细胞培养复习题(含答案)
1.体外培养的细胞按生长方式可分为哪二种按细胞在体外生长的形态特征,可分为哪几种常见类型
⑴按生长方式分为二型：
粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。
悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。（绝大多数有机体细胞属粘附型细胞。）
⑵可分四型：(1)上皮型细胞(2)成纤维型细胞(3)游走型细胞(4)多形型细胞
2.简述体外培养细胞的整个生命活动过程的分期及每代贴附生长细胞的生长过程
⑴通常，体外培养细胞的全部生命期大致可被分为以下三个阶段：
①原代培养期：也称初代培养，是指从机体中取出细胞接种培养到第一次传代之前的这一阶段。此期的细胞呈现出活跃移动的特点，可见细胞分裂，但不旺盛。处于原代培养阶段的细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上有很大的相似性。细胞群具有明显的异质性，细胞间的相互依存性强，在软琼脂培养基培养时细胞集落形成率很低。
②．传代期：通常是培养细胞全生命期中持续时间最长的时期，原代培养的细胞经传代后常被称做细胞系。一般情况下，正常体细胞在传代10-50次左右后，细胞分裂的能力就会逐渐减弱，甚至完全丧失，细胞便进入衰退期。
③衰退期：处于衰退期的培养细胞，增殖速率已经变得很慢或不再增殖，直至最后衰退死亡。
以上特点，主要是针对体外培养的机体正常细胞，对于体外发生转化的细胞和肿瘤细胞而言，永生性或恶型性的获得使得这类细胞获得持久性的增殖能力，这样的细胞群体常被称为无限细胞系或连续细胞系。
⑵每代贴附生长细胞的生长过程：①游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。时间：10分钟一4小时②贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。底物：玻璃、塑料、胶原、其它细胞等③潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。④对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。⑤停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂
机制：接触抑制、密度限制
3.简述体外培养细胞对生存环境的基本要求.
⑴细胞的营养需要：①基本营养物质：氨基酸（１２种＋谷氨酰胺）、维生素、葡萄糖、核糖、脱氧核糖等无机离子。②促细胞生长因子：多由血清提供
⑵细胞的生存环境：①温度条件对细胞生长的影响：不同生物来源的组织细胞培养温度不同；体外培养动物细胞最常用的温度是37℃，耐低温不耐高温。在生理温度范围内，温度与细胞生长率之间存在正相关关系。②气相环境对细胞生长的影响：动物细胞培养的气相环境都是采用5%CO2与95%空气（提供氧）的混合气体。Ｏ2参与细胞的能量代谢过程，ＣＯ2用于维持培养液的酸碱度，一般多为开放式培养③培养液的酸碱度对细胞生长的影响：大多数的有机体细胞能在～的环境中生存。最适宜的pH值范围是～。体外培养的正常细胞耐酸能力要强于耐碱能力④无污染、无毒。
4．什么是细胞培养用液,主要分为哪几类
⑴培养用液是维护组织细胞生存、生长及进行细胞培养各项操作过程中所需的基本溶液。⑵主要包括：平衡盐溶液；培养基；其他培养用液。
5．D-Hank’s与Hank’s的主要区别是什么
D-Hank’s不含有Ca2+、Mg2+ ，常用于配制胰酶溶液。
6．简述胰酶的常用浓度及配制时的注意事项。
胰酶(trypsin)溶液：浓度一般为％～％，配制时要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡盐溶液。
7.细胞培养中血清的主要作用
(1)提供基本营养物质；(2)提供贴壁和扩展因子(3)提供激素及各种生长因子；(4)提供结合蛋白(5)对培养中的细胞提供某些保护作用
8.血清的使用与储存有哪些注意事项
（1）使用前的处理：使用前通常在56℃加热30分钟，这一过程称为灭活。热灭活目的：灭活血清中的补体成分。对于一些品质高的胎牛血清和新生牛血清可以考虑不经
灭活直接用于细胞培养。
（2）储存条件：血清一般储存于－20℃,同时应避免反复冻融。大包装的血清，首先将血清灭活处理，然后分装为小包装，如10ml、20ml、50ml，储存于-20℃，使用前融化。融化后的血清在4℃不宜长时间存放，应尽快使用。
9.简述干粉培养基的配制过程。
DMEM培养液的配制（举例）：⑴900 mL ddH2O于1000 mL烧杯中，将DMEM粉1包倒入其中，盛粉袋用50 mL ddH2O分次冲洗，也倒入容器，磁力（或玻棒）搅拌溶解。
⑵用5％－10％的NaHCO3调pH至。⑶加青、链霉素至终浓度100u/mL 和100ug/mL ⑷用的滤膜过滤除菌。⑸分装（200 mL左右）后4℃冰箱保存。
10.细胞培养工作室可分为那几个部分，各有什么作用
一般包括：准备室、培养室和缓冲室。作用：⑴准备室：用于进行培养器皿的清洗、包装、培养物质的准备和消毒以及供应物品的保藏等。⑵培养室：用于进行细胞培养和各种无菌操作的实验室。其基本条件是：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。天花板不宜高过。⑶缓冲室：（更衣室）
11. CO2培养箱的作用及使用中的注意事项。
用于维持适当温度、湿度与pH。注意事项：⑴质量关键在控温装置，温度变化一般不应超过度;培养箱的温度设在35～37℃，这是人和哺乳动物培养细胞的最适温度。⑵培养容器需与外界保持通气状态。⑶箱内空气应保持干净，定期消毒（紫外灯、酒精）
⑷水槽:保持一定湿度
12. 试述清洁液的配方组成及配制时的注意事项。
⑴清洁液:重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml），强清洁液63∶1000∶200 ，次强清洗液120∶200∶1000 ，弱清洁液100∶100∶1000
⑵配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分。配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸，并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色
13．简述消毒灭菌的常用方法、要求条件及主要应用范围。
⑴物理消毒灭菌法
①紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿。消毒时间：30min（至少）；紫外杀菌功能除了紫外本身以外，还可以由产生的臭氧来完成。紫外
灭菌以后，最好过一个小时再进去。②过滤：μm（适用于液体）
③湿热（高压蒸气灭菌法）15磅,121℃，20min
各种物品有效消毒压力和时间不同，一般要求如下：
培养用液、橡胶制品l0磅l0分钟
布类、玻璃制品、金属器械等15磅20分钟
④干烤：160℃, 2 小时（适用于玻璃器皿等）注意：消毒后不要立即打开箱门，以防冷空气骤然进入引起玻璃炸裂，影响消毒效果。
⑵化学消毒灭菌法：①7５%酒精主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理。②1－２‰新洁尔灭主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒。③抗生素主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染。细胞培养中最常用的抗生素是青霉素（常用浓度是100u/ml）与链霉素（100μg/ml）。不要在原代培养中加入抗生素。
14. 如何对玻璃器皿进行有效清洗
玻璃器皿的清洗：浸泡—刷洗(+烘干)—浸酸—冲洗；清洗后的玻璃器皿：干净透明无油迹。⑴浸泡：①初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉。②新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等。先用自来水简单刷洗，然后用5％稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。③再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的残留蛋白质，干固后不易洗掉，用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上。⑵刷洗：用毛刷（特制的羊毛刷）沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质。刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度。自然晾干或烘干后泡酸。⑶浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液（洗液）中。清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质。浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面。浸泡时间：一般为过夜，不应少于6 小时。⑷冲洗：在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗,使之尽量不留污染或清洁液的残迹。最好用洗涤装置。如用手工操作，需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，然后用蒸馏水清洗3-5 次，晾干（或烘干）备用
