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miRNA与传染病

miRNA与传染病
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miRNA与传染病

【摘要】miRNA是一类新发现的内源性非编码小RNA,能够作用靶mRNA调控基因的表达。近来有研究发现miRNA与一些传染病的发生发展有着密切的联系,表明可以将miRNA 作为一种新的研究思路应用于传染病的诊断治疗。本文将对近几年国内外关于miRNA在传染病感染致病过程中的作用以及其应用与传染病临床诊断治疗的相关研究进行综述。

【关键词】传染病;miRNA;生物标志;诊断与治疗;筛查

传染病是一类严重威胁人类健康的疾病,近几年各种新发传染病的出现更是使得传染病成为热门的研究领域。miRNA作为一种新型基因调控分子,其在疾病的发生发展过程中具有非常重要的作用。近来有研究表明,miRNA在传染病感染致病过程中呈现特异性表达,与传染病发生有着密切的联系,现对两者关系进行阐述。

1miRNA概述

miRNA是一类内源性长约~22nt能够进行转录后调控的非编码小分子RNA。它通过碱基互补配对结合靶mRNA 3’-UTR端引起靶基因降解或抑制来进行基因的转录后调控[1]。自1993年首次被发现[2]至今短短十几年的时间,miRNA已成为科学研究的热点,其在生物体内的生成过程、生物学功能特征相继被研究报道。

1.1miRNA生物合成与基因调控机制

miRNA生物合成可分为三个阶段,第一阶段RNA聚合酶Ⅱ作用miRNA转录基因合成pri-miRNA,第二阶段pri-miRNA被核糖核酸酶Drosha剪切加工成长约60~70nt的具有茎环结构的pre-miRNA,第三阶段核内蛋白载体将pre-miRNA运送到细胞质中经核糖核酸酶Dicer 剪切加工为成熟的miRNA进而与细胞质RISC结合形成基因沉默复合物调控基因的表达[3]。其调控基因表达的机制主要是成熟miRNA与RISC形成的复合物特异性识别靶信使RNA的3’端非转录区域,通过碱基配对与靶基因的靶位点结合。其结合的方式分为完全配对和不完全配对,根据结合的方式不同,相应的调节效应也不同。miRNA复合物完全结合靶基因可导致靶基因裂解,不完全结合沉默靶基因的表达,最终达到基因调控的目的。

1.2miRNA功能特征

至今已发现的人类miRNA数量达上千种之多,调控着人类超过三分之一的基因表达。miRNA对细胞的增殖、分化、凋亡、炎症反应和免疫应答等生物过程具有重要的调控作用[4]。Reinhart BJ 等人在研究C.elegans幼虫发育中发现在不同的发育阶段lin-4和let-7两种miRNA 呈现特异性表达[5]。除表达特异性外miRNA在其进化过程中还呈高度的保守性,Lagos-Quintana等人研究发现miRNA不仅在大部分动物同源品系中序列具相似性而且在一些种系较远的动物中也发现的了miRNA相应的保守区域[6]。该特性已被广泛用于miRNA检测及新miRNA的发现。此外miRNA在分布上还表现一定的组织特异性,如miR-122主要存在有肝脏中,miR-124主要存神经组织中[7,8]。miRNA相较于mRNA来说其还可稳定的存在于体液环境中。近几年研究表明miRNA大量存在于由细胞分泌的微囊体中进行细胞间基因交流,

调控各类生理病理过程,该种miRNA也被称为循环miRNA,其可以稳定存在于人体多种体液中[9]。循环miRNA的发现使得miRNA作为一种非侵入性的易获取的疾病生物标志成为可能,为临床疾病研究提供了新思路。

miRNA在基因调控中所表现出来的种种特性,已经被广泛应用于临床医学实践中。近几年,其在传染病感染、诊断和控制方面的研究不断兴起。以下将对miRNA在传染病领域的研究做一个详细的阐述。

2 miRNA与传染病

传染病一直是威胁人类健康的主要疾病之一,虽然随着卫生条件的改善和科学技术的发展,许多传染病得到了很好的控制和消除,但仍然还有许多传染病难题未能攻克,如HIV感染、SARS病毒感染等。miRNA分子作为一种新型基因调控分子为攻克传染病难题注入了新活力。

2.1miRNA—传染病感染的潜在标志

miRNA作为一种潜在的早期诊断的生物标志,已经在多种病原微生物所引起传染性疾病研究中得到了证实。Gupta, A等人在研究miRNA与HIV-1的关系中发现多种参与细胞周期、凋亡、T细胞信号以及免疫活性等途径有关的miRNA表达发生特异性改变,提示miRNA有作为HIV-1感染早期生物标志的可能性[10]。Kawano, Y等人在研究慢性EB病毒感染与miRNA 关系中发现CAEBV感染患者血浆miR-BART1-5p, 2-5p, 5, 和22表达水平显著增高,并证明血浆miR-BART1-5p, 2-5p, 5, 和22的表达水平与CAEBV感染具有一定的相关性,可潜在的作为判断CAEBV感染及感染严重程度的生物标志物[11]。Qi, YM等人在登革热病毒感染患者外周单核细胞中也发现了特异性的miRNA表达[12]。

