抗原与蛋白偶联方法
抗原与蛋白偶联方法
常用的半抗原与蛋白偶联方法
EDAC：EDC是一种羧基和氨基反应零长度交联剂。EDC和与羧基反应形成氨基活化的O酰基异脲中间体，他可以迅速与氨基反应形成酰胺键，释放异脲副产物。该媒介在水中不稳定，因此两步共轭反应依赖N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)稳定结构。和氨基失败的反应导致媒介水解，羧基再生，释放N 代尿素。副反应形成N酰基脲，这通常限制羧基定位蛋白的疏水区。
EDC用于偶联半抗原到载体蛋白
原料：
1.载体蛋白：2mg牛血清白蛋白BSA，卵白蛋白OV A或血蓝蛋白Keyhole limpet hemocyanin KLH
2.偶联缓冲液：0.1M MES，pH4.5-5
3.EDC：10mg
4.Hapten：1-2mg
5.脱盐柱或凝胶过滤柱5-6KD阻隔。
操作步骤：
1.平衡EDC到室温，加入2mg的BSA、OVA或KLH到200ul偶联缓冲液，如果用热电的载体蛋白用
无菌水溶解。
2.溶解2mg多肽或半抗原到500ul偶联缓冲液加入200ul载体蛋白中。
3.对BSA或OVA结合，溶解10mg EDC到1ml超纯水立即加100ul(1mg EDC)该溶液到载体-多肽溶液
中。对KLH结合溶解10mg EDC到1ml超纯水立即加50ul(0.5mgEDC)该溶液到载体-多肽溶液中，如果发生沉淀进一步减少EDC用量。
4.室温反应2小时。用脱盐柱纯化偶联蛋白，如果存储免疫原数天，无菌过滤储存在无菌容器中4
或-20度保存。
用EDC和NHS或Sulfo-NHS两步法偶联偶联蛋白
用EDC和Sulfo-NHS活化反应在pH4.5-7.2有效，然而NHS激活或Sulfo-NHS激活的分子具有伯胺在pH7-8时有效。最好的结果是最初第一步反应在MES缓冲液中(或其他无氨基无羧基缓冲液pH5-6)，接着用磷酸盐缓冲液提高pH7.2-7.5(或其他无氨基无羧基缓冲液)立即与含氨基分子反应。为了淬灭第一个反应用2巯基乙醇或其他可以容易去除的试剂，用脱盐柱换液。
原料：
1.活化缓冲液：0.1M MES，0.5M NaCl，pH6.0
2.结合缓冲液：
3. 2
4.蛋白1：准备溶解到活化缓冲液中1mg/ml。
5.蛋白2：准备溶解到结合缓冲液中
6.NHS或Sulfo-NHS
7.2-巯基乙醇
8.脱盐柱
9.羟胺-盐酸
操作步骤：
1.开盖前平衡EDC和NHS到室温。
2.加0.4mg EDC(2mM)和0.6mg NHS或1.1mg Sulfo-NHS(5mM)到1ml蛋白1溶液中室温反应15min。
3.加1.4ul的2-巯基乙醇(终浓度20mM)淬灭EDC。
4.可选步骤：用PBS平衡的脱盐柱从超量试剂和灭活的交联剂中分离蛋白。
5.按相同摩尔比加蛋白2到活化蛋白1，室温反应2小时。
6.淬灭反应加入羟胺到终浓度10mM，该方法水解蛋白1上未反应的NHS生成异羟肟酸。其他淬灭
方法包括加20-50mM Tris，赖氨酸，甘氨酸或乙醇胺，然而这些伯胺包含修饰蛋白1的化合物。
7.通过脱盐柱去除多余的淬灭试剂。
（一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联）
1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method）
偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。
氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法
(1)5．8mg MIT用0.1ml二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。
(2)1.5mg酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。
(3)10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为9.0，q然后4度过夜。
(4)过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液(pH7.5)平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA 0.1％（w/v）、NaN3 0.02%(w/v)的缓冲液中。
2、碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤
(1) 取EDC 100mg , 用pH8.0的10 m mol/L PBS液2.5ml使之充分溶解（I液）
(2) 取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸25mg , 用0.2mol/L NaOH 溶液2ml 溶解(II液)
(3) 取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （pH8.0）液中（III液）
(4) 将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下0.5ml）
(5) 室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液
(6) 4度搅拌12小时
(7) 静置10小时（4度）
(8)有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。
3、孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法
(1) 用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L的溶液。
(2) 加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和DCC（二环已基碳化二亚胺），200 m mol/L, 4度反应16小时。
(3) 用簿层扫描方法纯化(氯仿：水=9：1)
(4) 按孕酮/酶摩尔浓度比约为10的比例，将上述溶液加入到酶液（用pH7.4，浓度50 m mol/L的磷酸缓冲液溶解）中。
（二）含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联
1、芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤
(1) 用0.1 mol/L HCl溶液配制4 m mol/L浓度的半抗原。
(2) 滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。
(3) 溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。
(4) 用pH9.0、浓度为200m mol/L的硼酸或碳酸缓冲液溶解蛋白。
(5) 边搅拌，边加入重氮化的半抗原（防止局部发生酸过量现象），调节pH到9.5。
(6) 冰箱中搅拌反应2小时，不断调节pH到9.0。
(7) 用PBS透析2天
(8) -20度保存（浓度为20mg/mL）
双功能的酰亚胺酯(imidate esters)可以氨基反应，形成脒。例如：用二甲基已二酰亚胺酯(dimethyladipimide)将去甲基三正喋呤(desmethylmortriptyline)与β-半乳糖苷酶偶联。
2、、应用双功能酰亚胺酯（imidate esters）制备去甲基三正喋呤-与β-半乳糖苷酶标记特的操作步骤(1) 用含5％（W/V）N-乙基吗啉的无水甲醇0.4ml,在室温下溶解570ug去甲基三正喋呤和488ug 二甲基已二酰亚胺酯(dimethyladipimide)(A液)
(2) 取与β-半乳糖苷酶100 ug, 溶于pH9.9的100 m mol/L碳酸缓冲液（含MgCl2 10m mol/L,2-巯基乙醇10 m mol/L 0.1ml(B液)
(3) 将A液倒入B液。
(4)20度反应90分钟后，加含NaCl 100 m mol/L, MgCl2 10 m mol/L和2-巯基乙醇10 m mol/L、pH7.5的Tris-醋酸缓冲液(50m mol/L) 1ml, 终止反应。
(5)过sephadex G-25, 去除小分子物质，得酶标记物（约75％的酶与半抗原结合，但用三正喋呤代替去甲三正喋呤(demethylmortriptyline )进行偶联，则只有15％的酶与之结合。
（三）含巯基半抗原的偶联
可用马来酰亚胺方法与蛋白偶联。此外，将载体蛋白用溴乙酰胺(bromoacetamide)激活。或将载体蛋白与半抗原在pH4.0的醋酸缓冲液中，通过过氧化氢的作用形成二硫键，也可以将半抗原连接到蛋白质分子上。
（四）含羟基的半抗原偶联
醇类羟基通过形成半琥珀酸酯转化为羧基的操作步骤
1、 15g 2,2,2-三氯乙醇（2,2,2-trichloroethanol）,12g 琥珀酸酐(succinic anhydride)和8.7ml 三乙基胺(triethylamime)用100 ml乙酰乙酯溶解。
2、加热回流1小时。
3、减压蒸馏去溶剂，,残余物用5% NaHCO3水溶液溶解。
4、用乙醚洗涤两次，然后用H2SO4进行s酸化（pH到2.0）.
