脉冲场电泳仪参数

脉冲场电泳仪参数

一、技术经济指标

、六角形电极的电泳槽，保证矢量电场的自由旋转，提供更高的分辨率、电泳速度和更精确的分离，对的片段都能提供有效的分离。

、自动演算：提供给用户一套程序用于优化实验参数。只要输入待分离片段的最小、最大长度，结合个主要变量的确定，帮助使用者获得最理想的实验条件。

、脉冲角度：可以在°间自由选择脉冲角度，使用户可以在同一系统上实现大至染色体级、小至质粒的有效分离。

、时间转换梯度：有线性、非线性（凸形和凹形）两种脉冲时间梯度，非线性梯度可以提供更广泛的分离动态范围，使用户可以精确的确定分离片段的大小。

、多状态功能：在一个中可以有个电场矢量，每个电场矢量可以有自己的电压和转换时间，可有选择地对一定大小范围的片段进行更精细的分离，并且可以在同一次电泳中实现和两种技术。

、二次脉冲功能：二次脉冲可加速从琼脂糖凝胶中释放，从而有利于非常大的片段的分离，并可提高分辨率。

、技术应用：

（钳式均衡电场）技术，产生均衡电场；

（程序自主控制电极）技术，根据片断大小的需要优化设定脉冲角度；（电场倒置）技术，为以下小片断提供快速分离；

（非对称场倒置）技术，精细分离小片断，提高分辨率；

以上技术的应用保证了科研人员在所有分子量范围内均能得到所最佳的线性分离。

、性能指标：

. 电源输出：最高电压，和，增量，连续可调

. 最大电流：0.5A

. 延迟启动：最高小时

. 电极调节能力：动态调节（反馈调整）±％

. 程序储存：存储个复杂实验程序，每个程序包含个程序模块或个简单程序

. 数据记录：键盘，条形码读取或接口

. 显示屏：行×字符行，荧光显示

. 转换范围：毫秒到小时

. 转换角度：°，°增量

. 电泳时间：最高小时模块

. 脉冲中断设置：可以通过电压，频率，角度和持续时间设定

二、设备产地：国外

三、参考品牌及型号：无

四、资质要求：

脉冲场凝胶电泳

脉冲场凝胶电泳 脉冲场凝胶电泳近年来，以脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis，PFGE)为代表的分子生物学分型方法日渐受到青睐，其原理为通过一定的方法，直接或间接反映病原体变异分化的本质即DNA序列的改变，从而做到微观变化的宏观显示。电泳结果通常是条带图谱。该方法的发展成熟为监测控制细菌的流行提供了广阔的前景。通过分型可以鉴定比较菌株是否一致，对于细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义。一、脉冲场凝胶电泳的原理PFGE与常规电泳的不同之处在于，常规的电泳采用的是单一的均匀电场，DNA分子经凝胶的分子筛作用负极移向正极。而PFGE采用了两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，使DNA分子的电泳方向随着电

场的变化而改变。正是因为电场方向的交替改变，才使大分子DNA得以分离。图l是根据Carle和Olson最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1 field gel electrophoresis，OFA-GE)绘制的PFGE 示意图。A、B代表两个交替开启和关闭的电场。当A电场开启时，B电场关闭，DNA分子从A电场的负极(A-)向正设(A+ )移动；当B电场开启时，DNA分子改变原来的运行方向，随B电场负极向正极移动。这样，随着电场方向的交替变化DNA分子图1 PGE的原理(OFAGE系统) A、B代表两电场即呈“Z” 字形向前移动。目前的理论和实验研究表明，当某一电场开启时，DNA分子即顺着此电场的方向纵向拉长和伸展，以“蛇行”(reputation)的方式穿过凝胶孔。如果电场方向改变DNA分子将必须先调转头来，才能沿着新的电场方向泳动。这样，随着电场方向反复变化，伸展的DNA分子必须相应地变化移动方向。可以想象，较小的分子能相当快

脉冲场凝胶电泳(PFGE)

