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猪血小板源生长因子受体α基因(PDGFRα) cDNA克隆与表达分析

基金项目：浙江省重大科技项目(No.2012C12906-8-1)、转基因生物新品种培育重大专项(No.2014ZX0801010B)和义乌市重大科技项目(No.2013-G2-01)收稿日期：2014-12-22接受日期：2015-01-13

猪血小板源生长因子受体α基因(PDGFR α)cDNA 克隆与表达分析

滕菲1，2朱志伟2黄菁2陈晓宇2于福先2曹伟东1，2石放雄1*潘建治1，

1南京农业大学动物科技学院，南京210095；2浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，杭州310021*通讯作者，jzpan9@https://www.wendangku.net/doc/6716432588.html, ；fxshi@https://www.wendangku.net/doc/6716432588.html,

摘要血小板源生长因子受体α(platelet-derived growth factor receptor,PDGFR α)是酪氨酸蛋白激酶受体家族成员之一，在脂代谢中具有潜在的调控作用。本实验旨在克隆猪(Sus scrofa )PDGFR α基因的cDNA 全长并分析其组织表达谱。根据GenBank 上已登录的人(Homo sapiens )、牛(Bos taurus )和小鼠(Mus musculus )等物种的PDGFR α基因保守序列设计引物，利用反转录PCR 和RACE 技术，克隆得到猪PDGFR α基因的cDNA 序列(GenBank 登录号:KP329568)。测序结果分析表明，猪PDGFR α基因cDNA 长度为6360bp ，其中开放阅读框(open reading frame,ORF)为3270bp ，3'非翻译区(untranslated regions,UTR)为2964bp ，5'UTR 为126bp ，共编码1089个氨基酸。该基因在基因组中大约横跨148Mb ，包含23个外

显子和22个内含子。序列同源性分析表明，猪PDGFR α基因的核苷酸和氨基酸序列与人、

牛、绵羊(Ovis aries )、小鼠的相似性较高。蛋白质结构预测发现，PDGFR α蛋白具有2个跨膜螺旋，10个N-连接糖基化修饰位点，75个磷酸化修饰位点以及1个信号肽结构，且N 端存在较强的疏水区域，C 端则表现出较强的亲水性。实时荧光定量PCR(quantitative Real-time,qRT-PCR)分析表明，该基因在杜洛克猪的心、肝、脾、肺、肾、小肠和骨骼肌等脏器均有表达，其中在脾脏中表达量最高，肾脏、肺脏次之。该基因在不同部位骨骼肌(比目鱼肌、冈上肌、股二头肌、腰小肌、腓肠肌和眼肌)中表达分析显示，在以比目鱼肌为代表的慢肌中表达量要极显著高于在以眼肌为代表的快肌中的表达量(P ＜0.01)。比较不同生长阶段PDGFR α基因的表达发现，初生阶段表达量极显著高于断奶和成年阶段(P ＜0.01)。本研究获得猪PDGFR α基因cDNA 全长、组织表达规律以及在不同肌肉组织中的相对表达量，为进一步研究猪PDGFR α基因的功能提供了基础资料。关键词

猪，血小板源生长因子受体α基因(PDGFR α)，基因克隆，组织表达

cDNA Cloning and Expression Analysis of Platelet-derived Growth Factor Receptor αGene (PDGFR α)in Porcine (Sus scrofa )

TENG Fei 1,2ZHU Zhi-Wei 2HUANG Jing 2CHEN Xiao-Yu 2YU Fu-Xian 2CAO Wei-Dong 1,2SHI Fang-Xiong 1*PAN Jian-Zhi 1,2*

1College of Animal Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China;2Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science,Zhejiang Academy of Agricultural Science,Hangzhou 310021,China *Corresponding author,jzpan9@https://www.wendangku.net/doc/6716432588.html,;fxshi@https://www.wendangku.net/doc/6716432588.html,

Abstract Platelet-derived growth factor receptor (PDGFR α)is the member of tyrosine kinase receptor

family and has a potential role of regulating lipid metabolism.The aim of this study was to clone cDNA of PDGFR αand analyze its mRNA expression level in different tissues and different periods of pig (Sus scrofa ).The specific primers were designed based on the published nucleotide sequence of human (Homo sapiens ),bovine (Bos taurus )and mouse (Mus musculus )in GenBank,and the whole cDNA of porcine PDGFR αgene

Online system:https://www.wendangku.net/doc/6716432588.html,

农业生物技术学报

Journal of Agricultural Biotechnology

2015,23(7):930~939

DOI:

10.3969/j.issn.1674-7968.2015.07.010

血小板源生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor,PDGFR)是酪氨酸蛋白激酶受体家族成员之一，由两种亚单位α及β构成，共以

