烟草瞬时转化实验步骤

烟草叶片瞬时转化实验

试验方法

一、实验材料及药品

pCAMBIA 1381Z-Luc载体、Gv3101农杆菌菌株及其感受态、MES、MgCl2、乙酰丁香通、5-6周本氏烟草等

二、载体构建及农杆菌转化

烟草瞬时转化实验选用融合Luc信号的pCAMBIA 1381Z-Luc载体，载体构建过程是将拟南芥及菊花的FT启动子分别采用双切双连的常规载体构建方式将启动子构建到pCAMBIA 1381Z-Luc载体上，同时将目的基因构建到pMDC43或pMDC32或pORE载体上作为超表达载体进行后续的瞬时转化实验。

通过农杆菌转化的方式，将上述构建好的质粒转化到农杆菌菌株GV3101的感受态细胞中。

三、材料的准备

1、烟草植株5-6周幼嫩未开花植株

2、携带质粒的农杆菌（GV3101或An105均可）

3、YEB培养液（一瓶+K+R、一瓶只+R——pCAMBIA 1381Z-Luc载体为卡纳氯霉素抗性、Gv3101只有r抗性）

4、处理液：10mL配方如下母液配方（10ml配方）：

0.5M MES 200ul 0.976g

1M MgCl2100ul 2.03g

100mM乙酰丁香酮10ul 0.196g（使用DMSO溶解）

灭菌水加至10ml （若长时间保存，需避光！）

四、操作步骤

1、农杆菌转化

2、转化正确的农杆菌进行过夜培养，同时培养P19菌株（最好先进行划线）

3、确定不同农杆菌所加菌液的量：

计算公式：V=n×Vfinal×0.5/OD600 VP19= n×Vfinal×0.3/OD600 OD600最好在1以上n=注射叶片数Vfinal=悬浮后的终体积多为2ml或3ml 注：在进行转录激活或抑制实验时，一般加入四种农杆菌（包括P19）而对照组往往只加入两种或三种菌液，此时，应使用Gv3101对体系进行补充，计算方法为公式一，具体加入量视对照组缺失的量确定，分别加入一倍或两倍Gv3101进行补充。

4、将计算出的各菌液体积进行混匀（此时各菌液实际浓度比例为1:1:1），5000rpm，5min

5、弃上清，用Vfinal（2ml或3ml）悬浮液进行悬浮，随后室温避光放置3h

6、利用无针头注射器注射叶片（先用针头在叶片上扎一个小孔）（注射烟草顶端以下第3-5片叶片）

7、暗培养1d，转入光照培养1-2d

8、利用稀释好的荧光素酶底物喷施到叶片上，黑暗下放置1-2min，随后利用CCD 冷冻相机进行观察。

荧光素酶的配置：固体0.032g溶解于1ml 灭菌水中，用前吸取该溶液100ul 稀释到10ml水中，并加入10ul Triton-X-100（全程避光）。

烟草遗传转化实验

烟草遗传转化实验文件管理序列号：[K8UY-K9IO69-O6M243-OL889-F88688]

实验八植物细胞悬浮培养 实验目的：学习和掌握植物细胞悬浮培养的操作技术与方法。 实验器材： 超净工作台、恒温培养室、高压灭菌器、冰箱、恒温培养箱、培养瓶、250 mL 、500 mL三角瓶、镊子、酒精灯等。 配置MS液体培养基（2，4-D 2 mg/L+1%甘露醇 +3% 蔗糖，pH 5.8）分装于250ml的三角瓶中，每瓶50ml。 实验材料：烟草叶片愈伤组织。 实验方法： 1.70%乙醇净化工作台并擦洗干净，将所用的材料、工具、培养基等放入 工作台。打开紫外灯和风机，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。 2. 在超净台上用无菌镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入150ml 三角瓶中并轻轻夹碎,每个三角瓶加入培养基20-30ml，每瓶接种1-2g愈伤组织，按愈伤组织与液体培养基1∶10的比例，以保证最初培养物中有足够量的细胞。 3.接种后的三角瓶用天平称取重量并记载，然后置于摇床上，在转速 100-120rpm，25℃下培养以及散射光条件下，进行振荡悬浮培养。4.每周更换新鲜液体培养基两次，每次更换1/3。每次更换新鲜培养基时 称取重量。 5. 每个人接种悬浮培养细胞1瓶，观察并记录细胞生长情况。 6. 培养7天后，制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图： 鲜重法：在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标，绘制 鲜重增长曲线。 烟草遗传转化实验 实验目的

