mTOR抑制剂的筛选方法
mTOR抑制剂的筛选方法
【摘要】雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是是丝氨酸/苏氨酸激酶分子靶位。mTOR是细胞生长增生的中心调控者，直接或间接参与细胞生长增生有关环节的调控。人体多种肿瘤细胞中可见mTOR通路的失调。近年来，有关mTOR抑制剂的专利申请不断增加，设计、合成、筛选结构新颖的mTOR抑制剂已经成为抗肿瘤药物研发的重大课题。本文就mTOR的结构功能、信号转导通路及mTOR抑制剂的筛选方法进行简单的介绍。
【关键词】雷帕霉素靶蛋白雷帕霉素靶蛋白抑制剂药物筛选
TOR(target of rapamycin，雷帕霉素靶蛋白)是一类进化上非常保守的蛋白激酶家族，广泛存在于各种生物细胞中。
1994年，Brown等证实并克隆了哺乳动物TOR基因，其产物只有一种蛋白，即mTOR(mammalian target of rapamycin，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)。mTOR属P13K蛋白激酶类家族，是P13K／PKB信号通路下游的一个效应蛋白，其底物主要控制与细胞生长和增殖密切相关的蛋白质的合成。mTOR控制细胞内mRNA的翻译，参与膜蛋白转运，蛋白质降解，蛋白激酶C信号转导和核糖体合成等一系列生理病理过程。
1.mTOR的分子结构
mTOR分子结构复杂，由2 549个氨基酸残基组成，分子中有数个各自独立而保守的结构域，类似于酵母中TOR的结构。mToR分子的氨基端存在20个串联重复序列，每一个重复序列包含2个分别由40个氨基酸残基组成的α螺旋，每个螺旋都有一个亲水基团和一个疏水基团。这种重复结构介导蛋白质之间的相互作用，并有利于mTOR定位于浆膜。
mTOR分子羧基端的中部是蛋白激酶域，结构和P13K激酶的催
化域相似。蛋白激酶域的上游是FRB域，为FKBPl2一雷帕霉素复合
物与mTOR相互作用的区域，该区发生突变后可以完全阻止雷帕霉
素对mTOR的抑制作用。FRB 下游大约500个氨基酸残基处为FAT域，作用可能是与mTOR分子末端的FATC域形成一个空间结构，从而暴露mTOR分子的催化域。FATC域和NRD域位于mTOR分子羧基末端，其中NRD域在FATC和激酶催化域之间，是mTOR的负性调节域，
而FATC域对mTOR的活性有着至关重要的作用，FATC结构中任何
一个氨基酸残基的缺失都能使mTOR丧失催化能力。
由于mTOR包含的几个相对独立的结构域都能够和其他蛋白质
发生作用，因而其能结合不同的蛋白质。实际mTOR存在两种复合
物形式，这两种复合物的结构在细胞中都是相对保守的。
mTOR形成的两种不同复合物——mTORC1和mTORC2。已知的mTOR对肿瘤细胞生长、分化和代谢的作用均由mTORC1完成，mTORC2对雷帕霉素不敏感。
FRB区，这个区域为免疫抑制剂FK506结合蛋白与雷帕霉素的
结合位点，是雷帕霉素与mTOR相互作用的区域。所以这个区域突
变后可完全阻止雷帕霉素对mTOR的抑制作用，FRB区之后为激酶区，作用是使丝氨酸苏氨酸发生磷酸化。最后的FATC为FAT碳末端区。FAT和FATC区可调节mTOR激酶的活性。
2.mTOR的信号转导通路
mTOR可通过P13K／AKT途径或AMPK途径来发挥作用。目前研究较多的是P13K／AKT途径。该途径在肿瘤中常被过度激活，使细胞周期调节失控，引起细胞转化和肿瘤进展。
正常情况下，生长因子诱导mTOR的活化是通过激活P13K实现的。P13K可磷酸化肌糖环3-羟基的磷酸肌醇。细胞膜3-磷酸磷脂(P13Ps)与Akt的PH区域连接，导致Akt转位至浆膜，从而与磷酸肌
醇依赖性激酶1(PDKl)接触。PDKl负责Akt的磷酸化，从而激活Akt。激活的Akt可磷酸化结节性硬化复合体2(TSC2)并减弱后者对mTOR 的抑制作用。Akt和P13K在功能上属于原癌基因，受到抑癌基因PTEN的负性调节。PTEN可使肌糖环3-羟基的磷酸肌醇磷酸化，在
胚胎发育、细胞迁移、凋亡和有效终止P13K介导的信号转导方面起着关键性的作用。PTEN突变在人类实体肿瘤非常常见。
活化的P13K位于细胞膜，可催化磷脂酰肌醇P2转变为磷脂酰肌醇P3，后者募集并激活AKT。PTEN可以下调PtdlinsP3的浓度。从
而抑制P13K／AKT途径。AKT对mTOR的激活主要通过以下两种方式：一种是磷酸化mTOR而直接激活它；另一种是磷酸化并抑制TSC1／TSC2二聚体。TSCl／TSC2是mTOR最重要的上游信号分子。Rheb是mTOR激活蛋白，TSCl／TSC2二聚体通过抑制Rheb阻止mTOR的活化。
由于P13K／Akt／mTOR通路分子发生突变或者上游信号通路分子激活，肿瘤细胞内P13／Akt／mTOR通路可被激活，从而使细胞增殖失控、凋亡抗拒以及引起细胞的代谢改变。
mTOR经过上述两种途径被活化后可将信号传递给下游通路，通过两种途径调节下游核糖体和mRNA结合，一是使抑制mRNA翻译的4E—BP1磷酸化失活，二是使促进mRNA翻译的S6K1磷酸化而激活，从而启动核糖体蛋白的翻译。两条途径的最终效应都是促进mRNA翻译，从而直接或间接调控翻译起始阶段、微丝形成、膜转运、蛋白降解、蛋白激酶C(PKC)通路、核蛋白体合成、tRNA合成及转录等。
3.mTOR抑制剂