α和β同二聚体以及α/β异二聚体等3种形式存在。PDGFR 是一种跨膜糖蛋白，由细胞外N 端与血小板源生长因子(platelet-derived growth factor recep-tor,PDGF)特异识别的结构域、单链跨膜的中间疏水结构域和胞内C 端具有酪氨酸蛋白激酶活性的肽段结构域组成(Li et al.,2000)。PDGF 和PDGFR 结合后形成受配体复合物，被活化的受体能激活多种信号转导通路，从而促进DNA 合成、细胞的分裂和增殖(Hoch,Soriano,2003)。但是受体、配体基因突变以及自分泌激活的PDGFR 信号转导通路会引发许多疾病以及恶性肿瘤的发生，如卵巢癌、神经胶质瘤、胃肠道间质瘤和隆突性皮肤纤维肉瘤等(张秀华等,2006;Andrae et al.,2008)。PDGFB 和PDGFR β对血管支持细胞的生长发育是必不可少的(Leveen et al.,1994)。然而PDGFA 和PDGFR α起着更广泛的生物学作用，包括中枢神经系统的形成，以及多种器官的生长发育等(Fruttiger et al.,1999;Karlsson et al.,2000,1999;Gnessi et al.,2000)。PDGFR α信号转导通路在早期胚胎发育过

程中起着十分关键的作用(Soriano,1997)。有研究报道指出成年鼠骨骼肌纤维的生成是由于PDG-FR α信号转导通路被激活，表明PDGFR α基因在纤

维前体细胞中表达(Olson,Soriano,2009)。Uezumi

等(2010)利用荧光激活细胞分选技术从骨骼肌中分离得到带有不同标记的非肌源性间充质干细胞，移植到受伤的肌肉模型后，只有PDGFR α+标记的间充质干细胞能定向分化成脂肪细胞，由此可推断PDGFR α基因对脂代谢具有潜在调控作用。目前有关猪(Sus scrofa )PDGFR α基因对脂肪细胞分化的调控作用尚未报道，因此可通过展开对猪PDGFR α基因的研究来了解脂代谢的调控机理，进而调控猪肉肌内脂肪含量并改善猪肉品质。然而目前猪PDGFR α基因的完整序列还未知，并且该基因的表达规律也未见相关报道。

本研究旨在通过猪PDGFR α基因cDNA 的克隆，并进行相关生物信息学分析，利用实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)检测其在杜洛克母猪不同脏器、不同部位骨骼肌以及不同生长阶段的表达情况，进而为该基因功能的研究提供基础资料。

was cloned using RT-PCR and RACE.The cloned full-length cDNA of PDGFR αgene was 6360bp (GenBank accession:KP329568)containing an open reading frame (ORF)of 3270bp,2964bp 3'untranslated regions (UTR),126bp 5'UTR,encoding a protein of 1089amino acid.This gene spaned approximately 148Mb on the genome,and contained 23exons and 22introns.The homology analysis of porcine PDGFR αgene indicated that the nucleotides and amino acids had high similarity with human,bovine,sheep (Ovis aries )and mouse.Ten N-glycosylation sites and 75phosphorylation sites were predicted in the translated PDGFR αprotein,as well as one signal peptide.The protein structure analysis showed that PDGFR αprotein had 2transmembrane helices.The N-terminal of the PDGFR protein was high hydrophobic,but the C-terminal showed high hydrophilism.Quantitative Real-time PCR (qRT-PCR)results suggested that PDGFR αmRNA expressed in heart,liver,spleen,lung,kidney,small intestine and skeletal muscle.PDGFR αmRNA expressed abundantly in spleen,followed by kidney and lung.Six kinds of muscle,including soleus muscle,supraspinatus muscle,biceps femoris muscle,psoas minor muscle,gastrocnemius muscle and loin muscle,were selected.The qRT-PCR results showed that the expression of slow muscles represented with soleus muscle was extremely higher than that in fast muscles represented with loin muscle (P ＜0.01).Different growth stages expression analysis showed that expression of porcine PDGFR αgene was extremely higher in the primary stage than that in weaning and adult stage (P ＜0.01).In conclusion,the research obtained the full-length cDNA of porcine PDGFR αgene,the rule of tissue expression and relative mRNA expression of PDGFR αgene in different muscles.The results provide a basic data for further understanding of the function of PDGFR αgene.Keywords

Porcine,Platelet-derived growth factor receptor gene (PDGFR α),Gene clone,Tissue expression

猪血小板源生长因子受体α基因(PDGFR α)cDNA 克隆与表达分析

cDNA Cloning and Expression Analysis of Platelet-derived Growth Factor Receptor αGene(PDGFR α)in Porcine

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1材料与方法

1.1材料

实验中所用的杜洛克母猪(Sus scrofa)由浙江省农科院杜洛克原种场提供；DEPC水购自美国Sig-ma公司；Trizol购自美国Invitrogen公司；DNA分子标准、DNA胶快速回收试剂盒、质粒提取试剂盒、大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞和pEASY-T1Simple克隆载体等均购自全式金生物技术(北京)有限公司；RACE试剂盒(SUPERSWITCHTM RACE cDNA Synthesis kit)购自杭州索来尔博奥生物技术有限公司；DNA限制性内切酶、T

4DNA连接酶、LA Taq DNA聚合酶、反转录试剂盒(Prime-Script?RT Reagent Kit)和实时定量试剂盒均购自大连宝生物工程大连有限公司(TaKaRa)有限公司。

