重视认识的反作用，重视科学理论对实践的指导作用。 四、真理是有条件的具体的的辩证关系原理及方法论 1、真理都是有条件的。任何真理都有自己适用的条件和范围。 2、整理是具体的。任何真理都是相对于特定的过程来说的，都是主观与客观、理论与实践的历史的具体的统一。 3、要求坚持真理的条件性，坚持主观与客观、理论与实践的历史的具体的统一。 五、认识具有反复性无限性的辩证关系原理及方法论 1、认识具有反复性，人类追求真理的过程并不是一帆风顺的。 2、认识具有无限性，追求真理是一个永无止境的过程。 3、认识具有上升性，从实践到认识、从认识到实践的循环是一种波浪式前进或螺旋式上升的程。 4、与时俱进，开拓发展，在实践中认识和发现真理，在实践中检验和发展真理，是我们不懈的追求和永恒的使命。

项目管理的基本原理和方法

项目管理的基本原理和方法 项目管理是一种科学的管理方式, 项目管理贯穿于项目实施的全过程, 项目管理的关键内容是进度、费用和质量的相互协调、相互制约、相互适应, 同时项目管理的组织与领导又是项目成败的关键。目前越来越多的企业逐步认识到项目管理的重要性, 相信在公路工程的各个领域都将会采用项目管理, 这样产生的高效率和高效益是可观的。 1 项目管理的基本概念 目前国际上对于项目管理还没有一个统一的定义。主要因为: 项目管理是一整套科学的管理体系和方法, 很难用几句话对其进行全面而精确的概括, 为此只能从不同的角度对其进行描述 描述1: 项目管理是在项目运作过程中, 综合应用各种知识、技能、手段和技术以完成项目预期的目标和满足项目有关方面的需求。 描述2: 项目管理是以项目为对象的一种科学的管理方式, 它以系统论的思想为指导, 以现代先进的管理理论和方法为基础, 通过项目管理特色的组织形式, 实现项目全过程的综合动态管理, 以有效地完成项目目标。 另外项目管理还有其它含义: 项目管理既是一种科学的管理活动, 也是一门新兴的管理学科。 2 项目管理的工作内容 项目管理认为, 各种项目的生命周期均可分为C、D、E、F 四个阶段。各个阶段具有各自的工作方法和工作内容。 (1)C 阶段。即概念阶段, 该阶段的主要内容有: ①调查研究、收集数据; ②明确需求、策划项目; ③确立目标; ④进行可行性研究; ⑤明确合作关系; ⑥确定风险等级; ⑦拟订战略方案; ⑧进行资源测算; ⑨提出组建项目组方案; bk提出项目建议书; bl获准进入下一阶段。 (2)D 阶段。即开发阶段, 该阶段的主要内容有: ①确定项目组主要成员; ②项目最终产品的范围界定; ③项目实施方案研究;

探针的设计原则

实时荧光Taqman 探针设计的几个要点 实验室很多同学都要做Real time PCR实验，实验室的师兄师姐都会有很多宝贵意见，不过也有实验室前没有做过的，查找了下资料和大家分享下关于实时荧光Taqman探针设计、实时荧光PCR探针的选择、 引物的设计及评价。 荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。目前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信 标Molecular Beacon。 广泛使用的TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是说5’荧光基团的发射波长正好是3’ 荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光)。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会将切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。报告信号 的强度就代表了模板DNA的拷贝数。 (请注意，该图显示的不是普通的Taqman探针法，而是Taqman MGB探针法)Taqman探针检测的是积累荧光。常用的荧光基团有FAM，TET，VIC，HEX等等。当探针完整的时候，由于3′端的荧光淬灭基团在吸收5′端报告基团所发射的荧光能量，本身会发射波长不同的荧光而导致本底高，因此TaqMan探针近来又有新的发展——TaqMan MGB探针。MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10°C左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高——因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。实验证明，TaqMan MGB探针对于富含A/T 的模板可以区分得更为理想。 Taqman探针法已经得到广泛使用，不过有人认为这种技术利用了Taq酶5`—3`外切酶活性，一般试剂厂家只给Taq酶的聚合酶活性定标，没有同时给Taq酶5`—3`外切酶活性定标，不同批号试剂之间会给定量带来差异。另外对探针的熔点温度(Tm)仅要求其高于60°C，这就使不同试剂盒之间的特异性参差不齐，难 于做质控检测。 Real time PCR Taqman探针设计、实时多重PCR探针的选择和引物的设计及评价 一、实时荧光Taqman探针设计 总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。即real-time PCR的扩增片段是50bp----150bp。当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的 片段是保守的。