除病毒传染病外,细菌性传染病中也发现了一系列特异性的miRNA表达。Qi, YH等人在探索肺结核早期miRNA表达水平变化中发现三种miRANs (miR-361-5p, miR-889 和miR-576-3p)可以较好的将活动肺结核病人与健康对照和其他微生物感染区分开来,表明血清miRNA作为一种非侵入性的肺结核早期检测的生物标志具有极大的潜能[13]。Wang, C等人则在研究肺结核从潜伏期到活动期转变过程中miRNA的特异性表达中发现17种miRNAs表达水平发生特异性的改变并证实其中一些miRNA控制着重要的肺结核感染基因表达,可作为潜伏期肺结核向活动性肺结核转变的生物标志物[14]。Ge, YY等人在百日咳患者血清中发现5种miRNAs( miR-202, miR-342-5p, miR-206, miR-487b, miR-576-5p)表达水平显著增高,其对百日咳诊断特异性、灵敏度分别高达94.3 %,97.4 %[15]。综合以上研究成果,可见miRNA与传染病感染存在着密切联系,预示着miRNA分子在特异性筛查和诊断传染性疾病方面具有巨大的潜能。但目前传染病miRNA的研究还处于一个初级阶段。随着研究的不断进行,相信会有越来越多与传染病相关的特异性miRNA被发现。

2.2miRNA在传染病感染过程中的生物功能

miRNA的异常表达涉及多种疾病的发生,在传染性病原体侵入宿主细胞导致一系列疾病症状的过程中miRNA也起着至关重要的作用。查阅近几年miRNA与病原体感染相关文献,miRNA在病原体感染宿主细胞过程中可扮演两种不同的角色。一些研究报道显示有些miRNA 可作为病原体在体内感染的助手,帮助病原体在宿主体内繁殖,逃避宿主细胞的免疫防御。Mallick, B等人在研究SARS病毒感染支气管肺泡干细胞(BASCs)的分子机制中发现SARS病毒可上调BASCs中的miRNAs-17*, miR-223-574-5p, 和miR -214来抑制自身的复制逃避体内的免疫清除直到感染成功[16]。Hu, J等人发现miR-122可与HCV基因组5'-UTR端两个结合位点特异性的结合,提高病毒RNA的稳定性,促进HCV病毒在宿主细胞中的复制[17]。Fukuhara, T等人研究证实了这一发现[18]。另一方面有些原本是参与调控宿主免疫防御miRNA,由于

受到病原体的调节修饰改变其调控功能或抑制其表达。Bakre A等人在研究呼吸道合胞病毒与宿主细胞之间的作用机制中发现呼吸道合胞病毒可修饰miRNA分子,调控人肺泡上皮细胞中介导细胞周期、趋化因子、细胞因子信号抑制的Let-7miRNA家族,影响宿主的免疫防御功能。Xu, F等人在研究金黄色葡萄球菌感染分子机制也发现金黄色葡萄球菌通过诱导蛋白激酶B/Akt1的信号和miRNA-155使巨噬细胞失去抗菌活性,引发宿主感染[19]。以上研究成果表明miRNA在传染病病原体感染过程具有重要的作用。

2.3miRNA在传染病治疗控制中的重要作用

随着一些传染病中miRNA生物功能的发现,基于miRNA的传染病治疗及疫苗的研究也相应的得到发展。如根据miR-122是HCV病毒感染复制的必须成分,可以通过下调miR-122表达抑制病毒的复制达到HCV治疗的目的。目前一种以miR-122为靶向的药物已经开始应用于HCV治疗的临床试验[20]。Rogers, JV等人发现一些特异性的miRNA表达与H5N1感染有着密切的关系,可潜在性作为H5NI感染治疗的药物靶[21]。Ibrisimovic, M等人研究发现人工miRNA表达和西多福韦联合可有效抑制野生型腺病毒复制,达到治疗的效果[22]。miRNA应用于传染病的治疗,较于传统的RNA干扰治疗,可以在一定程度上抑制病毒的免疫逃逸。Heiss BL等人在研究神经黄病毒感染中就发现通过在病毒基因组3’非编码区插入多个同时识别的基于脑组织表达的miRNA靶序列,可以有效阻止病毒的逃逸[23]。

3 传染病miRNA的检测

无论是研究miRNA在传染病中的生物标记作用,还是感染机制和治疗的研究,都离不开miRNA检测技术的支持。查阅相关文献,我们可以看到传染病miRNA研究的主要思路跟其他疾病miRNA研究一致:首先根据研究目的设计临床试验;然后对临床试验中所采集到的样本进行miRNA检测分析;最后对试验数据进行分析并结合实际做出准确结论[10-14]。其中实验室miRNA的检测是整个研究中关键的步骤。miRNA的内在性质如分子量小、低丰度、同源分子差异小、缺乏扩增的共同序列等性质决定了其实验室检测必将面临严峻的考验。经过十几年的不懈探索,这些技术难题被逐渐克服,发展了一系列新的miRNA 检测技术。有些技术已经很普遍的应用于miRNA的检测,如基因芯片技术、新一代深度测序、qPCR技术等。以下我们将从大规模miRNA筛查和miRNA确证试验两方面对现阶段比较成熟的miRNA 检测技术进行介绍。