1.2方法

1.2.1引物设计

比对GenBank中人(Homo sapiens,NM_ 006206.4)、牛(Bos taurus，XM_005207944.1)、绵羊(Ovis aries，XM_004009830.1)和小鼠(Mus muscu?lus，XM_006504263.1)等物种的PDGFRα基因序列同源性，并分析出PDGFRα基因序列的保守区域，根据引物设计原则利用Primer Premier5.0、Oligo6等软件设计引物，最后设计并合成PDGFRα基因特异性PCR扩增引物PDF和PDR，定量引物PDQF和PDQR。根据测序获得的猪PDGFRα基因的编码区(coding sequence,CDS)序列设计3'RACE引物P3R1和P3R2，5'RACE引物P5R1和P5R2。根据目前已公布猪3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(glyceral-dehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)(Gen-Bank登录号:AF017079)的序列，设计内参基因引物GAF和GAR。所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物信息见表1。

1.2.2样品采集及RNA的提取

选取初生(1日龄)、断奶(60日龄)、成年(8月龄)杜洛克母猪各3头，按照常规方法屠宰后，快速采集心、肝、脾、肺、肾、小肠、比目鱼肌、冈上肌、股二头肌、腰小肌、腓肠肌、眼肌共12种组织。用DEPC 水反复清洗样品后立即装入离心管中，现场液氮保存，然后移至-80℃冰箱保存备用。

总RNA的提取采用Trizol法，提取的RNA一部分用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和质量，另一部分置于-80℃冰箱保存备用。1.2.3猪PDGFRα基因的CDS克隆与测序

利用反转录试剂盒将提取的杜洛克猪各组织RNA反转录为cDNA。以PDF和PDR为引物克隆PDGFRα基因的CDS。PCR反应体系(20μL)：10×LA BufferⅡ为2μL，dNTPs(2.5μmol/L)2μL，LA Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，引物PDF和PDR (10μmol/L)分别为0.5μL，模板最终量70ng，用双蒸水来补齐。克隆引物退火温度为61℃，预期克隆产物大小为4000bp左右。PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸4.5min，共循环35次；最后再72℃延伸10min。吸取适量产物(5μL)进行琼脂糖凝胶电泳检测。

用DNA快速回收试剂盒回收PCR产物，将胶

引物名称Primer name PDF

PDR PDQF PDQR

P3R1

P3R2

P5R1

P5R2

GAF

GAR 引物序列(5'~3')

Primer sequence

TAGAGGGAGAGAAACAGAGAAGG

ATGACAATGAA TCGTTGGGCTTAT

GACGACCACCACGGCTCTAAT

GTTCTTAGCCAAGCATCGGACT

GATAATGGGCCACAGAAGATGAA

CATCCATGTACTCCCCGCTTGAAA

GTTCTTAGCCAAGCATCGGACT

CTTCTCTCTGCGTGTGGTTGTAA TA

ACTCACTCTTCCACTTTTGATGCTG

GGTGGTCCAGGGGCTCTTACT

引物用途

Primer function

血小板源生长因子受体α基因(PDGFRα)克隆

Cloning of platelet-derived growth factor receptorαgene(PDGFRα)

PDGFRα实时荧光定量(qRT-PCR)

Real-time quantitative PCR(qRT-PCR)of PDGFRα

PDGFRαcDNA3'末端快速克隆

Rapid-amplification of porcine PDGFRα3'cDNA ends

PDGFRαcDNA5'末端快速克隆

Rapid-amplification of porcine PDGFRα5'cDNA ends

3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)定量

qRT-PCR of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene(GAPDH)

表1猪PDGFRα基因CDS克隆与qRT-PCR引物

Table1Primers used in PDGFRαCDS cloning and qRT-PCR 932

80005000300020001000750500250100bp

4050

6360

bp bp 8000500020001000750500250

bp 回收所得到的目的片段与克隆载体pEASY-T1Simple 混合，35℃连接30min 。连接产物转化Trans-T1Phage Resistant 感受态细胞，选取含100mg/L 氨苄抗生素的琼脂糖凝胶平板，并将IPTG (500mmol/L)8μL 和X-gal(20mg/mL)40μL 混匀后涂于平板上，37℃静置30min 后，将转化后的感受态细胞均匀涂于平板上，置于37℃培养箱中过夜。挑取白色菌落放入新鲜配制含100mg/L 氨苄抗生素的LB 培养液中，放入37℃，210r/min 的摇床中培养过夜，经菌液PCR 及酶切鉴定后，送至上海生工生物工程有限公司测序。

3'RACE 和5'RACE 的扩增体系和反应条件依照相应的试剂盒说明书进行。1.2.4

猪PDGFR α基因的序列分析

猪PDGFR α基因序列的ORF 用NCBI 网站上ORF Finder 来进行分析；利用NCBI 在线软件blastn 来比对同源性；多物种间核苷酸和氨基酸序列同源性比对利用EBI 网站上的在线软件clustalw2(https://www.wendangku.net/doc/6716432588.html,/Tools/clustalw2/index.html)；蛋白质理论分子质量以及等电点是由软件EXPASY(https://www.wendangku.net/doc/6716432588.html,/cgi-bin/protparam/protparam)和DNAMAN 来进行分析；利用(https://www.wendangku.net/doc/6716432588.html,/tools/protparam.html)在线软件分析猪PDGFR α蛋白质疏水性；N-糖基化位点预测利用在线软件NetNGlyc