mTOR抑制剂雷帕霉素及其衍生物能结合FKBP(FKS06结合蛋白)，抑制mTOR，阻止P70S6K和4EBP磷酸化。同时也间接抑制了其它相关蛋白转录和翻译，具有抗菌、免疫抑制和抗肿瘤作用。
mTOR抑制剂是具有抗排斥、抗增殖、抗肿瘤及延长哺乳动物寿命等作用的多功能药物。第一个mTOR抑制剂雷帕霉素（Rapamycin，现称西罗莫司，Sirolimus）及其后来通过化学半合成获得的西罗莫司衍生物已作为免疫抑制剂用于器官移植的抗排斥
反应、作为雷帕霉素涂层支架治疗冠状动脉支架植入后的再狭窄、
作为治疗肾癌等癌症的mTOR靶向抗癌药物。
目前又发现雷帕霉素能够治疗老年性痴呆症，也是第一个被报
道能够延长哺乳动物生命的药物。雷帕霉素及其衍生物临床上的新
适应症逐步被开发，它们在治疗罕见病、疑难病症方面可能发挥更
大的作用。
近年来，有关mTOR抑制剂的专利申请不断增加，设计、合成、筛选结构新颖的mTOR抑制剂已经成为抗肿瘤药物研发的重大课题。
4.mTOR抑制剂的筛选方法
（1）酶联免疫吸附法（ELISA）
ELISA的原理是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
mTOR的Ser2448磷酸化是上游信号AKT激酶和下游p70S6
激酶反馈作用的结果，通过检测mTOR的Ser2448磷酸化程度可
以检测mTOR的活性。
我们找了Abcam公司的mTOR pSer2448 in vitro ELISA试剂盒，这个试剂盒是专为在细胞和组织裂解液精确测量mTOR的活性。
具体如下：采用mTOR特定的抗体包被微孔板，制成固相载体，样品吸入孔中，样品中存在的mTOR被固定化的抗体结合到
孔中。洗涤后，在微孔中加入检测抗体。洗去未结合的检测抗体，将酶标抗体加入孔中。各孔再次洗涤，将TMB底物溶液加入到孔中，TMB被催化转化成蓝色，蓝色的深浅与磷酸化的Ser2448的数量呈正相关。加入盐酸停止反应，颜色从蓝色变到黄色，用酶标仪在450nm波长下测定光密度值（OD值），可计算样品浓度。
受检抗原： mTOR phospho Ser2448
检测抗体： anti-mTOR phospho Ser2448 detector antibody
酶标: HRP-conjugated label specific for the detector antibody
底物： TMB
检测：最后加入盐酸停止反应，用酶标仪在450nm处测定OD值。
分析：OD值越小，mTOR的Ser2448磷酸化程度越低，抑
制剂作用越强。
（2）荧光共振能量转移（FRET）
荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近
（7~10nm）时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高
的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了
能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能
量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发
射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。
蛋白质磷酸化是细胞信号转导过程中的重要标志，研究其中的
酶活性是研究信号通路的一个重要方面。利用放射性以及免疫化学
发光等方法检测酶活性，都需要破碎细胞，用细胞提取物测定酶活性，无法做到活细胞内定时、定量、定位的观测酶活性变化，而利
用FRET方法就可以很好的解决这个问题。
利用FRET原理设计了一种新的探针（一种融合蛋白）：新探针包含一个对已知蛋白激酶特异性的底物结构域，一个与磷酸化底物
结构域相结合的磷酸化识别结构域。这个探针蛋白的两端分别是供体、受体荧光分子，利用FRET原理工作。当底物结构域被磷酸化后，分子内部就会发生磷酸化识别结构域与其结合而引起的内部折叠，
两个荧光蛋白相互靠近就会发生能量迁移。
实验用到的供体是Thr46（铽标记的anti-phospho-4EBP1），受
体是绿色荧光标记的4EBP1，是mTOR下游信号通路的蛋白，有活性的mTOR能磷酸化4EBP1，使之与供体结合。如果mTOR活性受到抑制，供体受体距离不能达到荧光能量转移的要求，则在515nm处与485nm处的信号比值增大。抑制剂的活性越大，比值越大。
（3）均相时间分辨荧光（HTRF）
我们找到的是HTRF ADP Transcreener试剂盒。
HTRF Transcreener ADP测定是竞争性免疫测定。mTOR是
一种激酶，在反应时会使ATP转化为ADP。ATP转化的ADP与
d2标记ADP竞争性地与铕标记的ADP单克隆抗体结合。
当铕标记的ADP单克隆抗体与有标记的ADP相结合后，他
们便能发射荧光；当抗体与没有标记的细胞内ADP结合后，没有
荧光产生。所以，通过检测荧光值的变化，便可量化细胞内的ADP。
该测定法包括两个步骤：一个酶促步骤及随后的通用检测步骤。
首先在激酶作用下，ATP转化成ADP；铕标记的抗体与加入的
标记的ADP能发生能量转移，与反应中转化的ADP没有能量转移，
检测不到荧光。所以荧光强度会随着反应转化的ADP量增加而减小。mTOR抑制剂活性越大，反应转化的ADP越少，荧光强度越强，通
过作图计算IC50，可以比较不同抑制剂的活性。