15．细胞培养中最常用的抗生素及使用浓度是什么
青霉素（常用浓度是100u/ml）与链霉素（100μg/ml）。
16．什么是原代培养简述原代培养方法的分类及主要操作步骤。
⑴原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称原代培养。
⑵原代培养方法分类：贴块法和消化法。消化法又分为冷消化与热消化；一次性消化与分次消化。
主要步骤：
贴块法：将取得洗净并剔去多余成分的组织切成约1mm3大小的植块，用于植块培养。消化法：将取得洗净并剔去多余成分的组织剪碎——蛋白酶溶液消化——机械方吹打组织块—对滤过液离心（<1000r/min, <10min）——用培养液悬浮成细胞悬液——计数并调节细胞密度——用于分离细胞培养
17．何谓传代培养简述贴壁细胞的传代操作步骤。
⑴传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或其他比率转移，接种到另一培养瓶的培养。
⑵贴壁细胞传代培养：①选取生长良好的细胞，在超净工作台的酒精灯旁，倒去瓶中的旧培养液，加入2～3ml的D- Hanks液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞表面的碎片。②加入适量0.１％－％胰蛋白酶消化液，室温消化，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液。③用Hanks液洗涤1次，加入适量培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬液。④以1：2或1：3进行分装，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37 ℃CO2培养箱培养。⑤观察：细胞培养24h后，即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况。
18．收集细胞时一般常用的转速和时间是多少
转速：1000r/min；时间：5min
19. 什么是冷冻保存影响细胞冷冻保存效果的因素有哪些
⑴冷冻保存(cryopreservation)：将体外培养物悬浮在加有冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度(一般是低于-70℃的超低温条件)，并在此温度下对其长期保存的过程。
⑵①冷冻速率当冷冻速度过慢时，细胞脱水严重，细胞体积严重收缩，超过一定程度时即失去活性。冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶质损伤。
当冷冻速度过快时，细胞内水分来不及外渗，会形成较大冰晶,造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细胞内冰晶损伤。②冷冻保存温度：液氮温度(-196℃)是目前最佳冷冻保存温度。应用-70℃～-80℃条件冷冻保存细胞，短期内对细胞活性无明显影响，但随着
冻存时间延长，细胞存活率明显下降。③复温速率指在细胞复苏时温度升高的速度。一般来说复温速度越快越好。常规的做法是，在37℃水浴中，于1～2min内完成复温。在冷冻复苏中遵循：慢冻速溶原则。④冷冻保护剂：是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。
分为：渗透性：常用甘油、DMSO
非渗透性
甘油或二甲基亚砜这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。
保护机制：是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤；同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。甘油和DMSO 并不能防止细胞内结冰。在使用该类冷冻保护剂时，需要一定的时间进行预冷，让甘油或DMSO等充分渗到细胞内，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。目前，DMSO的应用比甘油更为广泛。
非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质。
20．冻存的细胞一般如何复苏
1)将恒温水浴箱的温度调至37～40℃。2)从液氮中取出冻存小管，立即投入37～40℃温水中快速晃动，直至冻存液完全融解。要在1～2min内完成复温。3)将细胞冻存悬液移入离心管，加入约5m1培养液，轻轻吹匀。4)将细胞悬液经800～1000 r/min离心5min。弃上清液。5)给细胞沉淀物加入完全培养液，轻轻吹吸均匀。将细胞悬液移入培养瓶内，加足培养液进行培养。
21．简述培养细胞的非玻璃化冻存过程。
非玻璃化冻存——是利用各种温级的冰箱分阶段降温至-70～-80℃，然后投入液氮进行保存；该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成。
冻存过程：(1)待冻存细胞悬液的准备：①按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物,制备成单细胞悬液,计算细胞总数。②将细胞悬液以800～1000r／min离心5min，弃上清液。③向沉淀物中加入冷冻液。轻轻吹吸均匀，使细胞密度达1×106～1×107个/ml。④按每管1～的量，分装于冻存小管内。拧紧管盖。⑤在冻存小管上做标记，包
括细胞代号及冻存日期。
(2)分级冷冻：①先将冻存小管放人普通冰箱冷藏层(4～8℃)，约40min。②接着置于普通冰箱冷冻层(-10～-20℃)，30～60min。③再于-30℃放置30min左右（可省略）。④然后在-70～-80℃下过夜。⑤最后将冻存小管投入液氮保存。还有一种简单的方法，就是将冻存小管先悬挂在液氮罐口20 min，再直接投入液氮中保存。第三种方法是，用4℃预冷的冷冻保护液悬浮细胞，分装冻存小管后，将冻存小管放在4℃下30min；然后置于壁厚1 cm以上的泡沫塑料小盒内封好，立刻将小盒放置在-70～-80℃冰箱中24h以上至1周；再将冻存小管投入液氮中保存。
(3)记录：做好冻存记录。记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位置以及冻存经手人。
22．DMSO使用时应注意哪些事项
⑴在使用DMSO前，不需要对其进行高压灭菌，因其本身有灭菌作用。
⑵在常温下，DMSO对人体有毒，故在配制冷冻保护剂时最好带手套。
⑶由于许多冷冻保护剂(如DMSO))在低温条件下能保护细胞，但在常温下却对细胞有害，故在细胞复温融解后要及时洗除冷冻保护剂。
23. 细胞培养中常见有哪些微生物污染，有何主要特征
⑴真菌污染：真菌种类多，形态各异，但污染后均不难发现，大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可见；有的散在生长，镜下观察呈丝状、管状或树枝状菌丝，纵横交错穿行于细胞之间。念珠菌和酵母菌呈卵圆形态，散在于细胞周边和细胞之间生长。⑵细菌污染：污染后大多能改变培养液pH培养液变混浊，毒性大的细菌很快导致细胞崩解死亡。加用抗生素的培养用液一般可预防和排除个别少量细菌的污染。
⑶支原体污染：支原体是细胞培养中最常见、不易被察觉和干扰实验结果的一种污染。24．运送细胞的比较简便的方法是哪一种，简述其过程。
⑴一是用液氮或干冰保存运输，效果较好，但需用特制容器如小液氮罐等，又因液氮和干冰蒸发均较快，适于空运，比较麻烦;二是充液法运输，比较简便。
⑵充液法运输操作如下：①选生长状态良好的细胞，待达80%或90%汇合时，去掉旧培养液换入新培养液，量要达到培养瓶的颈部(过满易污染)，保留少许空间，塞紧瓶塞，空气过多运输中气泡运动易使细胞脱落; ②妥善包装和运送；一般在不超过四五天到达目的地的情况下，对细胞活力无严重影响; ③到达后，倒出大部分培养液，保留正常量，置37℃培养，次日传代。
25. 简述细胞污染的概念及种类.