(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNG-lyc/)；磷酸化位点预测利用在线网站(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)；

SignalP4.1(http://

www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行信号肽预测；猪的PDGFR α蛋白质的跨膜区域的分析利用在线网站(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)。1.2.5

各组织中猪PDGFR α基因的表达分析将提取的心、肝、脾、肺、肾、小肠、比目鱼肌、冈上肌、股二头肌、腰小肌、腓肠肌、眼肌共12种组织RNA ，依照反转录试剂盒说明书反转录为cDNA 。内参基因为猪GAPDH 基因，SYBR Green Ⅰ为染料，将反转录所得的cDNA 作为模板，用定量引物PDQF 和PDQR 检测猪PDGFR α基因。依照实时定量试剂盒SYBR ?Premix Ex Taq TM Ⅱ的说明书，检

测PDGFR α基因在各组织中的相对表达量。PCR 反应体系(20μL)：SYBR Premix Ex Taq Mix 10.0μL ；上下游引物(10μmol/L)混合物共0.8μL ；cDNA 模板(3μg/L)1.5μL ；ddH 2O 7.7μL 。qRT-PCR 反应程序：95℃预变性3min ；95℃变性20s ，61℃退火20s ，72℃延伸20s ，共39个循环；最后添加溶解曲线。在Bio-Rad CFX96Real-time PCR System 进行所有操作。1.2.6

数据分析

采用2-ΔΔCt 法(Livak,Schmittgen,2001)分析猪PDGFR α基因相对表达量，每个样品都重复3次。

每个独立的实验重复3次，每次3个重复。利用SPSS 22.0软件进行数据分析，结果表示为X ±SE 。用ANOV A 检测显著性差异，P ＜0.05表示差异显著，

P ＜0.01表示差异极显著。2结果与分析

2.1

猪PDGFR α基因cDNA 的克隆

将反转录所得的cDNA 作为模板，以PDF 和PDR 作为引物，对猪PDGFR α基因进行PCR 扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，发现在4000~5000bp 的位置有一条带(图1)，条带大小与预期的一致。切胶回收产物连接至pEASY-T1载体，利用酶切鉴定来确定其连上载体。将菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果分析得到猪PDGFR α基因的cDNA 片段长为4050bp ，其中ORF 为3270bp ，共编码1089个氨基酸，其中起始密码子ATG ，终止密码子为TGA 。

参考3'RACE 试剂盒说明书，以P3R1为引物

扩增获得的第一轮PCR 产物作为模板，

用P3R2引物进行第二轮巢式PCR 扩增，电泳检测得到2525图1

猪PDGFR α基因cDNA 克隆

Figure 1

cDNA cloning of porcine PDGFR αgene

M ：Trans2K pulus marker ；1：猪PDGFR α基因部分cDNA 扩增产物；2：猪PDGFR α基因全长

M:Trans2K pulus marker;1:Partial cDNA amplified products of porcine PDGFR αgene;2:Full length of porcine PDGFR αgene

猪血小板源生长因子受体α基因(PDGFR α)cDNA 克隆与表达分析

cDNA Cloning and Expression Analysis of Platelet-derived Growth Factor Receptor αGene(PDGFR α)in Porcine

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bp的扩增产物，测序后得到包含polyA的猪PDG?FRα基因的3'UTR序列长为2305bp。依照5' RACE试剂盒说明书，以P5R1为引物扩增得到的产物为模板，用引物P5R2进行第二轮巢式PCR，得到451bp的扩增产物，包括5'UTR未知序列长5 bp。最后根据拼接序列设计引物，扩增得到猪PDGFRα基因cDNA全长为6360bp(图1)。将该基因序列全长提交至GenBank，登录号为KP329568。

2.2猪PDGFRα基因的同源性分析

经同源性分析发现猪PDGFRα基因与哺乳动物相似性较高，其核苷酸序列与人(NM_006206.4)、牛(XM_005207944.1)、羊(XM_004009830.1)和小鼠(XM_006504263.1)的相似性分别对应为91%、91%、91%和86%；氨基酸序列同源性比对发现，其相似性分别为96%、95%、95%和91%(图2)。

2.3PDGFRα蛋白的生物信息学分析

2.3.1蛋白理化性质分析

通过EXPASY在线工具ProtParam分析猪PDGFRα蛋白的理化性质，从分析结果可知该蛋白质分子式为C

5475H8613N1429O1685S45，分子质量为122.8 kD，理论等电点为5.02，属于酸性蛋白，半衰期为30 h，不稳定系数为43.81，脂肪系数为91.15，总平均亲水性为-0.258，表明PDGFRα蛋白整体呈亲水性。

PDGFRα蛋白包含20种常见的氨基酸，其中Leu含量最高(9.5%)，Trp含量最低(1.2%)，带正电荷的氨基酸残基(Arg+Lys)总数为114，带负电荷的氨基酸残基(Asp+Glu)总数为161个，因此整体上带负电。