脉冲场凝胶电泳（PFGE）的原理大致为： 细菌包埋于琼脂块中，用适当的内切酶在原位对整个细菌染色体进行酶切，酶切片段在特定的电泳系统中通过电场方向不断交替变换及合适的脉冲时间等条件下而得到良好的分离。PFGE中内切酶的选用至关重要，所采用的内切酶常为寡切点酶（low frequency cleavagerestric-tionendoucleases），这种酶切后的片段少而大，适合于作PFGE电泳。McCllelland等通过对细菌的PFGE电泳图谱的内切酶的选择研究发现，四核苷酸CTAG在许多GC含量>45%的细菌染色体中是很少见的，在他们所试验的16个细菌的染色体中，被1个或多个可识别CTAG位点的内切酶酶切，每100000bps中不到一次，这些酶的识别序列分别为：XbaⅠ（TCTAGA），SepⅠ（ACTAGT），AvrⅡ（CCTAGG）和NheⅠ（GCTAGC）。同样地，在许多含G+C<45%的基因组，CCG和CGG更少。这样用SmaⅠ（CCCGGGG）、R srⅡ（CGGWCGG）、NaeⅠ（GCCGGC）和SacⅡ（CCGCGG）进行酶切，对产生平均超过100000bps片段是非常合适的。 对PFGE结果的观察，可因不同研究者而出现较大差异，据此，Tenover等经过多年的研究提出了PFGE的解释标准： (1)相同（indistinguishable）：酶切图谱间有同样的条带数，且相应条带大小相同，流行病学上则认为相同，这种经PFGE证实的结果，用其它方法检测不可能显示实质性的差异。(2)紧密相关（closelyrelated）：PFGE试验中，其它克隆株与暴发克隆株有一致的单一基因事件的改变，如点突变、插入或DNA缺失。典型的情况下，这种变化可导致2～3条带的差异，当一些分离菌株被多次重复培养或自同一病人多次分离时可观察到这种现象。 (3)可能相关（possiblyrelated）：两个独立的基因情况所致的一致的差异，如出现了4～6条带差异，此时能用简单的插入或DNA缺失或限制性位点的获得或缺失来解释。这些菌株与暴发株间遗传基因不紧密相关，流行病学上也不大可能相关，在长于6个月时间及大范围的暴发中收集的菌株可出现这类情况。 (4)不相关（unrelated）：1个分离菌株通过3个更多个独立的基因事件所致的一致的改变，其PFGE图谱与暴发克隆株样式不同，则可认为与暴发克隆株不相关（一般总有7个或更多个条带的差异）。典型情况下，这一分离株常只有少于50%的良好的分离的片段出现在暴发株图谱样式中。

脉冲场凝胶电泳

脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项 【实验原理】 大分子DNA(一般长度超过20kb ，在某些情况下，超过40kb 在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。 这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显着地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE设备能把大小范围在10～2000kb 的DNA 片段分开。FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。 【仪器、材料与试剂】 1. 制备DNA 样品所需材料 1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA。 2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。 3EC 缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5% 4ESP 缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL 蛋白酶K 。 5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。 6RNase(10mg/mL。

脉冲场凝胶电泳

脉冲场凝胶电泳（PFGE）的原理 脉冲场凝胶电泳（PFGE）的原理大致为: 细菌包埋于琼脂块中,用适当的内切酶在原位对整个细菌染色体进行酶切,酶切片段在特定的电泳系统中通过电场方向不断交替变换及合适的脉冲时间等条件下而得到良好的分离。 PFGE中内切酶的选用至关重要,所采用的内切酶常为寡切点酶(low frequency cleavage restriction endonucleases),这种酶切后的片段少而大,适合于作PFGE电泳。McClelland等[8]通过对细菌的PFGE 电泳图谱的内切酶的选择研究发现,四核苷酸CTAG在许多GC含量>45%的细菌染色体中是很少见的,在他们所试验的16个细菌的染色体中,被1个或多个可识别CTAG位点的内切酶酶切,每100000ｂｐｓ中不到一次,这些酶的识别序列分别为:XbaI(TCTAGA), SepI(ACTAGT),AvrII(CCTAGG)和NheI(GCTAGC)。同样地,在许多含 Ｇ+Ｃ<45%的基因组,CCG和CGG更少。这样用SmaI(CCCGGG)、RsrII(CGGWCCG)、NaeI(GCCGGC)和SacII(CCGCGG)进行酶切,对产生平均超过100000bps片段是非常合适的。 对PFGE结果的观察,可因不同研究者而出现较大差异,据此,Tenover 等[6]经过多年的研究提出了PFGE的解释标准:(1)相同(indistinguishable):酶切图谱间有同样的条带数,且相应条带大小相同,流行病学上则认为相同,这种经PFGE证实的结果,用其它方法检测不可能显示实质性的差异。(2)紧密相关(closely related): PFGE试验中,其它克隆株与暴发克隆株有一致的单一基因事件的改