原理和方法论

《生活与哲学》原理与方法论归纳整理 〖辩证唯物主义（唯物论、认识论、辩证法、）〗 第一部分：唯物论（物质、意识、运动、规律） 一．物质和意识辩证关系原理、方法论【重点掌握】 〖原理内容〗：，物质决定意识，意识是物质的反映；〖方法论〗：我们要坚持一切从实际出发，实事求是，使主观符合客观；意识对物质具有能动作用。〖方法论〗我们要重视意识的作用，重视精神的力量，自觉地树立正确的思想意识，克服错误的思想意识。正确意识对事物发展促进作用,错误意识对事物发展起着阻碍作用。 【应用举例】“根据…实际情况….制定….方案”；“针对…当前形势…作出…决策”；“主观符合客观”；企业生产要根据市场的实际需要进行（以市场为导向）。 二、意识能动作用原理【重点掌握】 〖原理内容〗：（1）人能够能动地认识世界。（因为意识活动具有目的性、计划性，主动创造性和自己选择性）（2）人能够能动地改造世界。（①意识对改造客观世界具有指导作用。正确意识促进事物发展,错误意识对事物发展起着阻碍作用。②意识对于人体生理活动具有调节和控制作用。） 〖方法论〗：要求我们要意识的作用，重视精神的力量，自觉地树立正确的思想意识克服错误的思想意识。 三．物质和运动辩证关系原理 〖原理内容〗：物质和运动是不可分割的。①物质是运动的物质，运动是物质的根本属性和存在方式，②运动是物质的运动，物质是运动的承担者。③总之，世界上一切事物都是运动、变化的。 〖方法论〗：我们要用运动、变化、发展的眼光看问题,反对割裂物质和运动二者联系的两种错误观点. 【错误倾向】离开物质谈运动或离开运动谈物质都是错误的。既要反对离开物质谈运动的唯心主义观点，又要反对离开运动谈物质的形而上学观点。 四．运动和静止辩证关系原理 〖原理内容〗：①世界上的一切事物都处于运动变化中，没有不运动的物质，因而运动是无条件的、绝对的、永恒的；②静止是有条件的、相对的和暂时的，静止是运动的一种特殊状态；动中有静、静中有动。③物质世界是绝对运动和相对静止的统一。 〖方法论〗：既肯定绝对运动，也承认相对静止的存在。要求我们用运动、变化、发展的观点看问题,还要看到事物相对静止的存在,反对割裂运动和静止的辩证关系. 【错误倾向】只承认静止而否认运动是形而上学的不变论，只承认绝对运动而否认相对静止则导致相对主义和诡辩论 五．规律的客观性和普遍性原理【重点掌握】 〖原理内容〗：所谓规律，就是事物运动过程中固有的本质的、必然的、稳定的联系。规律是客观的，是不以人的意志为转移的，它既不能被改变、创造，也不能被消灭。规律是普遍的，自然界、人类社会和人的思维，在其运动变化和发展的过程中，都遵循其固有的规律，一切事物的运动变化都是有规律的。 〖方法论〗：①我们必须遵循规律，按客观规律办事，而不能违背规律。②在客观规律面前，人并不是无能为力的，人可以发挥主观能动性认识和利用规律，改造客观世界，造福于人类。（想问题、办事情，既要尊重客观规律，按规律办事，又要充分发挥主观能动性，

