单细胞凝胶电泳——彗星实验方法的建立、改良与应用

陕西师范大学

硕士学位论文

单细胞凝胶电泳——彗星实验方法的建立、改良与应用

姓名：罗明志

申请学位级别：硕士

专业：动物学

指导教师：齐浩

20050501

单细胞凝胶电泳——彗星实验方法的建立、改良与应用

罗明志

摘要单细胞凝胶电泳（ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｓｉｓ，ＳＣＧＥ），又称彗星实验（ｃｏｍｅｔａｓｓａｙ），是一种在单细胞水平进行ＤＮＡ损伤的检测方法，具有简便、灵敏、快捷、样品用量小等优点，广泛用于遗传毒性检测、环境毒性检测、分子流行病学和ＤＮＡ损伤与修复等研究领域。

我们在本实验室建立了单细胞凝胶电泳技术，并对部分操作流程进行了改良，包括（１）制胶方法改良；（２）增加水洗；（３）进行梯度酒精脱水。在上述改良过程中，我们用“灌胶”法在载玻片上制胶，替代了传统的使用磨砂载玻片上“三明治”制胶，解决了彗星实验中常见的脱胶现象，脱水后有利于获得平整胶面：在裂解后增加了水洗步骤，以消除裂解液中的高盐和去垢剂对后续实验操作的影响；采用直流稳压电源进行单细胞电泳，保证了实验结果的可重复性；对染色的条件进行了筛选，确定了使用ＥＢ作为细胞ＤＮＡ的荧光染料；以ＣＡＳＰ（免费）作为彗星图像的分析软件，建立了图像分析的方法。这些实验步骤的改良以及实验流程的优化或标准化．简化了操作程序，节省了时间，并使结果分析更加简便。

为了验证上述改良后的实验系统是否可靠，我们用紫外线作为损伤因子处理细胞，诱导细胞ＤＮＡ损伤，然后用彗星实验检测这一损伤。从这～阳性模型的结果分析来看，发现细胞损伤呈现出很好的时间依赖性，表明该实验系统的可靠性。我们同时筛选并评价了彗星实验中有关的ＤＮＡ损伤分析指标，发现ＴａｉｌＬｅｎｇｔｈ，ＣｏｍｅｔＬｅｎｇｔｈ，ＴａｉｌＭｏｍｅｎｔ和ＯｌｉｖｅＴａｉｌＭｏｍｅｎｔ作为ＤＮＡ损伤的评价指标比较可靠。

我们建立了肝细胞的组织块原代培养系统。在建立肝细胞组织块原代培养实验流程中，我们对实验的各个步骤，例如组织块贴壁需要的时间、细胞生长所需的培养基种类、培养基添加剂以及动物组织供体年龄等进行了筛选，建立了小鼠肝细胞组织块的原代培养系统。

我们用单细胞凝胶电泳方法对磁场和抗癌药物对人自血病细胞Ｋ５６２以及小鼠原代肝细胞的ＤＮＡ损伤进行了检测。结果发现，Ｋ５６２细胞在９ｍＴ稳恒磁场中处理１２ｈ即可引起细胞的ＤＮＡ损伤，这一损伤随处理时间的延长而增加，具有时间依赖效应；同样条件下对原代肝细胞的处理以及更长时间的处理（３６ｈ、４８ｈ、７２ｈ）均未发现细胞的ＤＮＡ损伤。在使用较低浓度紫杉醇（５０ｎｇ／ｍＬ）处理Ｋ５６２细胞１２ｈ后，即可导致细胞ＤＮＡ损伤，并表现出时间依赖效应，而仅在高浓度长时阳Ｊ的紫杉醇（８００ｎｇ／ｍＬ，２４ｈ）处理下才会引起肝细胞的ＤＮＡ损伤。８００９９／ｍＬ环磷酰胺处理Ｋ５６２细胞１２ｈ即可引起细胞的ＤＮＡ损伤，而在１２００９９／ｍＬ时方才引起肝细胞的ＤＮＡ损伤。

关键词：单细胞凝胶电泳；ＤＮＡ损伤：ＵＶ；细胞培养；磁场；抗癌药物

Ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ－－

ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｏｍｅｔａｓｓａｙ

ＬｕｏＭｉｎｇｚｈｉ

ＡｂｓｔｒａｃｔＴｈｅｃｏｍｅｔａｓｓａｙ，ａｌｓｏｃａｌｌｅｄｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＣＧＥ），ｉｓａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｑｕｉｃｋａｎｄｃｈｅａｐｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｍｅｔｈｏｄｔｏｄｅｔｅｃｔａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｅＤＮＡｄａｍａｇｅｉｎｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｃｅｌｌｓ．ＩｔｗａｓｆｉｒｓｔｄｅｓｃｒｉｂｅｄｂｙＯｓｔｔｉｒｔｇａｎｄＪｏｈａｎ。ｓｏｎｉｎ１９８４ａｎｄＷａｓｌａｔｅｒｍｏｄｉｆｉｅｄｂｙＳｉｎｇｈ，Ｔｈｅｃｏｍｅｔａｓｓａｙｈａｓｂｅｅｎｕｓｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｉｅｌｄｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇａｇｉｎｇ，ｃｌｉｎｉｃａｌｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ，ｇｅｎｅｔｉｃｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙｉｎｔｈｅｐａｓｔｆｅｗｙｅａｒｓ．

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学位论文独创性声明

本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得陕西师范大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。

作者签名：——日期

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本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西师范大学。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西师范大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文的电子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。

作者签名：————日期

图１－１：Ａ表示未损伤细胞，Ｂ表示损伤细胞，引自［ＮｅｌｍｓＢＥ，１９９７１。

３单细胞凝胶电泳

３．１单细胞凝胶电泳的发展简史

１９７６年，Ｃｏｏｋ［ＣｏｏｋＰＲｅｔａｌ，１９７６］等人发明了一种研究ＤＮＡ损伤的方法。他们用含有非离子型去垢剂和高摩尔浓度ＮａＣＩ的裂解液裂解细胞，使细胞膜破裂，细胞质和核质被抽提，染色体结构破坏，大部分的组蛋白被高盐抽提，只剩下核骨架。核内ＤＮＡ结合在核骨架上形成ＤＮＡｌｏｏｐｓ，并不以ＤＮＡ线性分子的形式存在。当ＤＮＡ损伤时在这样的实验条件下会发生解旋。使ＤＮＡｌｏｏｐｓ从细胞核向外扩散形成‘＇ｈａｌｏ”，当ＤＮＡ损伤的程度加剧时，Ｈａｌｏ环的面积就会增大。

１９７８年，Ｒｙｄｂｅｒｇ和Ｊｏｈａｎｓｏｎ［ＲｙｄｂｅｒｇＢ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９７８］在上述实验的基础上第一次报道直接在单个细胞的水平上对ＤＮＡ损伤进行定量检测。将含有靶细胞的琼脂糖铺在载玻片上，用含有高浓度盐分和去垢剂的裂解液裂解细胞，之后在弱碱性条件下使ＤＮＡ解螺旋，中和后使用吖啶橙染色，显微分光光度计测定绿色荧光（ＡＯ与双链ＤＮＡ结合后发射绿色荧光）与红色荧光（ＡＯ与单链ＤＮＡ结合后发射红色荧光）强度，两者比值可定量反映ＤＮＡ的损伤程度。由于该实验的条件要求苛刻，该技术未能得到广泛应用。

在上述方法的基础上，０ｓｔｌｉｎｇ和Ｊｏｈａｎｓｏｎ于１９８４［０Ｓｔｌｉｎｇ０，１９８４］年建立了微凝胶电泳技术。该技术在解旋后增加了电泳步骤，使ＤＮＡ断片从细胞核向阳极移动，以形成类似于彗星的尾巴。ＤＮＡ的移行距离可用溴乙啶染色，再用荧光显微镜测定。若细胞中ＤＮＡ损伤增加，断片移行的距离也就变长。但是中性条件下的裂解和电泳只能检测细胞中的双链ＤＮＡ断片（Ｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｂｒｅａｋｓ，ＤＳＢｓ），不能测定单链ＤＮＡ断裂。因此１９８８年Ｓｉｎｇｈ［ＳｉｎｇｈＮＰ，１９８８］建立了碱性彗星实验（ｐＨ＞１３，Ｏ），该实验能够检测单、双链的断裂和碱性不稳定点（某些损伤因子能够导致脱嘌呤或者脱嘧啶位点的产生，形成碱性不稳定点［ｓｉｎｇｈＮＰｅｔａｌ，１９８９］，其在强碱条件下能够转换成ＤＮＡ链的断裂），从而使检测的灵敏度得到极大改善。大部分具有基因毒性的化学试剂所诱导的ＤＮＡ单链断裂和碱性不稳定点要多于ＤＮＡ双链的断裂，如ｘ射线和Ｈ２０２诱导的ＤＳＢｓ与ＳＳＢｓ之比分别是１：２０和