3.1 大规模miRNA的筛查

目前应用较多的miRNA表达谱分析方法有基因芯片技术、新一代深度测序、q-PCR阵列。这几种方法均具有高通量、快速等优点,基于检测原理和检测方式的不同,其有各自的特点。其中miRNA基因芯片应用较为广泛,它是基于核酸杂交原理发展而来的。该方法除具有高通量快速的优点外,与传统的杂交技术相比具有较高的灵敏度[24]。不过该技术仍存在着一些待解决的难题,如在一张芯片上很难同时满足多种miRNA杂交所需的条件,这样在一定程度上影响基因芯片的特异性和灵敏度。故基因芯片筛查的miRNA数据还需验证[25,26]。miRNA深度测序是基于测定miRNA核苷酸序列分析miRNA表达谱的方法。2007年,新一代深度测序技术出现弥补了传统深度测序技术费时的缺点,在短时间可同时进行上百万个基因序列的读取,这大大缩短了检测的时间[27,28]。同时也促进了其在miRNA表达分析中的应用。该种方法需要先从目标RNA样本中制备cDNA文库用于分子测序,然后运用相应的数据分析软件对miRNA进行定性定量分析。与基因芯片检测方法相比,新一代深度测序克服了背景噪声和交叉杂交等难题,不过该技术相对花费较高[29,30]。

qPCR技术由于其较高的灵敏度和特异性,已经被广泛的用于miRNA分子的检测。不过

通常说的qPCR是针对少量miRNA检测,面对大量miRNA检测时,应用普通的qPCR检测平台技术较繁琐。于是针对大量miRNA的筛查的qPCR阵列应运而生。该阵列检测的原理与qPCR类似,不同点在于它可以同时进行多个qPCR反应,对多种miRNA表达进行分析。这个检测技术的灵敏度特异度均较高,费用适宜,是一种较好的高通量miRNA 表达谱分析方法[31]。

3.2qPCR验证

qPCR被认为是现今miRNA检测方法中的金标准,该方法具有较好的特异性和灵敏度。该方法能够区分单个碱基差别的miRNA序列,灵敏度极高。qPCR通过设计特异性的逆转录引物使成熟miRNA逆转录为cDNA应用TaqMan 或SYBR Green 检测技术进行定性定量分析。其中常用的逆转录引物主要有两种,一种是是针对特定的miRNA序列设计带有5’末端的可以和miRNA3’端杂交的stem-loop引物,另一种为针对所有miRNA设计的带有通用多聚A尾的引物。根据采用逆转录引物的不同,我们将qPCR分为stem-loop RT-qPCR和poly(A)尾RT-qPCR。两种方法比较有,stem-loop RT-qPCR是针对特定miRNA设计的,特异性相对较好,但引物设计较困难,对于低丰度的miRNA检测效能没poly(A)尾RT-qPCR好。poly(A)尾RT-qPCR 引物设计方便,可以无需已知miRNA的序列即可进行逆转录,但是该方法不能用于检测带有发夹结构的miRNA[31-36]。

4 小结

自1993miRNA在线虫中被发现,其神秘的面纱被一层层揭开。许多研究都证实了miRNA 在真核生物生长发育中的基因调控作用,以及在疾病诊断、治疗、预后判断中的潜在作用。这些研究对miRNA在疾病领域的重要地位给予了充分的肯定,也促进miRNA向传染病研究领域的发展。目前传染病中miRNA的研究主要处于筛查传染病诊断治疗相关的miRNA生物标志阶段,且相应的传染病病种研究范围也还比较局限。在miRNA检测技术方面,现有的几种检测技术相对还比较成熟,不过仍存在不足。与此同时多种非标记的高通量的microRNA 检测方法得到发展,其中大多数是基于纳米技术、表面等离子共振(SPR)、改进的Raman 光谱技术等。虽然这些方法还未能普及,随着一个个技术瓶颈被攻破,基于非标记的、高灵敏度、快速、高通量的miRNA检测方法将会成为一种趋势。届时更多的miRNA与传染病的关系将会被发现,为克服当今传染病难题提供新思路。

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真核细胞常见表达载体

真核细胞常见表达载体 真核细胞, 表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对,主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成,在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是,由于该真核细胞表达载体中抗neo 基因存在,转染细胞后,用G418筛选,可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白,在PCMV启动子驱动下,在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成,能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外,载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制,而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点,将外源基因扦入这些位点,将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因,在PCMV启动子驱动下,在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin 抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成,能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外,载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制,而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白,该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白,因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点:该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的,克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因,故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。 5、CMV4 表达载体 特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动,多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是,该表达载体不含有neo基因,转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector: pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug 说明: pBluescript II kS、pUC18 &Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等。这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点,当外源DNA片段扦入,转化lacZ基因缺乏细胞,并在含有IPTG和X-gal的培养基上培养时,含有外源DNA载体的细胞将

各种表达载体

表达载体 一、原核细胞表达载体 1. pBAD载体: 特点; 该表达质粒含有araBAD(arabinose)操纵子的P BAD启动子和编码该启动子的正负调控子基因araC,具有紧密调控功能和高水平表达外源蛋白质的原核细胞表达载体。 请注意: 1. 当要扦入其他信号肽片段,改建此载体时,请不要利用该载体上的Nde1 EcoR1 BamH1 Kpn1和 Pst1位点,以免造成重组困难,因为前述内切酶在此载体上均有二个位点,最好使用只有一个酶切位点的Sac1和Hind111位点。同时记住,如在不含任何信号肽的P BAD表达质粒扦入信号肽,其非编码N- 末端要包含核糖体结合位点(RBS)核苷酸序列。 2在使用含Omp A分泌信号肽的P BAD表达质粒时,请应用Omp A分泌信号肽上的Sac1以及载体Hind111酶切位点,这些在载体序列上都是单个酶切位点。 本公司目前有含Omp A分泌信号肽和不含任何信号肽的二种P BAD表达质粒,其多克隆位点区域图谱如下: (a)、含Omp A分泌信号肽的P BAD表达质粒多克隆区域 SD P BAD….TACCCGTTTTTTT CC….GCTAGCAGGAGGAAACG ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT A M A E L TTC GCT ACC GTA GCC ATG GCC GAG CTC GGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTT Nco1 Sac1 Kpn1 Smal1 BamH1 (b)、不含分泌信号肽的P BAD表达质粒多克隆区域 Pst1 P BAD GCTAGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTT Nde1 Sac1 Smal 1 Hind111 下图显示本公司应用pBAD表达载体完成的实验结果: pBAD载体驱动大分子蛋白质在原核细胞 Origami(DE3)内高效表达 2. pCAl-n & pCAl-pelB载体 特点: 该原核细胞表达载体是来源于以T7 RNA聚合酶为基础的pET载体, 含有T7/LacO启动子、编码钙调素结合多肽标鉴和凝血酶切点的核苷酸序列。 因此,该表达载体在E.coli BL21(DE3)或BL21(DE3)pLysS宿主菌中能高水 平表达外源蛋白质、且这种表达的外源蛋白质因带有钙调素结合多肽和凝血 酶切点,故该蛋白产物易于纯化和产业化。 此外,本公司利用分泌信号肽PelB,构建成新型的的原核细胞表达载体Pcal-PelB。此载体表达的蛋白产物能在分泌肽PelB的指引下进入细胞周质。