原理和方法论

《生活与哲学》基本原理、方法论 一、唯物论（辩证唯物论）5个 1、物质决定意识原理 【原理内容】物质决定意识，意识是对物质的反映。 【方法论】要求我们想问题、办事情要一切从实际出发，实事求是(主观符合客观，做到主观与客观具体的历史的统一)。 2、意识反作用原理 【原理内容】意识反作用于物质，人能够能动地认识世界,人能够能动地改造世界,正确的意识对事物的发展起促进作用，错误的意识对事物发展起阻碍作用。 【方法论】重视意识的作用，重视精神的力量，自觉树立正确的意识，克服错误的意识。 3、物质和意识辩证关系原理 【原理内容】物质决定意识，意识是对物质的反映。意识反作用于物质，人能够能动地认识世界,人能够能动地改造世界,正确的意识对事物的发展起促进作用，错误的意识对事物发展起阻碍作用。 【方法论】要求我们想问题、办事情要一切从实际出发，实事求是(主观符合客观，做到主观与客观具体的历史的统一)。重视意识的作用，重视精神的力量，自觉树立正确的意识，克服错误的意识。 4、规律的客观性原理 【原理内容】规律是事物运动过程中固有的、本质的、必然的、稳定的联系。规律是客观的，不以人的意志为转移,人不能创造、消灭和违背规律。 【方法论】规律的客观性要求我们，必须遵循规律，按客观规律办事。 5、规律客观性和人的主观能动性辩证关系原理 【原理内容】规律是客观的，但人可以发挥主观能动性，认识和利用规律，改造客观世界，造福于人类。（认识和利用规律必须发挥主观能动性，发挥主观能动性必须以尊重客观规律为基础。） 【方法论】我们在想问题、办事情的时候，要把尊重客观规律和发挥主观能动性有机地结合起来，做到解放思想实事求是，与时俱进，求真务实。 二、认识论（辩证唯物主义认识论） 1、实践和认识的辩证关系原理 【原理内容】1实践决定认识：实践是认识的基础；实践是认识的来源；实践是认识发展的动力；实践是检验认识的真理性的唯一标准；实践是认识的目的和归宿。2认识对实践具有反作用：正确的认识（真理）对实践起指导作用，科学理论对实践有巨大的促进作用，谬误对实践起阻碍作用。 【方法论】把认识和实践相结合，做到理论和实践的具体的历史的统一。树立实践第一的观点，重视认识的作用。 2、真理的条件性和具体性原理 【原理内容】真理是人们对客观事物及其规律的正确反映。真理是具体的，任何真理都有自己适用的条件和范围；真理是有条件的，何真理都是相对于特定的过程来说的，都是主观与客观、理论与实践的具体的历史的统一。 【方法论】真理的条件性和具体性表明，真理和谬误往往是相伴而行的。 3、认识是发展的原理（认识过程的反复性和无限性原理） 【原理内容】认识具有反复性、无限性，人类的认识是无限发展的，要经过从实践到认识，再从认识到实践的多次反复才能完成；循环是一种波浪式前进和螺旋式上升，真理是永远不会停止前进的步伐，它在发展中不断超越自身。 【方法论】要求我们与时俱进，开拓创新在实践中认识和发现真理，在实践中检验和发展真理。 三、辩证法（唯物辩证法） （一）联系观点 3个 1、联系普遍性原理 【原理内容】事物是普遍联系的，联系具有普遍性、客观性和多样性 【方法论】要求我们用联系的观点看问题。要从事物固有的联系中把握事物，切忌主观随意性，注意分析、把握事物存在和发展的各种条件，一切以时间、地点、条件为转移。2、整体和部分相互关系原理 1)强调整体： 【原理内容】整体居于主导地位，整体统率着部分，具有部分不具有的功能。部分是整体中的部分，部分离不开整体，整体的功能状态及其变化会影响部分。 【方法论】树立全局观念，立足整体，统筹全局，选择最佳方案，实现整体的最优目标，从而达到整体功能大于部分功能之和的理想效果。 2）强调部分： 【原理内容】部分构成整体，整体离不开部分，部分的功能及其变化会影响整体的功能，关键部分的功能及其变化甚至对整体的功能起决定作用。 【方法论】重视部分的作用，搞好局部，用局部的发展推动整体的发展。 3）既强调整体又强调部分： 【原理内容】整体和部分相互联系，密不可分，辨证统一的。 【方法论】树立全局观念，立足整体，重视部分的作用，搞好局部。 3、系统优化的方法原理及方法论 【原理内容】系统是由相互联系和相互作用的诸要素构成的统一整体。系统的基本特征是整体性、有序性和内部结构的优化趋向。 【方法论】系统优化的方法要求我们用综合的思维方式来认识事物。既要着眼于事物的整体，从整体出发认识事物和系统，又要把事物和系统的各个部分、各个要素联系起来进行考察，统筹考察。优化组合，最终形成关于这一事物的完整、准确认识。 （二）发展观点 1、发展原理（发展的普遍性原理） 【原理内容】事物是变化发展的，发展具有普遍性，发展的实质是事物的前进、上升，是新事物的产生和旧事物的灭亡。 【方法论】我们必须坚持用发展的观点看问题。（与时俱进，培养创新精神，促进新事物的成长。） 2、事物发展是前进性和曲折性的统一原理（发展的道路、趋势）

