IDEXX-PRVgB说明书正式
中文说明书： 99-09428
猪伪狂犬病病毒gB抗体检测试剂盒
Pseudorabies Virus gB Antibody Test Kit
(PRV gB)
用途
猪伪狂犬病毒gB抗体检测试剂盒是一种用于测定猪血清、血浆和肌肉抽提液、在滤纸上干燥的血清和全血样本（此滤纸测定方法仅应用于法国的国家测试计划）中猪伪狂犬病毒（PRV）抗体的酶联免疫吸附试验方法。
概述
猪伪狂犬病由1型猪疱疹病毒引起，感染后引起死亡率最高的是易感母猪产下的哺乳期仔猪。患病的仔猪表现为呼吸困难、发热、流涎、厌食、呕吐、腹泻、战栗、沉抑。在这个年龄阶段，疾病的最后症状通常出现运动性共济失调、眼球震颤、运动失调、间歇性震颤、昏迷和死亡。
死亡通常出现在表现明显的临床症状后24~48小时。断奶猪和育肥猪的疾病临床特征本质相同，但死亡可能拖延4~8天。成年猪的死亡率可达2%，但通常不会出现死亡。仔猪的的疾病临床过程与成年猪本质上是一样的，存在的差异主要是胎儿可以通过胎盘感染。胎盘感染PRV，在怀孕的不同阶段，可以造成以下结果：重吸收、早产、流产、死胎、弱胎、感染的仔猪。Gustafson报道，康复的母猪群中有20%的母猪在下一次配种时将不再怀孕。
为了评估PRV的自然感染或免疫状况，可以检测血清、血浆和肌肉抽提液中的PRV抗体。
试剂
所有试剂保存于2~7℃，兽用制剂。
数量
A． PRV抗原包被的酶标板（焚烧所有用剩的材料及其容器） 6 块B． 辣根过氧化物酶（HRPO）标记的抗PRV gB抗体（用庆大霉素作保护剂）60ml C． PRV抗体阳性对照（PRV抗体加入含蛋白质稳定剂的磷酸盐缓冲液中，
7ml 用叠氮化钠作保护剂）
D． PRV抗体阴性对照（与PRV不反应的猪血清，用叠氮化钠作保护剂） 7ml E． 样品稀释液（含蛋白质稳定剂的缓冲液，用叠氮化钠作保护剂） 120ml G． 10倍浓缩的清洗液 235 ml H． TMB 底物溶液 60 ml
I． 终止液 60 ml
原理
猪伪狂犬病毒gB抗体检测（PRV gB）是通过2倍稀释的样品在抗原包被的微孔板上进行。初次孵育时，存在于检测样品中的PRV抗体会与酶标板上的抗原结合。然后开始洗涤步骤，向微孔板中加入酶标记的抗PRV gB的单克隆抗体，进行第二次孵育，在此过程中其与抗原竞争结合。如果检测样品中不存在PRV gB抗体，酶标单抗就可以与抗原自由结合，相反，如果检测样品中存在PRV gB 的抗体，酶标单抗与抗原的结合就会被阻断。而在此次孵育过后，未结合的酶标单抗就会被冲洗掉，加入底物/显色剂溶液后，在酶的存在下，底物转变为一种能与显色剂反应产生蓝色的物质。使用分光光度计测量650nm的吸收值A(650)。被检样品的A(650)值除以阴性对照的平均A(650)值，计算得出样品/阴性值（S/N）。样品中PRV抗体的含量与其A(650)和S/N值成反比。如果存在抗gB抗体，表明以前曾感染PRV野毒株或应用过传统的弱毒疫苗或灭活疫苗，或者应用过gE缺失疫苗。
自备器材
1. 精确的移液器，可以吸取50μl和100μl的移液器或者多道移液器；
2. 一次性吸头；
3. 用来稀释洗涤液的500ml量筒；
4. 96孔板酶标仪；
5. 稀释样品用的玻璃或塑料试管；
6. 双蒸水或去离子水；
7. 滴加和吸去洗涤液的装置；
8. 吸液用的真空泵和控制阀门。
注意事项
1. 虽然病毒都经过了灭活处理，但也要严格处理所有的PRV生物材料，要把它们当成能传播PRV一
样。
2. 移液时禁止用嘴吸。
3. 处理样品和试剂盒的地方禁止饮食和吸烟。
4. TMB底物溶液和终止液可能对皮肤有刺激性。
5. 某些试剂盒含有叠氮化钠作保护剂，处理时需要用大量的水冲洗以免形成叠氮化铜或叠氮化铅，
它们在碰撞时可以爆炸。小心处理，防止防腐剂污染抗PRV gB 酶标记抗体。
6. 避免底物TMB被强光照射，或接触到氧化剂。盛装TMB溶液的容器要用干净的玻璃或塑料器皿。
7. 所有试剂一律2~7℃保存。所有试剂用前恢复至室温20~25℃；使用后再放回2~7℃。
8. 用过的材料在弃去前要进行无害化处理。
9. 小心操作防止试剂盒成分被污染。
10. 不要使用过期的试剂盒组分；禁止非同批试剂盒组分混用。
11. 严格按照操作程序，仔细地吸液、计时、充分洗涤，保持精确和准确，这样将获得最佳检测结
果。
样品和试剂盒对照准备
血清：
A：个体的血清：
用样品稀释液将被检血清样品和试剂盒提供的对照品作2倍稀释(如100μl血清加入100μl稀释液中)。确保每个样品换一个吸头，将每个检测样品在微量板上的位置记录到记录表上。稀释后的样品血清，在加入包被孔之前，要充分混匀。