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１：２０００［０ｓｔｌｉｎｇＯｅｔａｌ，１９８７Ｊ，因此碱性彗星检测即成为十分灵敏的ＤＮＡ损伤的检测方法。

２０世纪９０年代以来，Ｓｉｎ曲与Ｏｌｉｖｅ的两个实验室分别重点研究了影响细胞彗星图像因素并努力提高该方法的灵敏度，他们对实验中的某些关键处理过程对结果的影响进行了研究。

自从碱性彗星实验问世以来，各相关实验室已将该技术广泛应用于检测细胞的ＤＮＡ损伤，与此同时，也在不断的对该方法进行改良，使之能够检测真核细胞内各种各样的ＤＮＡ损伤，例如单，双链的断裂，ＤＮＡ碱基的氧化损伤，ＤＮＡ．ＤＮＡ／ＤＮＡ一蛋白质／ＤＮＡ．药物交联以及ＤＮＡ修复［ＴｉｅｅＲＲｅｔａ１．２０００］等。

为了检测某些特异性的ＤＮＡ损伤，有的研究者将损伤因子作用后的细胞再用特异性修复酶处理，修复酶可将特异性ＤＮＡ损伤转换成ＤＮＡ链的断裂，从而提高了彗星实验检测的特异性。如核酸内切酶ＩＩＩ（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅＩＩＤ可以用束检测嘧啶氧化损伤［ＣｏｌｌｉｎｓＡＲｅｔａｌ，１９９３１，还可以用ｆｏｒｍａｍｉｄｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅＤＮＡｇｌｙｃｏ－ｓｙｌａｓｅ（ＦＰＧ）来检测嘌呤氧化产物（８－ｏｘｏｇｕａｎｉｎｅ）ｆＤｕ§ｉｎｓｋｆｉＭｅｔａｌ，１９９６］，用Ｔ４ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅＶ检测ＵＶ诱导的环丁烷嘧啶二聚体［ＣｏｌｌｉｎｓＡＲｅｔａｌ，１９９７］等。

也有研究者将篓星实验和原位杂交相结合，建立了荧光原位杂交彗星试验（Ｃｏｍｅｔａｓｓａｙ．ＦＩＳＨ）［Ｍｃｋｅｌｖｅｙ．ＭａｒｔｉｎＶＪｅｔａｌ，１９９８］，用来检测位点特异性ＤＮＡ损伤。

在第三届人口与环境突变世界大会上，由Ｇ．Ｓｐｅｌｔ，Ｒ．Ｓｒａｍ，Ｒ，Ｔｉｃｅ主持成立了彗星实验工作小组，以便对全世界从事彗星实验检测的人们提供方法和应用上的支持。【Ｃｏｍｅｔｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ，１９９８，８】

１９９９年３月２５—２６Ｈ在华盛顿举行的国际遗传毒性检测程序工作会议（ＩＷＧＴＰ）上建立了彗星实验的指导方针。代表们认为碱性骜星实验（ｐＨ＞１３，Ｓｉｎｇｈ，１９８８）最适合用来检测各种物质的遗传毒性。这是因为碱性彗星实验能够检钡ＣＪＤＮＡ单链断裂（ＳＳＢ）、碱性不稳定点（ＡＬＳ）、ＤＮＡ之间的交联、ＤＮＡ与蛋自质之间的交联以及与ＤＮＡ单链断裂相关的不完全切除修复位点等多种ＤＮＡ损伤。会议对碱性彗星实验的各个步骤进行了介绍，并对不同的彗星实验方法进行了介绍。例如用不同口Ｈ的电泳缓冲液进行电泳，以区别ＤＮＡ链的断裂和碱性不稳定点；用各种修复酶和抗体检测特异性的ＤＮＡ损伤；用中性扩散实验来区别凋亡和坏死；用非细胞体系来检测待测试剂和ＤＮＡ的相互作用［ＴｉｅｅＲＲｅｔａｌ，２０００］等。

３．２单细胞凝胶电泳的原理

３．２．１裂解

彗星实验首先是裂解细胞（破膜、去蛋白），以便使断裂的ＤＮＡ片段能够在外电场所施加的电场力的作用下从细胞核中迁移出来。

破坏细胞膜的主要原理是破坏维持膜结构稳定的力。膜分子的聚集是因为两

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类非共价键（ｎｏｎ—ｃｏｖａｌｅｎｔｂｏｎｄ）的相互作用（疏水的和／或亲水作用力）。彗星实验中膜的破坏主要是破坏膜上蛋白质之间、蛋白质与腊类分子之间、脂类与脂类分子之间的结合力。使膜结构瓦解。

目前去除细胞内蛋白质的方法有两种，一是用高盐溶液进行盐析，二是使用蛋白酶消化的方法，彗星实验通常使用前者。

裂解液由高盐与去垢剂构成。这些成分能使蛋白质变性，膜脂被抽提，导致维持膜结构稳定性的作用力丧失，细胞膜溶解，细胞内的大部分物质随即溶解，扩散至裂解液中，与ＤＮＡ相结合的蛋自质在高盐的作用下也与ＤＮＡ分离，扩散到裂解液中。

３．２２解旋

解旋的目的有两个，一是将双链ＤＮＡ变成单链，二是使ＲＮＡ降解。

核酸变性指维持ＤＮＡ双螺旋结构的氢键断裂，变成单链，该过程不涉及共价键的断裂。当ＤＮＡ水溶液加热至ｉ００℃或处于高ｐＨ（ｐＨ兰１３）时，ＤＮＡ双链的互补碱基对破坏，ＤＮＡ双螺旋很快解离成单链［汪垫仁等，２００１］。

目前彗星实验常用解旋液（１ｍＭＥＤＴＡ＋３００ｍＭＮａＯＨ）的ｐＨ值在１３以上，细胞ＤＮＡ在此环境下．很快变性解旋，由双链变成单链，同时高碱能使ＲＮＡ全部水解。其水解的原理是ＲＮＡ的核苷酸上有２＇－ＯＨ基，该．ＯＨ基在强碱环境下形成磷酸三酯，磷酸三酯极不稳定，随即水解产生核苷２’，３’一环磷酸酯，后者进一步水解形成２’．核苷酸和３’．核苷酸ｆ王镜岩等，２００２１。

３．２．３电泳原理

凝胶电泳是当前核酸研究中最常用的方法。它有许多优点：简单，快速，灵敏，成本低，凝胶电泳有分子筛和电泳的双重效果，所以分离效率很高［ＤｅｕｔｃＪＭ＋１９８８】。

电泳时ＤＮＡ分子在电场中的迁移率决定于以下因素：（１）核酸分子的大小，迁移率与相对分子质量的对数成反比。（２）凝胶浓度，迁移率与凝胶浓度成反比，常用ｌ％凝胶分离ＤＮＡ。（３）ＤＮＡ构象，一般条件下具有超螺旋结构的ＤＮＡ迁移最快，线性ＤＮＡ其次，开环ＤＮＡ最慢。（４）电压。一般不大于５ｖ／ｃｍ，在适当的电压范圈内，迁移率与电压成正比。（５）温度，４－３０＊（２均可，但当温度过高时，凝胶升温，溶液蒸发，造成电泳异常。当其它条件～致时，ＤＮＡ迁移的距离仅与其分子大小相关【王镜岩等，２００２】。

与常规的琼脂糖凝胶电泳相比，彗星实验中ＤＮＡ迁移则受制于更多的因素，包括细胞裂解的程度，ＤＮＡ解旋的程度，染色体高级结构等。

ＤＮＡ以组蛋白为核心形成核小体．存在于真核细胞的细胞核中。当ＤＮＡ发生断裂时，超螺旋结构就会变得松散［（Ｓｓｔｌｉｎｇ０ｅｔａｌ，１９８４３。若用去垢剂破坏细胞的膜结构，致使核蛋白被高浓度的盐分提取，核内ＤＮＡ便在原位上形成残留的类

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理和电泳时间能够提高ＳＣＧＥ的灵敏性，能检出低剂量辐射造成的细微ＤＮＡ损伤。