2.3.2蛋白质结构预测

利用EXPASY在线工具ProScale中Kyte and Doolittle算法分析蛋白质的疏水性可知，PDGFRα蛋白的N端表现较强的疏水性(score＞1.5)，而C端则表现出较强的亲水性，按分值大小划分，其疏水性最大值为4.167，最小值为-3.289，分别位于第536位和第700位AA处。糖基化位点分析PDG-FRα蛋白存在10个N-连接的糖基化修饰位点，分别位于氨基酸序列的42、66、76、103、179、320、353、359、458和468位天冬酰胺残基的酰胺氮原子上(图3)。磷酸化分析显示，PDGFRα蛋白的氨基酸序列上共存在39个丝氨酸(Ser)磷酸化位点，18个苏氨酸(Thr)磷酸化以及18个酪氨酸(Tyr)磷酸化位点(图4)。利用SignalP4.1信号肽分析表明，预测有1个信号肽，可能的剪切位点在第23个和第24个氨基酸之间，但PDGFRα蛋白为非分泌蛋白(图5)。TMHMM跨膜结构预测分析表明，猪PDGFRα基因的氨基酸序列存在2个跨膜结构域，并且AA有位于膜外和膜内，属于膜结合蛋白(图6)。

2.4猪PDGFRα基因的组织表达分析

将GAPDH作为内参基因，并以眼肌为参照，通过qRT-PCR检测猪PDGFRα基因在断奶杜洛克母猪骨骼肌(眼肌)、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠等7种组织中的表达量。结果表明，该基因在所检测的7种脏器中均有表达，其中脾脏的相对表达量最高，肌肉的相对表达量较低。此外，脾脏极显著高于其他组织(P＜0.01)，肾脏除与肺脏的差异不显著外，极显著高于其他组织(P＜0.01)(图7)。

以GAPDH为内参基因，以眼肌为参照，选取断奶2月龄杜洛克母猪不同部位的骨骼肌，检测PDG?FRα基因在不同肌肉中的表达。结果显示，比目鱼肌表达量最高，且与其他肌肉相比差异极显著(P＜0.01)；冈上肌表达量次之，但与其他肌肉组织的差异不显著；眼肌和腓肠肌表达量相对较低(图8)。

通过qRT-PCR检测猪初生、断奶和成年阶段不同肌肉组织中PDGFRα基因表达的差异。结果表明，初生阶段眼肌、冈上肌、股二头肌和腓肠肌中PDGFRα基因表达极显著高于断奶和成年阶段(P＜0.01)；而初生阶段比目鱼肌和腰小肌中PDGFRα基因的表达与断奶和成年阶段相比差异显著(P＜0.05)(图9)。

3讨论

PDGFRα属于Ⅲ型酪氨酸蛋白激酶受体家族之一，其主要在胚胎期神经系统发育过程中起重要作用。人的PDGFRα基因位于Ch4q11~q13上，包含23个外显子，其中外显子1编码5'非翻译区，外显子2编码起始密码子AUG，其转录起始位点位于翻译起始密码子AUG上游393bp处。若能分离猪PDGFRα启动子，后续便能展开体外对受体表达进行转录调控的相关研究。该基因没有典型的TATA 盒，但有典型的CCAAT盒和GATA膜体，并且包含潜在的Oct-1和AP-1等结合位点(Kawagishi et al, 1995)。PDGFR与Kit、干细胞因子受体(stem cell