5、用水洗涤固形物（为三氯乙基半琥珀酸酯）两次，用氯仿-已烷使其结晶（产量约75％，熔点88-89度）
6、取2.5g 半琥珀酸酯溶于6.5ml 亚硫酰氯(thionyl chloride)中，65度加热30分钟。
7、减压蒸发，干燥1小时（高度真空条件下）。
8、将上述产生（2，2，2-三氯忆基琥珀酰氯）溶于15ml N,N-二甲基-乙酸乙酰胺(N,N-dimethylethylacetamide)中，室温搅拌反应2小时。
9、 65度真空蒸发后，用异丙醇使结晶析出来（得盐酸化的结晶---5`-酯约84％，熔点160度）。
10、用溶于二甲基甲酰胺中的锌和醋酸解离三氯乙酯，得f半抗原-半琥珀酸酯，这样引和的羧基可与蛋白质偶联（如用碳化二亚胺化）。
半抗原用NaIO4氧化其中的糖苷醇后再与蛋白质偶联的操作步骤
1、 20mg 腺苷溶于1ml 100m mol/L NaIO4溶液中，4度避光反应30分钟。
2、加1滴乙二醇(得A液)
3、将A液加入到β-半乳糖苷酶液（20mg/ml,用150m mol/L NaCl,10m mol/L MgCl2水溶液溶解，用3％K2CO3调节pH至9.0）中
4、 4度反应2小时，期间不断调节pH9.0
5、加入临时配制的50 mg/ml NaBO4溶液，用量为反应体积的1/10。4度反应过夜。
6、用含有MgCl2 10m mol/L,2-巯基乙醇10 m mol/L、NaCl 100 m mol/L的50 m mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)透析(更换透析液数次)
（五）含酮基或酮基半抗原的偶联
是将酮基经羟胺类化合物处理变成肟类化合物，再进一步将肟类化合物中的羟基，衍变成羧基化合物，再进一步进行含羧基半抗原的偶联操作。这类羟胺类化合物主要有：氨氧乙酸aminoxy acetic acid 或羧甲氧胺carboxymethoxyl amine 或者盐酸羟胺
酮基的类固醇分子中引入羧基的操作步骤
1、在200ml 乙醇中，加入O-(羧甲基)羟胺（O-(carboxyl)hydroxylamine）和酮基半抗原，使其浓度分别为10m mol/L 和4m mol/L
2、加热回流90分钟
3、旋转蒸发，减少容积，然后加水至40ml，用乙醚抽提
4、用水洗涤乙醚抽提物，用Na2SO4干燥成白色粉末。
（六）、其他半抗原的偶联
虽含有游离基团，但因这些基团对于维其生物活性十分重要，因些不能直接用来与载体蛋白偶联。制备雌二醇-6-肟的操作步骤
a、雌二醇二醋酸盐的制备
1、 1g雌二醇溶于14ml 吡啶及3.5ml 醋酐中
2、加热回流1小时，冷却后倾入冰水中。
3、收集白色晶体，得产物约1.1g（熔点126到127度）
b、雌二醇-6-酮-二醋酸盐的制备
4、雌二醇二醋酸盐 1.1g，滴加冰醋酸 3.8ml 溶解后加含0.93g CrO3的含水冰醋酸 6.35ml (H2O:Hac=0.75:5.6)
5、室温搅拌1小时，静置24小时
6、用水稀释，用乙醚提取4次
7、用蒸馏水洗2次
8、减压蒸馏，得结晶油状渣物。
9、用90度烘干20分钟，得粗制品约500mg
10、用11ml 无水乙醇溶解粗制品，再加1.1ml 冰醋酸及1.5g吉纳你特T试剂(Girad T)，回流1小时。
11、冷却后，用冰致冷的蒸馏水稀释，用2.5mol/LNaOH调节pH至6.0-6.2.
12、用乙醚抽提3次，弃去乙醚。
13、水层用浓盐酸酸化（盐酸终浓度为1mol/L).
14、室温静置2小时。
15、用乙醚抽提3次。
16、合并乙醚抽提液，用0.125mol/L碳酸钠溶液洗1次，用蒸馏水洗3次。
17、用无水硫酸钠脱水，蒸干。
18、加7ml 醋酐，回流20分钟。
19、冷却后倾入用冰致冷的蒸馏水中，然后过滤、干燥得产物约176mg (熔点为162-166度)
c、二醇-6-酮的制备
20、用5.5ml 20％的氢氧化钾-甲醇溶液(W/V)溶解雌二醇-6-酮-二醋酸盐（176mg）,在室温下于氮气中水解24小时。
21、加蒸馏水稀释，用乙醚抽提3次。
22、在乙醚提取液中无水硫酸钠进行脱水，蒸发干燥，得产物约60mg(熔点为278-282度)
d、雌二醇-6-肟的制备
23、取雌二醇-6-酮50mg ,盐酸羧甲基羧胺50mg,溶于20％含水甲醇(V/V)7ml 和1mol/L醋酸钠4ml 中，回流1.5小时。
24、减压、蒸馏、浓缩后，加蒸馏水20ml
25、用2 mol/L NaOH调节pH至8.5。
26、用醋酸乙酯抽提4次
27、水层用1 mol/L盐酸酸化至pH2.5。
28、用醋酸乙酯抽提4次
29、合并抽提液，蒸干，得产物约100mg(结晶熔点约186-188度)
其他半抗原如：青霉素、生物素、地高辛、荧光素等半抗原交联。
过碘酸钠氧化反应原理：将糖基氧化为醛基活化后用于连接含氨基配体。
酰阱反应
NHS EDC偶联法
SMCC法抗体定向偶联技术的优化与应用研究介绍
华中科技大学 硕士学位论文 SMCC法抗体定向偶联技术的优化与应用研究 姓名：冯燕 申请学位级别：硕士 专业：生物医学工程 指导教师：杨祥良 2011-05-24
华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 摘要 蛋白质偶联技术是采用一定的技术手段将具有生物活性的蛋白质与其它载体分子或标记物结合在一起的一种方法，在生命科学和医学领域有着广泛的应用。在标记免疫分析方法中，抗体与酶等标记物的偶联效果会直接影响到免疫方法的灵敏度和可靠性。 常用的偶联方法如戊二醛法、碳二亚胺法、过碘酸钠氧化法法等不可避免地会产生酶或抗体的自身交联产物或多聚物，致使偶联效率降低、结合物活性减弱。在此基础上发展起来的异性双功能偶联剂虽然可以克服这一不足，但酶在抗体上的连接位点具有随机性，导致抗体和酶的活性会受到影响。因此，在实际应用中，需建立一种能定向偶联的抗体偶联技术。 本研究采用SMCC法，研究优化了免疫球蛋白IgG与辣根过氧化物酶HRP的偶联条件，主要研究内容包括： 1) 采用体内诱生腹水法制备氯霉素单克隆抗体，并对其活性进行测定，建立竞 争曲线。 2) 从投料比、反应温度、反应时间三个方面对抗体的DTT还原反应过程进行 了研究，探讨了还原条件对免疫球蛋白的结构、活性等方面的影响。 3) 采用SMCC法将抗体与HRP偶联，并对其活性进行鉴定，并将其用于酶联 免疫吸附实验。 研究结果表明，DTT还原反应的温度和时间对抗体结构和活性影响不大，而DTT 的加入量则有明显影响：在封闭巯基的条件下，投料比小于为600时，还原产物以大分子片段居多，当投料比大于600后，产物主要为小分子片段，且抗体活性开始下降，到6000时活性几乎完全丧失；在未封闭巯基条件下，由于游离巯基会重新聚合，当投料比在600～12000之间，抗体活性与产物的组成差异均不明显。在将其应用于羊抗小鼠二抗与HRP的偶联中，确定优化的SMCC法偶联条件为DTT与抗体
解偶联蛋白2的功能调控方式