（６）细胞所处周期的不同时相，因染色体的结构不同会影响ＤＮＡ的图像形成ｆＯｌｉｖｅＰＬｅｔａｌ，１９９１］。此外，彗星图象还与凝胶、染色剂、放大率及统计方法等因素有关。

（７）ＤＮＡ特异性的荧光染料。

（８）图像的获取。

３．６单细胞凝胶电泳的流程

要想得到一个可靠的、可重复的实验结果，应该熟知实验的每～步流程及其原理。

（１）实验用载玻片

目前单细胞凝胶电泳中用到的载玻片主要有三类：（１）常规载玻片：（２）完全磨砂的载玻片。女ＩＪＭｉｙａｍａｅ［ＭｉｙａｍａｅＹｅｔａｌ，１９９７］等采用完全磨砂的载玻片制胶。（３）特制的载玻片［ＳｍｉｔｈＭＪｅｌａｌ，１９９８】（中间有一个小槽，用于制胶）。一些试剂公司研制了一些专门用于单细胞凝胶电泳的载玻片，例如ＴＲＥＶＩＧＥＮ公司的

ＴｒｅｖｉｇｅｎＣｏｍｅｔＳｌｉｄｅＴＭ，这种载玻片提高了低熔点琼脂糖和载玻片的黏附力，并且减少了常规制胶方法中既耗时又不可靠的底胶制备方法。（图ｌ－２）

（２）制胶

图１．２：彗星实验专用载玻片

制胶的经典方法是在载玻片上制备“三明治”型胶体。第一层和第三层使用常

熔点琼脂糖，第二层是低熔点琼脂糖与细胞的混合液。凝胶浓度可根据实验要求而变化。其中第一层胶的主要作用是使得第二层胶和载玻片粘得更加的牢固。第三层胶能够防止电泳时含细胞凝胶中的盐分向电泳缓冲液中扩散［ＳｉｎｇｈＮＰｅｔａｌ，１９９７】。

在彗星实验的早期，通常采用磨砂的载玻片作为制胶载体，经实践发现，由

于此种载玻片能够造成很强的背景散射光，给后续的图形分析带来了很大的麻烦，

因此这种载玻片已渐被淘汰。

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可以在互联网上下载一些免费软件，进行彗星实验分析。

４单细胞凝胶电泳的应用

目前这一检测方法已经广泛地应用于有核细胞的ＤＮＡ损伤与修复研究，如遗传毒理学、放射生物学、环境生物监测［ＣｏｌｌｉｎｓＡｅｔａｌ，１９９７］、药物筛选、基因毒性检测和分子流行病［ＫａｓｓｉｅＦｅｔａｌ，２０００１、肿瘤发病机理及诊断与治疗［ＡｎｄｅｒｓｏｎＤｅｔａｌ，１９９８１、衰老和细胞凋亡机制等。

分别水洗１次、２次和３次，每次５ｍｉｎ。用同立．７１７０型全自动生化分析仪检测水洗后溶液中氯离子的含量以分析水洗效果。

ｌ，４，５电泳装置的筛选

分别选用ＺＤＹ－２Ａ型转移电泳仪（南京大学生化系生物技术丌发公司），ＤＹＹ－１１Ｂ型三恒电泳仪（ｊＥ京市六一仪器厂），ＪＷＹ－３ＤＦ型直流稳压电源（石家庄无线电四厂）进行电泳条件的筛选。

１．４．６梯度酒精脱水

在中和后用５０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１００％的乙醇脱水，５分钟／次。１．４．７染色条件的优化

（１）比较了浸染法和滴染法的染色效果。

（２）对ＡＯ、ＰＩ和ＥＢ三种荧光染料进行了比较观察，并对ＥＢ的染色体积、浓度和染色时间进行了筛选。

Ｉ．４．８观察用显微镜的筛选

分别选用了Ｏｌｙｍｐｕｓ８ｘ一２型落射式荧光显微镜、ＮｉｋｏｎＴＥ．２０００Ｓ型倒置荧光显微镜和ＬｅｉｃａＤＦ２Ｂ型落射式荧光显微镜。

２结果与分析

２．１载玻片的筛选实验分析发现磨砂载玻片的背景荧光强度偏高（见图２－１Ａ），而常规载玻片的背景荧光强度较低（见图２－１Ｂ）。我们选择常规载玻片作为实验用载玻片。

ｌ翎２－１：Ａ磨砂载玻片；Ｂ常规载玻片

２．２制胶方法的改良“三明治”制胶法存在着操作繁琐，胶面不平的问题，且制得的胶体在后续的操作中容易脱落，导致实验失败。我们对“三明治”制胶法进行了改良，制胶时只制备底胶和含细胞胶层。

在制备底胶时，我们分别比较了压片法、涂片法和镀膜法的效果，在含细胞胶层制备时我们采用灌胶法。

实验结果的分析发现，用压片法制的胶体很容易在后续的操作中脱落，同时

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这－Ｎ胶法还存在着胶面不平整的问题。涂片法制得的胶面也不平整，虽然可以部分解决脱胶问题，但这种法对操作者的个人实验经验依赖性较高。镀膜法制备的底胶胶面平整，能够解决脱胶问题，易学易操作，在后续实验中没有发生脱胶

现象。实验结果表明，使用浓度为０．１％、Ｏ．２％与Ｏ．５％的常熔点琼脂糖来镀膜时，以０．２％浓度的常熔点琼脂糖镀膜效果最好，此时胶体与载玻片的粘合较好，胶面

平整，在后续操作中胶体不脱落。根据这样的实验结果，我们选用Ｏ．２％的常熔点琼脂糖溶液进行镀膜，制备底胶，用灌胶法制备含细胞胶层。

２．２胶层中细胞密度的筛选在荧光显微镜下（物镜为４０倍．目镜为１０倍）进

行观察，发现当胶体中细胞密度为１×１０５ｃｅＵｓ／ｍＬ时，视野中的细胞数为５—８个，胶体中细胞密度为２．５×ｌＤ４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ时，视野内细胞要少很多，只有２—３个，丽胶

体中的细胞密度大于２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ时，视野内细胞过密，致使图像无法分析。根

据实验结果，我们选择１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ作为胶体中的细胞密度。

２．２水洗条件的筛选：裂解后胶体中含有大量的盐分与去垢剂，将会影响到电泳时细胞周围的电场强度发生

不规则变化，影响电泳结果。

为了去除残留在胶体中的盐

分和去垢剂，我们增加了水洗

程序（４＂Ｃ，３次，每次５ｒａｉｎ）。

我们检测了每次水洗后溶液

中ＣＩ一的含量，经目立全自动冈２—２：Ａ传统方法；Ｂ改良力’法生化仪上检测，３次水洗后的

氯离子含量微乎其微。达到了水洗的要求。

表：水洗后日立全自动生化仪铡定的溶液中的氯离子禽量／ｒｅｔｏｏＬ－Ｌ＂‘

水洗次数溶液中的氯离子含量

ｌ２３６６．７２．７０．２

若不进行水洗，经常会在图形观察与分析中发现一些尾部向一边偏移的彗星图像（见图２－２Ａ），这主要是裂解液中的高盐成分对局部电场性质的影响，改变了局部电压，导致ＤＮＡ迁移发生偏移。