(完整版)教案：教学基本原理与方法

课题：教学基本原理与方法 一、教学目标：通过本次课使学员学习和掌握教学的最基本的原理和方法，特别是教学的一些基本程序与要求，并能够结合自己的实际情况，吸取经验，树立信心，投身于自己的教学实践中去，提升教学能力，完成教学任务。 二、教学重点：教学的基本程序与要求 三、教学难点：教学的基本理论，特别是牵涉到哲学、心理学、逻辑学的部分 四、教学方法与手段：讲授法、讨论法、案例教学法相结合，教学录像与ppt相结合。 五、教学课时：3学时 六、教学步骤：先讲授教学的基本原理与方法部分，然后就教学的实际操作和技能技巧介绍一些经验之谈并与学员共同进行探讨。 讲稿提要 一、教学基本原理和方法 （一）教学的概念和任务 1、教学的定义。教学是教师的教和学生的学所组成的一种人类特有的人才培养活动。通过这种活动，教师有目的、有计划、有组织地引导学生学习和掌握文化科学知识和技能，促进学生素质提高，以适应社会、组织或个人的需要。 2、教学的任务。掌握知识与技能；学会学习与形成能力；确立情感态度价值观等。 （二）教学基本要素 教师、学生、教学内容、教学形式和手段等。 （三）教学能力结构 1、基本素养； 2、学科知识背景； 3、对所教知识结构的认知； 4、对学生认知发展的认知； 5、学科教学能力。 （四）遵循教学规律 1、间接经验与直接经验相结合。学生学习间接经验为主；学生学习间接经验要以直接经验为基础。 2、掌握知识与发展智力相统一。掌握知识是发展智力（观察力、记忆力、思维力和想象力）的基础；智力发展是掌握知识的重要条件；掌握知识与智力相互转化的内在机制（传授科学的规律性知识；科学组织教学过程；重视操作与活动） 3、教师的主导作用与学生的主体能动性结合。两种师生观：教师中心论与学生中心论。教师在教学过程中处于组织者的地位，充分发挥教师主导作用；学生在教学过程中作为学习主体的地位，充分发挥学生参与教学的主体能动性；建立合作、友爱、民主、平等的师生关系。 4、教学过程中知、情、意的统一。处理好知识学习与思想、情感、意志和个性培养的关系问题。 （五）贯彻教学原则 1、直观性原则是指在教学中要通过学员观察所学事物，形成所学事物的清晰表象，丰富感性认识，从而能够正确理解书本知识和发展认识能力。直观分为三类：一是实物直观；二是模象直观；三是言语直观。 2、启发性原则是指教师要重视学生是学习的主体，注意调动他们的学习积极性，引导他们独立思考，积极探索，生动活泼地学习，自觉掌握科学知识和提高分析问题和解决问题的能力。营造问题情境是启发的首要因素；独立思考是启发的关键；发扬教学民主是启发的条件。

