c27黑曲霉培养及分离纯化
jjjjdj 黑曲霉的分离筛选
一、实验简介
黑曲霉广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。黑曲霉的最适温度为37℃，黑曲霉对营养要求较低,只要培养基中含有碳源、氮源及磷、钾、镁、硫等元素即能生长良好，实验中采用察氏培养基进行培养。
黑曲霉的菌落蔓延迅速，但生长稍局限，菌丝初为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状，背面无色或中央略带黄褐色。顶部形成球形顶囊，其上全面覆盖一层梗基和一层小梗，小梗双层褐色，梗基较短，上长有成串褐黑色的球状分生孢子。孢子直径2.5～4.0μm。分生孢子头球状，直径700～800μm，褐黑色。
黑曲霉的个体形态和菌落形态都比较特殊，容易分辨，可利用平板划线法或稀释涂布法，得到单菌落，并结合显微镜检测，多步鉴定、纯化，得到的纯的菌种。
二、实验试剂与材料
1、材料：黑曲霉孢子悬浮液
2、溶液和试剂：硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾、硫酸亚铁、蔗糖、琼脂、1mol/L氢氧化钠溶液、1mol/L氯化氢溶液、75%乙醇、乙醇乙醚混合液、溴甲酚绿、水。
3、器材和其他用品：三角瓶、试管、搪瓷杯、培养皿、接种环、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、试管架、载玻片、盖玻片、光学显微镜、恒温培养箱、纱布、牛皮纸、滤纸、pH试纸、擦镜纸。
三、实验步骤和过程
1、无菌器材及无菌水的准备
1.1 培养皿：洗净的培养皿烘干后，每组将5套培养皿叠在一起，用报纸卷成一筒，然后进行灭菌。注意，一定要卷紧。
1.2 试管：做合适的棉塞，每组捆扎5支试管，用报纸包在一起后，用线绳扎紧，扎成活结，另一头再用皮筋扎好，然后进行灭菌。
1.3 三角瓶：在三角瓶瓶口塞一八层纱布，盖上牛皮纸，用线绳扎成活结，然后
进行灭菌。注意，装入的培养基不超过三角瓶的1/2。
上述物品均要用记号笔注明班级、组别、日期。
1.4 高压蒸汽灭菌
2、查氏培养基的配制
称量→熔化→定容→调pH→分装→加塞→包扎标记→灭菌→搁置斜面与倒平板→无菌检查
培养基配方：硝酸钠 3g 磷酸氢二钾 1g 硫酸镁（MgSO4·H2O）0.5g 氯化钾 0.5g
硫酸亚铁 0.01g 蔗糖 30g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml pH5.0-6.0
2.1 称量：按照培养基配方，依次准确地称取药品，放入搪瓷杯中。
2.2 熔化：量取自来水，加入所需水量的一部分至上述搪瓷杯中，用玻璃棒搅拌，待药品溶解后，加入琼脂，倒入余下的水，在电热板上加热熔化。
2.3定容：将加热后的培养基导入量筒中，用自来水进行定容，至1000ml。
2.4 调pH：待培养基稍冷却后，用精密pH试纸测量培养基的原始pH，若偏酸，用1mol/L NaOH边滴加边搅拌，使之达到pH5.0-6.0。若偏碱，则用1mol/L HCl 调节。
2.5 分装：用分装装置将培养基装入试管，高度为试管总长的1/5，共20支。余下培养基转入三角瓶中，培养基的量为三角瓶容量的1/3-1/2。
2.6 加塞、包扎、标记：试管加棉花塞，5支一捆包扎好，棉塞外加一层报纸防灭菌时冷凝水湿润棉塞，在外用线绳扎成活结，；三角瓶用纱布塞住瓶口，并用牛皮纸的线绳包扎好。用记号笔注明培养基名称、班级、组别、配制日期。
2.7 灭菌：0.1MPa，121℃，20min高压蒸汽灭菌。
2.8 搁置斜面：待已灭菌的试管培养基冷却至50℃左右，将试管口端搁置在有合适高度的器具上，使培养基斜面长度不超过试管总长的一半为宜。
2.9 倒平板：待三角瓶中培养基冷却至50℃左右，倒平板。
2.10 无菌检查：灭菌培养基放入37℃培养箱中一天，若无细菌污染则说明灭菌彻底。
3、菌种分离纯化
3.1 用接种环从黑曲霉孢子悬浮液，接种于小试管斜面中培养（5支）。然后放
37℃培养箱中培养24小时。
3.2 平板划线：左手拿平板，右手拿接种环在火焰上灭菌后沾取菌液或菌苔一环，在平板上划平行线三条，接种环在火焰上灭菌，左手转动平皿约70度，用无菌接种环通过第一次划线的末端作为起点作二次划线，依次作第三次、第四次划线（平行线划线法）。或将挑取有菌的接种环在平板培养基上作连续划线。
培养：合上皿盖，倒置培养皿于37℃培养24小时。
挑菌落：挑取单个菌落的菌苔少许，涂在载玻片上进行显微镜个体形态观察，结合菌落形态特征综合分析。若不纯，需再用平板划线法继续进行分离纯化。
四、实验分析与检测
1、黑曲霉菌落特征
孢子呈圆球状，淡灰黑色，数目较多，清晰明显，个体较大。
2、菌落计数情况
培养平板 1 2 3 4 5 6 7 8
菌落数18 20 16 5 13 17 9 24 3、菌落形态特征
第一天：直径约为5mm的菌落，扁平状，菌丝呈绒毛状，白色。
第二天：菌落变大，菌丝基部白色，顶部浅黄色。
第三天：菌落更大，菌丝基部浅黄色，顶部形成黑色球状形顶囊（即分生因子），菌丝密集，菌落呈现黑色。
4、结果分析
黑曲霉生长条件要求低，生长繁殖能力强，在平板上生长后，其他微生物难以生长繁殖，故黑曲霉较易实现扩大培养及分离纯化，对于利用黑曲霉进行工业发酵，如柠檬酸发酵具有一定意义。
五、实验存在的问题及建议
1、在分装培养基时，注意不使培养基沾在瓶口或管壁上端，浸湿棉塞，以免引起杂菌污染；
2、接种、分离时，要在无菌环境下进行（靠近火焰），手不可触摸试管口端，以防烫伤，接种环不要碰触试管口边，防止污染。划线接种时，动作要轻，不要
划破培养基。平板培养微生物时要倒置培养。
3、在显微镜观察黑曲霉菌时，使视眼中的黑曲霉菌数维持在10到30个左右。
微生物菌种的分离和纯化方法
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1、用固体培养基分离和纯化 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。1.1 稀释倒平板法 首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 1.2 涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，