解偶联蛋白2的功能调控方式 解偶联蛋白（uncoupling protein，UCP）是线粒体内膜的一类线粒体载体蛋白。大量的研究结果显示，UCP功能的异常与多种疾病关系密切。UCP2是UCP的一种重要类型，现综述概括UCP2的主要功能调控方式以及这些调控的生理意义。 肥胖、动脉粥样硬化、糖尿病、免疫失调等慢性疾病是严重影响人民群众身心健康的重要公共卫生问题。深入探讨这些疾病发生的分子机制并在此基础上探索有效的防护措施具有重要的意义。解偶联蛋白（uncoupling protein，UCP）属于一类存在于线粒体内膜的线粒体离子转运体家族成员。近年的研究发现解偶联蛋白在前述多种慢性疾病的发生发展过程中发挥着重要作用。而其本身的功能又受到多种机制的调控，现对这方面的进展进行综述。 1 解偶联蛋白概述 线粒体是真核细胞内主要的供能细胞器，通过对底物的降解反应产生ATP。在这个过程中，通过质子电化学梯度将底物的氧化与A TP合成偶联起来。但这种偶联并不是绝对的，质子可以通过线粒体内膜漏出（质子漏）而不引起A TP的产生，这个过程中一部分氧化产生的能量最后以热量的形式被消耗掉。质子漏与解偶联蛋白相关联，通过允许质子进入线粒体基质的方式，解偶联蛋白使质子梯度下将，从而导致氧化呼吸链的解偶联以及热量的产生[1]。最具特征性的解偶联蛋白为UCP1，UCP1在1978年被鉴定并在1988年被首次克隆。UCP1表达于棕色组织，在寒冷和食物所导致的非寒战性产热过程中发挥重要作用[2]。1997年，2种与UCP1相似的基因被克隆并分别命名为UCP2和UCP3。随后又筛选出2种新的UCP1相似物，并被分别命名为UCP4和UCP5/BMCP[3]。在各种UCP中，UCP2的组织分布最为广泛。 2 UCP2功能概述 人类的UCP2基因定位于11号染色体，主要表达于脂肪组织、骨骼肌、脾、肺、胰腺的β细胞以及巨噬细胞。虽然结构与UCP1相似，但是干扰、抑制UCP2的表达不会导致肥胖以及对寒冷敏感性的升高[4]。关于UCP2是否参与对寒冷应答的研究结果不尽一致，一般认为它不是主要的产热调控因子。但当特定的效应因子激活时，UCP2同样可以发挥促进产热的作用。由于对偶联过程、活性氧产物（ROS）产生以及脂肪酸代谢等多方面都有着广泛的影响，UCP2已经被发现参与多种生理、病理过程，如糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化、感染、衰老、肿瘤发生等。例如UCP2能够抑制β细胞分泌胰岛素，从而与Ⅱ型糖尿病有关[5]。UCP2诱导质子漏的一个重要作用是减少线粒体ROS的产生。UCP2的高表达可预防氧化损伤，而抑制UCP2的表达则可在多种细胞类型中促进氧化损伤[6]。此外，UCP2还通过缓解氧化应激抑制结肠癌以及动脉粥样硬化的发生[7]。 3 UCP2功能调控 3.1 遗传多态性在加拿大魁北克开展的一项人群研究发现UCP2基因的3个微随体与能量消耗有关[8]。此外，UCP2启动子866有一个G/A单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）。而该SNP被证实与血液三酰甘油、总胆固醇以及低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）胆固醇水平有关[9]。在Ⅱ型糖尿病患者，866-A等位基因携带者的胰岛素分泌能力比G等位基因携带者要低得多[10]。在德国的高加索人中，携带同样等位基因的糖尿病患者神经病变发生危险性显著降低[11]。而在中国人、马来人以及印度人，携带同样等位基因者拥有更高的腰/臀比，同时代谢性综合征的危险性也增高[12]。虽然在女性韩国人866-G等位基因携带者UCP2的表达和转录水平都显著降低，同时具有更高的体重指数（body mass index，BMI）以及脂肪量[13]，拥有866-G等位基因的澳大利亚高加索人却拥有较低的血清三酰甘油以及较高的胰岛素敏感性水平[14]。另外，UCP2基因4号
如何用碳二亚胺法将半抗原偶联到蛋白上
如何用碳二亚胺法将半抗原偶联到 【摘要】用碳二亚胺（EDC）法将14位羟基修饰的雷公藤内酯醇(TP)和不同的蛋白载体（阳离子化牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白）偶联合成TP的人工免疫抗原和检测抗原，紫外光谱鉴定偶联效果，计算偶联率。利用免疫抗原免疫小鼠，制备小鼠多克隆抗体，用检测抗原分析血清抗体效价，利用抗原竞争ELISA分析抗体特异性，为进一步研究TP的分子作用机理以及制备TP的单克隆抗体奠定基础。 【关键词】雷公藤内酯醇；14位羟基修饰；人工抗原；多克隆抗体 雷公藤内酯醇（triptolide，TP）分子式C20H24O6，分子结构如图1，相对分子质量360.41，为二萜类三环氧内酯化合物，是从植物雷公藤（Tripterygium Wilfordii Hook.f.）中提取的有效成分里活性最强的部分，具有消炎散结、清热解毒、抗菌、免疫抑制以及抗生育等功效。长期以来，TP作为临床上公认的免疫抑制剂，主要用于各种自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎以及器官移植排斥反应的治疗。近年来研究发现，该药对多种肿瘤细胞有诱导凋亡的作用，与化疗药物联合应用能协同杀伤肿瘤细胞或逆转肿瘤耐药，说明它具有抗肿瘤效果，因此在肿瘤治疗方面的应用也日益受到人们的关注。除此以外，它还对细胞发育增殖、细胞周期等有调控作用。近年来，国内外对TP具有如此广泛作用的分子机理产生了越来越浓厚的兴趣，从多个不同的角度进行了研究。但是，由于缺少方便快捷的TP检测手段，长期以来对TP直接作用位点的研究一直十分困难，对TP作用的靶蛋白和作用途径知之甚少。细胞免疫化学是追踪分子在细胞内作用过程的有力工具，如果能够得到TP的抗体，就为利用细胞免疫化学研究TP的作用靶点和在细胞内的定位等提供了分子探针，为最终研究TP作用机制和寻找其靶蛋白提供了可能。作为小分子半抗原，TP需要和大分子蛋白载体偶联才能成为能够诱导产生抗体的免疫原。为了不影响小分子的生物活性，提高偶联效率，我们需要选择合适的反应基团。已有的TP结构 活性研究显示，TP的不同生物效应依赖于不同的功能基团。研究证实，对于12，13位环氧进行开环反应所获得的稳定的衍生物雷公藤内酯三醇（triptriolide）会丧失免疫抑制和抗炎的生物活性。14位羟基是TP最容易被改造修饰的基团，研究表明，14位羟基被改造为水溶性的基团作为前药能极大改善小分子的水溶性，促进体内代谢，降低毒性，甚至能改善TP在体内的免疫抑制活性和抗肿瘤活性［1 2］。 综合考虑，TP的14位羟基是最合适的偶联基团。TP的水溶性不理想，且14位羟基不容易在温和条件下和蛋白载体反应，我们首先对14位羟基进行结构修饰，改造为水溶性的羧基，利用缩合反应偶联阳离子化牛血清白蛋白（cationized BSA，cBSA）和鸡卵清蛋白（OVA），合成TP的免疫抗原TP cBSA和检测抗原TP OVA。用免疫抗原免疫小鼠，顺利得到了TP的多抗。 1 实验部分 1.1 试剂和仪器 TP（购自SIGMA公司），cBSA（购自PIERCE公司），OVA，1 乙基 （3 二甲基氨