脉冲场电泳(PFGE)数据分析

细菌分子分型技术服务(PFGE/MLVA/MLST) 一、产品描述信息 过去20年的实践证明，分子分型方法在细菌的分子流行病学、种群结构分析、基因多态性分析等方面显示了很好的应用能力，在疾控、医药、农业、食品、环境、出入境检验检疫等领域发挥重要作用。其中脉冲场凝胶电泳（PFGE）、多位点序列分型（MLST）和多位点可变数目串联重复序列分型（MLVA）三种技术是目前应用最广泛的细菌分子分型方法。 PFGE以其重复性好，分辨力强而被誉为细菌分子分型技术的“金标准”。它可以用于大分子DNA的分离，其分辨范围达到10 Mb。PFGE选用识别低频率酶切位点的内切酶切割基因组DNA，获得的DNA大片段在外加脉冲电场的低浓度琼脂糖凝胶中分离，产生数量有限的DNA条带，在凝胶上按染色体片段长度的不同而呈现出电泳带型，从而实现对菌株分型以检测菌株的基因多态性。 MLST是基于细菌核苷酸序列比对的一种分子分型方法，其原理是通过比较细菌个体7个或者更多管家基因的核苷酸序列的多态性，确定其基因多态性，同时通过划分序列群和构建最小生成树来揭示细菌群体遗传结构。 MLVA是基于细菌基因组中多个位点的数目可变化的串联重复序列核心序列的拷贝数的差异来对不同细菌个体进行分型的一种技术。MLVA具有快速高通量易于操作等优点，不仅能确定基因多态性，而且能揭示细菌群体遗传结构特征。 使用PFGE、MLST、MLVA中的一种或者综合使用多种分型方法，可以揭示细菌的基因多态性和群体遗传结构，结合细菌的三间分布信息以及其他生物学信息（如耐药特征、特殊表型、毒力基因检测）等可以进行细菌的流行特征、传播机制、变异特征分析，以及特殊意义克隆群的甄别等研究，另外还可以为后续的研究，如全基因组测序、致病机制研究等项目筛选具有基因组代表性的测试菌株。 二、产品详细信息 1、技术路线 2、技术优势 1.技术成熟，本团队具有丰富的实践经验，可为客户提供详细先进的实验方案； 2.有多种分型方法组合供不同的实验目的选择；

脉冲场凝胶电泳实验流程

脉冲场凝胶电泳实验流程 一、准备样品 1. 琼脂糖包埋的样品 常用的DNA提取方法不能得到完整的大分子量DNA。大分子量DNA很脆弱，在制备过程中容易因移液等操作造成机械剪切。将完整细胞包埋入琼脂糖后再进行裂解，去除蛋白的操作，可防止大 分子量DNA的断裂。琼脂糖块包埋的DNA可以避免被机械剪切，并且是一种简单的操作方法。处理 过的包埋有DNA的琼脂糖块可以直接放入琼脂糖凝胶的点样孔。 在将细胞包埋入琼脂糖之前要先确定细胞浓度，尽管吸光度很常用，但是并不可靠。单位吸光度对应的细胞浓度会因菌株不同或培养基不同而有差异。这会影响琼脂糖块中DNA的含量，导致上 样量过大或不足。不论细菌、真菌还是哺乳动物细胞，使用血球计数板均可得到准确和高重复性的 细胞浓度。 Bio-Rad提供一次性的样品模具（货号：170-3713）。每个模具可制备50个10 x 5 x 1.5 mm的琼脂糖胶块。样品制备过程中的酶可以快速有效的扩散进入胶块，用Bio-Rad标准梳子制胶，胶块不需 要修剪就可直接放入点样孔。 2. 液体样品 小于200kb的DNA片断可以不用琼脂糖包埋，可直接以液体形式加入点样孔。当操作的DNA大于50kb时，必须用大开口的吸头。如果只电泳液体样品，使用厚度0.75 mm的梳子可以获得更锐利 的条带和更高的分辨率。 3. 制备琼脂糖包埋的哺乳动物DNA 该方法中用到的缓冲液，酶和琼脂糖均包含于试剂盒CHEF Mammalian Genomic DNA Plug Kit （货号：170-3591）。 1)将细胞悬浮于等渗盐溶液或不含血清的培养基中并置于冰上。用血球计数板对细胞计数，每毫 升琼脂糖块需要5 x 107个细胞，每个10 x 5 x 1.5 mm的样品块需要0.1 mL琼脂糖。 2)准备2% CleanCut?琼脂糖（货号：170-3594），用微波炉融化并置于50 °C水浴。 3)1000g、4 °C离心细胞悬液5分钟，用琼脂糖块一半体积的细胞悬浮缓冲液（10 mM Tris, pH 7.2, 20 mM NaCl, 50 mM EDTA）重悬细胞并置于50 °C水浴。 4)将细胞悬液与等体积的2% CleanCut琼脂糖轻揉且彻底混匀并放回50 °C水浴，用移液器将混合 物加入样品模具。静置使琼脂糖凝固，可以将模具置于4 °C冰箱10-15 min，这样可以加速凝固 并增加琼脂糖的强度以方便从模具中移出。 5)使用50 mL离心管，每1 mL琼脂糖块加入5 mL蛋白酶K反应液（100 mM EDTA, pH 8.0, 0.2% sodium deoxycholate, 1% sodium lauryl sarcosine, 1 mg/mL Proteinase K）。将凝固的琼脂糖块从 模具中捅入盛有蛋白酶K反应液的50 mL离心管中。于50 °C水浴中消化过夜，不需要振荡。 注：根据细胞特性不同，有的样品需要延长消化时间至4天，但这并不会损伤DNA。 6)用50 mL洗涤缓冲液（20 mM Tris, pH 8.0, 50 mM EDTA）洗涤琼脂糖块4次，于室温轻柔振荡， 每次30-60 min。如果样品接下来要进行限制性内切酶消化，建议在第2、3次洗涤时加入1 mM PMSF使残余的蛋白酶K失活。 7)琼脂糖块可于4 °C保存3个月至1年。 8)琼脂糖块可于洗涤缓冲液中长期保存，但必须在限制性内切酶消化前降低EDTA浓度。请在酶 切前用10倍稀释的洗涤缓冲液或TE（10 mM Tris, 1mM EDTA, pH8.0）洗涤琼脂糖块30分钟。 4. 制备琼脂糖包埋的细菌DNA 该方法中用到的缓冲液，酶和琼脂糖均包含于试剂盒CHEF Bacterial Genomic DNA Plug Kit （货号：170-3592）。 1)用50mL LB培养基或其他培养基培养细菌至OD600到达0.8 - 1.0。 2)当OD600到达0.8 - 1.0，加入氯霉素至终浓度180μg/m L并继续培养1小时