荧光检测还可以采用以下几种方法。
①ADP Hunter试剂盒
我们也可以直接检测激酶反应产生的ADP的量。ADP Hunter是一种高通量筛选激酶抑制剂的试剂盒。它的优点是
更加简便和灵敏。
此测定法直接检测磷酸化反应而产生的ADP分子，采用非放射性，非基于抗体的方法。激酶反应将ATP转化为ADP，通过偶联酶反应系统从ADP生成过氧化氢。在有过氧化氢酶（HRP）存在时，过氧化氢与ADHP（HRP显色底物）结合显色，用荧光酶标仪在最大激发波长和最大发射波长分别为530纳米和590纳米处检测荧光强度。
②ADP-Glo是测定激酶活性的一种常用方法，检测也是激酶反
应产生的ADP的量。在激酶反应后，把残留的未反应的ATP
用酶降解，反应产生的ADP在酶作用下转化成ATP，最后在
荧光素酶作用下检测荧光。不同浓度的ADP含量可做出的标
准图，将最后的实验结果与标准图对照，可得出结论。在最
下面的一条曲线表明磷酸化程度最弱，抑制剂的活性越强。
③LabChip EZ Reader MSA assays
这个方法跟之前的原理都略有不同，虽然最后也是检测荧光强度，但是它是把处理过的样品用荧光后标记吸入管中，根据不同带荷质比迁移率不同，荧光底物和荧光底物标记的检测物最后到达检测窗口的时间也不同，最后就能得到一幅
关于时间与荧光强度的关系图。跟高效液相的过程有点类似，
只不过高效液相是根据组分的极性不同，检测器是紫外。而
这个方法是根据荷质比，检测方法是荧光。在试验中用到的
样品可以是抑制剂处理过的mTOR下游靶蛋白，靶蛋白磷酸
化程度越弱，则荧光信号越弱，抑制剂活性越强。
（4）时间分辨荧光技术（TRF）
时间分辨荧光技术的原理是用三价稀土离子及其螯合物作为示
踪物，代替荧光物质、同位素、酶和化学发光物质，标记抗原、抗体、激素、核酸探针等物质。
当免疫反应发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点（特异性强、荧光光谱的Stokes位移、寿命长），用时间分辨荧光
分析仪，测定免疫反应最后产物的荧光强度。
根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。
示踪剂一般是具有独特荧光特性的稀土金属---镧系元素，镧系元素共有15种，应用在时间分辨荧光免疫技术中有四种：铕(Eu)、钐（Sm)、镝(Dy)、锝(Te)。
镧系元素荧光特点：
（1）荧光寿命极长
镧系元素螯合物（60~900 us) <铕：714us>
普通荧光免疫中荧光团：1~100us
样本中蛋白质荧光：1~10us，易猝灭。
（2）Stokes位移大（大约290nm）
铕：发射光613nm、激发光340nm，
荧光素的Stokes位移为28nm
（3）荧光特异性强（发射光谱带很窄：615± 5nm）
（4）解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍
所以镧系元素有两个优点， stocks位移,也就是激发光和发射光距离很大,很容易分辨激发光和发射光，而排除激发光的干扰。第二
个优点是镧系元素的荧光不仅强度高，而且半衰期也很长，通过时间分辨，极大地降低了自发荧光背景,实现了高信噪比。
故我们在时间分辨荧光检测中一般会采用DELFIA法(解离增强
镧系元素荧光免疫检测)。
这一技术使用镧系螯合物标记的试剂，通过洗涤来分离出未被
结合的试剂，从而检测体系中被标记的某种化合物或生物分子。
在加入样品后经过洗脱，phospho-p70S6K抗体留在板上，再加入铕标记的Eu-anti-phospho-p70S6K 抗体经过洗脱，加入增
强剂，Eu3+从复合物上解离下来，自由Eu3+在增强剂作用下在紫
外光的激发下能发出很强的荧光，信号增强了百万倍。实验用处理
过的mTOR与p70S6K一起培养一段时间，之后加入铕标价的磷酸化p70S6K抗体，在荧光下检测信号强度。信号强度越低表示磷酸化程度越低，mTOR活性越小，小分子抑制剂活性越大。
DELFIA 优点包括：DELFIA 适用于各种标记分子的结合检测:
从小肽段至蛋白大分子；高灵敏度 -信噪比可达 20 000:1；大的动
态范围 - 动态范围超过 3 logs；检测过程不涉及酶–无时间依赖性；试剂用量更少；价格不菲的抗体所需更少；无需像ELISA那样添加实验终止液；可同时检测多种待测物；减少了测量过程中的样品干扰；信号稳定超过24小时, 提高了试验重复性。
（4）Alphascreen
Alphascreen的作用原理：在Alphascreen系统中主要含有两种核心物质，一为Donor Bead，另一为Acceptor Bead，当Donor Bead所带有的A分子与Acceptor Bead所带有的B分子产生
相互作用时，可以680nm镭射光去激发Donor Bead表面所带有的光敏感物质，使其催化周遭的氧分子形成活化态。此时活化态的氧分子可以与邻近的Acceptor Bead产生化学冷光化反应，并进一步藉由能量转换激发Acceptor Bead所带有的荧光物质产生520-620nm的荧光信号。当分子不存在特异的相互作用时，活化态的氧无法扩散到Acceptor Bead，则不会有信号的产生。
AlphaScreen? SureFire? 检测试剂盒可用于 mTOR 通路的研究，由下图可见相关产品很多，方便用于mTOR抑制剂的筛选。