黑曲霉的次级产物的提纯
淮北师范大学信息学院 07生物工程 实验课题：利用黑曲霉生产柠檬酸的 实验设计方案 设计成员：万纹纹王磊 陈晨夏柱宝 指导老师：高翔
利用黑曲霉生产柠檬酸的实验设计方案 实验步骤： 筛选 → 诱变 → 培养基条件 → 发酵→ 产品分离纯化 一、 菌种的筛选： 1、 土壤采样： 采样人： 万纹纹 王磊 陈晨 夏柱宝 采样时间： 采样地点： 环境条件： 用取样铲，将表层5cm 左右的浮土除去，取5～25cm 处的土样10～25g ，装入事先准备好的塑料袋内扎好。应在三处不同的地点进行采样，将采集好的样品带回实验室备用。 2、 倒平板： 将PDA 培养基加热融化，待冷却至55-60℃倒平板15皿。 PDA 培养基配方： 马铃薯 200g 蔗糖 20g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml PH 自然 3、 制备土壤稀释液：各称土样10g ，迅速倒入带玻璃珠的90mL 无菌水的三角瓶中(玻璃珠 用量以充满瓶底力最好)，振荡约20min ，使土样充分打散，用一支1ml 无菌吸管从中吸取1ml 土壤悬液加入盛有9ml 无菌水的大试管中充分混匀，然后在用无菌吸管从此试管中 吸取1ml 加入另一盛有9ml 无菌水的试管里，混合均匀，以此类推制成110-、210-、3 10-、410-、510-、610-不同稀释度的土壤溶液。
4、 涂布：将倒好平板的底面用记号笔标上4 10-、5 10-和6 10-三种稀释度，然后用无菌吸 管分别由4 10-、5 10-和6 10-三管土壤稀释液中各吸取0.1ml 对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温静置5-10min ，使菌液吸附进培养基。 5、 培养： 将涂布好的平板倒置于35℃的培养箱中培养3-5d. 6、 挑菌落：黑曲霉形态特征：在固体培养基上，菌落由白色逐渐变至棕色。孢子区域为黑 色，菌落呈绒毛状，边缘不整齐，菌丝有隔膜和分枝，是多细胞的菌丝体，无色或有色，有足细胞，顶囊生成1层或2层小梗，小梗顶端产生一串串分生孢子。 用灭菌后的接种环在单个菌落上挑取少许要分离的细胞，接种到PDA 培养基的斜面上。置于35℃的培养箱中培养，待菌苔长出后观察其特征是否一致。 7、 划线分离： 用灭菌后的接种环挑取斜面培养基上的菌落在培养皿中划线。此步需要9 个培养皿。（注意：接种的过程最好在接种箱内进行。）将已划线的培养皿置于35℃的培养箱中培养3-5d 。观察菌落特征是否一致。 8、 镜检：在载玻片上加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落边缘挑取少量已 产孢子的霉菌菌丝，先置于50%乙醇中浸一下以洗去脱落的孢子，再放在载玻片上的染液中，用解剖针小心地将菌丝分散开。盖上盖玻片，置低倍镜下观察，必要时换高倍镜观察。检查是否为单一的微生物。若发现有杂菌，需要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。（试剂：乳酸石炭酸棉蓝染色液；仪器用具：无菌吸管，载玻片，盖玻片，解剖针，镊子，50%乙醇及显微镜等） 9、 制备母斜面：用灭菌的接种环将三种划线平板中的纯种黑曲霉接种到斜面上，作为母斜 面，35℃培养，备用。 10、产酸能力的检测： 将培养基50ml 分装到250ml 三角瓶内，灭菌后接入斜面孢子2环，于30~33℃培养。旋转式摇床的转速为300r/min ，往复式摇床振幅6cm ，频率为120
微生物的分离和纯化
实验十四微生物的分离和纯化 一、目的要求 掌握倒平板的方法和几种分离纯化微生物的基本操作技术。 二、基本原理 在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。 为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。 土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量和种类都是极其多样的，因此，土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以从其中分离、纯化到许多有用的菌株。 三、器材 高氏1号琼脂培养基，肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，10％酚，无菌培养皿，链霉素，土样等。 四、操作步骤 1．稀释涂布平板法 （1）倒平板将肉膏蛋白胨培养基、高氏1号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基溶化，待冷至55—60℃时，向高氏1号琼脂培养基中加入10％酚数滴，向马丁氏培养基中加入链霉素溶液，使每毫升培养基中含链霉素30μg。然后分别倒平板，每种培养基倒三皿，其方法是右手持盛培养基的试管或三角烧瓶，置火焰旁边，左手拿平皿并松动试管塞或瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出，如果试管内或三角烧瓶内的培养基一次可用完，则管塞或瓶塞不必夹在手指中。试管（瓶）口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。也可将平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夹住管塞并打开培养皿，再注入培养基，摇匀后制成平板，如图Ⅶ-1所示。最好是将平板放室温2—3天，或 37℃培养24小时，检查无菌落及皿盖无冷凝水后再使用。 （2）制备土壤稀释液称取土样10g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20分钟，使土样与水充分混合，将菌分散。用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。然后再用一支1ml无菌吸管从