脉冲场凝胶电泳.

脉冲场凝胶电泳.

————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期： 2

3 脉冲场凝胶电泳(PFGE 实验原理、操作步骤和注意事项 【实验原理】 大分子DNA(一般长度超过20kb ，在某些情况下，超过40kb 在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。 这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE 。通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE 设备能把大小范围在10～2000kb 的DNA 片段分开。FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。 【仪器、材料与试剂】 1. 制备DNA 样品所需材料 1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris ，pH7.5；0.15mol/LNaCl ；0.1mol/LEDTA 。 2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。 3EC 缓冲液(6mol/LTris ，pH7.5；lmol/L NaCl ；0.5%

脉冲场电泳仪参数

脉冲场电泳仪参数 一、技术经济指标 、六角形电极的电泳槽，保证矢量电场的自由旋转，提供更高的分辨率、电泳速度和更精确的分离，对的片段都能提供有效的分离。 、自动演算：提供给用户一套程序用于优化实验参数。只要输入待分离片段的最小、最大长度，结合个主要变量的确定，帮助使用者获得最理想的实验条件。 、脉冲角度：可以在°间自由选择脉冲角度，使用户可以在同一系统上实现大至染色体级、小至质粒的有效分离。 、时间转换梯度：有线性、非线性（凸形和凹形）两种脉冲时间梯度，非线性梯度可以提供更广泛的分离动态范围，使用户可以精确的确定分离片段的大小。 、多状态功能：在一个中可以有个电场矢量，每个电场矢量可以有自己的电压和转换时间，可有选择地对一定大小范围的片段进行更精细的分离，并且可以在同一次电泳中实现和两种技术。 、二次脉冲功能：二次脉冲可加速从琼脂糖凝胶中释放，从而有利于非常大的片段的分离，并可提高分辨率。 、技术应用： （钳式均衡电场）技术，产生均衡电场； （程序自主控制电极）技术，根据片断大小的需要优化设定脉冲角度；（电场倒置）技术，为以下小片断提供快速分离；

（非对称场倒置）技术，精细分离小片断，提高分辨率； 以上技术的应用保证了科研人员在所有分子量范围内均能得到所最佳的线性分离。 、性能指标： . 电源输出：最高电压，和，增量，连续可调 . 最大电流：0.5A . 延迟启动：最高小时 . 电极调节能力：动态调节（反馈调整）±％ . 程序储存：存储个复杂实验程序，每个程序包含个程序模块或个简单程序 . 数据记录：键盘，条形码读取或接口 . 显示屏：行×字符行，荧光显示 . 转换范围：毫秒到小时 . 转换角度：°，°增量 . 电泳时间：最高小时模块 . 脉冲中断设置：可以通过电压，频率，角度和持续时间设定 二、设备产地：国外 三、参考品牌及型号：无 四、资质要求：

分子克隆3—DNA凝胶电泳和脉冲场琼脂糖凝胶电泳

方案1.琼脂糖凝胶电泳 方案2.琼脂糖凝胶中DNA的检测 方案3.琼脂糖凝胶中DNA的回收：DEAE-纤维素膜电泳 方案4.琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺中DNA的回收：电泳洗脱至透析袋方案5.阴离子交换色谱纯化从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶回收的DNA 方案6.低熔点琼脂糖凝胶中DNA的回收：有机溶剂抽提 ·替代方案：用玻璃珠从琼脂糖凝胶中回收DNA 方案7.低熔点琼脂糖凝胶中DNA：用琼脂糖酶消化 方案8.碱性琼脂糖凝胶电泳 ·附加方案：碱性琼脂糖凝胶的放射自显影 方案9.中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 方案10.聚丙烯酰胺凝胶中DNA的染色检测 方案11.聚丙烯酰胺凝胶中DNA的放射自显影检测 方案12.聚丙烯酰胺凝胶中DNA片段的回收：压碎与浸泡法 脉冲场凝胶电泳（方案13~20） 方案13.脉冲场凝胶电泳制备DNA：哺乳动物细胞和组织DNA的分离方案14.脉冲场凝胶电泳制备DNA：酵母完整DNA的分离 方案15.琼脂糖凝胶中DNA的限制性内切核酸酶消化 方案16.脉冲场凝胶电泳的分子质量标准 方案17.横向交变场的脉冲场凝胶电泳 方案18.箝位匀强电场的脉冲场凝胶电泳 方案19.脉冲场凝胶中DNA片段的直接回收 方案20.脉冲场凝胶中浓缩DNA片段的回收

琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳用于分离、鉴定和纯化DNA片段。该技术的优点： [1].操作简单而迅速，能分离用其他方法不能满意分离的片段； [2].凝胶DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料直接观察到 [3].这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种目的。 [4].琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶能灌制成各种形状、大小、孔径，也能以许多不同的构型 和方位进行电泳。这些参数或条件的选择主要取决于被分离DNA片段的大小。 A.聚丙烯酰胺凝胶： [1].适用范围： 1.)最适合分离小片段DNA（5~500bp）； 2.)聚丙烯酰胺凝胶电泳是在恒定电场中垂直方位上进行的。 [2].优点： 1.)聚丙烯酰胺凝胶分辨率非常强，长度上相差1bp或质量上相差0.1%的DNA都可 以彼此分离。 2.)可以很快进行电泳，容纳较大的DNA上样量； [3].缺点： 1.)在制备和操作上更繁琐； B.琼脂糖凝胶： [1].适用范围： 1.)分辨率略低，但分离范围更大（50bp~百万bp）； 2.)小片段DNA(50~20 000bp)最适合在恒定强度和方向的电场中水平位的琼脂糖凝胶 内电泳分离。在这些条件下，DNA泳动速率通常随DNA片段长度的增加而减少， 但与电场强度成正比。当线状双螺旋DNA的半径超过凝胶的孔径时就达到凝胶分 辨率的极限，上述相关性立即被破坏，此时，DNA不再被凝胶按其大小筛分，而 必须以一段在前的方式在介质中迁移，这种迁移模式称为“蠕行”（reptation）。 3.)脉冲场电泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)：应用交替变换的方向成直角的 两个电场于凝胶，可以分辨的DNA长度已超过6000kb。对于所有生物体，PFGE 通常用于研究基因组、克隆和分析大的基因片段。 [2].优点： [3].缺点： 1.)凝胶的孔径越大，能被分离的DNA就越大，用低浓度琼脂糖(0.1%~0.2%, m/V)灌 制的凝胶可以分辨很大的DNA分子，但是这样的凝胶很脆，容易碎裂，并且需要 几天的时间电泳。即便如此，也不能分辨大于750kb的线状DNA分子。 方案1.琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是D-和L-半乳糖残基通过α(1→3)和β(1→4)糖苷键交替构成的线状聚合物。 琼脂糖形成螺旋纤维，后者再聚合成半径20~30nm的超螺旋结构。琼脂糖凝胶可以构成一个直径从50nm到略大于200nm的三维筛孔的通道。 商品化的琼脂糖聚合物每个链约含有800个半乳糖残基，琼脂糖不是均一的，不同制造商或不同生产批次的多糖链的平均长度都是不同的。此外，较低等级的琼脂糖也许存在其他多糖、盐和蛋白质的污染。这种变异性（非均一行）影响琼脂糖凝结和融化的温度、DNA的筛分和从凝胶回收DNA作为酶切底物的能力。应用特制等级的琼脂糖可以减少以上潜在的问题。 A.决定DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率的因素：

脉冲场电泳系统Rotaphor60(中文资料).

德国Biometra的脉冲场电泳系统 （Pulsed Field Gel Electrophoresis System） ——Rotaphor 6.0版 脉冲场电泳系统适用于分离高分子量DNA。依靠专利的Rotaphor技术，Biometra的脉冲场电泳系统6.0版可分离最高达6,000 kb的DNA；同时，还可轻易地分辨线性和环状的DNA。新的脉冲场电泳系统6.0版与以前的5.0版相比，不仅在硬件系统上做了较大改进，在控制软件上更是进行了一场革命。 在6.0版本中，整套系统由凝胶室（带旋转电极）、由 PC编程和控制的电泳系统、电源盒P25、制冷调节器KH-4 （用于外部制冷循环）等组成。用户除了可以自定义电泳 程序外，还可以选用预先储存的、针对不同分子量DNA 的程序，并对它进行修改；而且在每一个电泳程序中，都有一幅照片，显示根据这一程序电泳后的实际结果。由于使用了PC，理论上可以储存足够多的电泳程序。除此之外，新的电泳室内部还集成了缓冲液循环泵，这样，在进行长时间的电泳时（可长达80小时），确保缓冲液的离子平衡。 Biometra脉冲场电泳系统6.0版技术参数 凝胶室 由14个铂金电极组成的旋转电极组可以自由旋转，最大角度达 270°； 内置的缓冲液循环泵； 内部冷却回路，接于外置温度控制器； 温度敏感探头； 最多2.4 L缓冲液； 丙烯酸透明玻璃安全盖（当盖子抬起时自动切断电源）； 尺寸：35×47×25 cm（W×D×H）。 胶板 可调整水平的支脚； 20×20cm凝胶尺寸； 最大18cm电泳距离；