与同类型的检测方法TR-FRET、EFC和FP相比，AlphaScreen
的优势在于蛋白和多肽都可作为磷酸化底物用于激酶检测。与ELISA相比，该检测方法最大的优势在于无需进行引物标记，检测灵敏度比ELISA方法更高。
5.mTOR抑制剂的筛选方法的比较
以上就是mTOR抑制剂几种筛选方法的介绍，最后对几种筛选
方法进行简单的比较：
1.ELISA操作简单快速，特异性强，没有放射性污染，设备要求
简单，应用范围广。
2.荧光谐振能量转移法（FRET）操作简便，结果直观，但供体受体之间发生有效能量转移的条件是苛刻的，寻找一个合适的D-A
对是很不容易的。采用ADP含量测定试剂盒更方便，灵敏度很高。
3. DELFIA 适用于各种标记分子的结合检测,试剂用量少；价格不菲的抗体所需少,减少了测量过程中的样品干扰,灵敏度高。
4.Alphascreen实际上是ELISA+冷光信号放大测定，由于是类荧光检测所以比ELISA更灵敏，测量范围更广。ELISA的试用检验均可以应用。
参考文献
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https://www.wendangku.net/doc/6f15532303.html,/ALX-850-248/aposensor-adp-atp-ratio-assay-kit/
https://www.wendangku.net/doc/6f15532303.html,/usa/htrf-transcreener-adp
https://www.wendangku.net/doc/6f15532303.html,/nmeth/journal/v5/n10/fig_tab/nmeth.f.222_F1.html
http://www.promega.co.jp/jp/jp_tech/FAQs/Q&A_ADP-Glo.html
https://https://www.wendangku.net/doc/6f15532303.html,/products/pm/adp-glo-kinase-
assay/?origUrl=http%3a%2f%https://www.wendangku.net/doc/6f15532303.html,%3a81%2fproducts%2fpm%2fadp-glo-kinase-assay%2f
https://www.wendangku.net/doc/6f15532303.html,/nbspmTOR-pSer2448-ELISA-kit-
ab168538.html?refer404=catalogue%20168538
https://www.wendangku.net/doc/6f15532303.html,/en/applications/application-notes/by-assay-category/202-promegas-adp-glo-kinase-assay-performed-on-bmg-labtechs-pherastar-fs-and-polarstar-omega-obj-107-799.html
酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物研究方法进展
现代生物医学进展https://www.wendangku.net/doc/6f15532303.html, Progress in Modern Biomedicine Vol.10NO.16AUG.2010 酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物研究方法进展* 刘振凯1艾 菁2耿美玉1,2△ （1中国海洋大学医药学院山东青岛266003；2中国科学院上海药物研究所上海201203） 摘要：酪氨酸激酶（protein tyrosine kinases,PTKs ）在肿瘤细胞的增殖、分化、迁移、侵袭等相关信号通路中起到了关键的调控作用，已经成为肿瘤靶向性治疗的重要靶点。本文对靶向酪氨酸激酶的小分子抑制剂的筛选和评价方法进行综述，以期促进酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物的研究。 关键词：酪氨酸激酶；抗肿瘤药物；小分子抑制剂；抑制剂筛选 中图分类号： R730.5，R915文献标识码：B 文章编号：1673-6273（2010）16-3134-04Advances in Research of Protein-tyrosine Kinases Inhibitors as Anticancer Drug* LIU Zhen-kai 1,AI Jing 2,GENG Mei-yu 1,2△ （1Marine drug and food Institute,Ocean university of China,Qingdao,266003,China;2Shanghai Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Sciences,Shanghai,201203,China ） ABSTRACT:Protein tyrosine kinases (PTKs)have long been recognized as promosing therapeutic targets involved