黑曲霉发酵生产淀粉酶
黑曲霉发酵生产α-淀粉酶 前言： α-淀粉酶能随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，所得产物的还原性末端葡萄糖单位碳原子为α构型，同时该酶能使淀粉浆的粘度下降，因此又称为液化酶。耐酸性α-淀粉酶是在酸性条件下水解淀粉的酶类，其最适pH在4.0左右。自从日本研究者 YasujiMinoda等人用黑曲霉生产耐酸性α-淀粉酶以来，各国都对耐酸性α-淀粉酶进行了研究。 通过黑曲霉发酵生产α-淀粉酶的实验过程，熟悉发酵罐的构造和使用方法。初步了解发酵生产的原理和常规发酵参数的检测方法。整个实验按照“菌种的培养空消实消接种发酵放罐”的发酵过程进行。在整个发酵的过程中，每隔6h取一次发酵液样品检测其pH值、酶活、残糖量及生物量四个生理指标。最后将所测数据进行整理、分析，可以得出整个发酵过程各物质的生成和消耗的变化规律以及如何调整培养条件来提高发酵生产的效率，对大工业生产具有重要的指导意义。 正文： 一、实验目的 1．了解发酵罐的几大系统组成，即空气系统、蒸汽系统、补料系统、进出料系统、温度系统、在线控制系统。 2．掌握发酵罐空消的具体方法及步骤 3．掌握发酵罐进料及实消的具体方法及步骤 4．掌握发酵罐各系统的控制操作方法 二、实验原理 1.蒸汽系统： 蒸汽发生器：主要用于灭菌，分为自动加水和手动加水两种方式。 2.温度系统： (1) 夹套升温：蒸汽通入夹套。 (2) 夹套降温：冷水通入夹套，下进水，上出水。 (3) 发酵过程自动控温系统 3.空气系统： 空气除菌设备：空压机贮气罐油水分离器空气流量计空气过滤器发酵罐 4.补料系统：补加培养基、消泡剂、酸碱等。 5.在线控制系统 6.进出料系统：进料口（接种口）、出料口（取样口） 7.管道：包括水流通管道和气流通管道
微生物菌种的分离和纯化方法
微生物菌种的分离和纯 化方法 https://www.wendangku.net/doc/6914940170.html,work Information Technology Company.2020YEAR
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1、用固体培养基分离和纯化 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。 1.1 稀释倒平板法 首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 1.2 涂布平板法
【实验】微生物的分离与纯化
微生物的实验室培养——自酿葡萄酒中酵母菌的分离与纯化 一、实验目的：掌握无菌技术的操作，尝试用平板划线法和稀释涂布平板法分离纯化酵母菌。 二、实验步骤 （1）制备培养基（马铃薯琼脂培养基）：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板（已完成） （2）分离纯化 实验 步骤 操作流程流程叙述操作目的、作用 接种方法一：点燃酒精灯 ↓ 1.灼烧接种 环并冷却 ↓ 2.沾取菌液 ↓ 3.平板划线 ↓ 4.转动培养 皿约70°角 ↓ 5.灼烧并冷 却接种环 ↓ 6.平板划线 ↓ 7．倒置培养 用火柴点燃酒精灯，保证实验操作在酒精 灯火焰进行 将接种环放在火焰上灼烧，直至烧红， 让接种环自然冷却 打开装有菌液的试管，塞子要拿在手上， 将试管口通过火焰灭菌，将冷却的接种环 伸入菌液中，沾取菌液。将试管口通过火 焰灭菌，用塞子塞住试管 左手将皿盖打开一条缝隙；右手把沾有菌 种的接种环迅速伸入平板内，划3到5条 平行线（不要划破培养基），盖上培养皿盖 逆时针旋转培养皿约70°角 将接种环放在火焰上灼烧，直至烧红让接 种环自然冷却 从第一区域划线的末端开始往第二区域划 线，重复以上操作，在三、四、五区域划 线，注意不要将最后一区的划线与 相连。（也可以用连续划“Z”字形线的方 法 倒置培养皿，放入培养箱中培养 避免周围环境中微生物的 污染 清除； 防止杀死菌种 防止塞子被污染； 清除的杂菌 接种到培养基表面 调整角度，准备第二区域 的划线 在琼脂固体培养基表面连 续划线的操作，将聚集的 菌种逐步稀释分散到培养 基的表面 减少培养基内的水分蒸 发，使培养基保持湿润； 防止水珠回流打散菌落 在右图所示 的培养皿内 用笔模拟接 种环画出两 种平板划线 法的划线轨 迹 接种 方法 二： 1.系列稀 释操作 准备六只试管 ↓ 分别加入4.5mL蒸馏水并灭菌，编号 ↓ 取 mL菌液放入第1支试管并混匀 ↓ 从第1支试管取0.5ml菌液放入第2只试管并 混匀 ↓ 重复步骤，直至最后一支试管 2.涂布平 板操作 滴加100μL菌液到培养基表面 ↓ 引燃涂布器，待酒精燃尽后，冷却8～10s ↓ 把培养皿打开一条缝 ↓ 在培养皿盖内侧进一步冷却涂布器，均匀涂布 菌液，转动培养皿，涂匀 ↓ 盖上皿盖,放置10min ↓ 倒置培养皿，放入培养箱中培养 清除涂布器上的杂菌 使菌液均匀分布在培 养基表面 使液体被充分吸收 结果 观察 观察划线平板和涂布平板上的菌落形态、颜 色、大小，可挑取少量菌落制成临时装片，显 微镜下观察。 对菌落进行初步鉴定 1
黑曲霉发酵提取柠檬酸
黑曲霉发酵提取柠檬酸 实验一黑曲霉保藏菌的复苏 实验目的：了解黑曲霉保藏菌的生长状况和保藏菌的活化处理过程。实验原理：能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉及葡萄孢霉中的一些菌株都能够利用淀粉质原料大量积累柠檬酸。目前国内主要利用黑曲霉（Aspergillus niger）通过固体发酵或液体深层发酵生产柠檬酸。发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是微生物产生糖化霉首先将淀粉转变为葡萄糖，葡萄糖经过糖酵解途径（EMP）转变为丙酮酸氧化酶氧化生成乙酸和CO2，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A，然后在柠檬酸合成酶的作用下乙酰辅酶A和草酰乙酸合成为柠檬酸。产生的柠檬酸经碳酸钙作用形成柠檬酸钙沉淀，再经稀硫酸作用释放出柠檬酸。 实验步骤：1、观察保藏菌的生长状况，记录PH 2、黑曲霉复苏培养基的配制 （1）、分别称取蔗糖30g，KNO3 1g, K2HPO4 1g, 麸皮10%，MgSO4.7H2O 0.5g, KCL 0.5g, FeSO4.7H2O 0.01g, 于500ml搪瓷缸中。 （2）、加蒸馏水100ml，调节pH至7.0-7.2 （3）、牛皮纸包扎，灭菌 3、保藏菌的活化扩增 （1）配制5oBe’麦芽琼脂培养基 （2）20℃麦芽汁，糖度为5