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sPDGFR αMGTSH R MLLVLGCLFTGPSLILCQLSLPSILPNENEKVVQLN A SFSLRCFGESEVSWQYPMSEEE N P S VEIR S EENNSGLFVTVLEVVSASAAHTGLYTCYYNHTQ RE E S 110hPDGFR αMGTSH P A F LVLGCL L TG L SLILCQLSLPSILPNENEKVVQLNSSFSLRCFGESEVSWQYPMSEEE S SDVEIRNEENNSGLFVTVLEV S SASAAHTGLYTCYYNHTQ TE EN 110bPDGFR αMGTSH W ALLVLGCLFTGPSLILCQLSLPSILPNENE R VVQLNSSFSLRCFGESEVSWQYPMSEEE Y PDVEIRNEENNSGLFVTVLEVVSASAAHTGLYTCYYNHTQ M DEN 110oPDGFR αMGTSH W ALLVLGCLFTGPSLILCQLSLPSILPNENE R VVQLNSSFSLRCFGESEVSWQYPMSEEE Y PDVEIRNEENNSGLFVTVLEVVSASAAHTGLYTCYYNHTQ M DEN 110mPDGFR αMGTSH QVF LVL S CL L TGP G LI S CQL L LPSILPNENEK I VQLNSSFSLRC V GESEVSWQ H PMSEE DD P N VEIR SE ENNSGLFVTVLEVV N ASAAHTG W YTCYYNHTQ T DE S 110sPDGFR αEIEGR A IYIYVPDPDVAFVPLGMTD Y LVIVEDDDSAIIPCRTTDPETPVTLLSS D GVV H ASYDSRQGFNGTF T VGPYICEATVRGKKFQTIPFNVYALKATSELDLEMEA 220hPDGFR αE L EGRHIYIYVPDPDVAFVPLGMTD YL VIVEDDDSAIIPCRTTDPETPVTL HN SEGVVPASYDSRQGFNGTF T VGPYICEATV K GKKFQTIPFNVYALKATSELDLEMEA 220bPDGFR αEIEGRHIYIYVPDPDVAFVPLGMTDSLVIVED E DS V 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αQKPRYEIRWRVIESISPDGHEYIYVDPMQLPYDSRWEFPRDGLVLGRILGSGAFGKVVEGTAYGLSRSQPVMKVAVKMLKPTARSSEKQALMSELKIMTHLGPHLNIVNL 660sPDGFR αLGACTKSGPIYIITEYCFYGDLVNYLHKNRDSFLS R HPEKPKKELDIFGLNPADESTRSYVILSFENNGDYMDMKQADTTQYVPMLERKEVSKYSDIQRSLYDRPASYKK 770hPDGFR αLGACTKSGPIYIITEYCFYGDLVNYLHKNRDSFLSHHPEKPKKELDIFGLNPADESTRSYVILSFENNGDYMDMKQADTTQYVPMLERKEVSKYSDIQRSLYDRPASYKK 770bPDGFR αLGACTKSGPIYIITEYCFYGDLVNYLHKNRDSFLSHHPEKPKKELDIFGLNPADESTRSYVILSFENNGDYMDMKQADTTQYVPMLERKEVSKYSDIQR A LYDRPASYKK 770oPDGFR αLGACTKSGPIYIITEYCFYGDLVNYLHKNRDSFLSHHPEKPKKELDIFGLNPADESTRSYVILSFENNGDYMDMKQADTTQYVPMLERKEVSKYSDIQR A LYDRPASYKK 770mPDGFR αLGACTKSGPIYIITEYCFYGDLVNYLHKNRDSF M S Q HPEKPKK D LDIFGLNPADESTRSYVILSFENNGDYMDMKQADTTQYVPMLERKEVSKYSDIQRSLYDRPASYKK 770sPDGFR αKSMLDSEVKNLLSDDNS D GLTLLDLLSFTYQVARGMEFLASKNCVHRDLAARNVLLAQGKIVKICDFGLARDIMHDSNYVSKGSTFLPVKWMAPESIFDNLYTTLSDVWS 880hPDGFR αKSMLDSEVKNLLSDDNSEGLTLLDLLSFTYQVARGMEFLASKNCVHRDLAARNVLLAQGKIVKICDFGLARDIMHDSNYVSKGSTFLPVKWMAPESIFDNLYTTLSDVWS 880bPDGFR 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sPDGFR αVTYKNEEDKLKDWEGGLDEQRLSADSGYIIPLPDIDPVPEEEDLGKRNRHSSQTSEESAIETGSSSSTFIKREDETIEDIDMMDDIGIDSSDLVEDSFL 1089hPDGFR αVTYKNEEDKLKDWEGGLDEQRLSADSGYIIPLPDIDPVPEEEDLGKRNRHSSQTSEESAIETGSSSSTFIKREDETIEDIDMMDDIGIDSSDLVEDSFL 1089bPDGFR αVTYKNEEDKLKDWEGGLDEQRLSADSGYIIPLPDIDPVPEEEDLGKRNRHSSQTSEESAIETGSSSSTFIKREDETIEDIDMMDDIGIDSSDLVEDSFL 1089oPDGFR αVTYKNEEDKLKDWEGGLDEQRLSADSGYIIPLPDIDPVPEEEDLGKRNRHSSQTSEESAIETGSSSSTFIKREDETIEDIDMMDDIGIDSSDLVEDSFL 1089mPDGFR α

VTYKNEEDKLKDWEGGLDEQRLSADSGYIIPLPDIDPVPEEEDLGKRNRHSSQTSEESAIETGSSSSTFIKREDETIEDIDMMDDIGIDSSDLVEDSFL

1089

图2猪、人、牛、绵羊和小鼠PDGFR α基因氨基酸多重序列比对结果

Figure 2Multiple comparisons for amino acid sequences of pig PDGFR αgene in pig,human,bovine,sheep and mouse

猪、人、牛、绵羊和小鼠PDGFR α的氨基酸序列分别由s 、h 、b 、o 及m 开头。黑色：氨基酸序列一致；灰色和白色：氨基酸序列出现替换

Animo acid sequences of pig,human,bovine,sheep and mouse are represented by s,h,b,o and m,respectively.Black:Identical animo acid sequences;Grey and white:Animo acid sequence with conserved substitutions

猪血小板源生长因子受体α基因(PDGFR α)cDNA 克隆与表达分析

cDNA Cloning and Expression Analysis of Platelet-derived Growth Factor Receptor αGene(PDGFR α)in Porcine

935

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factor receptor,SCFR)、巨噬细胞集落刺激因子受体(macrophage colony stimulating factor 1receptor,M-CSF1R)等基因结构类似，如人的PDGFR 与Kit 基因均位于Ch4q11~q13上(徐希奇等,2005)。本研究预测猪PDGFR α包含10个N-连接的糖基化修饰位点，N-连接糖基化位点修饰是蛋白质翻译后最为常见的修饰方式之一，对调节蛋白的生物活性以及参与信号转导起着重要作用(魏琳琳等,2003)。PDGF 生长因子家族包括PDGF-A/B/C/D 共4种多肽链，可组成AA 、AB 、BB 、CC 以及DD 二聚体。除了PDGF-DD 二聚体外其余二聚体均能结合并激活PDGFR α(Fredriksson et al.,2004)。PDGFR α蛋白