⑴细胞污染: 凡混入培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物，都视为污染。⑵组织培养污染: 微生物：真菌、细菌、支原体和病毒；化学物质：影响细胞生存的非细胞所需的化学成分；细胞：不同细胞类型的交叉污染。
26. 细胞培养中污染主要通过哪些途径，一般如何预防
⑴空气: 培养设施不宜置于通风场所；定期清理净化工作台的过滤层，防止阻塞；操作中应减少空气流动；带口罩；夏季潮湿季节空气中含菌数量多，每立方米内含菌数不应超过1～5个。⑵清洗消毒：培养器皿和容器洗刷不净残留污物、培养用液灭菌不彻底等，都可引入有害物。⑶操作：实验操作马虎、动作不准确、消毒观念不强，使用的吸管、刀、剪沾染微生物等；或封瓶口时不严，都可发生污染。同时培养两种以上细胞，操作不慎使用同一吸管或培养用液，可能导致细胞交叉污染。⑷血清：血清也是污染细胞的来源，有的市售血清制备水平低、检测不严，常已被支原体和病毒污染。⑸组织：初代培养组织常有污染；有的是在手术中污染，有的本身可能是被污染的组织(如已发生溃烂的肿瘤组织)；手术用碘酒消毒后，擦拭不净可能混入碘污染。
27．细胞计数的操作要领及计算公式是什么
⑴具体操作程序如下：①取血细胞计数板和盖玻片，用75%酒精擦净。将盖玻片放于计数板上。②用滴管取混合均匀的细胞悬液，滴入计数室内。要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。滴加细胞悬液后约静置1分钟后则可以进行计数。③统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，分别数出四角的四个大格（每个大格含有16个中格）中的细胞数。对压边线细胞：计上不计下，计左不计右
⑵计算：一般以每毫升含细胞数来表示，大方格的面积为1mm2，室深为，则体积为。
推算得×104，才为1ml体积。所以计算公式为：细胞悬液的细胞数）/ml ＝（四个大格子细胞数/4)×104×稀释倍数；计数中，如果细胞悬液的细胞浓度过高，必须稀释后再计；如果细胞数太少,可离心浓缩后再计。每个细胞悬液至少滴样两次求平均值。
⑶用细胞计数板计数时应注意的事项:①不要漏计，不要重复②细胞悬液应混合均匀
③浓度不可过高也不可过低。
28. 简述细胞生长曲线绘制过程及其应用。
⑴细胞生长曲线(cell growth curve)是观测细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标，可根据细胞生长曲线分析细胞增殖速度，确定细胞传代、细胞冻存或具体实验的最佳时间。它以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标作坐标图。
⑵制作方法：①培养细胞：首先在2４孔培养板内分别接种相同数量的细胞。计数并记录接种的细胞悬液之密度。②计数细胞密度：从接种时间算起，每隔24h计数３孔内的细胞密度，算出平均值。为提高准确率，对每孔细胞可计数2～3次。如此操作至第七天结束。③绘制曲线：以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标，将全部结果在坐标纸上绘图，即得所培养细胞的生长曲线。
29. 简述MTT比色法的原理及操作过程。
⑴原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将染料MTT(二甲基噻唑二苯基四唑溴盐)转变为不可溶性的紫色结晶，后者被DMSO（或酸性异丙醇）溶解后所呈现的色度(用OD值表示)反映出活细胞的代谢水平。死亡细胞则无此酶活性。
溶液的配制
用PBS液或者生理盐水将MTT配成5mg／m1的溶液。（用μm滤膜过滤）。
保存：于4℃避光保存。可用2周。若暂不用，可冻存。
2.实验过程：（1）、将细胞培养于96孔培养板。（2）、按不同实验要求处理细胞。（3）、每孔加入15-20μlMTT液，继续培养3～4h。（4）吸去培养液，每孔加入200μlDMSO,在微型振荡器振荡5min,充分溶解混匀。（5）在酶标仪上测定光吸收。测定波长为490nm，以只加培养液的的培养皿为空白对照。
3.结果分析：细胞存活率=实验组光吸收值/对照组光吸收值*100％
4.注意事项：(1)高浓度血清可影响光吸收值,常使用含10%血清的培养液,在加入异丙醇溶液或DMSO前尽量吸净培养液。(2)吸去培养液时动作要慢,以免吸去形成的结晶。
30. 简述台盼蓝排除检测法原理
原理：由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，某些染料可大量进入却不被排出，因而细胞呈色。而活细胞反之，能排出进入细胞内的染料，因而不易着色。此法的原理即是利用死、活细胞对染料的不同反应而区分开两种细胞。
最常用的为“台盼蓝排除检测法”
(2)活体染色与细胞计数：①将1滴细胞悬液(贴壁细胞可经％胰蛋白酶溶液消化后，吹打制成细胞悬液)与2滴台盼蓝液混合后，滴入细胞计数板。②2min后，在显微镜下计数至少200个细胞。未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞。计算活细胞百分比。
注意事项:台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。否则，部分活细胞也会着色，会干扰实验结果。
细胞培养的操作步骤
传代细胞培养的视频拍摄脚本 一、实验准备 器材 液氮冷冻灌、恒温培养箱、电冰箱、高压灭菌锅、磁力搅拌器、离心机、分析天平、倒置显微镜、超净工作台、弯头吸管（1个）、胶头滴管（9个）、离心管（9个）、带塞培养瓶（不定个）、试管架、量桶、烧杯、酒精灯、抽滤瓶、G6型号细菌过滤漏斗、带塞小玻璃瓶，大三角瓶、无菌冻存管、液氮瓶（一）、器皿 1玻璃器皿的清洗灭菌： 种类：小玻璃瓶、弯头吸管、滴管（3个）、培养瓶、量桶、烧杯、抽滤瓶、大三角瓶，细菌过滤器接口管 药品：5％盐酸溶液、重鉻酸钾120ml、硫酸200ml、蒸馏水200ml （1）浸泡:新使用或重复使用的玻璃器皿须经5％盐酸溶液或自来水浸泡过夜或煮沸30min，水洗。以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷等物质，并消除其弱碱性。 （镜头一：实验人员将器皿放进加有5％盐酸溶液的盆内，并以字幕和配音的形式显示浸泡或煮沸时间和浸泡目的） （2）刷洗:浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。刷洗后经行烘干 （镜头二：实验人员刷洗器皿，使用正规的清洗方法，并烘干，只示范其中2--3种即可，实验人员必须介绍操作示范烘干箱的使用方法和相关数据的设置方法） （3）酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前须适当晾干或烘干，以免造成酸浸液稀释，影响效果。将玻璃制品完全浸泡入清洁液中24h。清洁液具有极强酸蚀作
用，操作过程需戴防护用具。 （镜头三：带好橡胶手套将清洁液加入到盆中，让后进行酸浸，并以字幕的形式显示浸泡时间） （4）冲洗、烘干备用:浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗10min，器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上，不留任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗2～3次 将清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干净透明，无油烟，不能残留任何有害物质及化学药品等。 （镜头四：自来水冲洗，蒸馏水清洗，烘干一起完成，在这个过程中可在装器皿的盘中放入一定量的玻璃器皿，只对其中一种进行自来水冲洗、蒸馏水清洗，洗好后就将所有仪器放入烘干箱中烘干，并在每一个步骤中以字幕或语音的形式显示相关操作次数和时间） （5）包装灭菌:器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒灭菌处理，以防止消毒灭菌后再次遭受污染。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。 （镜头五：实验人员对实验器皿中的1—2种进行包装示范，然后将其他包装过的器皿一起放入高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌） （实验人员必须示范操作高压灭菌锅和恒温干燥箱的用法，示范操作步骤，只示范一次即可，在下面的不同灭菌温度和不同灭菌时间可以字幕的形式显示）2、橡胶制品清洗消毒 种类：玻璃瓶橡胶塞、培养瓶瓶塞、皮管、滴管头 新的橡胶制品洗涤方法：0.5mol/L NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备