（3）加0.7%的琼脂 （4）加热，使其沸腾 （5）分装与试管中，每管约3ml （6）包扎灭菌，制成斜面培养基 （7）在超净工作台上划菌，包扎 （8）置于28~30℃培养箱中培养 实验要求：分析复苏和保藏培养基的区别，原因，营养成分的差异和操作的目的和意义。并加注参考文献。
实验二黑曲霉一级种子的制备 实验目的：了解种子扩大培养的程序，比较复苏均至一级种子的生境变化。 实验原理：黑曲霉在生长过程中不仅需要有充足的营养成分，而且还需要一定的氧气环境等。通过拌菌等增加菌种与培养基营养成分的充分接触，获得良好的生长。 实验步骤：1、观察活化的保藏菌生长状况，并记录。 2、在超净工作台上，将2-4管/组，活化的保藏菌分别加入约3mL双蒸水。 3、在混匀器上，将活化的保藏菌制成孢子悬液。 4、在超净工作台上，将孢子悬液一次倒入察氏培养基中。 5、用灭过菌的玻棒，将菌液和培养基充分拌匀。 6、测定此时的pH值，并记录。 7、取5ml充分拌匀的菌液培养基，用滤纸过滤。 8、收集滤液于20ml 离心管中。 9、3000r/min, 离心5min。 10、收集上清于试管中，标记后置于-4℃冰箱中。 11、每隔2天，用灭过菌的玻棒，在超净工作台上拌菌。同时测定pH，并取5ml样品，以上述做法，将收集的上清液保藏于-4℃冰箱中。注意：标记时，要标明实验日期，组别，班号。
大学土壤微生物分离实验报告
从土壤中分离纯化培养微生物并作初步观察鉴定 【摘要】利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离与纯化，根据细菌在选择培养基的存活情况，确定该菌种的固氮解磷解钾属性。 【关键词】细菌芽孢杆菌培养基、选择培养基的配制高压蒸汽灭菌 前言： 在自然条件下，微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。群落是不同种类微物的混和体。为了生产和科研的需要，人们往往需要从自然界混杂的微生物群体中分离出具有特殊功能的纯种微生物；或重新分离被其他微生物污染或因自发突变而丧失原有优良性状的菌株；或通过诱变及遗传改造后选出优良性状的突变株及重组株。这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离纯化技术。 分离纯化技术主要由采集样品、富集培养、纯种分离和性能测定等几个基本环节组成。 实验目的： 1、学习从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。 2、学习、掌握微生物的鉴定方法。 3、对提取的土样进行微生物选择培养、分离、纯化，根据菌落的存活状况来判断未知 菌的属性。 实验原理： 菌种来源:选择无机磷农药含量较高的土壤,有机磷农药化工厂 旁边的土壤和排污口区的污水. 培养基的选取：五组选择培养基，分别以辛硫磷、甲胺磷、敌敌畏、草甘膦及五种有机磷农药混合为微生物生长的唯一氮源磷源。 分离纯化微生物：稀释倒平板法、涂布平板法、稀释摇管法、平板划线分离法。 此次实验采取的是平板分离法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其基本原理主要包括两个方面：（一）选择适合于待分离微生物的生长条件或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰大部
分不需要的微生物。（二）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板法或平板划线法等技术来完成。 微生物的观察可以用显微镜观察其细胞形态，也可以用肉眼观察其菌落形态。前者是微生物的显微镜观察技术，后者是微生物的肉眼观察技术。 1. 实验器材、试剂与实验方法： 1.1器材： 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布、培养皿、自动立式压力蒸汽灭菌器、烘箱、玻璃珠、移液枪、枪头、称量纸、药匙、试管架、接种环、酒精灯、超净工作台, 粉碎机，接种环，移液枪配枪头。 1.2试剂： 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、1mol/L NaOH、1mol/LHCl、NaCl、95%乙醇、75%酒精，草甘膦，甲甘磷，敌敌畏，辛硫磷。 1.3土样、样品： 取自二十三冶草莓园的土壤，建设北路的大棚蔬菜菜地土壤，化工厂污水口。 1.4 实验方法 1.4.1配制培养基： (一）配制牛肉膏蛋白胨琼脂培养基200ml(用2个100ml三角瓶和2支试管分装）牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普遍的细菌基础培养基。 配方如下：牛肉膏 0.6g 蛋白胨 2g NaCl 1g 琼脂 3~4g 水 200ml pH 7.4-7.6 1、称药品按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏和蛋白 胨可分别放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。 2、加热溶解在烧杯中加入少于所需的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用 玻璃棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，在此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补充所失水分。 3、调pH 用pH试纸或酸碱度计检测培养基的pH值，若pH偏酸，可滴加1mol/L NaoH， 边加边搅拌，并随时检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用１mol/l HCL进行调节。 pH调节通常放在加琼脂之前。注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的