- 2 - 18齿梳子，制胶厚度为5mm 时，最大上样量约为60μl ；可选40齿梳子； 制胶框。 控制器 个人计算机； 操作系统Win XP ； 256M 内存； 40G 硬盘； 40×光驱； Rotaphor 电泳槽控制界面； 预装Rotaphor 6.0控制软件。 Rotaphor 6.0控制软件 17组优化程序，可用于分离100bp~6,000kb 的DNA 样品； 可根据分离样品类型将电泳程序分类； 非常方便地调整各种参数（电极角度、电压、脉冲时间）； 电泳电压范围0-225V （0-8.5V/cm ）； 电泳缓冲液温度精确控制（5-22℃）； 针对每一组电泳程序，都会有相应的实际电泳结果照片显示； 用户分组和密码控制； 全面的在线帮助； 德语或英语界面（正在完成中文化！！）； 用户手册。

脉冲场电泳

脉冲场凝胶电泳- 高分子量DNA琼脂糖凝胶块制备和加工 1．收集10ml全血，加入30ml细胞裂解液。置冰浴中至少20min直至红细胞完全溶解。 2．2000r/min离心10min，移去红色上清液，再次用细胞裂解液洗涤细胞，然后用PBS重悬细胞。 3．稀释单细胞悬液并取一小份用Neubauer腔计数细胞。 4．用PBS重悬细胞，以达到40μl PBS中含1百万个细胞比例（1百万个二倍体哺乳动物大约含有基因组DNA 10μg） 5．用PBS配制2％浓度低熔点琼脂糖溶液并保持在50℃。 6．将等体积（各1ml）细胞悬液与琼脂糖溶液于室温下混匀，立即倒入凝胶块模具中。 7．静置20min让琼脂糖固化，用无菌塑料杯（通常用作划菌）将凝胶块自模具中取出并置入蛋白酶缓冲液中，加入2mg/ml的蛋白酶K。8．将带有凝胶块的蛋白酶K缓冲液于50℃保持2～3天。每个盛有50ml蛋白酶缓冲液的Falcon管可容纳多达100个凝胶块。 9．蛋白酶K消化后，可将凝胶块保留在此缓冲液或0.5mol/L EDTA溶液中保存于4℃。 10．此外，继续将凝胶块用高压消毒过的TE缓冲液冲洗数遍的步骤。11．将凝胶块放入装有TE及0.04mg/ml PMSF溶液的Falcon试管中，灭活残留的蛋白酶K。 12.室温下用TE溶液漂洗凝胶块数次,将凝胶块放入另一干净的试管，可直接用于酶切反应或用0.5mol/L EDTA，（pH8.0）4℃保存凝胶块。

13．若用EDTA保存凝胶块，取出后应用TE溶液室温下漂洗30 min×2次。 脉冲场凝胶电泳- 大小标准物的制备 λ多联体 1．以TE缓冲液悬浮λ多联体（Boehringer MA宝灵曼公司产品），浓度为4μg/40μl。 2．用等体积TE配制的2％低熔点琼脂糖（温度保持在45℃）混匀。 3．移去混合液注入预冷的凝胶块模具中。 4．室温下用TE及100 mmol/L NaCl溶液温育2天。 酵母染色体 1．从YPD（酵母提取物，蛋白胨和葡萄糖）培养基瓶皿中挑选单一克隆加入10ml YPD预培养的肉汤中，30℃下剧烈震荡生长24小时，然后加入200ml YPD肉汤，剧烈振荡24～48h（产量大约100块）。2．4000×g转速，离心10min，然后用50mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)溶液悬浮。 3．仍以4000×g转速离心10min，再用SCE【1 mol/L 山梨醇，0.1mol/L 枸椽酸钠，pH5.8及10 mmol/L EDTA (pH7.5)】溶液重悬。 4．取稀释后的细胞悬液用Neubauer腔计数。 5．溶液短暂离心后，再用SCE重悬细胞，使40μl SCE溶液中含5×107个细胞（相当于80μl体积的模块中含有5×107个细胞）。 6．溶液与0.1mg/ml酵母扣糖酶100T和100mmol/Lβ-巯基乙醇混匀，37℃保温15～30min。

脉冲场凝胶电泳

脉冲场凝胶系统操作规范 文件编号：VBQW11##-## 版本号：A0 制定： 制定日期： 审核： 审核日期： 批准： 批准日期： 颁发部门：质量保障中心 发行日期：