真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体

真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体 标签:真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统 摘要: 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统,由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷,人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统,由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷,人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 自上世纪70年代基因工程技术诞生以来,基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行,在技术方法上得到了很大发展,时至今日已取得令人瞩目的成就。随着人类基因组计划的完成,越来越多的基因被发现,其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。 在各种表达系统中,最早被采用进行研究的是原核表达系统,这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌),通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物,而且所需的成本相对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点:如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控,有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用,过量表达可能导致非生理反应,目的蛋白常以包涵体形式表达,导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善,表达产物的生物活性较低。 为克服上述不足,许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域,其优点是: ①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计,而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性,故不存在基因的非特异性激活或抑制; ②能诱导基因高效表达,可达105倍,为其他系统所不及; ③能严格调控基因表达,即不仅可控制基因表达的“开关”,还可人为地调控基因表达量。 因此,利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前,基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。 1.酵母表达系统 最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母,后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等,其中,甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha,Candida Bodini,Pichia Pastris3种。以Pichia Pastoris应用最多。

各种表达载体介绍

pET 载体中,目标基因克隆到 T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下,并通过在宿主细胞提供 T7 RNA 聚合酶来诱导表达。 Novagen 的 pET 系统不断扩大,提供了用于表达的新技术和选择,目前共包括 36 种载体类型、 15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。 优点 · 是原核蛋白表达引用最多的系统 · 在任何大肠杆菌表达系统中,基础表达水平最低 · 真正的调节表达水平的“变阻器”控制 · 提供各种不同融合标签和表达系统配置 · 可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌 · 许多载体以 LIC 载体试剂盒提供,用于迅速定向克隆 PCR 产物 · 许多宿主菌株以感受态细胞形式提供,可立即用于转化 阳性 pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆 PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。 pET 系统概述 pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由 Studier 等开发的 T7 启动子驱动系统, Novagen 的 pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。 控制基础表达水平 pET 系统提供 6 种载体 - 宿主菌组合,能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白,所以进行优化选择是必要的。 宿主菌株 质粒在非表达宿主菌中构建完成后,通常转化到一个带有 T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌(λDE3 溶原菌)中表达目标蛋白。在λ DE3 溶原菌中, T7 RNA 聚合酶基因由 lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录,因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有 pLysS 和 pLyE 时调控会更严紧。 pLys 质粒编码 T7 溶菌酶,它是 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物,因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。 pLysS 宿主菌产生低量 T7 溶菌酶,而 pLysE 宿主菌产生更多酶,因此是最严紧控制的λ DE3 溶原菌。 有 11 种不同DE3 溶原化宿主菌。使用最广泛的为 BL21 及其衍生菌株,它的优点在于缺失 lon 和 ompT

表达载体的构建方法及步骤

表达载体的构建方法及步骤 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前,载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。 一个合格质粒的组成要素: (1)复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。 (2)抗生素抗性基因可以便于加以检测,如 Amp+ ,Kan+ (3)多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段 (4) P/E 启动子/增强子 (5)Terms 终止信号 (6)加 poly(A)信号可以起到稳定 mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的,同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因,则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点: 【1】构建 DNA 重组体的目的,克隆扩增/基因表达,选择合适的克隆载体/表达载体。 【2】.载体的类型: (1)克隆载体的克隆能力-据克隆片段大小(大选大,小选小)。如<10kb 选质粒。 (2)表达载体据受体细胞类型-原核/真核/穿梭,哺乳类细胞表达载体。

(3)对原核表达载体应该注意:选择合适的启动子及相应的受体菌,用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位;表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。 【3】载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异,适应目的基因与载体易于链接,不能产生阅读框架错位。 综上所述,选用质粒(最常用)做载体的5点要求: (1)选分子量小的质粒,即小载体(1-)→不易损坏,在细菌里面拷贝数也多(也有大载 体); (2)一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束,一般 10个以上的拷贝,而严谨型质粒<10个。 (3)必需具备一个以上的酶切位点,有选择的余地; (4)必需有易检测的标记,多是抗生素的抗性基因,不特指多位 Ampr(试一试)。(5)满足自己的实验需求,是否需要包装病毒,是否需要加入荧光标记,是否需要加入标签蛋白,是否需要真核抗性(如Puro、G418)等等。 无论选用哪种载体,首先都要获得载体分子,然后采用适当的限制酶将载体 DNA 进行切割,获得线性载体分子,以便于与目的基因片段进行连接。 如何阅读质粒图谱 第一步:首先看 Ori 的位置,了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒) 第二步:再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记。 (1)Ampr 水解β-内酰胺环,解除氨苄的毒性。 (2)tetr 可以阻止四环素进入细胞。 (3)camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。 (4)neor(kanr)氨基糖苷磷酸转移酶使 G418(长那霉素衍生物)失活 (5)hygr 使潮霉素β失活。