510501001502002503001

4567

P D G F R α基因相对表达量R e l a t i v e e x p r e s s i o n o f P D G F R α

D CD

B C

组织Tissue

图7猪PDGFR α基因在不同组织中的表达Figure 7Expression of PDGFR αgene in porcine differ ?

ent tissues

1~7：分别为眼肌、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和小肠。不同大写字母差异极显著(P ＜0.01)；内参基因：GAPDH ，n=3，下同

1~7:Loinmuscle,heart,liver,spleen,lung,kidney and small intestine,respectively.The different capital letters mean ex-tremely significant difference (P ＜0.01);Reference gene:

GAPDH,n=3,the same below

0.00.20.40.60.81.00

30405060

概率

P r o b a b i l i t y

氨基酸位置Amino acid position

C-score S-score Y-score

图5PDGFR α信号肽分析

Figure 5

PDGFR αsignal peptide analysis

PDGFR α蛋白在第23~24氨基酸序列间存在1个剪切位点A splice site was found at 23~24amino acid locus of PDG-FR αprotein

00.20.40.60.81.01.2

200

4006008001000

概率P r o b a b i l i t y

氨基酸位置Amino acid position

图6猪PDGFR α跨膜结构预测

Figure 6The transmembrane prediction of porcine PDGFR α红色：跨膜区；蓝色:在膜内；粉色:在膜外

Red:Transmembrane region;Blue:Inside of membrane;Pink :Out of membrane

00.250.500.751.000

200

4006008001000

序列位置Sequence position

潜在性Potential 临界值Threshold

潜在糖基化位点N -g l y c o s y l a t i o n p o t e n t i a l

图3PDGFR αN -糖基化位点分析

Figure 3

PDGFR αN -glycosylation sites analysis

PDGFR α蛋白存在10个N-连接的糖基化修饰位点

PDGFR αprotein had 10N-glycosylation potentials 01

200

4006008001000

潜在磷酸化位点P h o s p h o r y l a t i o n p o t e n t i a l

序列位置Sequence position

Serine Threonine

Tyrosine

图4PDGFR α磷酸化位点分析

Figure 4

PDGFR αphosphorylation sites analysis

PDGFR α氨基酸序列上存在39个丝氨酸磷酸化位点，18个苏氨酸磷酸化位点和18个酪氨酸磷酸化位点

39Ser phosphorylation sites,18Thr phosphorylation sites and 18Tyr phosphorylation sites were contained in the amino acid sequence of PDGFR α

936

包含39个丝氨酸(Ser)磷酸化位点，18个苏氨酸(Thr)磷酸化位点，18个酪氨酸(Tyr)磷酸化位点。PDGF和PDGFR特异结合后会诱导PDGFR二聚化，从而引起受体自动磷酸化(Ostendorf et al., 2012)。活化的PDGFR暴露磷酸化酪氨酸残基，通过与不同信号分子结合，激活细胞内信号转导通路(Tallquist,Kazlauskas,2004)。疏水性分析表明其N 端有较强的疏水区域，而C端则表现较强的亲水性，表明PDGFRα蛋白的N端在胞外接受信号而C 端则在胞内发挥功能。

PDGF最早是于1974年被发现的一种由血小板释放的细胞因子(Dirks,Bloemers,1996)。PDGF 已被证实参与到机体的许多重要生理过程，并与许多肿瘤的发生和发展都有着密切关联。通过研究猪PDGFRα基因在不同脏器中的表达发现，PD?GFRα基因在脾脏中表达最高，肾脏次之，同时在肌肉中也检测到表达。脾脏作为最大的淋巴器官能产生多种免疫细胞，通过多种机制抵抗肿瘤的产生。在有关淋巴癌的研究中发现，PDGFRα基因在成熟的T细胞和NK细胞中呈现显著性表达(Chen et al.,2008)。该实验结论进一步论证了PDGFRα基因在脾脏中高表达。PDGF必须与相应的PDGFR 结合后才能发挥其生物学效应。PDGF配体和受体在不同的器官中的表达有很大的差异。PDGF-AA和PDGFRα在肺成纤维细胞、肌肉细胞表达，PDGFRα的表达上调会导致肺纤维化疾病的产生(Trojanowska,2008)，PDGF-BB和PDGFRβ在肝纤维化中发挥重要作用(Bonner,2004)。