in a variety of human diseases and in particular several types of cancer.They play important roles in regulating intracellular signal transduction path-ways closely associated with the invasion,metastasis and angiogenesis of many tumors.An effort towards the development of new and more effective PTK inhibitors represents an attractive therapeutic strategy for cancer therapy.In this paper,we review the screening and evaluation methods of small-molecule inhibitors of PTKs with a view to promote the study of PTKs. Key words:Protein-tyrosine kinases;Antitumordrugs;Small-molecule inhibitors;Inhibitors screening Chinese Library Classification （CLC ）:R730.5R915Document code:B Article ID:1673-6273(2010)16-3134-04 *基金项目：国家杰出青年科学基金资助（No 30725046） 作者简介：刘振凯（1983-），男，硕士。研究方向：分子药理学。E-mail ：lzkai111@https://www.wendangku.net/doc/6f15532303.html, △通讯作者：耿美玉（1963-），研究员、博士生导师。E-mail ：mygeng@https://www.wendangku.net/doc/6f15532303.html, (收稿日期:2010-05-07接受日期：2010-06-01) 恶性肿瘤是严重威胁人类生命和健康的疾病。目前，临床上常用的抗肿瘤药物主要是细胞毒类药物，这类药物大多存在难以避免的选择性差、毒副作用强、易产生耐药等缺点[1]。近年来，随着生命科学研究的飞速发展，恶性肿瘤细胞内的信号转导、 细胞周期的调控、细胞凋亡的诱导、血管生成以及细胞与胞外基质的相互作用等各种基本过程正在被逐步阐明，给抗肿瘤药物的研发理念带来了巨大转变。以一些与肿瘤细胞分化增殖相关的细胞信号转导通路的关键酶/蛋白作为药物靶点，筛选发现选择性强、高效、低毒的新型抗癌药物已成为当今抗肿瘤药物研究开发的重要方向[2]。 蛋白酪氨酸激酶是一类具有酪氨酸激酶活性的蛋白质，它们能催化ATP 分子上的γ-磷酸基转移到底物蛋白的酪氨酸残基上，使其发生磷酸化。酪氨酸激酶分为受体型和非受体型两种。受体酪氨酸激酶是一种单次跨膜蛋白，目前至少已有近六十种分属20个家族的受体酪氨酸激酶被识别。不同的受体酪氨酸激酶和配体结合后，受体自身发生二聚化或结构重排，并进一步使受体胞内区特异的酪氨酸残基发生自身磷酸化或交叉磷酸化，从而激活下游的信号转导通路[3]。它们在信号由胞外转导至胞内的过程中发挥重要的作用。而非受体酪氨酸激酶是一种胞浆蛋白，现已经确认的有约30种，分为10大家族。蛋白酪氨酸激酶在细胞信号转导通路中占据了十分重要的地位， 调节细胞生长、分化、死亡等一系列生理生化过程。蛋白酪氨酸激酶功能失调则引发生物体内一系列疾病。大量资料表明，超过50%的原癌基因和癌基因产物都具有蛋白酪氨酸激酶活性，它们的异常激活或过度表达将导致细胞无限增殖，周期紊乱，最终导致肿瘤的发生发展[4]。 同时，酪氨酸激酶调控异常还与肿瘤的侵袭、 转移，肿瘤新生血管生成，肿瘤化疗抗性等密切相关。事实上，以酪氨酸激酶为靶点进行抗肿瘤药物的开发已成为国际研究的前沿。 1酪氨酸激酶抑制剂的开发策略 目前酪氨酸激酶抑制剂的开发策略主要分为胞外、胞浆和核内三个层面：细胞外策略主要是针对于受体型，配体与受体的生物拮抗剂以及特异性抗体，通过拮抗配体和受体的相互作用，抑制酪氨酸激酶的激活[5]；胞浆内策略主要分为抑制激酶区的激酶活性和拮抗酪氨酸激酶与其下游信号分子的相互作用两个方面[6]；核内策略主要是利用miRNA 降解或者干扰酪氨酸激酶的mRNA ，抑制激酶的蛋白表达而达到抑制激酶活性的目的[7,8]。其中研究最多的是抑制激酶区激酶活性的小分子抑制剂，而本文也主要是针对这部分抑制剂的研究方法进行探讨。酪氨酸激酶的自磷酸化过程和催化下游信号分子磷酸化的过程都涉及到ATP 上磷酸基团的转移，这一反应过程是酪氨酸 3134··
HMG-CoA还原酶抑制剂-他汀类药物的作用及机制研究