所有质粒载体汇总

酿酒酵母表达载体 pYES2,pYES2/NT,pYES2/CT,pYES3,pYES6, pYCplac22-GFP, 酵母载体pAUR123,pRS303TEF,pRS304, pRS305,pRS306,pY13TEF,pY14TEF pY15TEF, pY16TEF, 酵母基因重组表达载体pUG6, pSH47, 酵母单杂载体pHISi,pLacZi,pHIS2, pGAD424,酵母双杂交系统:酿酒酵母Y187, 酿酒酵母AH109;质粒pGADT7,pGBKT7 ;对照质粒pGBKT7-53 , pGBKT7-lam , pGADT7-T , PCL1,酿酒酵母菌株INVSc1,YM4271, AH109,丫187,丫190, 毕赤酵母表达载体 pPIC9K,pPIC9K-His,pPIC3.5K,pPICZalphaA,B,C,pPICZA,B,C,pGAPZ a A,pAO815,pPIC9k-His,pHIL-S1,pPink hc , 配套毕赤酵母Pichiapink, 毕赤酵母宿主X33, KM71 , KM71H , GS115, 原核表达载体pQE30,31,32,40,60,61,62等原核表达载体,包括pET系列,pET-GST, pGEX 系列(含GST标签),pMAL 系列pMAL-c2x,-c4x,-c4e,-c5x,- p5x,pBAD,pBADHis,pBADmycHis 系列,pQE 系列,pTrc99a,pTrcHis系列, pBV220,221,222,pTXB 系列,pLLP-ompA,pIN-III-ompA (分泌型表达系列),pQBI63 (原核表达带荧光)pET3a, pET 3d, pET 11a, pET 12a, pET 14b, pET 15b, pET 16b, pET 17b, pET 19b, pET 20b, pET 21a,b,d, pET 22b, pET 23a, pET 23b, pET 24a,b, pET 25b, pET 26b, pET 27b, pET 28a,b, pET 29a, pET 30a, pET 31b, pET 32a, pET 35b, pET 38b, pET 39b, pET 40b, pET 41a,b pET 42a, pET 43.1a,b pET 44a, pET 49b pET302,303 pET His,pET Dsb,pET GST,pET Trx pQE2, pQE9 pQE30,31,32, pQE 40 pQE70 pQE80L pQETirs system pRSET-A pRSET-B pRSET-C pGEX4T-1,-2,-3,5x-1,6p-1,6p-2,2tk,3c pBV220,221,222 pTrcHisA,B,C pBAD24,34,43 pBAD HisA,B,C pPi nPoi nt-Xa1,Xa2,Xa3 pMALc2x, p2x pBV220 pGEM Ex1, pGEM7ZF (+) , pTrc99A, pTwin1, pEZZ18 pkk232-8,pkk 233- 3,pACYC184,pBR322,pUC119 pTYB1,pTYB2,pTYB4,pTYB11 pBlueScript SK (+) ,pBlueScript SK (-) pLLP ompA, pINIIIompA, pMBP-P ,pMBP-C,大肠杆菌冷激质粒:pColdI pColdII pColdIII pColdTF原核共表达质粒:pACYCduet-1,pETduet- 1,pCDFduet-1, pRSFduet-1 Takara公司大肠杆菌分子伴侣:pG-KJE8 pGro7 pKJE7 pGTf2 pTf16 大肠杆菌宿主细胞:DH5a JM101 JM103

(整理)克隆载体与表达载体

一部分:概念解析 二部分:问题解答 克隆载体:大多是高拷贝的载体,一般是原核细菌,将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接,再导入原核细菌内,质粒会在原核细菌内大量复制,形成大量的基因克隆,被克隆的基因不一定会表达,但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段,这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。 克隆载体(Cloning vector ):携带插入外源片段的质粒或噬菌体,从而产生更多物质或蛋白质产物。(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。) 其中,为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。 是否含有表达系统元件,即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号,这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。 表达载体:有的是高拷贝的,有的是低拷贝的,各有各的用处,是一些用于工程生产的细菌,被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达,生产出我们需要的产物,导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率,一般因为具有强的启动子。 表达载体(Expression vectors)就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等),是目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中,有一个杂合tac强启动子和终止子,在启动子下游有RBS位点(如果利用这个位点,要求与ATG之间间隔 5-13bp),其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。 (RBS位点:1974年Shine和Dalgarno首先发现,原核生物,在mRNA上有核糖体的结合位点,它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3~10 bp处的由3—9bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸,刚好与16S rRNA 3,末端的富含嘧啶的序列互补,是核糖体RNA的识别与结合位点。根据发现者的名字,命名为Shine-Dalgarno序列,简称S-D序列。 由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3’端一部分序列互补,因此S-D序列也叫做核糖体结合序列。 真核生物存在于真核生物mRNA的一段序列,其在翻译的起始中有重要作用。加Kozark sequence(GCCACC), Kozak sequence是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的ATG环境,避免ribosome出现leaky scan) 克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒,所以常带有较强的自我复制元件,如复制起始位点等,往往在菌体内存在多拷贝,所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成,为的是控制目标蛋白的表达,如各种启动子(T7),调节子(LacZ)等,而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的,防止渗漏表达。 克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了,不管读码框什么的,但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面,而且要表达蛋白,所以就要求你的读码框不能乱了,否则就不能得到你想到的表达产物。 1.载体即要把一个有用的基因(目的基因——研究或应用基因)通过基因工程手段送到生物细胞(受体细胞),需要运载工具(交通工具)携带外源基因进入受体细胞,这种运载工具就叫做载体(vector)。 2. 载体的分类 按功能分成:(1)克隆载体: 都有一个松弛的复制子,能带动外源基因,在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段(基因)的载体。(2)表达载体:具有克隆载体的基本元件(ori,Ampr,Mcs