亚细胞定位之烟草转化方法

本氏烟草（N. benthamian）瞬时表达及相关实验方法： 一、农杆菌介导的烟草瞬时转化： A、实验步骤： 1、根据实验需要，将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中，并转化农杆菌。 2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中，28℃，200rpm过夜。 *估算时间，防止农杆菌液浓度超过1OD，否则会影响转化效率。 3、当菌液OD值介于0.6~1.0之间时，1000g，5min离心收集农杆菌。 4、用2ml Induction medium（without AS）轻柔重悬农杆菌，然后再次离心收集菌液。 5、重复步骤4。 6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬。 7、室温放置1~4小时 8、测OD值，根据实验需要，配置侵染液（组合详见下文）。 9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中。 *使用注射器时注意安全，防止针头扎到手，使用完的注射器要把针头套套上再扔，或者将针头放到注射器里面，避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套，防止交叉污染。B、试剂： Induction medium： MES-KOH PH 5.7 10mM MgCl210mM AS 200uM 推荐提前配制母液 1M MES-KOH PH5.7 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。 1M MgCl2 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。 0.2M AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌，分装（避免反复冻融），-20℃。用高压灭菌的超纯水稀释。 C、关于表达时间： 烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间，一般注射24小时之后到一周之内都会有表达。严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段，但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观，不要错过。 D、关于侵染液浓度： 推荐每个菌株的浓度在0.1~0.2之间。过高的农杆菌浓度会引起叶片萎蔫甚至枯萎。

烟草组培苗实验步骤

烟草叶片的组织培养 一、实验原理与实验步骤 在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。 植物材料：烟草植株 药品：（2,4-D、NAA、6-BA浓度均可）、1mol/L NaOH、1mol/L HCL 蒸馏水、70%酒精0.01%升汞 仪器：玻璃杯、玻璃棒、pH试纸(5.5-9.0) 、1瓶无菌水、1个无菌烧杯、1包无菌滤纸、 1个无菌白瓷板、培养瓶若干移液器、微波炉、灭菌器、超净工作台、酒精灯、解剖刀、镊子 二、实验方法与步骤

注意： 1、大量元素按照使用时高10倍的数值称取，分别将各种化合物称量后，除CaCl2·2H2O单独配制外，其余化合物混合在500ml烧杯中加适量蒸馏水溶解，用玻璃棒搅拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合物名称（或编号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaCl2·2H2O配制同上置于另一小口瓶中。 2、微量元素母液的配制 按要求浓缩100倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐（FeSO4·7H2O 和Na2-EDTA.2H2O）作为一组单独配制外，其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后，定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，贴上标签 3、铁盐配制将FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于450ml蒸馏水中，加热，（很重要）不断搅拌，溶解后，两液混合，调PH至5.5加水定容至1000ml，置于小口瓶中，贴上标签。 4、有机物母液配制，按母液要求浓缩50倍，除蔗糖按3%单独临时称量外，其余分别称量后，溶解，定容在500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，贴上标签。5．母液最好在2~4℃的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。（1）制备母液和营养培养基时，所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求，化学药品必须是高纯度的（分析纯）。 （2）称量药物采用高灵敏度的天平，每种药品专用一药匙。 生长调节剂母液配制： 为了操作方便，节约时间，生长调节剂也可如同配制母液一样，先配成原液，这样配制培养基时只要稍加计算，按需要量取即可。 不同药品在配制时若不溶于水，可用少量不同的溶剂先溶解，萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA）,赤霉素（GA3），2，4-D等生长素和玉米素（ZT）可先用少量95%酒精溶解，然后加水，如溶解不完全再加热。激动素（KT）和6-苄基嘌呤（BA）可溶于少量1mol/L的盐酸中，叶酸需用少量稀氨水溶解。 称取50mg生长调节物质，溶解后，在100ml的容量瓶中定容，配制的母液每毫升则含有生长调节物质0.5mg，配制后一般要求在低温（0~4℃）保存，配制培养基时如每升（1000ml）需添加的生长调节剂物质为0.5mg时，则取1ml母液即可。 三、培养基配制和灭菌 本次实验使用 （1）愈伤组织诱导及其幼芽分化培养基:MS+2,4-D 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L；（2）幼芽增殖培养基：MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L； （3）生根培养基：MS+NAA 0.2 mg/L。 注意事项：上述培养基均在MS固体培养基溶化后降低到50左右后，加入相应激素所得， MS固体培养基的配置过程在此不作过多赘述