HMG-CoA还原酶抑制剂-他汀类药物的作用及机制研究 他汀类药物作为 HMG-CoA 还原酶抑制剂 , 能有效降低低密度脂蛋白(LDL) 中胆固醇水平 , 从而大大减少了致命性和非致命性心血管疾病事件的发生。本文就心血管疾病的发病机制 , 以及他汀类药物对心血管疾病的治疗作用等方面进行概述。 心血管疾病又称为循环系统疾病 , 泛指由于高脂血症、血液黏稠、动脉粥样硬化、高血压等所引起的一系列涉及循环系统疾病 , 主要包括冠心病、心绞痛、心肌梗死、高血脂和运动猝死等疾病。 1心血管疾病的发病机制 心血管疾病种类较多 , 大多数都与动脉粥样硬化密切相关。其发病机制可能如下：①高脂血、NO 等因素使血管内壁细胞损伤 , 导致血管壁通透性改变 , 大量脂质透过内皮细胞深入内皮细胞间隙。进而引发内膜增厚、脂质沉积、细胞浸润、中膜平滑肌细胞向管腔转移和增殖等症状。②细胞外基质增生和出现泡沫细胞 , 使动脉壁变成糜粥样结构。 他汀类降脂药为细胞内胆固醇合成限速酶 , 即 3- 羟基 -3- 甲基戊二酰辅酶 A( HMG-CoA) 还原酶的抑制剂 , 是目前临床上应用最广泛的一类降脂药物, 常用的有辛伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、阿托伐他汀、匹伐他汀和氟伐他汀等。 2他汀类药物的结构 他汀类药物的化学结构大致分为三部分：一是与天然底物 HMG-CoA 类似的 3, 5- 二羟基庚酸结构片段 ( 在辛伐他汀和洛伐他汀结构中 , 与天然底物 HMG-CoA 类似的是 3-羟基戊内酯环 , 给药后在体内开环转化为有效的羟基酸 ), 它是他汀类药物的药效团；二是以共价键与 3, 5- 二羟基庚酸相连接的疏水性环状结构 , 它在药物与还原酶的结合中起着重要作用；三是疏水性环状结构上的取代基 , 它们决定药物溶解性和药动学性质。 3他汀类药物的降胆固醇作用 HMG-CoA 还原酶是人体胆固醇合成过程中的关键酶之一 , 他汀类药物具有与其天然底物 HMG-CoA 类似的结构片段 , 与 HMG-CoA 还原酶有着更高的亲和性 , 能够竞争性抑制 HMG-CoA 还原为甲羟戊酸 , 从而减少胆固醇的合成量。上调肝细胞膜上 LDL 受体数目 , 增加的 LDL 受体介导的 LDL 和 IDL( 中间密度脂蛋白 ) 的清除 , 从而使 LDL 和VLDL( 极低密度脂蛋白 ) 的合成下
谷胱甘肽转移酶抑制剂筛选方法一
谷胱甘肽转移酶（GST） 还原型谷胱甘肽占绝大多数。 谷胱甘肽转移酶 (GST) 是广泛分布于哺乳动物、植物、鸟类、昆虫、寄生虫及微生物体内的一组多功能同工酶。GST是由23-29KDa的不同亚基构成的同源二聚体，每一类GST同工酶中组成的亚基种类有多种，因此编码GST同工酶的基因是一个巨大的超基因家族。 GST主要功能是催化某些内源性或外来有害物质(过氧化物、α, β2不饱和醛酮、烷基或芳香基化合物)的亲电子基团与还原型谷胱甘肽的巯基偶联，增加其疏水性使其易于穿越细胞膜，分解后排出体外，从而达到解毒的目的，有抑制细胞癌变的功能。 通常认为，谷胱甘肽转移酶的作用是催化谷胱甘肽与外来的或内在的有害物质亲电结合排出体外而起到解毒的作用，但是对于治疗癌症药物的研究主要是针对能够抑制谷胱甘肽转移酶（GST）活性的酶抑制剂，而不是GST催化解毒作用。 研究表明，GST的酶活性水平与肿瘤的耐药性密切相关心。因此，GST可能是治疗耐药肿瘤的潜在药物作用靶点。 与GSTs相关疾病有：人类癌症包括胃癌，结肠癌，胰腺癌和肺癌动脉粥样硬化和冠心病。 近年来对GST抑制剂的研究越来越多，研究报道的GST抑制剂主要有：依他尼酸（EA）及其类似物、TLK199及其类似物、黄酮类化合物、双功能基化合物，还有其他一些抗虐药物如乙嘧啶和奎尼丁等等。 抗肿瘤药物与GSH作用模式图：
图中GST-∏是人体内一种Ⅱ相代谢酶，其对肿瘤的耐药作用主要由其解毒功能引起， 其作用机制：①催化谷胱苷肽(GSH)与亲电子药物如各种烷化剂结合，增加其水溶性，加速其排泄而使药效减低；②清除葸环类药物等产生的自由基，减轻药物自由基对细胞的损伤； ③通过直接与药物结合的形式降低药物活性等。 机理解释：图中是一个肿瘤细胞，当治疗肿瘤的药物顺铂进入细胞时，GST就会催化谷胱甘肽GSH与顺铂结合而将其排出体外，所以为了加强药效，就需要使GST的功能受到抑制，GST 抑制剂占据GST酶活性位点，使GST无法催化GSH与顺铂结合，这样就会降低抗肿瘤药物的耐药性。 筛选方法： 方法一：比色法 在该酶的抑制剂筛选中，采用比色法直接测定底物浓度，主要依据产物有紫外或可见光的特征吸收，通过测定反应体系的OD值变化，测定酶和抑制剂的活性。 实验原理：1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）与谷胱甘肽（GSH）在谷胱甘肽转移酶(GST)的作用下生成复合物CDNB-SG,该化合物在340nm 下呈现最大的光吸收值，根据加入样品前后酶活性的变化情况测定样品对GST的抑制活性。 实验材料： 试剂：还原型谷胱甘肽；1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）；次氯酸钠溶液；待筛选样品。 仪器：SpectraMax M5 型连续光谱酶标测试仪；Costar 384孔微板。
常用的五大类降脂药
For personal use only in study and research; not for commercial use 常用的五大类降脂药高脂血症根据发生异常改变的血脂成分的不同，可分为以下四 种：1.单纯性高胆固醇血症（正常人的血总胆固醇应低于5.2mmol/L，如超过 5.7mmol/L，即可诊断为高胆固醇血症）。2.单纯性高甘油三酯血症（指血甘油三酯 超过1.7mmol/L）。3.混合型高脂血症（指既有血浆胆固醇水平升高，又有血浆甘油 三酯水平升高）。4.低高密度脂蛋白血症（高密度脂蛋白小于40mg/dl）。目前 ，在临床上常用的降脂药物有许多，归纳起来大体上可分为五大类。 1 他汀类 三甲基戊二酰辅酶A（HMG－CoA）还原酶抑制剂，即胆固醇生物合成酶抑制剂（他 汀类药物），是细胞内胆固醇合成限速酶，即HMG－CoA还原酶的抑制剂，为目前临床 上应用最广泛的一类调脂药物。由于这类药物的英文名称均含有“statin”，故常