真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体

标签:真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统 摘要 : 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统,由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷,人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统,由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷,人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 自上世纪70年代基因工程技术诞生以来,基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行,在技术方法上得到了很大发展,时至今日已取得令人瞩目的成就。随着人类基因组计划的完成,越来越多的基因被发现,其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。 在各种表达系统中,最早被采用进行研究的是原核表达系统,这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌),通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物,而且所需的成本相对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点:如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控,有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用,过量表达可能导致非生理反应,目的蛋白常以包涵体形式表达,导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善,表达产物的生物活性较低。 为克服上述不足,许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域,其优点是: ①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计,而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性,故不存在基因的非特异性激活或抑制; ②能诱导基因高效表达,可达105倍,为其他系统所不及; ③能严格调控基因表达,即不仅可控制基因表达的“开关”,还可人为地调控基因表达量。 因此,利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前,基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。 1.酵母表达系统 最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母,后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等,其中,甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha,Candida Bodini,Pichia Pastris3种。以Pichia Pastoris 应用最多。

不同基因表达载体的优缺点 孟凡顺

不同基因表达达载体的优缺点 理化系生物技术班孟凡顺 进入21世纪以来,基因工程的发展越来越快,也越来越完整,作为新世纪生物科学前沿,基因工程的快速发展也大大的刺激了人们对科学知识的向往,走进基因工程,我们发现在基因工程的四大步骤,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将基因表达载体打入受体细胞以及目的基因的监测与鉴定,这其中最重要的是也是最繁琐的莫过于第二步基因表达载体的构建,而在基因表达载体的构建这一过程中,最重要的无疑就是目的基因导入受体细胞,将目的基因导入受体细胞的关键就是运载体的选择,在这里,我们要对运载体的种类进行介绍。 首先我们要知道什么东西可以作为运载体,作为运载体又有哪些特征? 首先,作为运载体的物质它必须可以进行自我复制,这样才可以在它与外源基因融合后,独立在宿主细胞中复制繁殖,其次有至少一个在融合外源基因后仍未被破坏的遗传表型,这便于将载体导入受体细胞后的识别与筛选,通常表现在为抗性与显色表型反应等,再次,载体上至少有一个限制性核酸内切酶的单一识别位点,这样方便了外源基因的插入,最后,要有适当的拷贝数,理论上在一定范围内,拷贝数量越多,越利于载体的制备,所有的基因工程中的表达载体都必须具有以上四个条件。 在这里,我介绍三种载体。 1质粒载体 质粒载体是基因工程中最常用的载体之一,它源于细菌,是一种源于染色体外却可以自由复制的小型环状DNA,大小在1~200Kb之间,质粒通常含有一些编码对细菌有利生存的基因也含有抗生素的抗性基因,经科学家多年的努力,人们终于对一些质粒的生物学特征有了一些了解,进行了比较详尽的研究,比如F质粒那F基因或性质粒,R质粒即抗性因子和col质粒即大肠杆菌因子。 其实,一个质粒就是一个复制子,复制子往往有宿主专一性,但奇怪的是,人们也发现了可以在两种不同宿主内复制的复制子,即可构建的穿梭载体,这种新型载体的发现,大大的推进了克隆

克隆载体与表达载体

克隆载体:大多是高拷贝的载体,一般是原核细菌,将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接,再导入原核细菌内,质粒会在原核细菌内大量复制,形成大量的基因克隆,被克隆的基因不一定会表达,但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段,这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。 克隆载体(Cloning vector ):携带插入外源片段的质粒或噬菌体,从而产生更多物质或蛋白质产物。(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。) 其中,为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。 是否含有表达系统元件,即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号,这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。 表达载体:有的是高拷贝的,有的是低拷贝的,各有各的用处,是一些用于工程生产的细菌,被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达,生产出我们需要的产物,导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率,一般因为具有强的启动子。 表达载体(Expression vectors)就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等),是目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中,有一个杂合tac强启动子和终止子,在启动子下游有RBS位点(如果利用这个位点,要求与ATG之间间隔5-13bp),其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。 (RBS位点:1974年Shine和Dalgarno首先发现,原核生物,在mRNA上有核糖体的结合位点,它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3~10 bp处的由3—9bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸,刚好与16S rRNA 3,末端的富含嘧啶的序列互补,是核糖体RNA的识别与结合位点。根据发现者的名字,命名为Shine-Dalgarno序列,简称S-D序列。 由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3’端一部分序列互补,因此S-D序列也叫做核糖体结合序列。 真核生物存在于真核生物mRNA的一段序列,其在翻译的起始中有重要作用。加Kozark sequence(GCCACC), Kozak sequence是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的ATG环境,避免ribosome出现leaky scan) 克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒,所以常带有较强的自我复制元件,如复制起始位点等,往往在菌体内存在多拷贝,所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成,为的是控制目标蛋白的表达,如各种启动子(T7),调节子(LacZ)等,而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的,防止渗漏表达。 克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了,不管读码框什么的,但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面,而且要表达蛋白,所以就要求你的读码框不能乱了,否则就不能得到你想到的表达产物。 1.载体即要把一个有用的基因(目的基因——研究或应用基因)通过基因工程手段送到生物细胞(受体细胞),需要运载工具(交通工具)携带外源基因进入受体细胞,这种运载工具就叫做载体(vector)。 2. 载体的分类 按功能分成:(1)克隆载体: 都有一个松弛的复制子,能带动外源基因,在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段(基因)的载体。(2)表达载体:具有克隆载体的基本元件(ori,Ampr,Mcs等)还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。 按进入受体细胞类型分:(1)原核载体(2)真核载体(3)穿梭载体(sbuttle vector)指在两种宿主生物体内复制的载体分子,因而可以运载目的基因(穿梭往返两种生物之间). 克隆载体顾名思义就是质粒拷贝数比较高,在做上游克隆时比较方便, 其重点在于质粒的复制.