烟草瞬时转化相关文献

Systemic Agrobacterium tumefaciens–mediated transfection of viral replicons for ef?cient transient expression in plants Sylvestre Marillonnet 1,2,Carola Thoeringer 1,2,Romy Kandzia 1,Victor Klimyuk 1&Yuri Gleba 1 Plant biotechnology relies on two approaches for delivery and expression of heterologous genes in plants:stable genetic transformation and transient expression using viral vectors.Although much faster,the transient route is limited by low infectivity of viral vectors carrying average-sized or large genes.We have developed constructs for the ef?cient delivery of RNA viral vectors as DNA precursors and show here that Agrobacterium–mediated delivery of these constructs results in gene ampli?cation in all mature leaves of a plant simultaneously (systemic transfection).This process,called ‘magnifection’,can be performed on a large scale and with different plant species.This technology combines advantages of three biological systems (the transfection ef?ciency of A.tumefaciens ,the high expression yield obtained with viral vectors,and the post-translational capabilities of a plant),does not require genetic modi?cation of plants and is faster than other existing methods. Viral vectors designed for expression of recombinant proteins in plants hold great promise because of high absolute and relative yields,and because of the speed provided by transient expression.Most of the results of practical interest achieved so far have been obtained with vectors built on the backbones of plus-sense RNA viruses such as tobacco mosaic virus (TMV)or potato virus X 1–4. We have recently shown that TMV-based vectors can be delivered to plant tissues using A.tumefaciens 5(agroinfection).However,one step of this process,namely the formation of active replicons from the primary nuclear transcript,is inef?cient.In a standard leaf transfec- tion experiment,this inef?ciency is masked by the subsequent ability of the replicons to move to neighboring cells by cell-to-cell movement.Here we show that this bottleneck can be fully remedied by incorpora-tion of silent nucleotide substitutions into the vector and by addition of multiple introns.We demonstrate that such modi?cations provide for ef?cient processing of the DNA information into active replicons in almost all cells (as high as 94%)of Nicotiana benthamiana ,an up to 1,000-fold improvement over nonoptimized TMV-based vectors,and an even higher improvement (4106-fold)in Nicotiana tabacum (tobacco).Finally,we show that the resulting vectors allow the development of a fully scalable and versatile whole-plant transfection protocol,that we term magnifection,for production of heterologous proteins in plants. RESULTS Viral replication following agroin?ltration of TMV-based vectors Agroin?ltration of a TMV-based viral vector containing the gene encoding green ?uorescent protein (GFP)(pICH16707,Fig.1a )into N.benthamiana leaves leads to the formation of foci of GFP ?uorescence 3d post-in?ltration (d.p.i.)(shown in ref.5and in Supplementary Fig.1online).T o quantify the proportion of cells initiating viral replication,a 489-bp deletion was made within the movement protein (MP)coding sequence,resulting in construct pICH14833(Fig.1a ).Replicons derived from this construct cannot move from cell-to-cell but are able to replicate autonomously within each infected cell.Three days after agroin?ltration of pICH14833in N.benthamiana leaf (OD 600of the A.tumefaciens in in?ltration solution was 0.7),a small number of cells expressing GFP appeared (see Supplementary Fig.1online),and the same pattern was still visible 2weeks after in?ltration.By counting protoplasts prepared from the in?ltrated area (Figs.1and 2),we found that 0.6–1.6%of cells initiated viral replication. There are several reasons why RNA viral vectors might have dif?culties starting the replication cycle.First,RNA viruses,such as TMV ,replicate in the cytoplasm and never enter the nucleus,and have therefore evolved in an environment where they are not exposed to the nuclear pre-mRNA processing machinery.As a result,pre-mRNA transcripts made in the nucleus from viral constructs may not be re-cognized and processed properly.Second,viral vector constructs encode very large transcripts (B 7.6kb for the primary transcript of a viral vector containing a GFP gene),a size much larger than the average size (1–2kb)of plant genes.Moreover,in nature,large eukaryotic genes often contain numerous introns that facilitate processing and export of the pre-mRNAs from the nucleus 6.We therefore hypothesized that modi?cations of the constructs that would increase the ef?ciency of processing and export of primary transcripts from the nucleus to the cytoplasm could lead to an increase in the number of cells that would initiate viral replication.Two types of modi?cations were made: Published online 8May 2005;doi:10.1038/nbt1094 1Icon Genetics,Biozentrum Halle,Weinbergweg 22,D-06120Halle (Saale),Germany.2These authors contributed equally to this work.Correspondence and requests for materials should be addressed to Y.G.(gleba@icongenetics.de).A R T I C L E S ?2005 N a t u r e P u b l i s h i n g G r o u p h t t p ://w w w .n a t u r e .c o m /n a t u r e b i o t e c h n o l o g y

农杆菌介导的瞬时表达系统

农杆菌介导的瞬时表达系统 一．溶液配制 乙酰丁香酮AS 0.1M，取0.101gAS溶于5mLDMSO中，在工作台上用灭过菌的0.45μM滤膜过滤,分装入无菌小管，-20℃冰冻保存； MES 1M 调pH=5.6，过滤除菌； MgCl2 1M 过滤后灭菌； Kan 终浓度100mg/ml，过滤除菌。 (AS ，MES均购自泰安齐旺试剂公司) YEB过夜培养液(30ml) MES AS Kan 10mM 20μM 50μg/ mL 300μl 6μl 15μl 悬浮培养液(50ml) MES 10mM 500μl AS 200μM 100μl MgCl2 10mM 500μl YEB培养基(pH 7.2) 酵母膏 牛肉膏 蛋白胨 蔗糖 MgSO4·7H2O 1g/L 5g/L 5g/L 5g/L 493mg/L 二．操作步骤 1. 挑起单个农杆菌菌落，接种3mL YEB培养基（含抗生素）在200r/min，28℃摇床培养过夜，储存时间比较长的菌液可多活化两次； 2. 接种2mL过夜培养的50mL的YEB液体培养基（含抗生素，10mM MES和20μM乙酰丁香酮），28℃摇床培养2-4h； 3. 将上述过夜培养菌液在4℃，8000g下离心6min，收集菌体； 4. 用渗透培养液重新悬浮沉淀的农杆菌细胞。调节浓度OD600至0.5-1.0（一般需要100-150mL渗透培养液），置室温培养至少3小时，无需振荡； 5. 对需要渗透处理的烟草植株无一定大小要求，一般4-5叶期，已经生长一个月左右的本生烟比较合适。一般渗透处理下部2-3个比较大的叶片。用针头在需要渗透处理的叶片背面非常细微地扎一细小的浅微孔，然后用3mL的无针头的注射器吸取2-3mL悬浮有农杆菌的渗透培养液，从针孔处将培养液轻微的注入叶片内。注意用一手指从叶片下面拖住叶片，将注射器平平地堵住针孔，不让液体从叶片边缘挤压出来。注射区域接近叶片边缘即可或根据自己的实验目的决定； 6. 将处理过的烟草放回温室，照常管理。一般沉默发生在2-5天内； 7. 在暗室里，利用长波紫外灯（MODEL SB-100P/F,365nm）观察渗透处理过的叶片，并拍照记录叶片侵染区绿色荧光表达的变化过程。