简 称为他汀类。现已有5种他汀类药物可供临床选用：（1）洛伐他汀（lovastatin ），常见药物有美降之、罗华宁、洛特、洛之特等，血脂康的主要成分也是洛伐他汀 。（2）辛伐他汀（simvastatin），常见药物为舒降之、理舒达、京必舒新、泽之浩 、苏之、辛可等。（3）普伐他汀（pravastatin），常用药有普拉固、美百乐镇。（4）氟伐他汀（fluvastatin），常见药有来适可。（5）阿托伐他汀（atorvastatin ），常见药为立普妥、阿乐。他汀类药物是目前治疗高胆固醇血症的主要药物。 该类药物最常见的不良反应主要是轻度胃肠反应、头痛。与其他降脂药物合用时可能 出现肌肉毒性。 2 贝特类贝特类药物的主要适应症为：高甘油三酯血症或
酪氨酸酶抑制剂的研究进展
龙源期刊网 https://www.wendangku.net/doc/6f15532303.html, 酪氨酸酶抑制剂的研究进展 作者：张启勤 来源：《科技资讯》2015年第18期 摘要：酪氨酸酶在黑色素的生物合成过程中起着关键性的作用，是黑色素合成的限速 酶，该酶决定了哺乳动物皮肤、头发的颜色。部分色素沉着性疾病，如皮肤病，如黄褐斑、雀斑等，是由于过量水平的黑色素在表皮沉积而形成。因此，可以选择应用酪氨酸酶抑制剂，通过抑制酪氨酸酶的活性，阻断黑色素的合成反应链，减少其在皮肤内的生成，从而达到祛斑增白的效果。近年来，由于其在化妆品领域的广泛应用，使得不断有更新更有效的酪氨酸酶抑制剂得到研究并开发。 关键词：酪氨酸酶抑制剂植物来源人工合成 中图分类号：Q356.1 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2015）06（c）-0200-02 酪氨酸酶（Tyrosinase），又称多酚氧化酶，是一种含铜金属酶，广泛存在于细菌、真菌、裸子植物、被子植物、哺乳动物等生物中，并存在于生物界系统发育阶段的各个水平。一般认为，羽毛，毛发，眼睛，昆虫表皮，种子等呈现出黑色、褐色、浅黄色等色素，都是酪氨酸酶作用的结果。酪氨酸酶在不同的生物中具有各异但却都很重要的功能。酪氨酸酶兼有单加氧酶和氧化酶双重功能，是生物体内参与黑色素（melanin）合成的关键酶。酪氨酸酶催化L-酪氨酸最终形成黑色素是一个非常复杂的过程。黑色素的合成途径一般被分为两个阶段：远端步骤和近端步骤。近端步骤包括单酚和/或邻-二酚的酶氧化，由含铜酪氨酸酶催化形成邻醌；远端步骤包括化学反应和酶反应，最终合成黑色素。 酪氨酸酶抑制剂作为黑色素祛除剂可以在皮肤美白化妆品具有重要作用，因此，可以通过酪氨酸酶的活性抑制实验来确定这些美白剂。 酪氨酸酶抑制剂的来源非常广泛，不仅有天然产物，而且有很多是人工合成化合物。如表1和表2所列，这些化合物在抑制酪氨酸酶单酚酶酶活的同时也抑制了二酚酶的酶活。 1 植物来源的酪氨酸酶抑制剂 众多的具有生物活性、副作用小的化合物来源于植物。如表1所示，很多植物源的天然产物对酪氨酸酶活性具有抑制作用，并且这些化合物的抑制能力及其抑制类型不尽相同。 1.1 高等植物来源的酪氨酸酶抑制剂 多酚类化合物，如单宁酸，广泛的存在于自然界中，与花的颜色有关。一些存在于植物中的树皮、根和叶子的多酚类化合物结构复杂，另一些存在于新鲜水果、蔬菜和茶叶中多酚类化合物结构却相对简单。酪氨酸酶强抑制剂黄酮类化合物，如4’，5，7-三羟基黄酮、槲皮素、
葡萄糖苷酶抑制剂筛选方法
葡萄糖苷酶抑制剂筛选方法 α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类以延缓肠道碳水化合物吸收而达到治疗糖尿病的口服降糖药物。其作用机制为：竞争性抑制位于小肠的各种α-葡萄糖苷酶，使淀粉类分解为葡萄糖的速度减慢，从而减缓肠道内葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖。 α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选的原理是：对-硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(pNPG)作反应底物；该底物是无色的。经α-葡萄糖苷酶水解后可以释放出对-硝基苯酚(pNP)，pNP在碱性条件下是黄色的，因此可以通过测定410nm处的吸光度反应出pNP的浓度(吸光度与pNP浓度成正比关系)。吸光度越小，说明pNP的浓度越小，即酶被抑制的程度越大。 设不加样品时，测得的吸光度为c0, 加样品后测的吸光度为c1. 那么酶的抑制率可通过1-c1/c0计算出来。 一实验试剂： α-Glucosidase(α-葡萄糖苷酶)、4Nitrphtnylα-D-glucopyranoside(4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷)（PNPG）、Acarbose(阿卡波糖) 均购自Sigma公司，无水Na2CO3、Na2HPO4、KH2PO4等, 均为分析纯。