表达载体转化的方法

目前外源基因导入叶绿体基因组的方法主要有基因枪转化法、PEG介导转化法、显微注射及激光注射法、转运肤介导的叶绿体间接转化法、电击法等。 (1)基因枪转化法 基因枪法是20世纪80年代后期发明的,它是将外源DNA(通常是带有目 的基因的质粒载体)如附在金属颗粒(如钨、金等)表面,然后通过高压动力装 置将金属颗粒轰击到受体细胞中的特定部位。基因枪法是目前己被验证的叶绿体基因组转化转化效率最高、采用最多的方法。大多数己经成功的叶绿体基 因组转化都是用这种方法实现的。它可以通过人为控制,将外源DNA导入到 细胞核及细胞器(如叶绿体体、线粒体等部位)中。基因枪法不受物种和基因型 的限制,转化后的组织可以迅速再生成植株,并且这一方法适合于不同种类的植物,其缺点是成本较高,操作复杂,不易普及到所有实验室。 (2)PEG介导转化法 PEG介导转化法是在PEG存在的情况下将去壁的受体细胞原生质体暴露 在纯化过的外源DNA中,由于PEG的存在,原生质体会先缩水,然后细胞膜结构会发生重构,在细胞膜结构到达不可逆破坏之前除去PEG,细胞膜结构又会回复到原先的自然稳定状态。在此过程中,外源DNA有机会进入胞内及质 体内,从而实现外源基因的转化。Golds等用PEG介导转化法成功地实现了烟草的原生质体转化,为质体转化提供了一条新的途径。该方法虽然成本较低,但原生质体的制备和再生比较困难,使得转化植株的再生频率较低,从而限制了这一方法的普遍应用。到目前为止,只有PEG法在烟草质体转化中获得成功的报道。 (3)显微注射及激光注射法 显微注射及激光注射法就是利用能量很高、直径很小的激光微束引起细胞膜可逆性穿孔,从而使处于细胞周围的外源DNA随之进入细胞的转基因方法。早在1987年,webe等就利用微束激光照射油菜细胞,将用荧光素标记的外源DNA 导入叶绿体,观察到荧光显示,并且发现这一处理对叶绿体的光合能力和细胞的分裂能力影响较小。由于激光微束穿刺技术操作简便,转化频率高,从而引起了许多科学家的重视,由此带动了此项技术在原生质体遗传转化中的应用与发展。此后,Kllobfauch等研究开发出了一种称为“毫微注射技术”(几mtojeetionteehnique)的叶绿体基因组转化方法。该方法是用一种亚显微直径为

基因表达载体构建

一、简述原核生物和真核生物基因表达调控的异同点,并说明基因表达调控与基因工程表达载体构建的关系。 1.原核生物和真核生物基因表达调控的共同点: (1)结构基因均有调控序列; (2)表达过程都具有复杂性,表现为多环节。 2.不同点: 原核生物:(1)RNA聚合酶只有一种,其σ因子决定RNA聚合酶识别特异性;(2)操纵子模型的普遍性;(3)阻遏蛋白与阻遏机制的普遍性(负性调节占主导);(4)转录和翻译偶联进行;(5)转录后修饰、加工过程简单;(6)转录起始是基因表达调控的关键环节。 真核基因表达调控特点:(1)RNA聚合酶有三种,分别负责三种RNA转录,每种RNA聚合酶由约10个亚基组成;(2)活性染色质结构发生变化;(3)正性调节占主导;(4)转录和翻译分隔进行;(5)转录后修饰、加工过程较复杂;(6)转录起始是基因表达调控的关键环节。 3.由于基因的表达调控受到多种因子的影响,而构建基因工程表达载体时多是将真和生物的目的基因转入到原核生物载体上表达,所以应注意以下几点: (1)外源基因插入序列必须保持正确的方向和阅读框架。其遗传密码不得缺失、遗漏、或错位及错码。否则会导致编码错误的蛋白质分子,特别是目的基因序列内部应不含两端酶切位点的识别序列。 (2)插入的外源基因必须放在原核的启动子控制之下,也就是使原核的RNA 聚合酶能够识别插入的基因。 (3)外源基因必须能在大肠杆菌中进行有效转录(如无内含子),转录后的mRNA 在菌体必须相当稳定,并且能有效地进行翻译,转译的蛋白分子在菌体内不致于受菌体蛋白酶的降解。 二、目的基因功能和表达分析的意义是什么?目的基因功能与表达分析的主要环节有哪些?各有什么目的?这些环节与基因工程的主要环节有什么异同? 1.意义:克隆的目的基因只有通过表达才能探索和研究基因的功能及基因表达调控的机理,明了其利用价值和途径。 2.主要环节: (1)目的基因的获得和加工:将得到的目的基因通过加工以期能连接到表达载体上并稳定表达; (2)载体的选择与加工:根据不同的实验目的和实验条件选择不同的载体,并