２．３电泳装置的筛选

电泳时应保证电源能够输出稳定的直流电。我们选用了三种型号的电源装鼍，结果发现ＺＤＹ－２Ａ型转移电泳仪（南京大学生化系生物技术开发公司）和ＤＹＹ－１１Ｂ

１５

有关中性单细胞凝胶电泳的总结要点

1、辐射生物剂量：此法适于照后短期内的剂量评价，中性条件优于碱性条件； 旁观效应：查阅了许多国外文献，尚无此方法观察旁观效应的研究报道，所以我采用此方法观察了1Gy照后的旁观效应，试验今天上午刚刚结束，结果待分析，粗略看，此法对于旁观效应还是很敏感的，此法的优势在于成本低，操作比较简单。 低剂量照射的适应性反映：本实验室的一个相关课题刚刚结提，论文在法医学与特种医学版的军事医学子版已有上传，感兴趣的可以去看。 凋亡细胞的观察：看过国外此法作出的凋亡细胞彗星图像，很漂亮，用CASP软件分析后，其曲线呈典型的双峰，而正常细胞为单峰。我的一些教训：观察凋亡细胞最好把电压、电流、和电泳时间均调低，否则，凋亡细胞中的DNA片断跑的太块，荧光下根本看不到凋亡细胞的尾巴。 注：我用的是中性条件，20V，200mA,20min, 凋亡细胞观察宜选用10V,100mA,10min。 2、中性单细胞凝胶电泳步骤：（以淋巴细胞为例） 1) 淋巴细胞的提取 ①取各组荷瘤鼠外周血0.2ml,肝素抗凝,加入到等体积淋巴细胞分离液上,3500r/min离心4min。 ②取中间层淋巴细胞并加入PBS至5 ml, 1500r/min离心8min。 ③重复洗涤细胞两次。 2) 琼脂糖玻片的制备 ①制好微型电泳槽。 ②使用两层凝胶法,第一层为100μl 0.75%正常熔点琼脂糖凝胶, 第二层为75μl 0.75%低熔点琼脂糖凝胶和25μl淋巴细胞的混合液。 3) 细胞裂解、电泳 ①好的玻片浸入新配的预冷的(4oC)中性裂解液中裂解1.5h。 ②取出玻片,用双蒸水浸没漂洗。 ③将玻片置于0.5%电泳液中先解旋20分钟，然后电泳20min,电压20V，电流200毫安。 4) 染色 用溴化乙啶(2μg/ml)染色。 用双蒸水冲去多余染液，滤纸洗去多余水分。 5)读片和分析 ①用荧光显微镜(激发波长515-560nm)观察玻片,每张胶随机抓 取100个慧星图像并用数码相机拍照后输入计算机储存。 ②用CASP软件分析系统分析慧星图像。 3、biomed96 ：lq6688你好，本人也正要做这个实验，预实验做了两次，但什么都没看到，也不知道是什么问题，望指教。 铺3层胶，第一层100ul1％regular胶，50度烤干，第二层50000个细胞100ul0.5％低熔点胶，第三层100ul 0.5％低熔点胶。 裂解液：EDTA 100mM Nacl 2.5M Tris(10mM)pH10 1%TritonX-100 裂解1小时 解旋液：EDTA1mM NaoH 300mM Ph>13 孵育20分钟。电泳40分钟。 染色：PI 50ug/ml染色15分钟。 结果是什么都看不到，好像一点都没染色。 lq6688：首先，此试验的生物学原理目前还不是很清楚，Sighn和Olive这两个单细胞凝胶电泳的鼻祖首先提出的中性和碱性条件，中性条件检测双链断裂，而碱性条件检测单链断裂，有人曾提出这是为什么，我查阅了大量文献，国外文献没有具体的说明，国内文献更是人云亦云，所以，目前只能按照大家比较默认的：中性－－双链，碱性－－单链，这不是用软件来区分的，而是你的试验条件决定的，我看了您的裂解

彗星实验

应用慧星试验研究细胞D NA损伤的原理与方法 山西大学生命科学系环境生物毒理学研究室(太原030006)　孟紫强 中国辐射防护研究院二所　张连珍 提　要　对应用慧星试验(即单细胞微凝胶电泳(SCGE技术)研究细胞DNA损伤的操作过程、技术原理以及实验操作过程中应注意的事项,进行了详细介绍和讨论。 关键词　慧星试验　单细胞微凝脉电泳　DNA损伤　哺乳类细胞　淋巴细胞 诱变剂往往是通过引起DNA损伤而诱发细胞突变和癌变。近年来由Singh等改进和建立的慧星试验(Com et assay)即单细胞微凝胶电泳(SCGE)技术,是一项测定和研究细胞DNA损伤的新技术,该技术在国外有关研究领域内已得到广泛的应用〔1,2〕。但在我国有关研究报道甚少。为此,本文对我们研究室建立和改进的SCGE技术作了详细报道,以期与国内同行交流和进一步改进。 1　SCGE测定原理 哺乳类细胞和人血淋巴细胞,其DNA的分子量很高且具有严密的超螺旋结构。在理想的实验条件下,对淋巴细胞的分离、处埋、裂解、碱处理等过程均保持在避光条件下小心谨慎地操作,使细胞DNA不受损伤,其DNA结构仍象在活细胞中那样完整,外加电泳电场就不会使DNA在凝胶中泳动。因此,在理想条件下,正常对照组细胞DNA在电泳之后仍应保持在原来位置。在SCGE实验中,细胞DNA之所以从原位向电泳电场的阳极迁移,形成慧星状图象,其原因是:当细胞DNA受损伤产生链断裂时,DNA的超螺旋结构受到破坏;在细胞裂解液作用下,细胞膜、核膜及其它膜结构受到破坏,细胞内的蛋白质、RNA及其它成分均可进入凝胶而扩散到裂解液中,而核DNA分子量很高不能进入凝胶,只能留在原位。在碱处理和碱性电泳液的作用下DNA解螺旋,使DNA的断链和碱易变性DNA片断从严密的超螺旋结构中释放出来;由于这些DNA断链分子量较小且碱变性为单链,所以在电泳电场中就可以离开核DNA在凝胶分子筛中向阳极移动,形成慧星状图象。DNA受损伤愈严重,产生的断链和碱易变性片断就愈多,断链也愈小;在相同电泳条件下迁移的DNA量就愈多,迁移的距离就愈长。因此,通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可定量测定DNA损伤程度,确定电离辐射或其它因素作用剂量与DNA损伤效应之间的关系。 我们的实验也表明,未处理的对照组淋巴细胞DNA在SCGE实验中也表现有微弱的迁移现象。我们认为这主要是由于人血淋巴细胞从静脉血分离出来之后,体外条件必竟是一种非生理条件,离开活体的细胞不可避免地会受到某些非生理条件的不利影响,使细胞中的DNA受到不同程度的损伤,导致微量DNA在电泳中迁移。我们在用碱洗脱法和DNA碱解旋速率法测定DNA单链断裂时,也发现未处理对照组的人血淋巴细胞和其它哺乳类细胞的DNA单链断裂占总DNA的5～30%〔3—5〕,也表明非生理条件能诱发DNA 损伤,与本实验结果一致。 2　SCGE实验方法 211　细胞分离和处理　(1)人血淋巴细胞分离:从健康人静脉采血015～1mL,沿离心管管壁滴加在等体积淋巴细胞分离液液面上,3500r m in离心2m in,吸取中间层淋巴细胞於10m l离心管中,加磷酸盐缓冲液(PBS)至5m l,1500r m in离心8m in,如此重复洗涤细胞两次,再将细胞悬于PBS,置4℃待用。(2)其它细胞的分离制备:对于体外培养的细胞株,若为贴壁生长的细胞,当细胞处于对数生长期时,可弃去培养液,加适量011%胰蛋白酶H ank’s溶液,在37℃下3-5m in,使细胞脱离瓶壁,用PBS洗涤细胞2—3次,调节至适当的细胞密度即可;若为悬浮培养的细胞,只需用PBS 洗涤细胞两次即可。对于实体肿瘤、胸腺、脾及其它组织,可用不锈钢剪去除结缔组织,剪碎,压研通过60目不锈钢网,再用PBS洗涤细胞2—3次,调节适当细胞密度即可。对于肝细胞的分离制备比较复杂,需经过含胶原酶和透明质酸酶的缓冲液进行器官灌注,再分离肝细胞。(3)紫外线或Χ-线照射:取新鲜分离的淋巴细胞或其它细胞悬液,用PBS调细胞浓度为1×105个细胞 m l,于冰水浴中经紫加线或60Co-Χ线照射,照后细胞置于冰水浴中,并立即用于SCGE测定。(4)化学处理:新鲜分离的淋巴细胞或其它细胞,在SCGE测定前用待测化学物在37℃下处理2-4h,细胞密度均为1×105个 m l。随后将细胞保存在4℃下或冰水浴中,立即进行测定。 212　制片　(1)磨砂载玻片:用水砂纸(粒度,N o. 380)将普通光学显微镜用的载玻片(厚度较薄为宜)单面加水轻磨,使形成的磨砂面均匀细密。磨时谨防加压过大、用力过猛,以免在载玻片面上形成粗纹痕迹。实验发现如磨砂面有粗纹划痕,细胞裂解液处理后,载玻