G蛋白偶联受体
G蛋白偶联受体标准化管理处编码[BBX968T-XBB8968-NNJ668-MM9N]
：G-protein coupled receptor 一种与三聚体G蛋白偶联的细胞表面受体。含有7个穿膜区，是迄今发现的最大的受体超家族，其成员有1000多个。与配体结合后通过激活所偶联的G蛋白，启动不同的信号转导通路并导致各种生物效应。 G蛋白偶联型受体是具有七个跨膜螺旋的受体，在结构上面它包括七个跨膜区段，它们与配体结合后，通过与受体偶联的G蛋白的介导，使第二信使物质增多或减少，转而改变膜上的离子通道，引起膜电位发生变化。其作用比离子通道型受体缓慢，这类受体与G蛋白之间的偶联关系也颇为复杂；一种受体可以和多种G蛋白偶联，激活多种效应系统；也可同时和几种受体偶联或几种G蛋白与一种效应系统联系而使来自不同受体的信息集中于同一效应系统。与G蛋白偶联受体有关的信号通路有：腺苷酸环化酶系统（AC系统），磷酸肌醇系统，视网膜光电信号传递系统，与嗅觉相关的信号传导系统，一氧化氮系统等。三聚体GTP结合调节蛋白（trimeric GTP-binding regulatory protein）简称G蛋白，位于质膜胞质侧，由α、β、γ三个亚基组成，α 和γ亚基通过共价结合的脂肪酸链尾结合在膜上，G 蛋白在信号转导过程中起着分子开关的作用，当α亚基与GDP结合时处于关闭状态，与GTP结合时处于开启状态，α亚基具有GTP酶活性，能催化所结合的，恢复无活性的三聚体状态，其GTP酶的活性能被RGS（regulator of G protein signaling）增强。RGS也属于GAP（GTPase activating protein）。G蛋白耦联型受体为7次跨膜蛋白，受体胞外结构域识别胞外信号分子并与之结合，胞内结构域与G蛋白耦联。通过与G蛋白耦联，调节相关酶活性，在细胞内产生第二信使，从而将胞外信号跨膜传递到胞内。G蛋白耦联型受体包括多种神经递质、肽类激素和趋化因子的受体，在味觉、视觉和嗅觉中接受外源理化因素的受体亦属G蛋白耦联型受体。由G蛋白耦联受体所介导的细胞信号通路主要包括：和磷脂酰肌醇信号通路。（一）cAMP信号途径在cAMP信号途径中，细胞外信号与相应受体结合，调节腺苷酸环化酶活性，通过第二信使cAMP水平的变化，将细胞外信号转变为细胞内信号。 1、cAMP信号的组分①.激活型激素受体（Rs）或抑制型激素受体（Ri）；②.活化型调节蛋白（Gs）或抑制型调节蛋白（Gi）；③.腺苷酸环化酶
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介 （一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联） 1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method） 偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。 氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法 1、5．8mg MIT用0.1ml二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。 2、1.5mg酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。 3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为9.0，q然后4度过夜。 4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液(pH7.5)平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA 0.1％（w/v）、NaN3 0.02%(w/v)的缓冲液中。 碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤 1、取EDC 100mg , 用pH8.0的10 m mol/L PBS液2.5ml使之充分溶解（I液） 2、取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸25mg , 用0.2mol/L NaOH 溶液2ml 溶解(II液) 3、取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （pH8.0）液中（III液） 4、将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下0.5ml） 5、室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液 6、 4度搅拌12小时 7、静置10小时（4度） 8、有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。 孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法 1、用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L的溶液。 2、加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和DCC（二环已基碳化二亚胺），200 m mol/L, 4度反应16小时。 3、用簿层扫描方法纯化(氯仿：水=9：1) 4、按孕酮/酶摩尔浓度比约为10的比例，将上述溶液加入到酶液（用pH7.4，浓度50 m mol/L 的磷酸缓冲液溶解）中。 5、 （二）含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联 芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤 1、用0.1 mol/L HCl溶液配制4 m mol/L浓度的半抗原。 2、滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。 3、溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。 4、用pH9.0、浓度为200m mol/L的硼酸或碳酸缓冲液溶解蛋白。 5、边搅拌，边加入重氮化的半抗原（防止局部发生酸过量现象），调节pH到9.5。
硅烷偶联剂的使用(完整篇)