下面的对于收集在滤纸上的干燥的血清和干燥的全血样本的测定方法只应用于法国的国家检测计划。在其他的国家，这种方法并未做过评估。
B：混合的血清（至多5只）：
1. 在微量试管或试管中混匀血清。
2. 个体血清样本（至多5钟个）各取10ul，放到同一试管内。
3. 旋转并混匀。混合血清样本的处理与个体血清样本相同，并用样品稀释液将样本按1：2稀
释（如100μl血清加入100μl样品稀释液中）。阳性对照血清和阴性对照血清按同样的方法，用样品稀释液按1：2稀释。并按照血清的标准操作进行。
滤纸：（Whatman 1或3号）
注意：用1×洗液按1：2比例稀释阳性对照血清和阴性对照（100μl血清加入100μl1×洗液中）。
A：个体的滤纸片样品：
1． 每只动物打下3个（直径为6mm）滤纸圆孔，并把它们放入干净的试管内。
2． 加300ul的1×洗液到试管内。
3． 旋转试管，确保所有的试纸浸没在液体下。
4． 在室温（20-25℃）孵育该试管2小时。
5． 旋转试管，确保所有的样本均被洗下，并收集液体（洗出液）。
B：混合的滤纸片样本：
1. 每只动物取3个孔（直径为6mm）滤纸（等于混合的5个动物取15个孔），并把它们放在干
净的试管内。
2. 加600ul的1×洗液到试管内。
3. 重复A的3-5的步骤。
洗涤液制备
使用前，将浓缩的洗液恢复到室温，摇动混合，使析出的盐类完全溶解。浓缩洗液（10×）在使用前需要用蒸馏水或去离子水按10倍稀释（如：每块板检测需要30ml浓缩洗液加270ml蒸馏水）。
操作步骤
注意：所有试剂在使用前一律恢复至室温（20~25℃）。试剂应该旋转或颠倒混匀。
1. 取出PRV抗原包被板，在记录纸（表）上记录样品位置。
2. 加100 μl 2倍稀释的阴性对照血清至A1、B1孔。
3. 加100 μl 2倍稀释的阳性对照血清至C1、D1孔。
4. 加100 μl处理好样品至相应的孔。
5.全部的单一血清样本和全部的混合血清样本的测试在室温（20~25℃）孵育1小时或2~7℃过夜孵
育（16-20小时）；其中从滤纸上得到的洗出液不必稀释，每孔100ul,要在2~7℃过夜孵育（16-20小时）。
6. 每孔用大约300 μl稀释好的洗液洗涤微孔3~5次。每次洗涤后，甩掉孔内的液体。在甩掉液体
后，加入酶标抗体前，避免孔壁变干。在最后一次甩干后，在吸水材料上轻扣板，彻底去掉剩余的液体。
7. 每孔加入100 μl抗PRV gB酶标抗体。
8. 室温（20~25℃）孵育20分钟。
9. 重复步骤6。
10. 每孔加100 μl TMB底物溶液。
11. 室温（20~25℃）孵育15分钟。
12. 每孔加入50 μl终止液终止反应。
13. 以空气作为空白对照对酶标仪进行空白设定。
14. 在650nm，A（650）测量和记录样品和所有对照的吸光值。
15. 计算结果。
试验有效性
要使试验有效，必须满足以下条件：
阴性对照平均值减去阳性对照平均值，其差必须大于等于0.30；如测定结果无效，首先应怀疑是操作技术，并在仔细阅读产品说明后重新检测。针对抗原成分的抗体的存在与否，通过计算每个样品的S/N值来决定。
具体方法参见样品结果的计算
结果判定
对于血清和全血样本：
A 快速模式： （1小时孵育/ 室温：20~25℃）
1. 若S/N比值小于或等于0.60，样品为PRV抗体阳性。
2. 若S/N比值小于或等于0.70但大于0.60，该样品必须被重测。如果结果相同，则过一段时间后
重新从动物取样进行检测。
3. 若S/N比值大于0.70，样品则为PRV抗体阴性。
B 过夜模式： （16-20小时/ 2~7℃）
1. S/N比值小于或等于0.50，样品为PRV抗体阳性。
2. 若S/N比值小于或等于0.60但大于0.50，该样品必须被重测。如果结果相同，则过一段时间后
重新从动物取样进行检测。
3. 若S/N比值大于0.60，样品则为PRV抗体阴性。
备注：通过重复确认所有阳性样品。
滤纸片测试：
A．过夜模式：（16-20小时/ 2~7℃）
1. 若S/N比值小于或等于0.70，样品为PRV抗体阳性。
2. 若S/N比值大于0.70，样品则为PRV抗体阴性。
注意：推荐对所有的阳性样本做进一步双份确认。
计算方法
1. 阴性对照平均值的计算（NC）
NC = A1 A(650)+B1 A(650)
2
2. 阳性对照平均值的计算（PC）
PC = C1 A(650)+D1 A(650)
2
3. 样品/阴性对照比率的计算（S/N）
S/N = 样本A(650)
NC
备注：北京爱德士元亨生物科技有限公司有实验数据分析（如平均值，阳性率）的软件(xChek)。
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