彗星试验步骤

彗星试验步骤 1.5.4 彗星试验（单细胞凝胶电泳试验）：参照文献[i]，略加改动，进行碱性单细胞凝胶电泳，具体如下。 1.5.4.1 制片 将0.6%的NMPA（用PBS配制）于微波炉中加热融化后，浸泡磨砂玻片，用吸水纸将玻片滑面及四周吸干，自然晾干备用。 1.5.4.2 铺胶 取1.5.3中所备细胞悬液10μl，向其中加入70μl 37℃0.7%LMPA（用PBS配制），混匀后迅速滴于37℃预热的玻片上，立即盖上盖玻片，4℃固化10min。 1.5.4.3 裂解 轻轻取下盖玻片，将玻片浸于新鲜配制并预冷的细胞裂解液中，4℃避光裂解1h。 1.5.4.4 解旋 从裂解液中取出载玻片，用PBS浸泡玻片3×3min。用纸巾吸去玻片上残留的液体，置于水平电泳槽中，加新鲜配制的碱性电泳缓冲液至高于玻片表面3mm 以上，避光解旋30min。 1.5.4.5 电泳 电压25V，调整液面高度使电流达到300mA，电泳25min。 1.5.4.6 漂洗及染色 电泳完毕，取出玻片，用PBS浸泡2×15min，以中和强碱。用纸巾吸去玻片上残留的液体，然后滴加20μg/ml的EB20μl，盖上盖玻片，立即置荧光显微镜下观察。 以上步骤尽量在黄光下或暗处进行，避免其他原因所致的DNA损伤。每一剂量水平制片2张。 1.5.4.7 结果观察 荧光显微镜下200倍观察，激发波长515~560nm，发射波长590nm。每一剂量水平随机观察100个细胞，记录拖尾细胞数。计算拖尾细胞率（以下简称拖尾率），拖尾率＝(拖尾细胞数/100)×100%。每一剂量水平用目镜测微尺测量30个拖尾细胞的全长和头长，拖尾细胞尾长（以下简称尾长，tail length，TL）＝全

水处理实验报告-混凝实验

水处理实验报告-混凝实验 降低或降低不多～胶粒不能相互接触～通过高分子链状物吸附胶粒～一般形成广西民族大学水污染控制工程实验报告 2012 年 6 月 10 日絮凝体。消除或降低胶体颗粒稳定因素的过程叫脱稳。脱稳后的胶粒～在一定 姓名实验混凝的水利条件下～才能形成较大的絮凝体～俗称矾花～自投加混凝剂直至形成矾 名称实验投加混凝剂的多少～直接影响混凝效果。水质是千变万化的～最花的过程叫混凝。同组者 佳的投药量各不相同～必须通过实验方可确定。实验目的: 在水中投加混凝剂如 A1(SO)、 FeCl后～生成的AI、 Fe的化合物对胶体的脱1、通过实验学会求一般天然水体最佳混凝条件,包括投药量、PH、水流速度梯度,的2433 稳效果不仅受投加的剂量、水中胶体颗粒的浓度、水温的影响～还受水的 pH 值影响。基本方法。 如果pH值过低(小于4)～则混凝剂水解受到限制～其化合物中很少有高分子物质存在～2、加深对混凝机理的理解。 絮凝作用较差。如果pH值过高(大于9—10)～它们就会出现溶解现象～生成带负电荷实验原理: 的络合离子～也不能很好地发挥絮凝作用。混凝阶段所处理的对象主要是水中悬浮物和胶体杂质～是水处理工艺中十分重要的

投加了混凝剂的水中～胶体颗粒脱稳后相互聚结～逐渐变成大的絮凝体～这时～一个环节。水中较大颗粒悬浮物可在自身重力作用下沉降～而胶体颗粒不能靠自然沉降 水流速度梯度G值的大小起着主要的作用。得以去除。胶体表面的电荷值常用电动电位ξ表示～又称为Zeta电位。一般天然水中的胶体 颗粒的Zeta电位约在-30mV以上～投加混凝剂之后～只要该电位降到-15mV左右即可得到较好的实验步骤及装臵图: 混凝效果。相反～当电位降到零～往往不是最佳混凝状态。因为水中的胶体颗粒主要是带负1.最佳投药量实验步骤 电的粘土颗粒。胶体间存在着静电斥力～胶粒的布朗运动～胶粒表面的水化作用～使胶,1,、用6个1000mL的烧杯～分别取1000mL原水～放臵在实验搅拌机平台上, 粒具有分散稳定性～三者中以静电斥力影响最大～若向水中投加混凝剂能提供大量的正,2,、确定原水特征～即测定原水水样混浊度、 pH值、温度。离子～能加速胶体的凝结和沉降。水化膜中的水分子与胶粒有固定联系～具有弹性较高,3,、确定形成矾花所用的最小混凝剂量。,混凝剂A、B,方法是通过慢速搅拌烧杯的粘度～把这些水分子排挤出去需克服特殊的阻力～这种阻力阻碍胶粒直接接触。有些中200mL原水～并每次增加1mL混凝剂的投加量～逐滴滴入200mL原水杯中直到出现水化膜的存在决定于双电层状态。若投加混凝结降低ζ电位～有可能是水化作用减弱～矾花为止。这时的混凝剂量作为形成矾花的最小投加量, 混凝剂水解后形成的高分子物质在胶粒与胶粒之间起着吸附架桥作用。即使ζ电位没 有 ,4,、确定实验时的混凝剂投加量。根据步骤3得出的形成矾花的最小混凝剂投加量～ 取其1,3作为1号烧杯的混凝剂投加量～取其2倍作为6号烧杯的混凝剂投加量～用

单细胞凝胶电泳(SCGE)检测锰损伤神经元DNA

单细胞凝胶电泳(SCGE)检测锰损伤神经元DNA1 陆彩玲，郭松超，鲁力，陈维平，邝晓聪 广西医科大学公共卫生学院，广西南宁（530021） E-mail：lcling78@https://www.wendangku.net/doc/6c11245760.html, 摘要：目的建立体外染锰细胞模型，探讨锰神经毒性的作用机制。方法：以原代培养的成熟皮层神经元为靶，据本室前期试验结果确定低中高不同浓度的锰液（分别为0.2mmol/L,0.6mmol/L,1.0mmol/L），与神经细胞共孵育。显微镜观察各组神经细胞形态学的变化，用单细胞凝胶电泳试验（SCGE）检测神经细胞的DNA损伤，以彗星细胞尾长及彗星样细胞百分率为评价损伤的指标。结果：光镜下可见不同浓度锰孵育后神经细胞形态学发生改变，单细胞凝胶电泳试验显示神经细胞DNA出现不同程度的损伤，彗星尾长及彗星样细胞百分率较对照组明显增加（P＜0.01）。尤以高浓度锰组损伤组严重，显著高于中低浓度组（P＜0.01）。结论：锰不但能引起体外培养的神经细胞外在的形态学损伤，还可导致神经细胞DNA的损伤。 关键词：锰，单细胞凝胶电泳 (SCGE)，DNA损伤 目前，随着生产工艺的改进和预防措施的加强，严重的职业性锰中毒已很少发生，但长期低剂量的锰暴露依然存在，并对接触者的潜在影响仍不可低估。慢性锰中毒是进行性的、不可逆的病变，并且锰对接触者的危害正由临床型向亚临床型转变，因而更为敏感、特异的效应指标，以早期筛检出亚临床中毒者及高危人群，是今后锰神经毒性研究中重点解决的问题。 DNA损伤是遗传毒理学的一个重要研究领域，长期不可逆转的DNA损伤累积可诱导细胞突变、畸变。单细胞凝胶电泳(Singl cells gel eletrophoresis,SCGE)又称彗星试验（comet assay），由Ostling等（1984）首创，后经Singh等（1988）进一步完善并逐渐发展起来的一种快速检测单细胞 DNA损伤的实验方法，适用于多种细胞，广泛应用于检测诱变剂、射线等对DNA的损伤、监测环境污染物对机体的遗传损害、研究毒物致癌机制等方面，具有经济、简捷、灵敏等优点，日益广泛地应用在各种诱变剂的遗传毒性检测上。鉴于此，本研究以此法检测染锰后对神经细胞遗传物质的影响，探讨锰神经毒性的机制，为锰中毒的防治提供研究基础。 1. 材料与方法 1.1 试剂 MnCl2·4H2O(购自上海生化试剂公司, AR级), Dulbcco's Modifed Eagle 培基(DMEM,高糖)及新生小牛血清购自Gibco公司(美国)，L-谷氨酰胺与多聚赖氨酸 (PL YS)购自生物工程产品公司（上海）.低熔点凝胶(LMPA)及正常熔点凝胶(NMPA)、TritonX-100、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)、Tris-HCl、溴乙锭(EB) 购自Sigma 公司（美国）其他所有试剂都达试验用的分析纯级 1.2 皮层神经元的原代培养 制备原代皮层神经元方法参照方法所述[1]. 取新生24小时内Wistar 乳大鼠，消毒后冰层上剥离大脑皮层，解剖显微镜下剔除血管、脑膜及海马组织后转入盛D-Hank’s液的玻璃瓶，机械法分离神经细胞。200um稠布筛网过滤神经细胞悬液，滤后悬液800转/分离心5 1本课题得到国家自然科学基金资助项目（项目批准号：30260095）的资助。