实时定量PCR引物和探针设计操作步骤Primer Express软件

实时定量PCR引物和探针设计操作步骤Primer Express软件 Primer Express 是实时定量PCR引物和探针设计的专用软件。遵守以下三个原则有助于快速建立定量PCR反应体系： 1.所有扩增按照同样的原则设计 (Primer Express)； 2.所有PCR反应在ABI PRISM ?7000/7900上使用同样的热循环条件； 3.所有反应使用相同的PCR试剂。 引物和探针的设计原则 下述原则的重要程度由上往下越来越低，请尽量满足编号靠前的条件。它们中有的已经在Primer Expre软件中设置成缺省值，有的则需要在选择引物和探针时由设计者加以运用。如果是设计SYBRGreen 引物，也要选择TaqMan Primer and Probe design并遵守这些规则，但是只需要合成引物就可以了。 TaqMan 探针： 1. 保持G-C含量在30-80%之间。 2. 避免同一碱基重复过多。特别是G，不可超过4个及以上。 3. 5' end不能是G。 4. 尽量使探针中的Cs多于Gs。如果不能满足，则使用互补链上的探针。 5. 对于单探针反应，用Primer Express?软件计算出来的Tm值应当在68-70 °C 之间。 引物：1. 在探针确定以后再选择引物。 2. 引物要尽可能地接近探针，但是不要重叠。 3. 保持G-C含量在30-80%之间。 4. 避免同一碱基重复过多。特别是G，不可超过4个及以上。 5. 用Primer Express?软件计算出来的Tm值应当在58-60 °C之间。 6. 3' end 的5个碱基中G and/or C碱基的总数不能超过2个。 实时TaqMan 引物和探针设计 Begin by opening Primer Express and selecting "File", "New", and "TaqMan? Primer & Probe Design". The following screen will appear. You can close the TaqMan? Primer & Probe Data box as shown.

管理学原理与方法重点

管理学原理与方法(周三多第五版) 总论 人类活动的特点：目的性，依存性，知识性 管理的概念：管理是管理者为了有效地实现组织目标（目的性有效性协调性过程性） １：管理是人类有意识有目的的活动。２：管理应当是有效的。 ３：管理的本质是协调。４：协调是运用各种管理职能的过程。 管理的职能：决策、组织、领导、控制、创新，是一切管理活动最基本的职能。 1：决策：所有管理者必须制定符合并支持组织的总体战略目标。（制定目标、行动） 2：组织：设计岗位，授权分工，使整个组织协调地运转。（设计、授权） 3：领导：指导人们的行为，通过沟通增强互相理解，统一思想和行动，激励成员自觉地为实现组织目标共同努力。（指导、沟通、激励） 4：控制：使实践活动符合于计划，计划是控制的标准。（衡量、纠偏） 5：创新：与其他职能结合中表现。 管理二重性：1、管理的自然属性 --反映人与自然的关系不以人的意志为转移，也不因社会制度形态的不同而有所改变，这完全是一种客观存在。 2、管理的社会属性 --反映社会关系 管理者的角色：明茨伯格这十种角色可归入三类。 人际角色：代表人角色、领导人角色、联络者角色 信息角色：监督者、发言人、传播人 决策角色：企业家、干扰对付者、资源分配者、谈判者 管理者三种技能：卡次 1：技术技能，运用管理者所监督的专业领域中的过程、惯例、技术和工具的能力。 2：人际技能，成功地与人打交道并与人沟通的能力。 3：概念技能，把观点设想出来并加以处理以及将关系抽象化的精神能力。 管理学的研究方法：归纳法、试验法、演绎法 中国传统管理思想的要点： 1：宏观管理的治国学--（财政赋税、人口管理、货币管理、等） 2：微观管理的治生学--（农副业、手工业、运输、建筑工程等） 顺道、重人、人和、守信、利器、求实、对策、节俭、法治 西方早期思想产生的三个人物：亚当斯密巴贝奇罗伯特欧文 泰罗创立的科学管理理论 主要观点：1：科学管理的根本目的--谋求最高工作效率 2：达到最高效率的重要手段--用科学的管理方法代替旧的经验方法 3：实施科学管理的核心问题-要求管理人员和工人双方在精神上和思想上来一个彻底的改变 提出的以下管理制度：1：对工人提出科学的操作方法，以便合理利用工时，提高效率 2：在工资制度上实行差别计件制 3：对工人进行科学的选择，培训和提高 4：制定科学的工艺规程 5：使管理和劳动分离 评价：1：它冲破了传统地落后地经验管理办法，将科学引进了管理领域，创立了一套具体地科学管理方法2：科学地管理方法和科学地操作程序使生产效率提高了二三倍，推动了生产地发展，适应了资本主义地发展。 3：由于管理职能于执行职能地分离，企业中开始有一些人专门从事管理工作 4：泰罗把人看成会说话的机器，只能按照管理人员的决定、指示、命令执行劳动，在体力技能上受很大的压榨 缺陷：适应历史发展的需要而产生的，同时也受到历史条件和个人经历的限制，他的科学管理所涉及的问