烟草农杆菌转化实验步骤1

烟草农杆菌转化实验 实验配方：1L RMOP: 20×大量元素50ml 200×微量元素5ml 200×有机5ml 200×铁盐5ml 3%蔗糖30g 0.8%琼脂（国产）4g/500ml 灭菌后，每500ml培养基加入: 0.1mg/L NAA 1mg/ml NAA 50μL 1mg/L 6-BA 1mg/ml6-BA 500μL YEB: 液体培养基：1L 酵母提取物1g 牛肉膏5g 蛋白胨5g 蔗糖5g MgSO4?7H2O 0.5g pH7.0 高压灭菌。 固体培养基： 每升YEB 液体培养基加15g 琼脂粉，高压灭菌。 卡那霉素（Kan）储液：100mg/ml 利福平（Rif）储液：50mg/ml YEB 固体培养基平板: 灭菌后的YEB 固体培养基待其温度降至50℃时加入卡那霉素（Kan）和利福平（Rif），至终浓度为50mg/l，混匀后立即倒入培养皿，凝固后4℃倒置保存。 一．农杆菌感受态细胞的制备 （1）划线活化农杆菌，挑取农杆菌单菌落于3ml的YEB液体培养基（含Rif 50mg/l）中，28℃振荡培养过夜； （2）取过夜培养菌液1ml接种于50ml YEB（Rif 50mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5； （3）取2ml菌液，13000rpm，离心30sec, 弃上清； （4）加入10ml 0.1M CaCl2，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30min；

（5）13000rpm，离心30sec，弃上清，置于冰上，加入2.5ml预冷的0.1M CaCl2，充分悬浮细胞，分装在1.5ml EP管中，液氮中速冻1min，置-80℃冰箱保存备用。二．质粒DNA导入农杆菌 ①电转法： 1.取农杆菌感受态在冰上冻融； 2.加2μL质粒DNA于100μL感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀； 3.然后再将其转入电转杯中（不要产生气泡），在2500V高压下电击； 4.取出电转杯，加入500μL预冷的YEB培养基（不含抗生素），轻轻吹打混匀，吸出菌液转入1.5ml离心管中，28℃，200rpm振荡培养5h； 5.取30-40μL菌液涂在含相应抗生素（50mg/l Kan和50mg/l Rif）的YEB平板上，28℃倒置培养1.5-2天； 6.挑选单菌落PCR检测，将阳性菌落保存。 ②冻融法： 1、在200μl感受态细胞中加入2－6μl质粒DNA，冰浴5min，液氮中速冻5min； 2、迅速转入37℃水浴中，热激5min； 3、加入1ml YEB（不含抗生素）液体培养基，28℃慢速振荡培养2－4小时； 4、3000rpm离心4min，去一部分上清，留取200μl菌液涂布于含有50mg/l Kan 和50mg/l Rif的YEB平板； 5、放置约0.5h，待水份干后，28℃培养约24小时至长出菌落。 6、挑选单菌落PCR检测，将阳性菌落保存。 三．烟草遗传转化实验 ①准备农杆菌 （1）将农杆菌在平板上划线，从平板上挑取单菌落，接种到20mL附加相应抗生素（kan 50mg/L, Rif 50mg/L）的YEB液体培养基中，在恒温摇床上，于28℃下以180r/min培养至OD600为0.6~0.8（约需17h）。 （2）将OD600为0.6~0.8的菌液，按1%~2%的比例，转入新配制的无抗生素（含Rif）的YEB液体培养基中，可同时加入100~500μmol/L的乙酰丁香酮。在上述相同的条件下再培养6h左右，待OD600为0.2~0.5时即可用于转化。