毒性试验整理

实验一发光细菌的急性毒性评价试验 一、实验器材 1.菌株 明亮发光杆菌（Photobacterium phosphoreum） 2.培养基 酵母膏0.5%，胰蛋白胨或多聚蛋白胨（Polypetone）0.5%，甘油0.3%，NaCl 3%，Na2HPO4 0.5%, KH2PO4 0.1%，pH6.5。固体培养基再加琼脂2%。 3.溶液、试剂及待测物质 酵母粉，蛋白胨，NaCl（AR），Na2HPO4（AR），KH2PO4（AR），甘油（AR），二甲基亚砜（AR），乙酸乙酯（AR），HCl（1M），去离子水。 4.仪器及其他用品 生物毒性测试仪；电热恒温鼓风干燥箱；振荡培养箱；DELTA 320pH计；氮吹仪；镊子，移液枪，三角锥形瓶等。 二、目的要求 1.学习了解发光细菌的急性毒性评价试验的基本原理。 2.掌握发光细菌的急性毒性评价试验的操作要领和评价方法。 三、基本原理 发光细菌是指在正常的生理条件下能够发射肉眼可见的蓝绿色荧光的细菌，这种可见荧光波长在450-490 nm之间，在黑暗处肉眼可见。不同种类发光细菌的发光机理是相同的，都是由特异性的荧光酶(LE)，还原性的黄素(FMNH2)，八碳以上长链脂肪醛(RCHO)，氧分子(O2)所参与的复杂反应，大致历程如下： FMNH2+LE→FMNH2·LE+O2→LE·FMNH2·O2+RCH→LE·FMNH2·O2·RCHO→LE+FMN+ H2O+RCOOH+光 具体来说，生物发光反应由分子氧作用，胞内荧光酶催化，将还原态的黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛氧化为FMN及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长为 407-409 nm处的蓝绿光。 发光细菌法是利用灵敏的光电测量系统测定毒物对发光细菌发光强度的影响。发光细菌含有荧光素、荧光酶、ATP等发光要素，在有氧条件下通过细胞内生化反应而产生微弱荧光。当细胞活性升高，处于积极分裂状态时，其ATP含量高，发光强度增强。发光细菌在毒物作用下，细胞活性下降，ATP含量水平下降，导致发光细菌发光强度的降低。实验显示，毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系，因而，可以根据发光细菌发光强度判断毒物毒性大小，用发光度表征毒物所在环境的急性毒性。

混凝搅拌实验操作方法

混凝搅拌试验作业指导书 混凝搅拌实验是一种模拟混合、反应、沉淀三个工艺过程的实验手段，自来水厂可以通过混凝搅拌试验选择混凝剂的品种以及混凝剂最佳投量。 一、仪器及器皿 1、六联混凝实验搅拌机（带6个原水杯）1台、电子天平1台、散射光浊度仪1台、pH计1台； 2、100mL的容量瓶2个、100mL烧杯2个、收集瓶（250mL-300mL）6个、1升量筒1个、刻度吸管（1mL、2mL、5mL、10mL）各1支； 3、10升～15升的水桶1只、玻棒2根、洗耳球1个、定时器1个，温度计1支、蒸馏水洗瓶1个。 二、混凝剂溶液的配制 取固体混凝剂约10克备用（可装在磨口试剂瓶中以避免受潮）。混凝剂溶液的浓度单位实验室常用毫克/升（mg/L）表示，生产上用于投加量计算时往往采用公斤/千立方米（Kg/Km3），这两个浓度单位是等价的，即：1mg/L=1Kg/Km3。 配制混凝剂溶液浓度的高低取决于投药量的大小，混凝搅拌机投药试管的体积一般约10毫升，所以当投药量大时应提高混凝剂的配制浓度，以保证投药试管能容纳下所投加的混凝剂溶液（投加混凝剂溶液的体积不超过9mL）。 1、1 mL=1 mg(1 mg/L）混凝剂溶液的配制 用天平准确称取0.1g固体混凝剂之于100mL烧杯中，用少量蒸馏水溶解后移入00mL 容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，即配成1mL=1mg（1mg/L）的混凝剂溶液。 2、1 mL=10 mg（10 mg/L）混凝剂溶液的配制

用天平准确称取1g固体混凝剂之于100mL烧杯中，用少量蒸馏水溶解后移入00mL 容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，即配成1 mL=10 mg（10 mg/L）的混凝剂溶液。 表1 投药量与混凝剂溶液浓度的关系 三、混凝试验模拟投药量的确定 混凝试验6个原水杯中混凝剂的模拟投药量，一种方法是根据当时生产实际投药量来确定，另外一种方法是根据形成矾花所用的最小投加量来确定。 1、根据生产实际投药量来确定6个模拟投药量 假如当时原水浊度为20NTU、投药量为5mg/L，则可以5mg/L为中心点来确定6个原水杯的投药量，即1～6号杯的投药量分别为3mg/L、4mg/L、5mg/L（中心点）、6mg/L （或以此为中心点）、7mg/L、8mg/L。 2、根据形成矾花所用的最小投加量来确定6个模拟投药量 ①确定形成矾花所用的最小投加量，在烧杯中加入200mL原水，慢速搅拌，每次增加0.5mL混凝剂溶液投加量，直至出现矾花为止，这时的混凝剂溶液量作为形成矾花的最小投加量。 ②根据得出的形成矾花最小混凝剂投加量，来确定混凝实验6个原水杯的模拟投药量。假如形成矾花最小混凝剂投加量为3mg/L,则取其1/4（即约1mg/L）作为1号杯的混凝剂投药量，取其2倍（即6mg/L）作为6号杯的投药量，用依次增加投加量相等的方法求出2-5号烧杯混凝剂投药量，即2-5号原水杯的投加量分别为2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L。 四、搅拌试验步骤

双向凝胶电泳比较三种常用蛋白质提取方法

ISS N　100727626 C N　1123870ΠQ 中国生物化学与分子生物学报 Chinese Journal of Biochemistry and M olecular Biology 2005年10月 21(5):691～694 ?技术与方法? 双向凝胶电泳比较三种常用蛋白质提取方法 翁　瑜1),2),　曾群力2),3),　姜　槐2),　许正平2),3)3 (1)浙江大学生命科学学院;2)浙江大学医学院浙江省生物电磁学重点研究实验室;3)浙江大学医学院环境基因组学研究中心,杭州　310031) 摘要　组织(或细胞)的蛋白质提取效率直接影响蛋白质双向凝胶电泳(22DE)的分辨率.为探索建立适用于人乳腺癌细胞株MCF27蛋白质提取的最佳条件,比较目前在双向凝胶电泳中常用的3种蛋白质提取方法对MCF27细胞总蛋白的提取效率.MCF27细胞经培养后,分别采用M2PER试剂、标准裂解液或含硫脲裂解液提取其总蛋白质,然后进行双向凝胶电泳,并根据凝胶上蛋白质斑点的丰度和分布特点判断所得双向电泳图谱的质量,以确定MCF27细胞蛋白质提取的相对最佳方法.结果显示,M2PER试剂法得到的图谱分辨率较低,蛋白质主要集中分布在分子量15～70kD,pH417～613的范围内;标准裂解液法得到的图谱分辨率有所提高,蛋白质分布比M2PER试剂法得到的图谱广;硫脲裂解液法得到的图谱是三者中分辨率最高的,尤其是高丰度蛋白和高分子量蛋白分离效果比前两者好.结果表明,在3种常用的蛋白质提取方法中,硫脲裂解液对细胞蛋白质的溶解性最佳,相对更适合于提取MCF27细胞的蛋白质,并与双向凝胶电泳条件更兼容. 关键词　蛋白质提取,双向凝胶电泳,MCF27,条件优化 中图分类号　Q503 Comparison of Three Protein Extraction Methods by Tw o2 Dimensional E lectrophoresis WE NG Y u1),2),ZE NG Qun2Li2),3),J I ANG Huai2),X U Zheng2Ping2),3)3 (1)College o f Life Sciences,2)Bioelectromagnetics Laboratory,3)Research Center for Environmental G enomics, Zhejiang Univer sity School o f Medicine,Hangzhou　310031,China) Abstract　Protein extraction from tissue or cells is a key step to achieve high2res olution protein separation in tw o dimensional electrophoresis(22DE).Three routine cellular total protein extraction methods were com pared in order to determine an optimal one for human breast cancer cell line MCF27.The cultured MCF27cells were lysed by M2PER kit,standard lysis buffer or im proved lysis buffer,respectively.Then the extracted total proteins were subjected to22DE,and the best extraction method was determined by the indexes of protein distribution and abundance on corresponding silver2stained gel.Data showed that use of M2PER kit gave the lowest res olution,in which m ost proteins were distributed in the pI ranging from417to613with m olecular weight between15kD and70kD.Standard lysis bu ffer im proved protein res olution with broader protein distribution pattern.Im proved lysis bu ffer generated the best res olution am ong these three methods,especially for the high2abundance and high m olecular weight proteins.Based on above results,we concluded that the im proved lysis bu ffer has the best protein s olubilization ability,which renders it much m ore suitable for cellular protein extraction from MCF27,and is m ore com patible with the conditions of22DE. K ey w ords　protein extraction,tw o dimensional electrophoresis,MCF27,optimization 收稿日期:2004212203,接收日期:2005203221 国家自然科学基金项目(N o.50137030,30170792),浙江省自然科学基金项目(N o.301524)和浙江省卫生厅重点项目(N o.2004Z D006)资助 3联系人　T el:0571287217386,Fax:0571287217410,E2mail:zpxu@https://www.wendangku.net/doc/6c11245760.html, Received:December3,2004;Accepted:M arch21,2005 Supported by National Natural Science F oundation of China(N o.50137030,30170792),and Natural Science F oundation of Zhejiang Province(N o.301524),and K ey Program of Health Bureau of Zhejiang Province(N o.2004Z D006) 3C orresponding author T el:0571287217386,Fax:0571287217410,E2mail:zpxu@https://www.wendangku.net/doc/6c11245760.html,