脂肪细胞起源于胚胎干细胞分化而来的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)。医学上，脂肪过多积累会使机体功能紊乱从而引发许多疾病。肝脏、骨骼肌是脂肪异常积累的主要组织，常见疾病有肥胖、2型糖尿病、Duchenne肌肉萎缩症等。学者们一直在追踪研究与PDGFR基因相关的MSCs诱导分化成脂肪细胞的机制。Uezumi等(2010)通过将小鼠骨骼肌中分离得到的PDGFRα+标记的间充质干细胞移植到受伤的肌肉模型后，体内和体外实验均能定向分化成脂肪细胞，从而推断PDGFRα+间充质干细胞是肌纤维间隙中脂肪的起源。Liu等(2012)等将小鼠骨骼肌分为快肌和慢肌，以PDGFRα+作为前体脂肪细胞表面标志，实验结果显示慢肌比快肌富含更多的前体脂肪细胞，并且更易于形成脂肪。本实验选取以比目鱼肌代表的慢肌，以眼肌代表的快肌和以腓肠肌代表的混合型肌肉等6种骨骼肌来检测PDGFRα基因的表达，qRT-PCR结果显示，断奶阶段比目鱼肌的表达量要显著高于眼肌，与Liu等(2012)的结果表现出一致性。肌内脂肪(intramuscular fat,IMF)的含量是衡量猪肉品质的一个重要指标。IMF的形成过程十

123456

B B

B B B B

b b

B B

初生

Primary

断奶

Weaning

成年

Adult

基

因

相

对

表

达

量

肌肉组织

Muscular tissue

图9猪PDGFRα基因在不同生长阶段各肌肉组织中的表达Figure9Expression of PDGFRαgene in different mus?cles at different growth stage

不同小写字母和不同大写字母分别表示同一肌肉组织不同阶段差异显著(P＜0.05)和极显著(P＜0.01)

The different lowercase letters and different superscript capital letters mean significant difference(P＜0.05)and extremely significant difference(P＜0.01)in the same muscles at differ-ent growth stage,respectively

123456

B B B

基

因

相

对

表

达

量

肌肉组织

Muscular tissue

图8猪PDGFRα基因在不同肌肉中的表达

Figure8Expression of PDGFRαgene in porcine differ?ent muscles

1~6：眼肌、比目鱼肌、冈上肌、股二头肌、腰小肌和腓肠肌，下同

1~6:Loinmuscle,soleus muscle,supraspinatus muscle,biceps femoris muscle,psoas minor muscle and gastrocnemius mus-cle,the same bolow

猪血小板源生长因子受体α基因(PDGFRα)cDNA克隆与表达分析cDNA Cloning and Expression Analysis of Platelet-derived Growth Factor ReceptorαGene(PDGFRα)in Porcine

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分复杂，伴随着一系列基因表达水平的发生，从而引起细胞结构和功能的改变。目前PDGFRα基因对IMF的影响和调控机制仍处于初步研究阶段，下一步可从细胞水平对两者的关系进行验证，并结合营养调控来观察该基因与脂质代谢相关基因表达的关系，从而为猪肉品质改良育种提供理论依据。

本研究比较了杜洛克母猪在初生、断奶和成年3个阶段PDGFRα基因的表达，结果发现，初生阶段表达量最高，成年阶段表达量最低。分析其原因可能是由于具有分化为脂肪潜能的MSCs，随着年龄的增长其分化潜能逐渐降低。Fitter等(2012)通过研究慢性粒细胞性白血病治疗药imatinib的副作用效应，显示该药物通过抑制PDGF、PDGFRα/β、PI3激酶这一通路，促进间充质干细胞分化形成脂肪，从而增加脂联素(adiponectin)的分泌，这一调控机理的揭示也表明PDGFR在脂肪组织形成中具有重要作用。同年Huang等(2012)对牛肌肉内血管基质细胞的分化调控进行了研究，利用MACS技术分离纯化了PDGFRα阳性的前体细胞进行比较实验，确认到Zfp423高表达细胞易于向脂肪细胞分化，认为PDGFRα阳性细胞具有分化为脂肪细胞或成纤维细胞的潜能，Zfp423水平是其中的关键调控因子。紧接着Lee等(2012)的研究表明，β3肾上腺素受体激活药物和高脂肪日粮处理，可使小鼠腹腔脂肪组织中PDGFRα+细胞增加，流式细胞仪分离的这类细胞在体外和体内能够分化为白色脂肪细胞(white adipocytes)和褐色脂肪细胞(brown adipo-cytes)，证明其是具有双潜能的脂肪前体细胞。

4结论

本研究首次克隆了猪PDGFRα基因(GenBank 登录号:KP329568)，获得其cDNA全长6360bp。PDGFRα蛋白呈酸性，带负电荷，属于膜结合蛋白。根据qRT-PCR结果可知，PDGFRα基因在不同脏器中均有表达，且在脾脏中的表达量最高，肾脏、肺脏次之；PDGFRα基因在不同部位肌肉中表达的结果显示，以比目鱼肌为代表慢肌的表达量要显著高于以眼肌为代表的快肌；通过在不同生长阶段中的表达发现，该基因在初生阶段中的表达量极显著高于断奶和成年阶段。本研究为进一步了解PDG?FRα基因的功能，以及该基因在肌内脂肪代谢过程中的调控机理提供基础资料。参考文献

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猪血小板源生长因子受体α基因(PDGFRα)cDNA克隆与表达分析cDNA Cloning and Expression Analysis of Platelet-derived Growth Factor ReceptorαGene(PDGFRα)in Porcine

(责任编辑靳晓霞)

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