设计实验：微生物菌种的分离纯化、培养、、鉴定 以及保藏技术
设计实验：微生物菌种的分离纯化、培养、、鉴定以及保藏技术 一．实验目的 1.学习大肠菌群分离纯化、鉴定的原理。 2.掌握平板表面涂布法、平板划线法的分离技术。 3.学习掌握菌种保藏的原理和方法。 二.实验原理 菌种的分离纯化 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1.涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。 2.平板划线法 最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。 大肠菌群的培养鉴定 大肠菌群能在乳糖胆盐液体培养液中生长，并且产气产酸，使培养液变色。还能在伊红美兰固体培养上生长，形成黑紫色的菌落，有的还有金属光泽。其他病原菌的菌落呈粉红色。再做镜检观察是无芽孢的革兰氏阴性杆菌（呈红色）。即可鉴定是有大肠菌群的菌存在。 菌种保藏 菌种保藏是将微生物的菌种经长时间的保存，不污染其它杂菌，及可保持其形态特征和生理性状，减少变异，防止衰老，以便于将来使用。 保藏菌种一般是选用它的休眠休，如孢子；芽孢等等，并且要创造一个低温；干燥；缺氧；避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体能长期地处于休眠状态。对于不产孢子的微生物，应使其新陈代谢处于最低状态，又不会死亡，从而达到长期保存的目的 三.实验器材 1.菌种：污水中的大肠菌群、酵母菌和霉菌 2、培养基：乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、麦芽汁固体斜面培养基 和马铃薯固体斜面培养基。 3.器材：接种环、安培瓶、干燥器、冰箱、产气管、试管、培养皿、无菌平皿、无菌玻璃涂棒移液管、电炉、双目显微镜、恒温培养箱、无菌操作台、高压灭菌锅、恒温干燥箱等。 4.试剂：革兰氏一(草酸铵结晶紫)、革兰氏二(路哥氏碘液) 、革兰氏三（95%乙醇）、 革兰氏四（蕃红）；试剂：医用液体石腊（比重0.83～0.89）。 四．试验方法及步骤 1.大肠菌群的分离纯化 第一天 a．涂布平板法：将已熔化的营养琼脂培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的含大肠菌群的污水滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，置培养箱中37℃培养24小时。经培养后挑取单个菌落。 第二天 b．平板划线法：经培养后挑取单个菌落，接种环以无菌操作沾取少许菌落，在无菌伊红美兰琼脂培养基平板表面进行连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果
利用黑曲霉发酵产生柠檬酸
利用黑曲霉发酵生产柠檬酸 摘要：柠檬酸是目前以微生物发酵生产的重要有机酸之一，它的用途非常广泛，需求日益增长。目前国内柠檬酸年产量约2.5×105吨，其中半数以上供出口之用。80年代，我国国内的柠檬酸消费急剧上升，速度远远超过了西方发达国家。随着人民生活水平的提高，对食品和饮料等含柠檬酸制品的需求量猛增，但就人均消费量来看，我国的柠檬酸消费还是很低的，以用于食品和饮料的柠檬酸为例，我国的人均消费量远低于美国和日本，市场潜力巨大，因此增加柠檬酸生产不仅可以满足国内日益增长的需要，也是换取外汇的重要手段之一。 柠檬酸是葡萄糖经柠檬酸循环而形成的最有代表性的代谢产物，早已发展成大规模的商用生产。常用的菌种是黑曲霉，产酸浓度在每升发酵液中＞150g。 关键词：黑曲霉，柠檬酸，三羧酸循环 1、柠檬酸用途 柠檬酸被称为第一食用酸味剂，极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等，用于饮料、糖果、酿造酒、冰淇淋、酸奶、罐头食品、豆制品与调味品等的生产中。另外，在药物、美容品、化妆品工业上也有着重要的应用。它是香料和饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，同时是化学中间体，用于制造药物，也可用于金属清洁剂、媒染剂等。柠檬酸的盐类、酯类和衍生物也各具特点，用途极为广泛而有良好的发展前景。 2、黑曲霉 黑曲霉，子囊菌亚门，丝孢目，丛梗孢科中的一个常见种。广泛分布于世界各地。食品工业上用作发酵菌种，如用于食醋生产制曲、麸曲法白酒生产制曲、
柠檬酸发酵等，主要是利用此黑曲霉分泌产生淀粉酶、糖化酶、柠檬酸、葡萄糖酸、五倍子酸等的功能；在生物肥料工业上，黑曲霉具有裂解大分子有机物和难溶无机物，便于作物吸收利用，改善土壤结构，增强土壤肥力，提高作物产量的效果。 3、柠檬酸循环（citric acid cycle，CAC） 又称三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA），Krebs循环，由诺贝尔获奖者（1953年）、德国学者H.A.Krebs于1937年提出。是指由丙酮酸经过 一系列环节作循环式反应而被彻底氧化、脱羧，形成CO 2、H 2 O和NADH 2 的过程。 这是一个广泛存在于各种生物体中的重要生物化学反应，在各种好氧微生物中普遍存在。在真核微生物中，柠檬酸循环的反应在线粒体内进行，其中的大多数酶定位于线粒体的基质中；在原核生物中，大多数酶位于细胞质内。