目录 1. 目的 (4) 2. 适用范围 (4) 3. 职责 (4) 4. 操作规范 (4) 4.1 简介 (4) 4.1.1. 技术原理 (4) 4.1.2 主要仪器设备和试剂 (4) 4.2 准备工作 (5) 4.3灌胶 (5) 4.4上样 (6) 4.5 主机程序设置 (6) 4.6 凝胶染色和观察 (6) 4.7 电泳槽清理 (7) 5. 注意事项 (8) 6. 常见故障及解决方法 (8) 7. 关于参数设置的几点建议 (9) 8. 试剂配制 (11)

1.目的 指导技术员规范地使用脉冲场凝胶系统。 2.适用范围 本标准适用于利用脉冲场凝胶系统对相关产品进行检测。 3.职责 分子部门负责本文件的编写，质量保障部及检验人员负责本标准的监督。 4.操作规范 4.1简介 4.1.1. 技术原理 常规的琼脂糖凝胶电泳采用单一的均匀电场，一定大小的线状DNA分子经凝胶的分子筛作用以一定的速率由负极向正极移动。但当DNA分子的长度超过一定极限后，其迁移率于则于分子大小无关，而主要是决定于电场强度。实践表明，长度大于50kb的DNA不能在恒场强的琼脂糖凝胶电泳中较好的分离。脉冲场凝胶系统(Pulsed field gal electrophoresis, PFGE)正好解决这一问题。PFGE采用两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，DNA的电泳方向随着电场的变化而改变，大分子的DNA得以分离。严格来讲，“脉冲”场电泳有些用词不当，应称作“交替”场电泳。电场变换方向的间隔时间为脉冲时间，其分为从数秒到几小时。通常脉冲时间越长分辨的DNA片段越长。 图一. 脉冲场电泳交变示意图 图一是根据Carle和Olson最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1 field gel electrophoresis，OFAGE) 绘制的PFGE示意图。A、B代表两个交替开启和关闭的电场。当A电场开启时，B电场关闭，DNA分子从A电场的负极(A-)向正极(A+ )移动；当B电场开启时，DNA分子改变原来的运行方向，随B电场由负极(B-)向正极(B+)移动。这样，随着电场方向的交替变化DNA分子即呈“Z” 字形向前移动。可以想象，较小的分子能相当快速地适应这种变化，但大分子则需更多的时间来改变方向，而真正用于前移的时间相对减少，从而将不同大小的分子分开。 4.1.2 主要仪器设备和试剂

PFGE原理及注意事项

脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis ,PFGE)是通过脉冲电场方向、时间与电流大小交替改变完成分离大分子DNA。 PFGE注意事项：： 蠕动泵的流速：电泳过程中，控制好蠕动泵的流速，一般控制在50-70左右，以免速度太快，使胶在溶液中移动。 冷却泵的开启：冷却泵开启时，一定要把蠕动泵打开，以避免冷却泵管道内的溶液因为过度制冷，凝结成冰块而堵塞管道。 电泳结束后，应及时取出凝胶，进行染色等操作，以避免因为时间太长，而造成条带的弥散。 脉冲场凝胶电泳（PFGE）的原理 脉冲场凝胶电泳（PFGE）的原理大致为: 细菌包埋于琼脂块中,用适当的内切酶在原位对整个细菌染色体进行酶切,酶切片段在特定的电泳系统中通过电场方向不断交替变换及合适的脉冲时间等条件下而得到良好的分离。 PFGE中内切酶的选用至关重要,所采用的内切酶常为寡切点酶(low frequency cleavage restriction endonucleases),这种酶切后的片段少而大,适合于作PFGE电泳。McClelland等[8]通过对细菌的PFGE

电泳图谱的内切酶的选择研究发现,四核苷酸CTAG在许多GC含量>45%的细菌染色体中是很少见的,在他们所试验的16个细菌的染色体中,被1个或多个可识别CTAG位点的内切酶酶切,每100000ｂｐｓ中不到一次,这些酶的识别序列分别为:XbaI(TCTAGA), SepI(ACTAGT),AvrII(CCTAGG)和NheI(GCTAGC)。同样地,在许多含 Ｇ+Ｃ<45%的基因组,CCG和CGG更少。这样用SmaI(CCCGGG)、RsrII(CGGWCCG)、NaeI(GCCGGC)和SacII(CCGCGG)进行酶切,对产生平均超过100000bps片段是非常合适的。 对PFGE结果的观察,可因不同研究者而出现较大差异,据此,Tenover 等[6]经过多年的研究提出了PFGE的解释标准:(1)相同(indistinguishable):酶切图谱间有同样的条带数,且相应条带大小相同,流行病学上则认为相同,这种经PFGE证实的结果,用其它方法检测不可能显示实质性的差异。(2)紧密相关(closely related): PFGE试验中,其它克隆株与暴发克隆株有一致的单一基因事件的改变,如点突变、插入或ＤＮＡ缺失。典型的情况下,这种变化可导致2～3条带的差异,当一些分离菌株被多次重复培养或自同一病人多次分离时可观察到这种现象。(3)可能相关(possibly related):两个独立的基因情况所致的一致的差异,如出现了4～6条带差异,此时能用简单的插入或ＤＮＡ缺失或限制性位点的获得或缺失来解释。这些菌株与暴发株间遗传基因不紧密相关,流行病学上也不大可能相关,在长于6个月时间及大范围的暴发中收集的菌株可出现这类情况。(4)不相关(unrelated):1个分离菌株通过3个更多个独立的基因事件所致的