农杆菌介导的基因瞬时表达技术及其应用

龙源期刊网 https://www.wendangku.net/doc/6d7884084.html, 农杆菌介导的基因瞬时表达技术及其应用 作者：宋建刘仲齐 来源：《天津农业科学》2008年第01期 摘要：主要介绍了农杆菌介导的基因瞬时表达方法的原理、技术、影响因素及其在外源基因表达分析、启动子分析、基因沉默及防卫反应等方面的应用。 关键词：农杆菌；植物；基因瞬时表达 中图分类号：Q789文献标识码：A文章编号：1006—6500(2008)01—0020—03 把外源基因导入受体植物内，是研究基因功能和获得遗传修饰有机体的主要手段。农杆菌介导法是目前最常用的遗传转化方法，当农杆菌感染植物受伤组织后，质粒上的目标基因可以进入植物细胞内并整合到植物染色体中，这种转化细胞经过诱导分化，再生成为转基因植株。通常大多数植物的遗传转化和再生效率低下，费时且费用昂贵。即使对于转化程序大大简化的植物，例如拟南芥，仍然需要花费数月的时间来产生适合分析的转基因植株。农杆菌介导的瞬时表达提供了一种快速分析基因型功能的方法，该方法是Rossi等在1993年创建的。他们将带有重组质粒的农杆菌，经诱导后通过抽真空渗透入植物叶片进而渗透入植物细胞，通过目的基因瞬时表达来检测植物中农杆菌介导的T-DNA转移的效率。随后人们又采用针管注射活体植株叶片，来进行农杆菌介导的基因瞬时表达检测。近几年该项技术不断完善、发展，已被广泛用于外源基因表达分析、无毒基因与抗性基因的相互作用、基因沉默、启动子分析等许多植物分子生物学领域。 1主要原理 农杆菌介导的瞬时表达是将目的基因插入共整合载体或双元载体，转化根癌农杆菌，后者经酚类化合物诱导处理后，通过真空渗透或针管注射入植物叶片组织中，农杆菌在叶片内与植物细胞紧密接触。诱导处理在转录水平激活Vir区基因，真空渗透或注射使得农杆菌与植株叶片细胞接触，从而实现了T-DNA转移进入植物细胞核。大部分T-DNA并未整合入植物基因组而是暂时存在于核内并在植物细胞转录、翻译成分的协助下瞬时表达T-DNA基因，通常在数小时后即可检测到外源基因的表达，并在1～2d内达到最高值。而少量整合进植物染色体的 T-DNA在瞬时表达中不起作用或极为微弱。

烟草栽培学实验指导书

目录 实验一烟草形态与类型的观察与识别 (2) 实验二育苗技术观察 (5) 实验三烤烟烟苗素质考察 (10) 实验四主要栽培技术与烤烟生长分析 (11) 实验五打顶时期与留叶数对叶片生长的影响观察 (12) 实验六烤烟叶片经济性状考察 (13)

实验一烟草形态与类型的观察与识别 一、目的 通过观察烤烟根、茎、叶等器官构造与形态，建立对烟草初步的感性认识；观察掌握不同类型烟草的形态特征并能识别。 二、内容 观察烤烟植株形态及根、茎、叶等器官特征，观察烤烟、白肋烟、香料烟、晒烟、晾烟、黄花烟六种类型的外观特征，并能描述。 1、烤烟 烤烟亦称火管烤烟，源于美国的弗吉尼亚州，具有特殊的形态特征，因而也被称为弗吉尼亚型。烤烟的主要特征是植株高大，叶片分布较疏而均匀。一般株高120-150cm，单株着叶20-30片，叶片厚苤适中，中部的质量最佳。栽培上不宜施用过多的氮素肥料。叶片自下而上成熟，分次采收最初的调制方法也是晾晒。后来（1869）年改用火管烘烤。目前是在烤房内调制，烤后呈金黄色。其化学成分的特点是含糖量较高，蛋白质含量较低，烟碱含量中等。烤烟是我国也是世界上栽培面积最大的烟草类型，是卷烟工业的主要原料，也被供作斗烟。世界上生产烤烟的国家主要有中国、美国、印度，其次是巴西、津巴布韦、泰国、加拿大、日本等。我国烤烟种植面积和总产量都居世界第一位。重点产区有河南、山东、云南、贵州、黑龙江、湖南、湖北、陕西、安徽等省，四川、广东、福建、辽宁、江西、广西、吉林等省（区）也有较大面积的栽培。 2、晒烟 晒烟的烟叶利用阳光调制，主要有晒红烟与晒黄烟。一般晒黄烟外观特征和所含化学成分与烤烟相近，而晒红烟则同烤烟差别较大。晒红烟的叶片一般较少，叶肉较厚，分次采收或一次采收，晒制后多呈深褐色或褐色，以上部叶片质量最好。烟叶一般含糖量较低，蛋白质和烟碱含量较高，烟味浓，劲头大。晒烟主要用于斗烟、水烟和卷烟，也作为雪茄芯叶、束叶和鼻烟、嚼烟的原料。此外，有些晒烟还可以加工成杀虫剂。世界上生产晒烟的主要国家是中国和印度。我国各省都有晒烟种植，但分布零散，比较集中的有四川、广东、贵州、湖南、湖北、云南、吉林、山东、陕西等省。 3、晾烟 晾烟有浅色晾烟（白肋、马里兰）和深色晾烟之别，都是在阴凉通风场所晾制而成。而其中的白肋烟、马里兰烟和雪茄包叶烟因别具一格，均已自成一类。但在我国，除将白肋烟单独作为一个烟草类型外，其余所有的晾制烟草，包括雪茄包叶烟、马里兰烟和其他传统晾烟，均归属于晾烟类型。 4、白肋烟 白肋烟是马里兰深色晒烟品种的一个突变种。1864年美国俄亥俄州布朗县的一个农场在马里兰阔叶烟苗床里初次发现了奶黄色的突变烟株，后经专门种植