只有琥珀酸脱氢酶属于例外，它在线粒体或原核细胞中都是结合在膜上的。 3.1 TCA循环的调节作用 3.1.1 TCA循环的起始酶：柠檬酸合成酶是一种调节酶。但在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉TCA循环的第一个特点。顺乌头酸酶失活，阻断TCA循环是柠檬酸积累的必要条件。顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在pH2.0时失活，线粒体顺乌头酸酶在催化时有柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7的平衡，这个平衡可能就是造成柠檬酸的最初积累而使pH值降低。 3.1.2黑曲霉菌体内α-酮戊二酸脱氢酶缺失或活力很低（TCA循环被阻断）。3.1.3氧和pH值对柠檬酸发酵的影响很大。标准呼吸链产生ATP积累，侧呼吸链不产生ATP，缺氧导致侧呼吸链失活，使ATP积累，柠檬酸积累减少。 4.发酵机理 4.1以薯干粉、玉米粉或淀粉等糖类为原料经黑曲霉柠檬酸产生菌糖化后产生高浓度的葡萄糖。 4.2黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸：葡萄糖以糖酵解途径、磷酸戊糖循环两种途径产生丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧形成乙酰CoA，另一方面经CO2固定化反应后生成草酰乙酸，最后草酰乙酸和乙酰CoA缩合产生柠檬酸。 4.3生理调节：柠檬酸是黑曲霉的良好碳源，故柠檬酸的积累是菌体代谢失调
微生物的接种、分离纯化与培养方法
微生物的接种、分离纯化与培养方法 实验目的：学习掌握无菌操作技术；学习接种方法；学习常用的分离、纯化菌种的方法。实验内容： 一、接种 将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。１、接种工具和方法 在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。（图３－３） 图３－３接种和分离工具 1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀 常用的接种方法有以下几种： １）划线接种这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。２）三点接种在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。 ３）穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。 ４）浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45° C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。 ５）涂布接种与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。 ６）液体接种从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。
黑曲霉发酵生产纤维素酶实验1
黑曲霉发酵生产纤维素酶实验 一、实验目的 1、了解纤维素酶的生产工艺和原理 2、掌握液体发酵和固体发酵工艺 3、学会DNS法测定还原糖含量的方法和原理 二、实验原理 纤维素酶可以用于一切含纤维素的生物质的降解，具有广阔的应用前景。高产纤维素酶的微生物主要有木霉属、曲霉属、根霉属，黑曲霉所产的纤维素酶中β-葡萄糖苷酶活力高，能避免酶解产物纤维二糖的阻遏作用，而且安全无毒，故而成为生产纤维素酶的主要菌种之一。纤维素酶是诱导酶，故发酵生产时需有纤维素物质作诱导剂。 以羧甲基纤维素钠作底物，用发酵所得纤维素酶对底物进行酶解，测定酶解液中的还原糖含量（以葡萄糖计），可以计算酶活力高低。还原糖与DNS反应形成棕色物质，颜色深浅与糖含量成正比。 三、材料与试剂配制 1、生产菌种：黑曲霉 2、斜面（活化）培养基：酵母膏0.4%，蛋白胨0.6%，可溶性淀粉1%，葡萄糖0.9%，马玲薯浸出液7%，琼脂2%，陈海水（或人工海水）配制，pH7.0-7.4。 3、人工海水：NaCl = 24 g/L ;MgSO4·7H2O = 7.0 g/L ;NH4NO3= 1 g/L ;KCl = 0.7 g/ L ; NaH 2PO 4 = 2.0 g/ L ;Na 2 HPO 4 =3.0 g/ L ,pH7.4。 4、微量元素液：FeSO4·7H2O 5.0mg/L，MnSO4·H2O 1.6mg/L， ZnSO 4· 7H 2 O 1.4mg/L，CoCl 2 2.0mg/L，加蒸馏水200ml使之溶解。 5、液体发酵产酶培养基：麸皮作碳源 3 g，氯化铵或硫酸铵作无机氮源1 g，蛋白胨0.05g作有机氮源，人工海水100 ml（含1%微量元素液），自然pH值。 6、固体发酵产酶培养基：麸皮：稻草粉=2：1作碳源5 g，人工海水
实验24 黑曲霉发酵生产柠檬酸
黑曲霉发酵生产柠檬酸 柠檬酸（citric acid ）又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸（2-hydroxytricarboxylic acid ）、2--羟基丙烷-1，2，3-三羧酸（2-hydroxy propane-1，2，3-tricarboxylic acid ）。商品柠檬酸有两种形式：一种为无色透明，有光泽的含一个结晶水的晶体，其分子式为C 6H 807·H 2O,相对分子质量为210.14。另一种为无色半透明全对称晶体的无水柠檬酸，分子式为C 6H 8O 7，相对分子质量192.13。柠檬酸因无毒、水溶性好、酸味适度、易被吸收和价格低廉等优点，被广泛应用于食品、医药、化工、化妆品、清洗（洗涤）、建筑等工业部门。1893年前，人们主要从柑橘、菠萝和柠檬等果实中制取柠檬酸。1893年后发现微生物可产生柠檬酸，1951年美国Miles 公司首先采用深层发酵法生产柠檬酸。