脉冲场电泳操作注意事项

脉冲场电泳操作注意事项 一、操作注意事项 安全： 1、CHEF 系统在运行中使用高电压和大电流，因此在仪器运行过程中，不 能随意打开电泳槽。如果确实需要打开电泳槽，一定要在仪器暂停、“high voltage”指示灯熄灭后才可以打开。 2、脉冲场电泳过程中，缓冲液会循环流动，因此要检查电泳槽和管道系统 时候有漏液。 3、电泳结束后，等“high voltage”灯灭后，再依次关掉冷凝系统，主机开 关，打开电泳槽，取出凝胶，进行染色等操作。 操作注意事项： 4、电泳槽水平的调节：用水平泡调节，确保电泳槽的水平， 5、灌胶框的放置：不同的凝胶使用不同的灌胶框，检查灌胶框的位置，使 之处在电泳槽的中央。 6、梳子的放置：梳子不要和灌胶框密切接触，保持1-2毫米的距离； 7、灌胶：灌胶前用水平泡调节灌胶框的水平；加热好的琼脂糖溶液，不要 立刻倒胶，待稍许冷却后，约40℃左右，再倒胶。倒胶过程中如果有气泡，用tip头将气泡戳破即可。 8、修胶：制备好的凝胶，在从灌胶架取下后，要用手术刀片，对凝胶进行 修饰，把多余的凝胶刮去。 9、凝胶的放置：点样孔的位置应靠近电泳槽的后侧。 10、蠕动泵的流速：电泳过程中，控制好蠕动泵的流速，一般控制在50 左右，以免速度太快，使胶在溶液中移动。 11、过滤条的使用：在电泳槽的前内侧，放置过滤条，以放置游离的凝 胶碎片进入冷却泵，堵塞管道系统。 12、冷却泵的开启：冷却泵开启时，一定要把蠕动泵打开，以避免冷却 泵管道内的溶液因为过度制冷，凝结成冰块而堵塞管道。 13、电泳结束后，应及时取出凝胶，进行染色等操作，以避免因为时间 太长，而造成条带的弥散。

伯乐脉冲场电泳安装条件

1、 1 M Tris-HCl, pH 8.0 121.1 g Tris base溶于650-700 ml纯水中，加入80 ml 6 N HCl*，在室温下调pH至 8.0，加水终体积至1000 ml，高压灭菌。 或者157.6 g Tris-HCl溶于800 ml纯水中，在室温下调pH至8.0，加水终体积至1000 ml，高压灭菌。 2、10 N NaOH 400 g NaOH小心溶于800 ml纯水中，冷却到室温，加灭菌的纯水使终体积至1000 ml。 3、0.5 M EDTA, pH 8.0 溶于800 ml纯水中，加入50ml 10N NaOH调pH至8.0，加水终体积至1000 ml，分成数份，高压灭菌。 4、20% Sodium Dodecyl Sulfate (SDS，十二烷基硫酸钠) 将20克SDS小心加入装有80 ml灭菌纯水的容器中，在35°- 45°C轻轻混匀溶解，定容至100ml。 5、20 mg/ml 蛋白酶K储存液 100 mg Proteinase K 粉末溶于5 ml 灭菌纯水中，混匀，分装在1.5 ml离心管中，每管500-600 μl，-20°C保存备用。 6、10× Tris-Borate EDTA Buffer (TBE) 0.9 M Tris base (108 g) 0.9 M Boric Acid (55 g) 0.02 M EDTA, pH 8.0 (40 ml 0.5 M) 溶于1000 ml灭菌的纯水中，高压灭菌 注意：如果缓冲液有沉淀生成必须丢弃。 7、Ethidium Bromide（EB） 10 mg/ml EB的储存液用纯水1:10,000 稀释(即100 ml水中加入10 μl储存液，500ml 水中加50ul储存液）。稀释液在丢弃前可以染5-6块胶。储存在棕色瓶中的EB稀释液可以用3-5次。废弃的EB溶液应妥善处理。 （注：可用无细胞毒性的核酸染料Gelred替代EB，配制500ml染液的方法是在450ml 纯水中加入50ml的1MNaCl和150μl的Gelred染料。）