pET表达载体

表达载体pET A.pET系统是有史以来在E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。 目的基因被克隆到pET质粒载体上,受噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制;表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。T7 RNA 聚合酶机制十分有效并具选择性:充分诱导时,几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白;诱导表达后仅几个小时,目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。尽管该系统极为强大,却仍能很容易地通过降低诱导物的浓度来削弱蛋白表达。降低表达水平可能可以提高某些目的蛋白的可溶部分产量。该系统的另一个重要优点是在非诱导条件下,可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录。用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因,即可避免因目的蛋白对宿主细胞的可能毒性造成的质粒不稳定(详见I. F.部分)。如果用非表达型宿主细胞克隆,可以通过两种方法启动目的蛋白的表达:用带有受λpL和pI启动子控制的T7 RNA聚合酶的λCE6噬菌体侵染宿主细胞,或者将质粒转入带有受lacUV5 控制的T7 RNA聚合酶基因的表达型细胞。在第二种情形下,可以通过在细菌培养基中加入IPTG 来启动表达。尽管有时(例如非毒性目的蛋白) 可以直接将目的基因克隆到表达型宿主细胞中,但这种策略并不是通用做法。两种T7启动子以及多种拥有不同抑制本底表达水平的宿主细胞共同构成了一个极为灵活而有效的系统,使各种目的蛋白得以最优化表达。 所有pET载体以及相关产品均以试剂盒形式提供,用户可以很方便地进行克隆、表达检测以及纯化目的蛋白的所有操作。pET表达系统包括质粒和宿主菌。您可参考系统组成部分,选择符合具体需要的载体/宿主菌最佳组合。 B.使用许可及协议 Novagen的T7表达系统,包括细菌、噬菌体和带有T7 RNA 聚合酶基因的质粒,均依照非商业用户应用声明相应条款有条件提供。详情请垂询。 C. 系统组成 pET表达系统提供目的基因克隆和表达所需的核心试剂。 ? 选定的pET载体DNA,10 µg ? 宿主菌BL21,BL21(DE3)以及BL21(DE3)pLysS甘油菌1, 2

真核细胞常见表达载体复习过程

精品文档 真核细胞常见表达载体 真核细胞, 表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对,主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成,在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是,由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在,转染细胞后,用G418筛选,可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein V ector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白,在PCMV启动子驱动下,在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成,能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外,载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制,而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点,将外源基因扦入这些位点,将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因,在PCMV启动子驱动下,在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin 抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成,能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外,载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制,而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白,该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白,因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点:该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的,克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因,故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。 5、CMV4 表达载体 特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动,多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是,该表达载体不含有neo基因,转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector: pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug 说明: pBluescript II kS、pUC18 &Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等。这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点,当外源DNA片段扦入,转化lacZ基因缺乏细胞,并在含有IPTG和X-gal的培养基上培养时,含有外源DNA载体的细胞 精品文档

表达载体

一、大肠杆菌表达载体 大肠杆菌表达载体都是质粒载体。作为表达载体首先必须满足克隆载体的基本要求,即能将外源基因运载到大肠杆菌细胞中。在基本骨架的基础上增加表达元件,就构成了表达载体。各种表达载体的不同之处在于其表达元件的差异。1.表达融合蛋白的表达载体 当蛋白质表达以后,有效的分离纯化或分泌就成为获得目标蛋白的关键因素。通过以融合蛋白的形式表达,并利用载体编码的蛋白或多肽的特殊性质可对目标蛋白进行分离和纯化。用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽(Tag),常用的有谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase, GST)、六聚组氨酸肽(polyHis-6)、蛋白质 A(protein A)和纤维素结合位点(cellulose binding domain)等。 1.1 表达 LacZ 融合蛋白的载体 如 pEX1/2/3 载体(图 3-31),P R 受 cIts857 控制,宿主 M5219 含缺陷性原噬菌体,编码 cIts857 和 N 蛋白。 cIts857 强烈抑制基因转录。 N基因可使 RNA polymerase 跨过基因内部潜在终止位点。一般采用 42-45 ℃灭活cIts857 阻遏物,此处采用40℃ 以减少热激蛋白的诱导并使细菌能继续生长。因为温度转换不仅可诱导 PL/PR 启动子,也可诱导热激基因,而后者有些可编码蛋白酶。 1.2 表达 GST 融合蛋白的表达载体 GST 表达载体在启动子tac 和多克隆位点之间加入了两个与分离纯化有关的编码序列,其一是谷胱甘肽转移酶基因,其二是凝血蛋白酶(Thrombin)切割位点的编码序列。当外源基因插入到多克隆位点后,可表达出由三部分序列组成的融合蛋白。 GST 是来源于血吸虫的小分子酶( 26kDa),在E.coli 易表达,在融合蛋白状态下保持酶学活性,对谷胱甘肽有很强的结合能力。 将谷胱甘肽固定在琼脂糖树脂上形成亲和层析柱,当表达融合蛋白的全细胞提取物通过层析柱时,融合蛋白将吸附在树脂内,其它细胞蛋白就被洗脱出来。然后再用含游离的还原型谷胱甘肽的缓冲液洗脱,可将融合蛋白释放出来。再用凝血蛋白酶切割融合蛋白,便可获得纯化的目标蛋白。除了凝血蛋白酶的切割位点外,其它还有 Xa 因子(Factor Xa)和肠激酶。 1.3 利用 T7 噬菌体启动子的表达载体 表达载体 pET-5a 是典型的 pET 载体(图 3-32),其组成是在载体的基本结构的基础上加入了 T7 噬菌体启动子序列及其下游的几个酶切位点。当外源基因插入到这些酶切位点后,就可在特定的宿主细胞中诱导表达。大肠杆菌中 T7 启动子表达调控模式图见图3-33 。

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