我国在20世纪40年代初期开始浅盘发酵生产柠檬酸，60年代开始采用薯干粉直接深层发酵法生产柠檬酸。 能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉、葡萄孢菌及酵母中的一些菌株都能够利用淀粉质原料或烃类大量积累柠檬酸。至今世界上消费的柠檬酸主要采用发酵法，而最具商业竞争优势的是采用黑曲霉（Asp.niger ）、文氏曲霉(Asp.Wentii )和解脂假丝酵母等菌种的深层液体发酵。目前国内外普遍采用黑曲霉的糖质原料发酵生产柠檬酸。 本实验以薯干粉或玉米粉为原料，采用黑曲霉，通过深层液体（摇瓶）发酵产生柠檬酸。柠檬酸发酵液经过滤除去菌丝体和残存杂质，过滤液中加入碳酸钙中和，生成柠檬酸钙沉淀。将获得柠檬酸钙再用稀硫酸酸解生成柠檬酸和硫酸钙沉淀而制得粗制柠檬酸液，粗制柠檬酸液再经活性碳脱色、离子交换脱盐制得精制柠檬酸液。精制柠檬酸液经真空浓缩、结晶制得符合英国药典BP-98版标准的无水或一水柠檬酸。 5.3.1 柠檬酸发酵 1、 实验目的 了解柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸深层液体发酵及发酵过程中生化指标的分析方法。 2、实验原理 黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将薯干粉或玉米粉中的淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径（EMP ）和HMP 途径转变为丙酮酸；丙酮酸由丙酮酸氧化酶氧化生成乙酸和CO 2，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A ，然后在柠檬酸合成酶（柠檬酸缩合酶）的作用下生成柠檬酸。黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA 循环中的ɑ-酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA 循环变成“马蹄型”,代谢流汇集于柠檬酸处,使柠檬酸大量积累并排出菌体外。其理论反应式为: O H O H C O O H C 27862612625.1+→+ 柠檬酸理论得率为106.7%，若以含一个结晶水的柠檬酸计为116.7%。 3、实验装置材料与流程 （1） 实验装置与材料 ① 实验装置 旋转式摇床、恒温培养箱、高速离心机（4000-6500r/min ）。 ② 菌种 黑曲霉（Asp.niger ）柠檬酸生产菌株Co8-27。 ③ 材料 麸皮、马铃薯 、薯干粉、蔗糖、玉米粉、大麦芽、大米、琼脂、淀粉酶（中温酶与高温酶）。 ④ 器皿 15mL 试管、100mL 三角瓶、2000mL 烧杯、500mL 三角瓶、离心管若干。 ⑤ 试剂 0.1429mol/L NaOH 、1%酚酞试剂、斐林甲、乙溶液、0.01%标准葡萄糖溶液。 （2） 试剂
实验二微生物的分离、纯化和接种
实验二微生物的分离、纯化和接种 微生物的分离、纯化 1、目的要求 1.1了解微生物分离和纯化的原理 1.2掌握常用的纯化分离微生物的方法 2、基本原理 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。本实验采用平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、pH值、温度和溶解氧等要求，或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术来完成。而纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。 本实验将在混合有几种微生物菌液中分离纯化出两种微生物来。 3、实验材料 3.1培养基 肉汤培养基（固体）。 3.2溶液或试剂 盛4.5ml无菌水的试管，其中有一只盛有玻璃珠。 3.3仪器或其他用具 无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，涂布器等。 4流程 倒平板制备梯度稀释液涂布（或划线法）培养挑单菌落保存。 5、步骤 5.1平板划线分离法 5.1.1倒平板 倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拔出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰
附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml,加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后置于桌面上，待凝固后即成平板(教材p367图13-14)。并用记号笔标明培养基名称、菌液编号和试验日期。 5.1.2划线 在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取菌悬液一环在平板上划线(教材p367图13-15)。划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。 常用的划线方法有:用接种环以无菌操作挑取菌悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3~4条，再转动培养皿约70度角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。 5.1.3挑菌落 同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止。 5.1.4结果判定 所做划线法是否较好地得到了单菌落?如果不是，请分析其原因。 (二)微生物的接种技术 1目的 1.1学习掌握微生物的儿种接种技术 1.2建立无菌操作的概念，掌握无菌操作的基本环节 2 实验说明 将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项基本操作技术。