硅烷偶联剂的使用（完整篇） 一、选用硅烷偶联剂的一般原则 已知，硅烷偶联剂的水解速度取于硅能团Si-X，而与有机聚合物的反应活性则取于碳官能团C-Y。因此，对于不同基材或处理对象，选择适用的硅烷偶联剂至关重要。选择的方法主要通过试验预选，并应在既有经验或规律的基础上进行。例如，在一般情况下，不饱和聚酯多选用含CH2=CMeCOO、Vi及 CH2-CHOCH2O－的硅烷偶联剂；环氧树脂多选用含CH2－CHCH2O及H2N－硅烷偶联剂；酚醛树脂多选用含H2N－及H2NCONH－硅烷偶联剂；聚烯烃选用乙烯基硅烷；使用硫黄硫化的橡胶则多选用烃基硅烷等。由于异种材料间的黏接可度受到一系列因素的影响，诸如润湿、表面能、界面层及极性吸附、酸碱的作用、互穿网络及共价键反应等。因而，光靠试验预选有时还不够精确，还需综合考虑材料的组成及其对硅烷偶联剂反应的敏感度等。为了提高水解稳定性及降低改性成本，硅烷偶联剂中可掺入三烃基硅烷使用；对于难黏材料，还可将硅烷偶联剂交联的聚合物共用。硅烷偶联剂用作增黏剂时，主要是通过与聚合物生成化学键、氢键；润湿及表面能效应；改善聚合物结晶性、酸碱反应以及互穿聚合物网络的生成等而实现的。增黏主要围绕3种体系：即（1）无机材料对有机材料；（2）无机材料对无机材料；（3）有机材料对有机材料。对于第一种黏接，通常要求将无机材料黏接到聚合物上，故需优先考虑硅烷偶联剂中Y与聚合物所含官能团的反应活性；后两种属于同类型材料间的黏接，故硅烷偶联剂自身的反亲水型聚合物以及无机材料要求增黏时所选用的硅烷偶联剂。 二、使用方法 如同前述，硅烷偶联剂的主要应用领域之一是处理有机聚合物使用的无机填料。后者经硅烷偶联剂处理，即可将其亲水性表面转变成亲有机表面，既可避免体系中粒子集结及聚合物急剧稠化，还可提高有机聚合物对补强填料的润湿性，通过碳官能硅烷还可使补强填料与聚合物实现牢固键合。但是，硅烷偶联剂的使用效果，还与硅烷偶联剂的种类及用量、基材的特征、树脂或聚合物的性质以及应用的场合、方法及条件等有关。本节侧重介绍硅烷偶联剂的两种使用方法，即表面处理法及整体掺混法。前法是用硅烷偶联剂稀溶液处理基体表面；后法是将硅烷偶联剂原液或溶液，直接加入由聚合物及填料配成的混合物中，因而特别适用于需要搅拌混合的物料体系。 1、硅烷偶联剂用量计算 被处理物（基体）单位比表面积所占的反应活性点数目以及硅烷偶联剂覆盖表面的厚度是决定基体表面硅基化所需偶联剂用量的关键因素。为获得单分子层覆盖，需先测定基体的Si－OH含量。已知，多数硅质基体的Si－OH含是来4-12个/μ㎡，因而均匀分布时，1mol硅烷偶联剂可覆盖约7500m2的基体。具有多个可水解基团的硅烷偶联剂，由于自身缩合反应，多少要影响计算的准确性。若使用Y3SiX处理基体，则可得到与计算值一致的单分子层覆盖。但因Y3SiX价昂，且覆盖耐水解性差，故无实用价值。此外，基体表面的Si-OH数，也随加热条件而变化。例如，常态下Si－OH数为5.3个/μ㎡硅质基体，经在400℃或800℃下加热处理后，则Si－OH值可相应降为2.6个/μ㎡或＜1个/μ㎡。反之，使用湿热盐酸处理基体，则可得到高Si－OH含量；使用碱性洗涤剂处理基体表面，则可形成硅醇阴离子。硅烷偶联剂的可润湿面积（WS），是指1g硅烷偶联剂的溶液所能覆盖基体的面积（㎡/g）。若将其与含硅基体的表面积值（㎡/g）关连，即可计算出单分子层覆盖所需的硅烷偶联剂用量。以处理填料为例，填料表面形成单分子
兽药人工抗原的合成方法
兽药人工抗原的合成方法 1 兽药人工抗原的合成方法 兽药人工抗原合成的基本方法为兽药半抗原与载体蛋白质的偶联。 1.1 半抗原的合成大多数的兽药小分子不具有直接与载体蛋白质交联的功能团（羧基和氨基），需要通过化学合成或衍生的方法首先制备出具有活性交联功能团的相应半抗原。理想的半抗原（合成或衍生后的半抗原）应具有待测物（待测的半抗原原型）的特征结构，且与载体连接后应保持该特征结构能在最大程度为免疫细胞识别和结合（能将该基团暴露）。兽药半抗原活性基团种类主要有-NH2、 -COOH、-OH、-SH，在与载体偶联制备人工抗原时，有些活性基团还需要先进行选择性保护和去保护，如阿维菌素半抗原的合成(李俊锁等，1999)。不同的兽药有不同的半抗原活化方法，目前获得半抗原常用的方法有：对药物分子进行改造使之产生活性基团；在药物分子内部引入活泼卤元素，达到所需反应的目的；利用原形药物的代谢产物作为活泼半抗原；利用化学合成的方法合成有活性功能团的半抗原；直接购买与半抗原结构相似的有活性基团的商品化学试剂。 1.2 兽药人工抗原合成常用的载体常用于兽药人工抗原合成的载体蛋白质包括牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、人血清蛋白(HSA)及钥孔血蓝蛋白(KLH)，其中又以牛血清蛋白最为常用。因为BSA理化稳定，经济易得，分子内自由氨基多，与半抗原偶联率高，并且具有在不同pH值和离于强度下以及在含有某些有机溶剂状态下都能保持较大的溶解度。近年来，国内外都有文献介绍以人工合成的多聚肽做载体(常用多聚L赖较氨酸)，自身免疫原性很差但可以增加半抗原的免疫性，有利于机体产生特异性更高的抗体，且具有比BSA更多的自由氨基(与BSA相当分子量的多聚赖氨酸的自由氨基数约是BSA所含数目的10倍)，可以大大提高载体蛋白质与半抗原的偶联率。以多聚赖氨酸做载体来制备兽药人工抗原尚未见报道，这应该是一个值得探讨的方向。 1.3 兽药抗原的偶联方法活化的半抗原与载体偶联应根据半抗原功能团的不同，选用不同的偶联剂和不同的偶联方法。人工抗原合成的传统方法有：混合酸酐法、活泼酯法及碳二亚胺法，用于羧基半抗原与载体的偶联；戊二醛法或重氮化法用于氨基半抗原与载体的偶联；氨基氧乙酸化用于酮基半抗原与载体的偶联；丁二酸酐衍生化用于羟基半抗原与载体的偶联。人工抗原合成的基因工程方法：利用基因工程技术表达特定抗原蛋白或通过核苷酸序列推导合成相应编码的蛋白质抗原肽段，得到目的抗原。 2 影响兽药人工抗原质量的因素 人工抗原的质量好坏指其免疫原性的优劣，受多种因素的影响。不同药物的质量影响因素也不尽相同，一方面取决于人工抗原本身的性质，另一方面取决于接受该抗原刺激的机体的反应性。概括起来主要有以下几个方面。 2.1 抗原分子特性免疫学理论认为抗原物质除了要求具有一定的分子质量(10ku)外，其表面还必须有一定的化学组成和结构，分子结构和空间结构越复杂、支链越多，免疫原性越强，越易于诱导机体产生抗体。对于具有多个载体偶联位点的兽药半抗原，以不同位点相偶联制备的抗原，其相应的特异性、亲和性、效价也都不相同，即由于不同偶联位点制备的抗原的空间结构不同所致。所以，当一个兽药分子内部有多个不同的结合位点时，要尽可能多合成不同的人工抗原，然后通过比较筛选出最好的抗原用于抗
抗体偶联药物中的生物分析