细胞培养复习题
名称解释 细胞培养（动物细胞培养）：动物细胞培养是指将动物活体体内取出的组织用机械或消化的方法分散成单细胞悬液，然后放在类似于体内生存环境的体外环境中，进行孵育培养，使其生存、生长并维持其结构与功能的方法。 组织培养：从生物体内取出活的组织（多只组织块）在体外进行培养的方法。有时泛指所有的体外培养。 器官培养：是将活体内的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。 合成培养基：根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的、配方恒定的培养基。 无血清培养基：由基础培养基和替代血清的补充因子（生长因子和激素、结合蛋白等）组成。 完全培养基：在合成培养基里添加血清后的培养基。 接触抑制：体外培养的细胞在贴附底物上连接成片、相互接触后失去运动的现象。 无限细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。 去分化（脱分化）：细胞在体外不可逆地失去原有特性。注意：去分化不意味分化能力完全丧失！在适当调节信号刺激下仍能表现出分化特性。但分化能力会随培养时间延长而逐渐丧失。 不适应：各种分化细胞，在体外培养时逐渐失去各自的形态与功能特征，表现出某种趋同性。原因：培养条件变化使分化发生阻抑 细胞分裂指数（MI）：是指细胞群中每1000个细胞中的分裂相数量 细胞群体倍增时间：是指培养物中细胞数量翻倍的时间。 原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。 传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。
动物细胞培养技术思考题
《动物细胞培养技术》复习思考题 动物细胞培养的实验器皿清洗要求为何较高？你认为该如何保证器皿中无杂质？如果器皿中有杂质，会对细胞培养产生什么样的影响？ 答：①离体细胞对各种毒物都很敏感，若所用器材清洗效果未达到要求，各种毒物会损坏细胞影响实验。②器皿使用高压灭菌锅，121.3℃，20~30分钟，在取拿的时候用经过高压灭菌后的镊子取拿，避免造成污染。③ 叙述超净工作台的工作原理？ 答：超净工作台最主要的是空气循环过滤的过程，在这个过程中风机起到了心脏的作用。鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。 正压过滤器为何会除菌？ 答：正压式过滤器没有内置灭菌灯，正压式过滤器利用的是两层0.22um孔的过滤膜，这层膜可以将细菌阻挡在膜上，过滤的液体流下去就基本上完成了灭菌过程 各种细胞培养用液的配制需要很精确吗？如果不精确，会导致什么后果？请举例说明。你认为精确配制各种溶液？ 答： 配制后平衡盐溶液呈黄色意味着液体的pH发生了什么变化？ 答：配制后的液体应呈桃红色，PH值为7.4左右。苯酚红的变色域：1.2（橙）~3.0（黄），6.5（棕色）~8.0（紫色），若为黄色，则液体呈酸性，不利于细胞的生存。 用于分离细胞的消化液为什么宜用无Ca、Mg离子的D-Hanks液或PBS液配制 答：Ca＋2、Mg＋2是细胞膜的重要组分，具有使细胞凝聚的作用。因此，用于分离细胞的消化液宜用无Ca＋2、Mg＋2离子的D-Hanks液或PBS液。 L-谷氨酰胺在营养液中有何作用？ 答：L－谷氨酰胺是细胞的能量来源；是一种必须氨基酸，是使物体合成核酸、蛋白质、嘌呤、嘧啶的重要前体，也是蛋白质合成分解的调节物；是细胞内氨的清除剂，氨对一些细胞有毒性。 HEPES溶液的作用机理？ 答：它是一种氢离子缓冲剂。主要作用是防止培养基pH迅速变动 平衡盐溶液的组成与基本作用？小牛血清在细胞培养中有哪些作用？ 答：①平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成,它的作用是维持细胞渗透压平衡,保持pH 稳定及提供简单的营养.主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。②作用：a提供能促使细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或含量微小的营养物，以及某些低分子营养物质； b提供结合蛋白，识别维生素、脂类、金属离子，并与有毒金属和热源物质结合，起解毒作用；c是细胞贴壁、铺展生长所需因子的来源； d起酸碱度缓冲液作用； e提供蛋白酶抑制剂，细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。 营养液制备后为什么要小剂量分装？ 答：避免营养液被污染后，全部的营养液都被污染。 营养液一次用完过后，下一次的实验就不能用，会引起污染，影响实验，若冷冻营养液，则营养液的营养成分会有所损失，影响细胞的生长 10万U/mL单位青霉素、链霉素的配制方法？ 答：用注射器吸10毫升双蒸水溶解100万单位的链霉素，弃去2ml，用剩余的8ml链霉素溶解80万单位的青霉素，配制成每毫升青霉素、链霉素各10万单位的母液。
高中生物细胞工程试题
阶段质量检测(二) 细胞工程 (时间:4５分钟,满分:10０分) 一、选择题(每小题3分,共45分) 1、下列生物工程技术中,不属于细胞工程得就是( ) A.通过试管动物大量繁殖优良动物 Ｂ.利用含有人胰岛素基因得大肠杆菌生产胰岛素 C.通过体细胞克隆技术培养出克隆羊 D、将某人得肝癌细胞在实验室中繁殖成一个细胞系 2。下列关于植物体细胞杂交技术得叙述,错误得就是( ) A.获得原生质体得过程需要用到纤维素酶与果胶酶 B.利用植物体细胞杂交可以获得某种多倍体植株 C.植物体细胞杂交过程就就是原生质体融合得过程 Ｄ。可根据细胞中染色体数目与形态得差异来鉴定杂种细胞 3.植物体细胞杂交制备原生质体与动物细胞培养配制一定浓度得细胞悬浮液,所需要得酶依次就是( ) Ａ.淀粉酶与磷脂酶 B.纤维素酶与胰蛋白酶 C.脂肪酶与二肽酶 Ｄ。过氧化氢酶与半乳糖苷酶 ４.下列有关单克隆抗体制备得叙述,正确得就是( ) A.先利用特定得抗原蛋白饲喂小鼠,再从小鼠脾脏中分离B淋巴细胞 B。为避免病毒感染,只能用聚乙二醇、电激等处理来诱导骨髓瘤细胞与已免疫得B淋巴细胞融合 Ｃ.体外培养杂交瘤细胞需要在培养液中添加动物血清与抗生素 D.经过选择培养基初次筛选得杂交瘤细胞即可进行体内或体外培养 5。(全国高考)关于动物细胞培养与植物组织培养得叙述,错误得就是( ) A.动物细胞培养与植物组织培养所用培养基不同 Ｂ.动物细胞培养与植物组织培养过程中都要用到胰蛋白酶 C、烟草叶片离体培养能产生新个体,小鼠杂交瘤细胞可离体培养增殖 D。动物细胞培养可用于检测有毒物质,茎尖培养可用于植物脱除病毒 ６。细胞工程中,选择合适得生物材料就是成功得关键、下列选择不合理得就是( ) A、选择高度分化得动物体细胞进行培养有利于获得大量细胞 Ｂ。选择胚胎细胞作为核供体进行核移植可提高克隆动物得成功率 Ｃ、选择一定大小得植物茎尖进行组织培养可获得脱毒苗