彗星实验要点

1、凋亡细胞的观察：看过国外此法作出的凋亡细胞彗星图像，很漂亮， 用CASP软件分析后，其曲线呈典型的双峰，而正常细胞为单峰。我的一些教训：观察凋亡细胞最好把电压、电流、和电泳时间均调低，否则，凋亡细胞中的DNA片断跑的太块，荧光下根本看不到凋亡细胞的尾巴。注：我用的是中性条件，20V，200mA,20min, 凋亡细胞观察宜选用10V,100mA,10min。朋友们如果有异议，请不吝赐教，也对我有所帮助。 2、 解旋20分钟应该没问题，但是我认为您的电泳时间过长，当然我不知道 您的电泳条件（电压、电流、），我认为20分钟足够了，时间长了一是浪费时间，二是彗星图像不好，不利于分析。您的裂解时间有点短了，文献报道，最好不要少于1.5小时 3、一般100ul0.5％低熔点胶中含400个细胞就足够了 4、本版【图片仓库】子版有我做的彗星图像，感兴趣可以看看 https://www.wendangku.net/doc/6c11245760.html,/bbs/post/view?bid=66&id=2729243&sty=1&tpg=1&ag e=0 5、注意，CASP只读.tif扩展名的图像，如果你的相机拍摄的图像可以有.tif 格式，就更好了，如果是.jpg格式，那还要在计算机中转换一下，不过很简单 6、首先，荧光染色的东西最好马上看，否则影响结果。 其次，您的染色液量我觉得多了点，我用2ug/ml，1ml注射器1滴就可以。第三，要忠于实验结果，图象内容不能更改，可以用ACDSEE或PHOTOSHOP 转换图象格式或大小，所以，作出来的实验图象质量要好 7、。背景的选择问题，如果图片质量好的话，背景大小不同，对结果影 响不是很大，如果图片背景乱七八糟，那背景框的选择肯定对结果产生很大影响。我的建议：背景框不要太大，参考我贴的那个图。注意，背景框可以在细胞的上面或下面，如果背景框在上面时，分析后的图像（分析后出现一个头、尾分明的图像，是基本重合在细胞上的）质量很差，很不规则，那再把背景框调到下面试试，如果还是不好，那只能说你的结果质量不好了。背景框的选择关键在于分析同一批细胞，背景框要相同，才能保持资料的可比性。 结果的保存，记得好像使用说明里提到了，如果没有提到，那就是我原创的！！！呵呵，先卖个关子。FILE菜单下有一个EXPORT RESULTS（输出结果）的按钮，点击以后，默认是.TXT文本文件，好了，给你的输出文件起个名字，选择保存位置，点击确定就OK了，回到你保存的输出结果文件，发现它是一个不可识别的文件，那就直接把它的扩展名改成.TXT，打开它，看看你的结果，包括13个指标，很好，这个.TXT的结果文件可以被SPSS统计软件直接识别，不是很方便吗？？（如果你愿意把数据一个一个地输入统计软件，我也没意见，呵呵）。这里还有一个小窍门，在用SPSS读取之前，最好把你的结果文件调整一下，这也是我发现的。把所有的指标都排列到第一行，下面的结果要和指标一一对应，每个数据之间留空格（默认的），行与行之间不要用回车，就是不要有空行，其实调整起来很简单，主要是调节.TXT文本文件阅读框的宽度。调好后，SPSS软件直接识别，很方便，为你节省很大工作量，不信就试试。 8、我用双层铺胶法，自制微电泳槽，第一层:0.75％正常熔点胶，100μl，

单细胞凝胶电泳——彗星实验方法的建立、改良与应用

陕西师范大学 硕士学位论文 单细胞凝胶电泳——彗星实验方法的建立、改良与应用 姓名：罗明志 申请学位级别：硕士 专业：动物学 指导教师：齐浩 20050501

单细胞凝胶电泳——彗星实验方法的建立、改良与应用 罗明志 摘要单细胞凝胶电泳（ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｓｉｓ，ＳＣＧＥ），又称彗星实验（ｃｏｍｅｔａｓｓａｙ），是一种在单细胞水平进行ＤＮＡ损伤的检测方法，具有简便、灵敏、快捷、样品用量小等优点，广泛用于遗传毒性检测、环境毒性检测、分子流行病学和ＤＮＡ损伤与修复等研究领域。 我们在本实验室建立了单细胞凝胶电泳技术，并对部分操作流程进行了改良，包括（１）制胶方法改良；（２）增加水洗；（３）进行梯度酒精脱水。在上述改良过程中，我们用“灌胶”法在载玻片上制胶，替代了传统的使用磨砂载玻片上“三明治”制胶，解决了彗星实验中常见的脱胶现象，脱水后有利于获得平整胶面：在裂解后增加了水洗步骤，以消除裂解液中的高盐和去垢剂对后续实验操作的影响；采用直流稳压电源进行单细胞电泳，保证了实验结果的可重复性；对染色的条件进行了筛选，确定了使用ＥＢ作为细胞ＤＮＡ的荧光染料；以ＣＡＳＰ（免费）作为彗星图像的分析软件，建立了图像分析的方法。这些实验步骤的改良以及实验流程的优化或标准化．简化了操作程序，节省了时间，并使结果分析更加简便。 为了验证上述改良后的实验系统是否可靠，我们用紫外线作为损伤因子处理细胞，诱导细胞ＤＮＡ损伤，然后用彗星实验检测这一损伤。从这～阳性模型的结果分析来看，发现细胞损伤呈现出很好的时间依赖性，表明该实验系统的可靠性。我们同时筛选并评价了彗星实验中有关的ＤＮＡ损伤分析指标，发现ＴａｉｌＬｅｎｇｔｈ，ＣｏｍｅｔＬｅｎｇｔｈ，ＴａｉｌＭｏｍｅｎｔ和ＯｌｉｖｅＴａｉｌＭｏｍｅｎｔ作为ＤＮＡ损伤的评价指标比较可靠。 我们建立了肝细胞的组织块原代培养系统。在建立肝细胞组织块原代培养实验流程中，我们对实验的各个步骤，例如组织块贴壁需要的时间、细胞生长所需的培养基种类、培养基添加剂以及动物组织供体年龄等进行了筛选，建立了小鼠肝细胞组织块的原代培养系统。 我们用单细胞凝胶电泳方法对磁场和抗癌药物对人自血病细胞Ｋ５６２以及小鼠原代肝细胞的ＤＮＡ损伤进行了检测。结果发现，Ｋ５６２细胞在９ｍＴ稳恒磁场中处理１２ｈ即可引起细胞的ＤＮＡ损伤，这一损伤随处理时间的延长而增加，具有时间依赖效应；同样条件下对原代肝细胞的处理以及更长时间的处理（３６ｈ、４８ｈ、７２ｈ）均未发现细胞的ＤＮＡ损伤。在使用较低浓度紫杉醇（５０ｎｇ／ｍＬ）处理Ｋ５６２细胞１２ｈ后，即可导致细胞ＤＮＡ损伤，并表现出时间依赖效应，而仅在高浓度长时阳Ｊ的紫杉醇（８００ｎｇ／ｍＬ，２４ｈ）处理下才会引起肝细胞的ＤＮＡ损伤。８００９９／ｍＬ环磷酰胺处理Ｋ５６２细胞１２ｈ即可引起细胞的ＤＮＡ损伤，而在１２００９９／ｍＬ时方才引起肝细胞的ＤＮＡ损伤。 关键词：单细胞凝胶电泳；ＤＮＡ损伤：ＵＶ；细胞培养；磁场；抗癌药物