抗体偶联药物研发中的生物分析 李秀立, 陈笑艳, 钟大放* (中国科学院上海药物研究所, 上海药物代谢研究中心, 上海201203) 摘要: 抗体偶联药物(antibody-drug conjugates, ADCs) 是一类单克隆抗体通过一段连接臂共价偶联细胞毒性小分子化合物而成的复合物, 可以提高抗肿瘤药物的靶向性并减少毒副作用。ADCs结构具有异质性并且其药物?抗体比值(drug-to-antibody ratio, DAR) 在体内呈动态变化, 其生物分析面临着巨大的挑战, 常用的定量分析包括酶联免疫吸附反应(ELISA)和液相色谱?质谱分析(LC-MS)。ADCs同其他生物制品一样, 在体内可能会产生抗药抗体(anti-therapeutic antibody, ATA), 影响其药效、药动学及安全性, 因此有必要评价其免疫原性。本文综述了在ADC研发过程中常见的基于ELISA和LC-MS方法的待测物分析, 包括DAR分布、总抗体、结合型抗体、结合型药物、游离药物以及ATA分析, 可为我国的ADCs研发提供参考。 关键词: 抗体偶联药物; 药物?抗体比值; 免疫原性; 酶联免疫吸附反应; 液相色谱?串联质谱 中图分类号: R917 文献标识码:A 文章编号: 0513-4870 (2016) 04-0517-12 Bioanalysis in the development of antibody-drug conjugates LI Xiu-li, CHEN Xiao-yan, ZHONG Da-fang* (Shanghai Center for Drug Metabolism and Pharmacokinetics Research, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201203, China) Abstract: Antibody-drug conjugates (ADCs) are complex molecules with cytotoxic small molecular drugs covalently bound to monoclonal antibodies via a linker and can improve the targeted drug delivery with minimizing the systemic toxicity. ADCs are heterogeneous mixtures with different drug-to-antibody ratios (DARs) and the DAR distribution is dynamically changing in vivo, therefore the bioanalysis of the ADCs is challenging. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and LC-MS have been widely used in the ADCs bioanalytical assays. Just like other biotherapeutics, ADCs may elicit the host immune response and produce the anti-therapeutic antibody (ATA), which could affect its efficacy, pharmacokinetics, and safety. It is thereby important to investigate its immunogenicity in the ADC development. In this review, we summarized the ELISA- and LC-MS-based bioanalysis strategies for the development of ADCs, including DAR distribution, the determination of total antibody, conjugated antibody, conjugated drug, free drug, and ATA, with the expectation of providing insights and reference for the ADC development in China. Key words: antibody-drug conjugate; drug-to-antibody ratio; immunogenicity; enzyme-linked immunosorbent assay; LC-MS 抗体偶联药物(antibody-drug conjugates, ADCs) 是一类单克隆抗体通过一段连接臂(linker) 共价偶 收稿日期: 2015-09-08; 修回日期: 2015-10-11. *通讯作者 Tel / Fax: 86-21-50800738, E-mail: dfzhong@https://www.wendangku.net/doc/6e17730953.html, DOI: 10.16438/j.0513-4870.2015-0792联细胞毒性小分子化合物而成的复合物, 用于治疗恶性肿瘤。单克隆抗体可以靶向结合肿瘤细胞表面的抗原, 通过细胞内化作用进入细胞。进入细胞后, 其结构中的小分子药物在溶酶体低pH环境或蛋白酶作用下释放出来, 发挥细胞毒作用。由于单克隆抗体的靶向性, 正常组织细胞内药物浓度较低。因此与传统
第3节：G蛋白偶联受体介导的信号转导
途径一：激活离子通道的G 蛋白偶联受体所介导的信号通路 G 蛋白偶联受体介导的信号转导受体：G 蛋白 结构三个亚基组成 G α：分子开关锚定在膜上 G β、G γ：二聚体形式，锚定在膜上 7次跨膜α螺旋（右图上） N 端在胞外、C 端在胞内激活的普遍机制（右图下） 根据效应蛋白分类 1、激活离子通道的G 蛋白偶联受体 2、激活或抑制腺苷酸环化酶，以cAMP 为第二信使的G 蛋白偶联受体 3、激活磷脂酶C ，以IP 3和DGA 作为双信使的G 蛋白偶联受体 三类方式比较典型例子心肌细胞M 乙酰胆碱受体激活G 蛋白开启K +通道附图p168（下图⑤）Gt 蛋白偶联的光敏感受体的活化诱 发cGMP 门控阳离子通道的关闭 附图p168（下图⑥） 第二信使：cGMP
图⑤ 图⑥ 途径二：激活或抑制腺苷酸环化酶的G 蛋白偶联受体 腺苷酸环化酶的G 蛋白偶联受体 刺激AC 的物质 肾上腺素、胰高血糖素、促肾上腺皮质激素受体：刺激性激素受体（Rs ），Gs α抑制AC 的物质前列腺素、腺苷 受体：抑制性激素受体（Ri ），Gi αAC AC 结构12次跨膜蛋白C 端与N 端均在细胞内胞质侧有两个大的相似的结构域，跨膜区有两个整合结构域 AC 功能在Mg 2+或Mn 2+存在下，催化ATP 生成cAMP 蛋白激酶A （PKA ）未激活状态2个调节亚基与2个催化亚基结合激活状态激活物：cAMP 调节亚基与催化亚基分开作用底物特点磷酸化基序：X-Arg-(Arg/Lys)-X-(Ser/Thr)-Φ（X ：任意AA ，Φ：疏水AA ）cAMP 与PKA 的结合协同方式（类似血红蛋白结合氧） cAMP 的降解环腺苷酸磷酸二酯酶（PED ）降解cAMP 生成5'-AMP 信号通路模式图p169（图⑦）cAMP-PKA 信号通道对肝细胞和肌细胞糖原代谢的调节p171（下图⑧）、对真核细胞基因表达的调控p171（下图⑨）
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介
常用的半抗原与蛋白偶联 方法简介 Last revision date: 13 December 2020.