生物技术概论试题
生技28、查找阅读有关生物技术的英文文献并翻译成中文一、名词解释 Plasmid 目的基因 单克隆抗体技术 细胞融合 基因库 问答题：
1.疾病基因治疗有哪四大策略，肿瘤的基因治疗主要有哪两种策略？ 2.从cDNA文库和基因文库中获得目的基因有什么不同？ 3.如何从一片嫩叶经组织培养培育出众多的完整植株？ 4.开展干细胞研究对人类有何积极的意义？ 5.为什么说干细胞的应用将具有广泛的前景？ 6.人类基因组计划任务是什么？将解决什么问题？它对医学的发展有什么影响？ 7.生物法处理污水或废水有哪几种常见方法？污水治理的意义何在？ 8.空气污染治理与水污染治理有什么关系，常见的方法有哪几种 9.什么事生物修复技术，方法，举例说明其应用价值 10. 生物技术对经济社会发展的影响，试举例说明。
第二部分综合练习 一、单项选择题 4. 下面哪个不是生物技术包括的基本内容？ 细胞工程基因工程遗传工程酶工程 1、现代生物技术是一项高新技术，它具有高新技术的“六高”特征，下面哪个不属于“六高”？ A、高效益 B、高风险 C、高势能 D、高效率 2、生物技术是以下面哪个为核心？ A、基因工程 B、细胞工程 C、酶工程 D、发酵工程 3、分子克隆主要是指 A、DNA的大量复制 B、DNA的大量转录 C、DNA的大量剪切 D、RNA的大量反转录 4、多数限制性核酸内切酶切割后的DNA末端为 A、平头末端 B、3突出末端 C、5突出末端 D、粘性末端 5、设计聚合酶链反应的引物时，应考虑引物与模板的 A、5…端特定序列互补 B、5?端任章序列互补 C、3…端特定序列互补 D、3?端任意序列互补 6、用于鉴定转化于细胞是否含重组DNA的最常用方法是 A、抗药性选择 B、分于杂交选择 C、RNA反转录 D、免疫学方法 7、下列哪些是发酵技术独有的特点 A、多个反应不能在发酵设备中一次完成 B、条件温和、能耗少、设备简单 C、不容易产生高分子化合物 D、发酵过程中不需要防止杂菌污染 8、不是工业生产上常用的微生物为 A、担子菌 B、细菌 C、酵母菌 D、霉菌 9、机械搅拌发酵罐与通风搅拌发酵罐相比，下列不属于前者特点的是 A、发酵罐内没有搅拌装置，结构简单 B、发酵罐内有搅拌装置，混合速度快 C、耗能少，利于生产 D、发酵罐内没有搅拌装置，结构复杂 10、从微生物细胞制备酶的流程一般包括破碎细胞、溶剂抽提、离心、过滤、干燥这几 个步骤。
高中生物 动物细胞培养和核移植技术教案 新人教版选修3
动物细胞培养和核移植技术 备课日期2014年 3 月 4 日课型新授课 教学目标 知识与技能 1\简述动物细胞养的含义。 2\说出动物细胞养的所需条件。 3\简述动物细胞培养的基本程序。 4\简述动物细胞核移植的概念。 过程与方法 情感态度 与价值观 1\通过学习基因工程的概念，使学生认识到科学研究需要的严谨，激 发为祖国而奋斗的精神。 2\通过学习基因操作的工具，使学生树立结构与功能相统一的辩证唯 物主义观念。 教学重点 1\动物细胞培养的过程及条件； 2\用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景 教学难点用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程 教学方法以探究法、谈话法、材料教学法相结合。 教学用具多媒体课件 课时安排1课时 教学内容设计与反思 板书设计:
教学内容设计与反思一、复习导入: 教师活动：投影幻灯片，引导学生思考、分析讨论。 （1）植物细胞工程常用的技术手段有哪些？ 植物组织培养 植物体细胞杂交 （2）植物体细胞杂交的结果是产生了？ （3）植物体细胞杂交过程中涉及的原理是？ 二、讲授新课: （一）动物细胞工程 动物细胞工程常用的技术手段 动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体、动物细胞培养 动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。 （二）动物细胞培养 1.发展历史: 单20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形 成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问 题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的 脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神 经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验 不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后， 在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物 细胞培养。 2、动物细胞培养的应用和概念： 动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关 的组织,将它分散成个细胞,然后,放在适宜的 培养基中,让这些细胞生长和增殖. 3、动物细胞培养过程： 引导学生阅读课文44--46面相关内容。
细胞培养中无菌操作技术
细胞培养中的无菌技术： 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作台面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株的操作。 2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管、吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面的中央无菌区域，勿在边缘的非无菌区域操作。 3. 小心取用无菌的实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或容器瓶口，亦不要在打开的容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 4. 工作人员应注意自身的安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染的细胞株应特别小心操作，并选择适当等级的无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 的产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头的伤害等。 5. 定期检测下列项目： 5.1. CO2 钢瓶的CO2 压力 5.2. CO2 培养箱的CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。 5.3. 无菌操作台内的airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。
最新细胞工程练习题(附答案)