药物毒理学考试要点

名词解释 1.血脑屏障：是指血液-脑组织间液和血液-脑脊液间的屏障，由血液-脑屏障、脑脊液-脑屏 障和血液-脑脊液屏障三个屏障构成。 2.内分泌系统：是一种整合性的调节机制，通过分泌特殊的化学物质来实现对有机体的控 制与调节。 3.药物依赖性：也称药物成瘾性，是精神活性物质与机体长期相互作用下造成的一种精神 状态（有时也包括身体状态），表现为强制性地连续不断地使用该药物的行为和其他反应，目的是去感受该药物所产生欣快性精神效应，或是为了避免由于停用该药物引发的戒断症状所带来的严重不适感。 4.直接致癌物：指进入机体后不需经代谢活化，直接与细胞生物大分子（DNA、RNA、蛋 白质）作用而诱发细胞癌变的化学物质。 5.间接致癌物：指进入机体后需经细胞内微粒体混合功能氧化酶系统等代谢活化后才具有 致癌性的化学物质。 6.促癌物：此类物质本身并无致癌性，严格的说不属于致癌物，但它可以与致癌物协同作 用，诱发突变细胞克隆扩增，促进癌的发生；或在致癌物作用之后，反复作用与细胞，加速癌细胞发展成为癌瘤。 7.促癌剂：具有促癌作用的物质，通过促进突变细胞的克隆扩增而发挥致癌作用。 8.前致癌物：未经代谢活化的间接致癌物称为前致癌物或原致癌物。 9.辅致癌物：有些化学物质既非引发剂，也非促长剂，本身并不致癌，但能增强引发剂和 促长剂的作用，即能加速致癌作用的过程。 10.药物的暴露：通过对暴露、时间依赖性的靶器官剂量与毒性作用关系研究解释毒性作用

机制。 11.急性毒性试验：又称单次给药毒性试验，系研究实验动物一次或24小时内多次给予受 试物后一定时间内所产生的毒性反应，观察期至少为14天。 最大耐受剂量（浓度）：（MTD）指动物能够耐受的而不引起动物死亡的最高剂量。 最小致死剂量（浓度）：（MLD）引起个别受试动物出现死亡的剂量 LD50：（半数致死量）预期引起50%动物死亡的剂量，该值是经统计学处理所推算出的结果。 12.长期毒性实验：又称重复给药毒性试验，是研究实验动物重复给予较大剂量的受试物后 产生的毒性反应特征，药物非临床安全性评价的重要内容。 13.一般生殖毒性实验：在雌雄动物交配前的交配期直至胚胎着床给药，评价受试药物对动 物生殖的毒性干扰作用，即生殖过程的第一阶段试验。 14.致畸敏感期毒性试验：妊娠动物自胚胎着床至硬腭闭合阶段给药，评价受试药物对妊娠 动物、胚胎及胎仔发育的影响。致畸敏感期毒性试验即生殖过程的第二阶段试验。15.围生期毒性试验：从胚胎着床到幼仔断奶这段时期给药，检测受试药物对妊娠及哺乳动 物、胚胎发育以及子代出生后生长发育的不良影响。围生期毒性试验即生殖过程的第三阶段试验 16.光敏反应：指皮肤对光线敏感产生的不良反应，是由某些药物（化学药物）与皮肤接触、 经特定波长的光照后引起的皮肤损伤。 17.靶点：医学上进行某些放射治疗时，放射线从不同方位照射，汇集病变部位，这个病变 部位叫做靶点。 18.靶部位：药物吸收进入机体分布于全身，通常仅对其中某些部位造成损害，被药物造成 损害的部位叫靶部位。

凝胶电泳实验报告模板

凝胶电泳实验报告模板

降低了对流运动，故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩擦系数是分子的大小、极性及介质粘度的函数，因此根据分子大小的不同、构成或形状的差异，以及所带的净电荷的多少，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基因呈离子状态从这种意义上讲，D N A 和RNA多核苷酸链可叫做多聚阴离子( Polyanions ) 。因此，当核酸分子被放置在电场中时，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖- 磷酸骨架结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因而它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型，分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA 分子迁移要快些。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。 聚丙烯酰胺凝胶电泳，普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。琼脂糖凝胶孔径较大适用于分离同工酶及其亚型，大分子核酸等应用较广。琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。 3.1 凝胶电泳的分类 按照分离物质来分凝胶电泳可以分为核酸凝胶电泳和蛋白质凝胶电泳；按照分离介质来分可以分为琼脂糖凝胶电泳技术和PAGE凝胶电泳。本次实验我们采用按介质的分类方法来学习的。 3.1.1琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他

彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验

彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验，是由Ostling等于1984年首次提出的一种通过检测DNA链损伤来判别遗传毒性的技术。它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越大，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。同时，这种技术只需要少量细胞。 彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验，是由Ostling等于1984年首次提出的一种通过检测DNA链损伤来判别遗传毒性的技术。它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越大，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。同时，这种技术只需要少量细胞。 我最近做彗星实验，总是解决不了脱胶问题，要么是铺第二三层胶的时候第一层胶就松动，要么侥幸没动，在裂解、解旋、电泳、中和过程中都会出现胶脱落的现象，我愁死了，不知道是什么原因？我的步骤这样，请帮我分析分析好吗？ 1.5%正常熔点琼脂糖120微升乘热滴于磨砂载玻片上，盖玻片，4度20分钟，0.8%低熔点琼脂糖和 细胞混合液80微升，0.8%低熔点琼脂糖80微升铺第二、三层胶，裂解液和电泳液中和液都按配方来

彗星实验

彗星实验 彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验。 实验原理：它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到电解液中，而核DNA由于分子量太大不能进入凝胶而留在原位。在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成"彗星"状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越大，在相同的电泳条件下迁移的DNA 量就愈多，迁移的距离就愈长。通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。同时，这种技术只需要少量细胞。 实验材料： 玻片、琼脂糖、细胞裂解液、碱性解链溶液（PH>13,200mM NaOH,1Mm EDTA）、电泳槽、超纯水、DAPI、PBS、荧光显微镜。 实验步骤： 1.制片：配制1%的琼脂糖凝胶，于微波炉中加热融化后，浸泡磨砂玻片，用吸水纸将玻 片滑面及四周吸干，自然晾干备用； 2.细胞处理：将细胞消化收集，离心后吸弃上清，用预冷的1*PBS清洗细胞一次，以1*10^5 细胞/ml悬浮细胞；

3.铺胶：将细胞与凝胶以一定的比例（1：10）混匀后迅速滴于玻片上，在显微镜下观察 细胞的数目（注意调整比例及铺板均匀），4℃黑暗环境中固化10min； 4.裂解：轻轻取出玻片，将玻片浸于预冷的细胞裂解液中，4℃避光裂解30-60min; 5.解旋：从裂解液中取出载玻片，用PBS浸泡玻片3次，每次3mim,用纸巾吸去玻片上 的液体，置于水平电泳槽，加入新鲜配制的碱性电泳缓冲液至高于玻片表面3mm以上，避光解旋30min; 6.电泳：电压30V,电流300Ma,电泳30min。 7.漂洗及染色：电泳完毕，取出玻片，用PBS浸泡2次，每次15min,以中和强碱。滴加 DAPI染色，立即置于荧光显微镜下观察。 结果观察： 荧光显微镜下20倍波长，激发波长377nm，发射波长477nm。每一个视野观察50个细胞，记录拖尾细胞数。计算拖尾细胞率=（拖尾细胞数/50）*100%。每个视野用目镜测微尺测量30个细胞的全长和头长，拖尾细胞尾长（TL）=全长-头长，计算各剂量组的平均尾长。