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介 （一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联） 1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method） 偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。 氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法 1、5．8mg MIT用二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。 2、酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。 3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为，q然后4度过夜。 4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA ％（w/v）、NaN3 %(w/v)的缓冲液中。 碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤 1、取EDC 100mg , 用的10 m mol/L PBS液使之充分溶解（I液） 2、取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用L NaOH 溶液2ml 溶解(II液) 3、取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （）液中（III液） 4、将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下） 5、室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液 6、4度搅拌12小时 7、静置10小时（4度） 8、有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。 孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法 1、用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L的溶液。 2、加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和 DCC（二环已基碳化二亚胺），200 m mol/L, 4度反应16小时。 3、用簿层扫描方法纯化(氯仿：水=9：1) 4、按孕酮/酶摩尔浓度比约为10的比例，将上述溶液加入到酶液（用，浓度50 m mol/L的磷酸缓冲液溶解）中。 5、 （二）含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联 芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤 1、用 mol/L HCl溶液配制 4 m mol/L浓度的半抗原。 2、滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。 3、溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。
硅烷偶联剂的使用方法
一、选用硅烷偶联剂的一般原则 已知，硅烷偶联剂的水解速度取于硅能团Si-X ，而与有机聚合物的反应活性则取于碳官能团C-丫。因此，对于不同基材或处理对象，选择适用的硅烷偶联剂至关重要。选择的方法主要通过试验预选，并应在既有经验或规律的基础上进行。例如，在一般情况下，不饱和聚酯多选用含CH2=CMeC、OOVi 及CH2-CHOCH－2O 的硅烷偶联剂；环氧树脂多选用含CH2- CHCH2及H2N-硅烷偶联剂；酚醛树脂多选用含H2N-及H2NC0NH硅烷偶联剂；聚烯烃选用乙烯基硅烷；使用硫黄硫化的橡胶则多选用烃基硅烷等。由于异种材料间的黏接可度受到一系列因素的影响，诸如润湿、表面能、界面层及极性吸附、酸碱的作用、互穿网络及共价键反应等。因而， 光靠试验预选有时还不够精确，还需综合考虑材料的组成及其对硅烷偶联剂反应的敏感度等。为了提高水解稳定性及降低改性成本，硅烷偶联剂中可掺入三烃基硅烷使用；对于难黏材料，还可将硅烷偶联剂交联的聚合物共用。硅烷偶联剂用作增黏剂时，主要是通过与聚合物生成化学键、氢键；润湿及表面能效应；改善聚合物结晶性、酸碱反应以及互穿聚合物网络的生成等而实现的。增黏主要围绕 3 种体系：即（1）无机材料对有机材料；（2）无机材料对无机材料；（3）有机材料对有机材料。对于第一种黏接，通常要求将无机材料黏接到聚合物上，故需优先考虑硅烷偶联剂中丫与聚合物所含官能团的反应活性；后两种属于同类型材料间的黏接，故硅烷偶联剂自身的反亲水型聚合物以及无机材料要求增黏时所选用的硅烷偶联剂。 二、使用方法 如同前述，硅烷偶联剂的主要应用领域之一是处理有机聚合物使用的无机填料。后者经硅烷偶联剂处理，即可将其亲水性表面转变成亲有机表面，既可避免体系中粒子集结及聚合物急剧稠化，还可提高有机聚合物对补强填料的润湿性，通过碳官能硅烷还可使补强填料与聚合物实现牢固键合。但是，硅烷偶联剂的使用效果，还与硅烷偶联剂的种类及用量、基材的特征、树脂或聚合物的性质以及应用的场合、方法及条件等有关。本节侧重介绍硅烷偶联剂的两种使用方法，即表面处理法及整体掺混法。前法是用硅烷偶联剂稀溶液处理基体表面；后法是将硅烷偶联剂原液或溶液，直接加入由聚合物及填料配成的混合物中，因而特别适用于需要搅拌混合的物料体系。 1、硅烷偶联剂用量计算 被处理物（基体）单位比表面积所占的反应活性点数目以及硅烷偶联剂覆盖表面的厚度是决定基体表面硅基化所需偶联剂用量的关键因素。为获得单分子层覆盖，需先测定基体的Si—OH含量。已知，多数硅质基体的Si —OH含是来4-12 个/卩叭因而均匀分布时，1mol硅烷偶联剂可覆盖约7500m2的基体。具有多个可水解基团的硅烷偶联剂，由于自身缩合反应，多少要影响计算的准确性。若使用丫3SiX处理基体，则可得到与计算值一致的单分子层覆盖。但因丫3SiX价昂，且覆盖耐水解性差，故无实用价值。此外，基体表面的Si-OH数，也随加热条件而变化。例如，常态下Si —OH数为5.3个/卩川硅质基体，经在400C或800C 下加热处理后，则Si —OH值可相应降为2.6个/卩卅或V 1个/卩讥反之，使用湿热盐酸处理基体，则可得到高Si —OH含量；使用碱性洗涤剂处理基体表面，则可形成硅醇阴离子。硅烷偶联剂的可润湿面积（WS，是指ig硅烷偶联剂的溶液所能覆
抗原偶联选择方法
抗原偶联选择方法-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1