细胞工程练习题 一．选择题 1. 在离体的植物器官、组织或细胞脱分化形成愈伤组织的过程中，下列哪一项条件是不需 要的 A．消毒灭菌B．适宜的温度C．充足的光照D．适宜的养料和激素 2. 下列关于植物组织培养的叙述中，错误 ．．的是 A．培养基中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压 B．培养基中的生长素和细胞分裂素影响愈伤组织的生长和分化 C．离体器官或组织的细胞都必须通过脱分化才能形成愈伤组织 D．同一株绿色开花植物不同部位的细胞经培养获得的愈伤组织基因相同 3．我国科学工作者曾成功地将分别属于两个科的植物----烟草和菠菜杂交成功，从而获得一种新型的烟草品种。在此过程中，下列操作不．是必需的是 A．杂交前要除去两种细胞的细胞壁 B．原生质体融合前要先脱分化 C．原生质体融合后，要选出烟草----菠菜融合细胞加以培养 D．要诱导愈伤组织进行再分化 4．下图是“白菜—甘蓝”杂种植株的培育过程。下列说法正确的是 A．所得到的“白菜—甘蓝”植株不能结籽 B．愈伤组织是已高度分化的细胞 C．上述过程中包含着有丝分裂、细胞分化和减数分裂等过程 D．诱导原生质体融合时可用聚乙二醇 5．下面是将四倍体兰花的叶片通过植物组织培养形成植株的示意图，相关叙述中正确的是 A．②阶段会发生减数分裂过程B．①阶段需生长素而③阶段需细胞分裂素C．此过程体现植物细胞具有全能性D．此兰花的花药离体培养所得植株为二倍体6．下图为将胡萝卜的离体组织在一定条件下培育形成试管苗的过程示意图。有关叙述正确的是 A. 利用此过程获得的试管苗可能为杂合子 B．①②过程中都会发生细胞的增殖和分化 C. 多倍体植株的培育需经过如图所示过程 D．此过程依据的生物学原理是细胞膜具有流动性 7. 各项培育植物新品种的过程中，不经过愈伤组织阶段的是 A．通过植物体细胞杂交培育白菜——甘蓝杂种植株 B．通过多倍体育种培育无子西瓜 C．通过单倍体育种培育优质小麦 D．通过基因工程培育转基因抗虫水稻 8. 作物新品种的过程中，常利用植物组织培养技术。下列叙述正确的是 A.培育转基因的外植体得到的新个体属于基因突变个体 ③ ② ① 四倍体兰花叶片愈伤组织胚状体植株
细胞培养基本操作技能
细胞培养基本操作技能 无菌操作基本技术 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。 5. 定期检测下列项目： 5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力 5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。 5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。 实验用品 1. 种类︰ 1.1. 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteur pipet 外，其它均为塑料无菌制品。 1.2. TC 级培养盘表面均有coating 高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask, plates, dishes, roller bottle 等，依实验需要使用。 1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml 1.4. 塑料离心管: 15 ml, 50 ml，均有2 种不同材质，其中polypropylene (PP) 为不透 明材质，polystyrene (PS) 为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。 1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉废弃培养液等。 1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100 ml, 250 ml,500 ml,1000 ml 2. 清洗︰ 2.1. 新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡数小时，洗净后才开始使用。 2.2. 用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。 3. 灭菌︰ 3.1. 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121 oC, 15 lb, 20 分钟，置于
(完整word版)细胞工程 期末考试复习题目
细胞工程期末考试复习题目 细胞工程填空：20个ⅹ分=10分选择：10个ⅹ2分=20分名词：10个ⅹ6分=30分简答：5个ⅹ6分=30分论述: 1个ⅹ10分=10分第一章绪论1、细胞工程的定义及特点？细胞工程：是指主要以细胞为对象，应用生命科学的理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传性状，以获得特定的细胞，组织产品或新型物种的一门综合性科学技术。细胞工程的特点：前沿性：现代生物技术的热点争议性：新技术给伦理道德带来的冲击综合性：多学科交叉应用性：工程类课程，重在产品与技术第二章细胞培养的设施与基本条件：1、什么是细胞及组织培养？组织工程：习惯上繁殖所有的体外培养，即器官培养，组织培养和细胞培养的总称。其本
意是指从活的机体中去取出器官、组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外建立无菌、室温和一定营养条件等，使之生长和生存，并维持其结构和功能能的技术称为组织培养。细胞培养：将组织块用机械方法或酶解法分离成单个细胞，做成细胞悬液，再培养于固体基质上，成单层细胞生长，活在培养液中呈悬浮转肽培养的技术称为细胞培养。2、了解细胞培养实验室的基本规划及相关注意事项？实验室规划：⑴准备室：培养用具清洗、消毒和做实验准备的场所，一般建在通风和光线充足的地方。⑵缓冲间：保护操作室的无菌环境，避免空气对流。 ⑶操作间：要求无菌。最好设在阴面，防止室温过高；天花板高度不超过2米，保证紫外线有效杀菌效应；门用拉门，避免空气流动。室内天花板、地板和四周墙壁要光滑无死角，要镶瓷砖或涂油漆，便于清洗与消毒，不易在墙角推挤灰尘。3、细胞培养的设备有
哪些？有何基本作用⑴超净工作台①最好安装在无尘室内，最好在无菌间，避免过多灰尘使滤器阻塞，降低净化效果，缩短使用寿命。②新安装的或长期未使用的工作台，工作前必须对工作台和其周围环境用真空吸尘器或不产生纤维的工具进行清洁工作，在采用药物灭菌法或紫外线灭菌法进行灭菌处理。③每次使用时，应先用75%酒精擦洗台面，并进行30~50min紫外线灭菌灯处理净化工作区内累积的微生物，在关闭紫外灯后，应启动送风机使之转运2min后在进行培养操作。④净化工作区内不应存放不必要的物品，以保持洁净气流不受干扰⑤高效过滤器3年更换一次。请专业人员操作，以保持密封良好。定期将粗过滤器中的过布拆下清洗。⑥每次使用净化台要即使清楚工作台面上的物品，并用酒精擦洗台面使之始终保持洁净。⑵CO2培养箱：①一定浓度的CO2生长，尤其是原代培养和单
2015 动物细胞培养技术实验报告
一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。 制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施： 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水； 冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工
细胞培养中无菌操作注意事项