烟草瞬时转化实验步骤

烟草叶片瞬时转化实验 试验方法 一、实验材料及药品 pCAMBIA 1381Z-Luc载体、Gv3101农杆菌菌株及其感受态、MES、MgCl2、乙酰丁香通、5-6周本氏烟草等 二、载体构建及农杆菌转化 烟草瞬时转化实验选用融合Luc信号的pCAMBIA 1381Z-Luc载体，载体构建过程是将拟南芥及菊花的FT启动子分别采用双切双连的常规载体构建方式将启动子构建到pCAMBIA 1381Z-Luc载体上，同时将目的基因构建到pMDC43或pMDC32或pORE载体上作为超表达载体进行后续的瞬时转化实验。 通过农杆菌转化的方式，将上述构建好的质粒转化到农杆菌菌株GV3101的感受态细胞中。 三、材料的准备 1、烟草植株5-6周幼嫩未开花植株 2、携带质粒的农杆菌（GV3101或An105均可） 3、YEB培养液（一瓶+K+R、一瓶只+R——pCAMBIA 1381Z-Luc载体为卡纳氯霉素抗性、Gv3101只有r抗性） 4、处理液：10mL配方如下母液配方（10ml配方）： 0.5M MES 200ul 0.976g 1M MgCl2100ul 2.03g 100mM乙酰丁香酮10ul 0.196g（使用DMSO溶解） 灭菌水加至10ml （若长时间保存，需避光！） 四、操作步骤 1、农杆菌转化 2、转化正确的农杆菌进行过夜培养，同时培养P19菌株（最好先进行划线） 3、确定不同农杆菌所加菌液的量： 计算公式：V=n×Vfinal×0.5/OD600 VP19= n×Vfinal×0.3/OD600 OD600最好在1以上n=注射叶片数Vfinal=悬浮后的终体积多为2ml或3ml 注：在进行转录激活或抑制实验时，一般加入四种农杆菌（包括P19）而对照组往往只加入两种或三种菌液，此时，应使用Gv3101对体系进行补充，计算方法为公式一，具体加入量视对照组缺失的量确定，分别加入一倍或两倍Gv3101进行补充。 4、将计算出的各菌液体积进行混匀（此时各菌液实际浓度比例为1:1:1），5000rpm，5min 5、弃上清，用Vfinal（2ml或3ml）悬浮液进行悬浮，随后室温避光放置3h 6、利用无针头注射器注射叶片（先用针头在叶片上扎一个小孔）（注射烟草顶端以下第3-5片叶片） 7、暗培养1d，转入光照培养1-2d 8、利用稀释好的荧光素酶底物喷施到叶片上，黑暗下放置1-2min，随后利用CCD 冷冻相机进行观察。

烟草瞬时表达步骤 电子版

亚细胞定位准备(用烟草ck) MS无抗培养基倒平皿，铺二层滤纸于培养基上；吸水纸（卫生纸一卷），小滤纸，用10ml 离心管代替打孔器，50ml离心管；小三角瓶（均需要灭菌，115℃，30min） 1.将保存的农杆菌划线（kan+rif）,第三天中午挑菌于（kan+rif）LB培养基中28-30℃，摇 床20h至第四天早上； 2.以1:25比例（1ml接种于25ml）接菌液于25mlLB(含kan+rif，50nmAS)28-30℃，摇床 培养至OD=0.6-0.8，约5h。 3.用50mL离心管收集菌体，常温，5000rpm，离心5min,弃上清； 4.用以下溶液重悬菌体等体积25ml(10mM MgCL2，10mM MES, 150nM AS)放入小三角瓶， 室温下静置活化2h，（铺滤纸于已凝的无抗MS培养基）； 5.将叶片打孔，圆状的叶片浸泡在菌液中，真空渗透30min-1h（0.85Mpa）。 6.用灭菌的吸水纸吸干表面的菌液，平铺放置于MS培养基上，光照培养48h。 7.观察。 GUS定量分析 所用试剂： 1、0.1M磷酸缓冲液）（pH7.0） 1M Na2PO4 11.54ml 1M NaH2PO4 8.46ml Add ddH2O TO 200ml 2、GUS 蛋白提取液 (现用现配) 0.1M磷酸缓冲液（pH7.0） 100ml 10% SDS 2ml 0.5M EDTA(Ph8.0) 4ml Tritonx-100 200ul β-巯基乙醇 200ul add ddH2O TO 200ml 121℃灭菌室温保存 3、gus蛋白分析buffer 每100ml的蛋白提取液加入4-MUG 70.46mg,-20℃保存，现配现用。 4、0.2M Na2CO3 buffer。 Gus蛋白提取方法（全过程于冰上操作） ?取适量烟草叶片，加入适量PVP,加液氮研磨成粉末，取约0.6g装入15ml离心管中?预先加入500ml蛋白提取液，摇匀，在冰上放置置沉淀 ?4℃，13000prm离心15min. ?吸取上清到另一管中进行下一步实验，（未及时做放-20℃） Gus活性测定 ?取20ul蛋白加入37℃预热的180ulgus 蛋白分析buffer中，37℃温浴。 ?20min,30min,40min,50min各取50ul加入950uL的0.2M Na2CO3 buffer中终止反应（注意设置重复） ?样品转入酶标板上，使用酶标仪检测荧光强度（x 365nm/455nm） 180ul x 蛋白标准曲线 y=0.0022x+0.3620(R2=0.9966)