无论微生物的分离、培养、纯化或鉴定以及有关微生物形态观察及生理研究都必须进行接种。接种的关键是严格进行无菌操作，如操作不慎引起污染，则实验结果不可靠，影响下一步工作的进行。 3实验器材 3.1器械和用品 酒精灯，玻璃铅笔，火柴，试管架、接种环、接种针、滴管、移液管、三角型接种棒等接种工具。 3.2菌种和培养基 菌种:大肠杆菌(Escherichiacol)，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）培养基:牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 4操作步骤 4.1斜面接种法 斜面接种法主要用于接种纯菌，使其增殖后用以鉴定或保存菌种。 通常先从平板培养基上挑取分离的单个菌落，或挑取斜面，肉汤中的纯培养物接种到斜面培养基上。操作应在无菌室、接种柜或超净工作台上进行，先点燃酒精灯。 将菌种斜面培养基(简称菌种管)与待接种的新鲜斜面培养基(简称接种管)持在左手拇指、食指、中指及无名指之间，菌种管在前，接种管在后，斜面向上管口对齐，应斜持试管呈45度角，并能清楚地看到两个试管的斜面，注意不要持
黑曲霉发酵
黑曲霉，半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。有的菌株还可将羟基孕甾酮转化为雄烯。生长适温37℃，最低相对湿度为88%，能引致水分较高的粮食霉变和其他工业器材霉变。 黑曲霉是发酵常用的菌种。食品工业上用作发酵菌种，如用于食醋生产制曲、麸曲法白酒生产制曲、柠檬酸发酵等，主要是利用此黑曲霉分泌产生淀粉酶、糖化酶、柠檬酸、葡萄糖酸、五倍子酸等的功能；在生物肥料工业上，黑曲霉具有裂解大分子有机物和难溶无机物，便于作物吸收利用，改善土壤结构，增强土壤肥力，提高作物产量的效果。黑曲霉产生的孢子很多，很适合于用沙土管法进行保存。 沙土管保藏法。取河沙用水浸泡洗涤数次，过60目筛除去粗粒，再用10%盐酸浸泡2～4小时，除去其中有机物质，再用水冲洗至流水的pH达到中性，烘干备用。同时取贫脊土或菜园土用水浸泡，使呈中性，沉淀后弃去上清液，烘干碾细，用100目筛子过筛，将
处理好的沙与土以（2～4）:1混匀，用磁铁吸出其中的铁质，然后分装小试管或安瓿内，每管装量0.5～2克，塞棉塞，用纸包扎灭菌（1.5公斤/平方厘米，1小时），再干热灭菌（160℃，2～3小时）1～2次，进行无菌检验，合格后使用。将已形成孢子的斜面菌种，在无菌条件下注入无菌水3～5毫升，刮菌苔，制成菌悬液，再用无菌吸管吸取菌液滴入砂土管中，以浸透砂土为止。将接种后的沙土管放入盛有干燥剂的真空干燥器内，接上真空泵抽气数小时，至沙土干燥为止。真空干燥操作需在孢子接入后48小时内完成，以免孢子发芽。制备好的沙土管用石蜡封口，在低温下可保藏2～10年。 但是沙土管保存使用起来不是很方便，而且只是适用于长期的保存，容易导致大量的孢子特性下降，用之前需要进行分离纯化。 还有以下保藏方法可以应用： 1、斜面保藏方法，可以取部分孢子重新分离，然后传斜面待斜面张满孢子后在4度冰箱进行保存可以保存1－2个月没有问题，我们做过相关的试验。而且可以随时使用，进行活化或者直接接种，非常方便。 2、深冷管保存，可以用无菌水配成20％甘油加入到斜面中刮下孢子进行保存。或者用专用的GSH（甘油
土壤微生物的分离和纯化
土壤微生物的分离和纯化 一、实验目的 1、掌握从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。 2、学会根据微生物培养特征初步判断未知菌的类别。 3、练习微生物接种、移植和培养的基本技术，掌握无菌操作技术。 二、实验原理 土壤是微生物生长和栖息的良好基地。土壤具有绝大多数微生物生活所需的各种条件，是自然界微生物生长繁殖的良好基地。因此，土壤是微生物资源的巨大宝库。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，可用于培养细菌。链霉素可以抑制细菌和放线菌的生长，对酵母菌和霉菌不起作用。加入一定量链霉素的培养基可以从混杂的微生物群体中分离出酵母菌和霉菌。重铬酸钾或苯酚对土壤真菌、细菌有明显的抑制作用，可用于选择分离放线菌。 三、实验器材 1、材料：10cm左右深层土壤。 2、培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏培养基、高氏Ⅰ号培养基 3、其他物品：试管、三角瓶、烧杯、量筒、电子天平、精密pH试纸、培养皿、高压蒸汽灭菌锅、移液枪、枪头、接种环、酒精灯、链霉素(1万单位/ml) 、10%苯酚、无菌水。 四、实验步骤 1、土样采集：取10cm左右深层土壤10g备用。 2、制备土壤稀释液：称取土壤1g，放入有99mL无菌水的三角瓶中，振荡均匀，即为稀释10－2的土壤悬液。然后进行十倍梯度稀释，依次制备10－ 3、10－ 4、10－ 5、10－ 6、10－7 稀释度的土壤稀释液。 3、培养基平板制备：按培养基配方各配置牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏培养基、高氏Ⅰ号培养基各100ml。灭菌后分别倒3个平板。（高氏Ⅰ号培养基灭菌前加入10滴10%苯酚；马丁氏培养基倒平板前加入2ml去氧胆酸钠(2%)和0.4ml 1万单位/ml链霉素） 4、接种：用无菌吸管吸取0.1ml相应浓度土壤稀释液，以无菌操作技术接种在平板上，涂布均匀。细菌选用10－4、10－ 5、10－6 三个稀释度接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，放线菌与霉菌选用10－2 、10－3、10－4三个稀释度，分别接种于高氏Ⅰ号培养基、马丁氏培养基。（一个稀释度一个平板） 5、培养：细菌平板于37℃恒温培养1～2d，放线菌于30℃培养2～3d，霉菌于30℃培养3～5d ，观察。 6、计数：用稀释水样检测平板的菌落计数方法进行计数，报告细菌总数/(CFU·ml-1) 7、纯化：挑取典型菌落接种于相应平板，培养条件同上，培养纯化。 五、思考题