载体的选择： 1.载体表面应首先应具有化学活性基团，这些基团可以直接与抗生素或农药分子偶联， 这是化学偶联制备抗原的前提； 2.其次,载体应具备一定的容量,可以偶联足够的分子； 3.载体还应该是惰性的,不应干扰偶联分子的功能； 4.而且载体应具有足够的稳定性,且应该是廉价易得的. 载体蛋白质有牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等 这些蛋白质分子中的α和ε-氨基（等电点8和10）、苯酚基、巯基（等电点为9）、咪唑基（等电点为7）、羧基（等电点2～4,大部分来自天冬氨酸或谷氨酸的β-和γ-羧基）等在等电点pH条件下,一部分成为质子,另一部分未质子化的亲核基团则具有反应活性,可与半抗原中的对应基团结合.当然,这些基团的反应性也取决于蛋白质各种氨基酸残基的微环境.牛血清白蛋白（BSA）和人血清白蛋白（HAS）分子中含有大量的赖氨酸,故有许多自由氨基存在,且在不同pH 和离子强度下能保持较大的溶解度.此外,这些蛋白质在用有机溶剂（如吡啶、二甲基甲酰胺）溶解时,其活性基团仍呈可溶状态,因此,这两种蛋白质是最常用的载体蛋白质.近年来,有研究报道用人工合成的多聚肽(最常用的是多聚赖氨酸)作载体,表现出能增加半抗原的免疫原性,从而使产生征对半抗原的特异性抗体可能性增加,被广泛应用。 人工抗原合成方法： 小分子半抗原与载体蛋白偶联效果会到偶联物的浓度及其相对比例、偶联剂的有效浓度及其相对量、缓冲液成分及其纯度和离子强度、pH以及半抗原的稳定性、可溶性和理化特性等因素的影响.通常是在条件温和的水溶液中将半抗原与载体蛋白共价结合,不宜在高温、低温、强碱、强酸条件下进行.一般是由半抗原上的活性基团决定偶联合成的方法,常用的方法如下： 分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶联 1）混合酸酐法（mixed anhydride method）：也称氯甲酸异丁酯法。偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixedacidanhydride)，然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。 2）碳二亚胺法（CDI）：碳二亚胺(EDC)使羟基和氨基间脱水形成酰胺键,半抗原上的羧基先与EDC反应生成一个中间物,然后再与蛋白质上的氨基反应,形成半抗原与蛋白质的结合物（见图）.EDC被称作零长度交联剂之一,因为它作为酰胺键的形成介质并没有形成手臂分子. 此连接方法十分简便,只需将载体蛋白质和抗原按一定比例混合在适当的溶液中,然后加入水溶性碳化二亚胺,搅拌1～2h,置室温24h,再经透析即可。如果半抗原分子中不含羧基,可通过某些化学反应引入羧基.在引入羧基后,也可用上述方法进行偶联。 含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联 1）戊二醛法：双功能试剂戊二醛的两个醛基分别与半抗原和蛋白质上的氨基形成schiff键(-N=C<，在半抗原和蛋白质间引入一个5碳桥。这一反应条件温和，可在4～40℃及～内进行，操作亦简便，因此应用广泛。戊二醛受到光照、温度和碱性的影响，可能发生自我聚合，减弱其交联作用，因此最好使用新鲜的戊二醛。
抗体偶联药物
抗体偶联药物（ADC的涅槃重生 抗体偶联药物（antibody-drug conjugate, ADC ）是将抗体与细胞毒性药物连接起来，通过抗体的靶向作用将细胞毒药物靶向肿瘤，进而降低化疗中常见的 药物非特异性的全身毒性。抗体偶联药物（antibody-drug conjugate, ADC ）的研究可以追溯到1980s，，但是直到2000年，首个抗体偶联药物gemtuzumaboz ogamicin （商品名Mylotarg，Pfizer研发）才被FDA B准用于治疗急性粒细胞白血病，但由于偶联技术、靶向性、有效性等受限，完整的抗体偶联药物在血液不稳定，导致致死性毒性的产生，于2010年撤市。这使得本就不明朗的ADC药物研究，更蒙上了一层阴影。 但是随着Takeda/Seattle Genetics 通过对原有技术的改进，利用自己的 新型抗体偶联技术开发了brentuximabvedotin （SGN-35商品名Adcetris ，） 新型抗体偶联药物，并与2011年被FDA批准用于治疗霍奇金淋巴瘤和系统性间变性大细胞淋巴瘤。2013年抗体偶联药物再次取得突破，Ge nen tech/Immu noGen 联合开发的Ado-trastuzumabemtansine （T-DM1,商品名Kadcyla ）被FDA批准用于HER2阳性乳腺癌，这是首个针对实体瘤的抗体偶联药物。随着这两个药物的研发成功，ADC药物再次以火热的状态进入人们的研究视野。 1、进入临床阶段ADC药物 截至目前大概有30多种ADC药物进入临床开发阶段（表1），统计表中30 种药物针对适应症发现，其中仅有4种药物针对实体瘤。主要原因：抗体难于透过毛细管内皮层和穿过肿瘤细胞外间隙到达实体瘤的深部。而使用抗体片段，如Fab,制备分子量较小的偶联物，可能提高对细胞外间隙的穿透性，增加到达深部肿瘤细胞的药物量。因此“抗体的小型化或适度的小型化将会是研制ADC药物 的重要途径”。同时我们还能看到ImmunoGe、Seattle Genetics 在现有ADC 药物研发中占有绝对的统治地位，这得力于他们成熟的抗体偶联技术一一利用天然抗体自身的赖氨酸和半胱氨酸中的巯基偶联药物（non-specific ）。 2、如何才能成功开发出一种ADC药物？
羧基磁珠与蛋白偶联方法
羧基磁珠与蛋白偶联方法 来源：时间：2009-6-6 23:34:26 简介 BioMag 和BioMagPlus 超顺磁珠适用于磁分选细胞、细胞器、蛋白、免疫球蛋白、核酸及其它生物或非生物体系中的分子。BioMag 和BioMagPlus 磁珠表面不规则，因此具有比较大的表面积，可以增加磁珠与偶联分子的接触机率，提高偶联效率。此外，这两种磁珠90%以上为氧化铁，可以加快磁分选速度，这特别适用于大批量，高能量分选样品。 BioMag and BioMagPlus 磁珠采用的工艺制备，只不过BioMagPlus经过了另,外的去除细尘处理，偶联试剂盒中提供的就为此类磁珠。 BioMagPlus 羧基磁珠表面的羧基经过二亚胺EDAC活化后，即可以与蛋白偶联。 Bangs 公司的BioMagPlus Carboxy l Protein Coupling Kit 适用于蛋白与BioMagPlus 超顺磁珠的偶联，此kit提供了可供5次偶联的试剂和磁珠。 材料 ?BioMagPlus 羧基磁珠: 2.5mL，1.5μm ，20 mg/mL ?EDAC (1-ethy l-3-(3-dimethy laminopropyl)carbodiimide): 0.10g ?15mL 尖头离心管: 5 tubes ?BioMag 磁分离器 ?0.05M MES 缓冲液(pH 5.2): 2 x 175mL ?淬灭液(1M Glycine, pH 8.0): 25mL ?洗涤缓冲液: 125mL 实验步骤 活化 ?移取 0.5mL (10mg) 的 BioMagPlus 羧基磁珠至 15mL 尖头离心管内，并放置在磁分离架上直到上清液变完全透彻后，用吸管小心移弃上清。 ?加 5mL of MES 缓冲液充分混匀洗涤. 将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后.用吸管小心移弃上清。 ?重复 Step 2, 三次. 最后一次洗涤后, 重悬磁珠于 5mL 的 MES 缓冲液中。 ?将 EDAC 从冷藏处取出置于室温30分钟。准确称取所需的EDAC (1.6mg EDAC/mg BioMagPlus 磁珠)加入装有磁珠的离心管内， ?剧烈振荡摇匀。 ?室温下，将离心管置于旋转混匀仪上活化反应 30 分钟。反应过程中，注意不让磁珠沉淀聚积在一起。 ?将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后.用吸管小心移弃上清。 ?重复 Step 2, 四次。 蛋白偶联 计算需要偶联的蛋白，抗体量. 一般地，每mg活化的羧基磁珠可以偶联20-500ug的蛋白（抗体），