烟草遗传转化实验

实验八植物细胞悬浮培养 实验目的：学习和掌握植物细胞悬浮培养的操作技术与方法。 实验器材： 超净工作台、恒温培养室、高压灭菌器、冰箱、恒温培养箱、培养瓶、250 mL 、500 mL三角瓶、镊子、酒精灯等。 配置MS液体培养基（2，4-D 2 mg/L+1%甘露醇 +3% 蔗糖，pH 5.8）分装于250ml的三角瓶中，每瓶50ml。 实验材料：烟草叶片愈伤组织。 实验方法： 1.70%乙醇净化工作台并擦洗干净，将所用的材料、工具、培养基等 放入工作台。打开紫外灯和风机，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。 2. 在超净台上用无菌镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入 150ml三角瓶中并轻轻夹碎,每个三角瓶加入培养基20-30ml，每瓶接种1-2g愈伤组织，按愈伤组织与液体培养基1∶10的比例，以保证最初培养物中有足够量的细胞。 3.接种后的三角瓶用天平称取重量并记载，然后置于摇床上，在转速 100-120rpm，25℃下培养以及散射光条件下，进行振荡悬浮培养。 4.每周更换新鲜液体培养基两次，每次更换1/3。每次更换新鲜培养 基时称取重量。 5. 每个人接种悬浮培养细胞1瓶，观察并记录细胞生长情况。 6. 培养7天后，制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图： 鲜重法：在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标，绘制鲜重增长曲线。

烟草遗传转化实验 实验目的 烟草是遗传转化的模式植物，已经建立了一套完善的转化再生体系。本实验以烟草为实验材料，了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤，掌握遗传转化的基本操作技术。实验要求： 掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法；理解农杆菌介导途径进行基因转化的机理；了解转基因植物筛选的方法。 实验原理 根癌农杆菌是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒，简称为Ti质粒。野生型农杆菌的Ti质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T－DNA 区，含致瘤基因；另一个是毒性区，在T－DNA的切割、转移与整合过程中起作用。用于植物基因转化的农杆菌Ti质粒载体系统的构建，是将野生Ti质粒中的致瘤基因删除，并在T－DNA区域内插入适当的选择标记和多克隆位点。 p BI121载体是常用的植物表达载体，载体的骨架是pUC18，以CaMV35S启动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因NPTII为卡那霉素（kan）抗性选择标记基因，含有卡那霉素抗性基因作为筛选基因。β－葡萄糖苷酶gus基因作为报告基因，转化的获得的转基因细胞、组织或植株，具有抗卡那霉素的特性，经组织化学染色呈蓝色。 实验器材 摇床、超净工作台、小型离心机、冰箱、移液抢、镊子、手术刀、酒精灯、棉球、培养皿、三角瓶、滤纸、牛皮纸、牙签。 实验材料 植物材料：烟草无菌苗 农杆菌与载体：农杆菌LBA4404 p BI121 YEB培养基：牛肉膏(5 g/L)、蛋白胨(5 g/L)、酵母提取物(1 g/L)、蔗糖(5 g/L)、MgSO4 (0.5 g/L)、pH 7.0 烟草分化培养基：MS + 2mg/L 6-BA + 0.5mg/L IAA 烟草生根培养基：MS + 0.5mg/L IAA 卡那霉素（Kan）母液：50mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。 头孢霉素（cef）母液：300mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。 利福平(rif): 50mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。