体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室。若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。因而．为在一切操作中为最大可能的保证无菌。每一项工作都必须做到有条不紊和完全靠。 【培养前准备】在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。 【操作野消毒】无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面―次(拖布要专用).紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然后紫外线淌毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。―些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。 【洗手和着装】原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿装细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75％酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。 【火焰消毒】在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯或煤气灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。但要注意：金属器械不能在为焰中烧的时间过长，以防退火，烧过的金属镊要待冷却后才能挟取组织，以免造成组织损伤。吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入营养液中。开启、关闭长有细胞的培养瓶时，火焰灭菌时间要短。防止因温度过高烧死细胞。另外胶塞过火焰时也不能时间长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞。 【操作】进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。吸取营养液、 PBS、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。工作中不能面向操作野讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。操作前用酒精擦拭超净台面及双手。手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。
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细胞工程学名词解释及问答题 一、名词解释 1、细胞工程（cytotechnology或cell engineering）：它是以生物细胞、组织或器官为研究对象，运用工程学原理，按照预定目标，改变生物性状，生产生物产品，为人类生产或生活服务的科学。 或应用细胞生物学和分子生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养。通过细胞工程可以生产有用的生物产品或培养有价值的植株，并可以产生新的物种或品系。 2、看护培养（nursing culture）：用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持续分裂增殖的方法。 3、细胞杂交（cell hybridization）：指用人工方法把不同类型的两个或两个以上细胞合并成一个细胞的技术。 4、外植体〔explant〕：从植物体上分离下来的用于离体培养的植物组织、器官等材料。 5、人工种子：是指植物离体培养中产生的胚状体或不定芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中所形成的能发芽出苗的颗粒体。 6、花药培养（anther culture）：将成熟或未成熟的花药从母体植株上取下，放在无菌的条件下，使其进一步生长、发育成单倍体细胞或植株的技术。（指离体培养花粉和花药，使小孢子改变原有的配子体发育途径，转向孢子体发育途径，形成花粉胚或花粉愈伤组织，最后形成花粉植株，并从中鉴定出单倍体植株，使之二倍化的细胞工程技术。 7、条件培养基(conditioned medium)：培养过程中，有些细胞可能会分泌活性物质到培养液中，这种培养过某种细胞以后，含有细胞分泌物的培养液称为条件培养基。 8、植物脱毒：由人工用物理、化学和生物方法将植物体组织器官病原体消除，以使这些组织器官生成完整植株。 9、原代细胞系：指从机体中取出而直接培养的细胞，从一代到十代的细胞培养是原代培养，形成的整个系统叫原代细胞系。 10、体细胞杂交：指在人工控制条件下，不经过有性过程，两种体细胞原生质体相互融合产生杂种的方法。 11、胚胎培养：是指胚或具胚器官（如子房、胚珠等）在离体无菌条件下发育成幼苗的技术。 12、互补选择：是指利用两个亲本具有不同的遗传和生理特征，在特定培养条件下，具有发生互补作用的杂种细胞才能生长的选择方法。 13、悬浮培养(suspension culture):是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。 14、植板率:植板率是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例。 15、玻璃化冻存：是指液体转变为非晶态（玻璃态）的固化过程。 16、接触抑制(contact inhibition)：当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片即每个细胞与其周围的细胞相互接触时，细胞就停止增殖，即细胞密度不再增加，这一现象称之为接触抑制或密度依赖抑制现象。 17、非对称融合（aymmetric fusion）：利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合。 18、对称融合（symmetric fusion）：两个完整的细胞原生质体融合。 19、胞质体：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。 20、体细胞胚：离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞）。 21、永久细胞系：大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖，当超过有限世代后，在体外永久存活下来发育成永久细胞系或称连续细胞系。
动物细胞培养技术 思考题
《动物细胞培养技术》复习思考题 1.动物细胞培养的实验器皿清洗要求为何较高？你认为该如何保证器皿中无杂质？如果 器皿中有杂质，会对细胞培养产生什么样的影响？ 答：①离体细胞对各种毒物都很敏感，若所用器材清洗效果未达到要求，各种毒物会损坏细胞影响实验。②器皿使用高压灭菌锅，121.3℃，20~30分钟，在取拿的时候用经过高压灭菌后的镊子取拿，避免造成污染。③ 2.叙述超净工作台的工作原理？ 答：超净工作台最主要的是空气循环过滤的过程，在这个过程中风机起到了心脏的作用。鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。 3.正压过滤器为何会除菌？ 答：正压式过滤器没有内置灭菌灯，正压式过滤器利用的是两层0.22um孔的过滤膜，这层膜可以将细菌阻挡在膜上，过滤的液体流下去就基本上完成了灭菌过程 4.各种细胞培养用液的配制需要很精确吗？如果不精确，会导致什么后果？请举例说明。 你认为精确配制各种溶液？ 答： 5.配制后平衡盐溶液呈黄色意味着液体的pH发生了什么变化？ 答：配制后的液体应呈桃红色，PH值为7.4左右。苯酚红的变色域：1.2（橙）~3.0（黄），6.5（棕色）~8.0（紫色），若为黄色，则液体呈酸性，不利于细胞的生存。 6.用于分离细胞的消化液为什么宜用无Ca、Mg离子的D-Hanks液或PBS液配制 答：Ca＋2、Mg＋2是细胞膜的重要组分，具有使细胞凝聚的作用。因此，用于分离细胞的消化液宜用无Ca＋2、Mg＋2离子的D-Hanks液或PBS液。 7.L-谷氨酰胺在营养液中有何作用？ 答： L－谷氨酰胺是细胞的能量来源；是一种必须氨基酸，是使物体合成核酸、蛋白质、嘌呤、嘧啶的重要前体，也是蛋白质合成分解的调节物；是细胞内氨的清除剂，氨对一些细胞有毒性。 8.HEPES溶液的作用机理？ 答：它是一种氢离子缓冲剂。主要作用是防止培养基pH迅速变动 9.平衡盐溶液的组成与基本作用？小牛血清在细胞培养中有哪些作用？ 