定量PCR Taqman探针设计要领

定量PCR+Taqman探针设计要领 自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR 荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。 一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。 第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBI genbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA 或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DN***段重叠的情况）内。 第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则： 总体原则 * 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。 * 所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。* 扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。 * 保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。 * 为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G） * 将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。 引物设计原则 * 序列选取应在基因的保守区段 * 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构 * 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。 * Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60% * 引物之间的TM相差避免超过2℃ * 引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基 * 为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。 * Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp

数量性状的选择原理与方法

第十二章数量性状的选择原理与方法动物育种中所重视的大多数重要经济性状都是数量性状，例如产奶量、乳脂率、产蛋数、蛋重、瘦肉率、增重速度、饲料转化率等。数量性状是由微效多基因控制的，每个基因作用微小， 效应各异，可以累加和倍加，只有通过群体对其进行研究，选择是在一个群体中通过外界的作用， 将其遗传物质重新组合，以便在世代的更替中，使群体内的个体更好地适应于特定的目标，优良 性状只有通过不断的选择才能得到巩固和提高。因此选择就成为进一步改良和提高家畜生产性能 的重要手段。阈性状是一类特殊类型的性状，与数量性状的遗传基础是一致的，对它的选择方法 有所不同。 第一节选择差与选择反应 家畜的繁殖率一般都是很高的，特别是应用人工授精技术以后，不需要将育种群中同一世代 出生的所有家畜全部留作种用，而是将各方面优秀的个体选留下来，用于繁衍下一代，因此选种 是改进群体遗传的重要手段。选择差和选择反应是进行数量性状选择的基础。 一选择差 选择差(S)是由被选择个体组成的留种群数量性状的平均数( P)与群体均数（P）之差： S P－P（公式 12-1） S= S 选择差表示的是被选留种畜所具有的表型优势。选择差的大小，主要受两个因素的影响，一是畜群的留种率（P），留种率是指留种个体数占原始畜群总数的百分比。一般来说，群体的留种率愈小，所选留个体的平均质量愈好，选择差也就越大。在实际的育种工作中，在一个每年都要扩大的畜群里，需要选留的种母畜多，留种率加大，选择差减小。在一个母畜头数年年保持不变的群体中，种母畜的留种率较小，选择差会增大。多胎家畜的选择差要比单胎家畜大，因为可能供选择的后代数目较多。断乳成活率较高的畜群，要比成活率较低的选择差大。公畜的选择差通常都大于母畜，这是因为公畜的留种比例小。对于限性性状的公畜，在选择时，留种的少数公畜，如果选择不那么准确，其实际选择差就会比预期的减小。二是性状的表型标准差，即性状在群体中的变异程度。同样留种率，标准差大的性状，选择差也大。由于数量性状的表型值呈正态分布，群体的标准差的大小基本稳定，因此留种率的大小就决定了选择强度的高低。 度量不准确会影响选择差。即使记录准确，但未加利用也会造成选择差减小。如要选用肉用牛的增重速度，有的牛增重率大但外形中等；有的牛增重率中等但外形优异，如选后者，就会造成增重率的选择差减小。 有时也会因育种措施不当而人为地加大留种率。例如，有的羊场在羔羊断奶前后，选择一批当时看来较好的羔羊组成特培群，给予特殊的饲养管理条件，到选种时，由于培育群的条件比其他群优越，以致种羊全部选自特培群。这样就加大了留种率。影响了选择效果。 由于不同性状的度量单位不同，选择差的单位也不同，它们之间的选择差不能进行相互比较，为了便于分析规律，通常将选择差标准化，变成标准化的选择差，即选择强度，选择强度通常用小