[烟草亚细胞定位]农杆菌瞬时侵染烟草-激光扫描共聚焦法

[植物科学领域]利用农杆菌侵染烟草进行体内瞬时表达的方法 Method for transient expression in vivo by infecting tobacco with Agrobacterium 一、原理（Principle） 烟草叶片的瞬时表达系统常用来进行基因的亚细胞定位监测，监测蛋白在细胞中分布的位置，从而对其功能进行预测。通过基因翻译的蛋白与绿色荧光蛋白构成融合蛋白，在激光共聚焦仪器下观测绿色荧光的分布，判断蛋白表达的部位。同时，还可根据荧光的光强度检测蛋白的表达量。该过程是经根癌农杆菌介导的，进而将目的基因整合到到烟草的细胞内的。 Tobacco leaf transient expression systems are often used to monitor the subcellular localization of genes, monitor the distribution of proteins in cells, and predict their function. The gene translated protein and green fluorescent protein constitute a fusion protein. The distribution of green fluorescence is observed under a laser confocal instrument to determine the protein expression site. At the same time, the expression level of the protein can also be detected based on the light intensity of the fluorescence. This process is mediated by Agrobacterium tumefaciens, which integrates the gene of interest into tobacco cells. 二、材料与试剂 1. 携带表达载体的农杆菌菌株（通常表达载体由35S启动子驱动） 2. 2-4周的烟草植株 3. LB培养基 4. 乙酰丁香酮 5. MES: 2-(N-吗啉代)乙磺酸 6. 抗生素 7. 注射器 Materials and reagents 1. Agrobacterium strain carrying an expression vector (usually the expression vector is driven by the 35S promoter) 2. Tobacco plants for 2-4 weeks 3.LB medium 4.Acetosyringone 5.MES: 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid 6.Antibiotics 7. syringe 三、仪器 1. 50 ml 离心管 2. 光谱仪 3. 紫外灯 4. 荧光显微镜 Third, the instrument 1. 50 ml centrifuge tube 2. spectrometer 3. UV lamp 4. fluorescence microscope

烟草转化及CoIP方法

CoIP protocol From Guo Siyi 烟草转化体系 将含有正确构建质粒的阳性农杆菌克隆在YEB 液体培养基中培养过夜，到OD600 约 1.5 左右（大约20h），同时摇菌P19，它能有效抑制植物对外源导入载体表达的沉默效应，提高表达量。然后收集菌体，5000 rpm 5min 常温离心，将菌体用侵染缓冲液（10 mM MES，100 μM AS-乙酰丁香酮，50 mM MgCl2）重悬，用紫外分光光度仪测定OD600 值；根据实验要求将含有不同载体组合的菌液混合，同时在每一个组合中也加入P19，最终使得每种菌液成分的OD600 在0.8 左右；然后将混合的菌液在28 ℃下以200 rpm 的转速再培养至少3 h，然后注射合适大小的烟草叶片。尽可能多的注射烟草叶片，并标记下注射的叶片及对应区域；之后用保鲜膜封闭，在暗中培养2 d，然后再转入光下培养2-3 d，并取材在荧光显微镜下观察GFP 的荧光已确定烟草叶片中外源载体的表达情况，视情况取材做后续的实验。 免疫共沉淀（CoIP） 将VER2，TaGRP2 与不同的标签蛋白融合如FLAG-VER2，TaGRP2-GFP，将该载体转化农杆菌获得阳性克隆，然后共同用农杆菌侵染的方法转化烟草。至少设定两组样品：即FLAG-VER2/TaGRP2-GFP 以及FLAG-VER2/GFP。检测目的蛋白是否表达：用Bradford 法测定提取蛋白的浓度，然后用SDS-PAGE 分离蛋白（15-30 μg protein/lane）做Western Blot 用（WB）标签抗体FLAG，GFP 检测融合蛋白是否在烟草中表达。并根据WB 的结果估算实验组（FLAG-VER2/TaGRP2-GFP）与对照组（FLAG-VER2/GFP）的蛋白相对表达量。 Pre-clear：（所有步骤尽量在冰上进行） 取两份30 μL protein A/G beads 到EP 管中放于冰上，用600 μL 的蛋白提取buffer 重悬beads，4 ℃离心1000 g 1 min。冰上静止1 min，弃上清。（重复此操作3 次） 将适量蛋白溶液（根据WB 结果，调整实验组和对照组蛋白样品，使得目的蛋白的表达基本相当，总蛋白在400-600 μg，溶液总体积在1 mL 左右，可用蛋白提取buffer 补齐）加入beads 中，4 ℃颠倒混匀1-2 h；然后4 ℃离心2000g 1 min，将上清转移至新EP 管中，取20 μL 样品待用，即Input。 免疫沉淀： 将上清中加入适量的GFP 抗体，根据WB 结果来加，10-20 倍于WB 的抗体用量。4 ℃颠倒混匀1-2 h，快到时间时，重新准备两份30 μL protein A/G beads 在新EP 管中放于冰上待用（用蛋白提取buffer 重悬3 次）。将混匀的蛋白+抗体溶液加入含有beads 的EP 管中，4 ℃颠倒混匀1-2 h。 清洗杂蛋白： 4 ℃离心1000 g 1 min，将上清转移到新EP，此为UBP（unbinding protein），存于冰上待用。将beads 用wash buffer 清洗4- 5 次，600 μL/次，每次重悬后4 ℃离心1000 g 1 min。留40 μL 最后一次的wash buffer（即W5）于冰上待用。 洗脱结合蛋白： 将beads 用50 μL elution buffer 洗脱后加10 μL 6×SDS loading buffer，或者用60 μL 1×SDS loading buffer 煮沸5 min。WB 检测FLAG-VER2 蛋白是否与TaGRP2-GFP 蛋白共沉