答：①平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成,它的作用是维持细胞渗透压平衡,保持pH 稳定及提供简单的营养.主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。②作用：a提供能促使细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或含量微小的营养物，以及某些低分子营养物质；b提供结合蛋白，识别维生素、脂类、金属离子，并与有毒金属和热源物质结合，起解毒作用；c是细胞贴壁、铺展生长所需因子的来源；d起酸碱度缓冲液作用； e提供蛋白酶抑制剂，细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。 10.营养液制备后为什么要小剂量分装？ 答：避免营养液被污染后，全部的营养液都被污染。 营养液一次用完过后，下一次的实验就不能用，会引起污染，影响实验，若冷冻营养液，则营养液的营养成分会有所损失，影响细胞的生长 11.10万U/mL单位青霉素、链霉素的配制方法？ 答：用注射器吸10毫升双蒸水溶解100万单位的链霉素，弃去2ml，用剩余的8ml链霉素溶解80万单位的青霉素，配制成每毫升青霉素、链霉素各10万单位的母液。
细胞培养实验报告
动物细胞培养 一、试验目的。 1、掌握无菌操作技术。 2、掌握原代和传代细胞培养。 3、掌握细胞冷冻和复苏技术。 4、了解培养成纤维细胞的形态。 二、试验原理。 将动物机体的组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 对具有移动特性的稳定细胞系或细胞株进行长期保存，一方面可以作为细胞研究的试验材料，另一方面可以做细胞制品的生产材料。目前广泛应用的细胞保存方法是低温冷冻保存法，。细胞的冷冻保存的原则是慢冻快融，这样做是为了防止细胞由于冷冻过程中产生了冰晶而发生细胞破裂。 三、实验器材及药品。 器材：怀孕的小白鼠、培养箱、培养瓶、培养皿、移液器、眼科剪、镊子、酒精 培养箱、超净工作台、离心管、灯、离心机、水浴锅、倒置显微镜、CO 2 高压灭菌锅、试管架等。 药品：小牛血清、DMEM合成培养基、抗生素、DMSO冷冻剂、胰酶、PBS缓冲液等。 四、实验操作。 1、消毒灭菌。 将实验所需用到的工具（如枪头、培养皿、眼科剪、镊子以及每个人的实验服等）集中灭菌、烘干。配制75%的酒精以备实验时所需。
2、培养基的配制。 分别取10ml的小牛血清、90ml的DMEM合成培养基，将两种培养基混合在一起，再向其中加入1ml的抗生素，吹打混匀就得到了细胞培养的培养液。 3、原代培养。 （1）、准备。将实验过程中会用到的工具以及药品全部放在超净工作台上进行紫外消毒灭菌。实验开始前带好乳胶手套，用酒精对手进行消毒。将怀孕的小白鼠放在酒精中杀死，取出子宫内的胚胎组织。 （2）、剪切与消化。将胚胎组织放于平板中，用眼科剪将组织块剪碎，剪得越碎越好。将剪碎的组织块放于离心管中，加入大约200μl的胰酶进行消化。也可将其置于37度恒温箱中进行消化。 （3）、分离细胞。消化到一定时间时，如果离心管中的溶液中出现了明显的浑浊，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，则应该加入与胰酶等量的培养液终止消化。离心管于离心机中离心，弃上清液，得到分散的细胞。 （4）、转移细胞并培养。向含有分散细胞的离心管中加入配制好的培养液，吹打 箱培养，瓶口少少混匀，将培养液用移液器移到细胞培养瓶中。置于℃恒温CO 2 拧的松一点。 4、传代培养。 （1）、倒置显微镜下观察细胞的形态。倒置显微镜下观察培养细胞的长势及密度，根据细胞密度决定传代的稀释倍数。 （2）、收集原代培养的细胞。吸出培养瓶中的旧培养液，并用PBS冲洗两遍。然后向培养瓶中加入200μl的胰酶进行消化。消化一段时间后用配置好的培养液等比例终止消化。然后离心，收集到原代培养的细胞。 （3）、传代细胞的培养。向离心管内加入大约7—8ml的培养液，吹打混匀。将培养液转移到培养瓶中，置于37度恒温CO 培养箱中培养。培养1—2天后于显 2 微镜下观察细胞的形态。 5、细胞冷冻保存。 （1）、收集细胞。吸出培养瓶中的旧培养液，并用PBS冲洗两遍。然后向培养瓶中加入200μl的胰酶进行消化。消化一段时间后用配置好的培养液等比例终止
细胞培养技术和培养箱习题
第十章细胞培养技术和培养箱 首页习题习题参考答案 习题名词解释选择题简答题 一、名词解释 1. 细胞培养 2. 细胞培养传代 3. 原代细胞培养 4. 无限细胞系 5. 细胞融合 6. 细胞治疗 7. 培养箱 8. 缓冲室 9．手套操作箱 二、选择题 【A型题】在五个选项中选出一个最符合题意的答案（最佳答案）。 1.体外培养细胞的分类（贴附型或悬浮型）是根据（） A．细胞为上皮样或成纤维细胞样 B．能否贴附在支持物上生长 C．呈密度抑止特性 D．肿瘤细胞 E．细胞可多次传代 2. 下述细胞传代的概念中，正确的是（） A．当细胞增殖至一定密度后，分离出一部分细胞接种到其他容器的过程 B．从体内取出细胞接种到培养容器，细胞继续增殖的过程 C．培养细胞期间更新培养液的过程
D．当细胞增殖至一定密度后，分离出一部分细胞接种到其他容器并及时更新培养液使细胞增殖继续的过程 E．细胞倍增的过程 3. 细胞生长维持液，需添加的血清量的百分比为（） A．1％～2％ B．2％～5％ C．5％～10％ D．10％～20％ E．20％～25％ 4．培养细胞传代时，通常是（） A．根据不同细胞采取不同的方法 B．常用二乙烯四乙酸二钠（EDTA） C．EDTA与胰蛋白酶按不同比例混合使用 D．悬浮生长的细胞直接添加胰蛋白酶” E．贴壁生长的细胞添加新鲜培养液 5. 二氧化碳培养箱结构的核心部分，主要是 A．湿度调节装置 B．湿润的含水托盘 C．温度调节器 D．CO2调节器、温度调节器和湿度调节装置 E．气体保护器装置 6. 二氧化碳培养箱调节CO2浓度范围为（） A．0％～20％ B．20％～40％ C．10％～20％ D．20％～30％ E．30％～40％ 7. 厌氧培养箱通过自动连续循环换气系统保持箱内的厌氧状态，其换气过程是（） A．①气体排空→②净化→③气体排空→④N2净化→⑤气压平衡 B．①气体排空→②N2净化→③气压平衡
细胞培养基本操作
细胞培养基本操作 无菌操作基本技术 1.实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以75 % 酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以75 % 酒精擦拭无菌操作台面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2.无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以75 % 酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。 3.小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 4.工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起气溶胶之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。 实验用品 1.细胞培养实验用品均为无菌，分玻璃容器和塑料无菌制品。 2.种类：培养瓶，培养皿，多孔培养板，巴氏管，离心管（15ml,50ml）,玻璃血清瓶等。 3.清洗和消毒 3.1．玻璃器皿： A.浸泡：新玻璃器皿，自来水初步清洗；使用后玻璃器皿立即浸入清水中，避免器皿内蛋白质干涸黏附于玻璃上导致难以清洗。浸泡使器皿完全浸入水中，使水进入器皿内而无气泡空隙遗留。 B.刷洗：浸泡后用毛刷加洗涤剂洗涤，刷洗后要将洗涤剂彻底冲洗干净，晾干。