(完整版)哲学原理与方法论(经典版)

《生活与哲学》基本原理和方法论 （一）唯物论（7个） 世界观：人们对整个世界以及人与世界关系的总的看法和根本观点。 方法论：人们认识世界和改造世界的根本原则和根本方法。 辩证唯物论：物质、意识、规律 1、世界物质性统一性原理 【原理内容】世界是物质的世界，世界的真正统一性在于它的物质性。 【方法论】要求我们想问题、办事情要一切从实际出发，理论联系实际，主观符合客观，反对主观主义。 〖错误倾向〗：反对不从实际出发的主观主义，反对本本主义（教条主义）、经验主义。 2、意识的指导作用原理 【原理内容】意识对改造客观世界具有指导作用，正确的意识能够促进客观事物的发展，错误的意识则会阻碍客观事物的发展。 【方法论】我们要重视意识的作用，重视精神的力量，树立正确的思想意识，克服错误的思想意识。（举例：树立正确的金钱观、消费观、就业观、价值观；弘扬航天精神、感动中国人物的感人精神） 3、物质和意识的辩证关系原理 【原理内容】物质决定意识，意识对物质具有能动作用。 【方法论】我们要处理好主观和客观的关系，既要做到一切从实际出发、使主观符合客观，又要重视意识的作用。（举例：家庭实际消费、自身实际就业、省情制定发展战略等）【错误倾向】既要反对夸大意识能动作用的唯意志主义，又要反对片面强调客观条件，安于现状，因循守旧，无所作为的思想。 4、规律的客观性和普遍性原理 【原理内容】规律是事物运动过程中固有的、本质的、必然的、稳定的联系。规律是客观的，既不能被创造，也不能被消灭，是不可违抗的。规律是普遍的，事物在运动变化发展过程中都遵循其固有的规律。 【方法论】我们要尊重客观规律，按客观规律办事。人可以在认识和把握规律的基础上，根据规律发生作用的条件和形式利用规律，改造客观世界，造福于人类。 〖错误倾向〗：反对否认规律的客观性和企图创造规律或消灭规律的唯心主义观点，反对不讲科学，不顾客观规律的冒险盲干的主观主义。 5、发挥主观能动性和客观规律的关系 【原理内容】尊重客观规律是发挥主观能动性的前提和基础，只有发挥人的主观能动性才能认识、掌握和利用客观规律。

定量PCR引物探针设计原则完整版

定量P C R引物探针设计 原则 Document serial number【NL89WT-NY98YT-NC8CB-NNUUT-NUT108】

定量PCR引物、探针设计原则 自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与 扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR 要求。当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。 一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBIgenbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DNA片段重叠的情况）内。 第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则： 总体原则 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。 所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。 扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应 就越容易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。 保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。 为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G） 将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。 引物设计原则 序列选取应在基因的保守区段 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构? 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。 Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60% 引物之间的TM相差避免超过2℃ 引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基 为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。 Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp? 引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。