水为超纯水。苦瓜提取物。 二实验器材： Bio Tek酶标仪、电子天平、Eppendorf的移液器、pH计、酶标板、恒温水浴器 三实验方法： （一） 试剂配制 （1）pH值6.8的0.1 mol/L磷酸缓冲液 分别配制0.1 mol/L Na2HPO4和KH2PO4(13.6 g配成1L)，用这两种溶液混匀互调pH 值至6.8即得0.1 mol/L磷酸缓冲液 （2）用pH值6.8的0.1 mol/L磷酸缓冲液配制0.26 U/mlα-Glucosidase （3）底物(PNPG)用pH值6.8的0.1 mol/L磷酸缓冲液配制成浓度为5 mmol/L (1.505mg/ml) （4）反应终止液：0.2 mol/L Na2CO3。 （5）阳性药的配制：精密称取阿波卡糖样品，以磷酸缓冲液为溶剂溶解，配成10 mg/ml 的浓度。 （二） 实验方法 1. 各浓度药液按每孔50 μL加入酶标板，每浓度设三复孔。另设一药物对照孔、空白反应孔及空白对照孔。然后向药物反应孔和空白反应孔加入50 μL 0.26 U/mL的 -葡萄糖苷酶，其他组加50 μL 磷酸缓冲液，经此步骤后，各孔的组成为： 药物反应孔：50 μL药液+ 50 μL酶 药物对照孔：50 μL药液+ 50 μL磷酸缓冲液 空白反应孔：50 μL磷酸缓冲液+ 50 μL酶 空白对照孔：50 μL磷酸缓冲液+ 50 μL磷酸缓冲液 上述反应体系在微型振荡器上震荡30秒，置于恒温37 o C水浴中孵育10min。
蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP_1的中药抑制剂筛选
第46卷 第6期吉林大学学报(理学版) Vol .46 No .6 2008年11月JOURNAL OF J I L I N UN I V ERSI TY (SC I E NCE E D I TI O N ) Nov 2008 蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP 21的中药抑制剂筛选 李婉南1 ,李 莹1 ,庄 妍1 ,李 贺1 ,陈颖丽2 ,赵志壮 1,3 ,付学奇 1 (1.吉林大学生命科学学院,长春130012;2.吉林省中医药科学院,长春130021; 3.美国俄克拉荷马大学健康科学中心,俄克拉荷马城73104,美国) 摘要:用含有蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP 21催化结构域(ΔSHP 21)的质粒转化大肠杆菌,得到 ΔSHP 21的高效表达,经分离纯化后,以ΔSHP 21为靶标,通过体外酶反应动力学实验,对157种中药水提液的抑制效果进行研究,筛选出两种对ΔSHP 21具有显著抑制作用的中药:山茱萸和蒲公英,并对其I C 50及抑制类型做了进一步研究.为建立蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂的筛选方法和中药在治疗免疫疾病和糖尿病上的开发和应用提供了理论依据.关键词:包含SH2结构域的蛋白质酪氨酸磷酸酶1(SHP 21);中药;抑制剂;筛选中图分类号:Q55 文献标识码:A 文章编号:167125489(2008)0621211206 Screen i n g Traditi onal Chi n ese M edi ci n es for I nhi bitors of Prote i n Tyrosi n e Phosphat ase SHP 21 L IW an 2nan 1 ,L I Ying 1 ,ZHUANG Yan 1 ,L I He 1 ,CHEN Ying 2li 2 ,ZHAO Zhi 2zhuang 1,3 ,F U Xue 2qi 1 (1.College of L ife Sciences,J ilin U niversity,Changchun 130012,China; 2.A cade m y of Traditional Chinese M edicine and Herbs of J ilin P rovince,Changchun 130021,China; 3.Health Sciences Center ,O klaho m a U niversity,O klaho m a C ity 73104,USA ) Ab s trac t:W ith pT7as a vect or,ΔSHP 21,a recombinant p r otein containing the catalytic domain of p r otein tyr osine phos phatase SHP 21,was highly exp ressed in E .coli cells .The enzy me was further purified t o near homogeneity .W ith the purified recombinant enzy me as a target,aqueous extracts of 157traditi onal Chinese herb medicines were analyzed f or their abilities t o inhibit SHP 21.T wo most potent inhibit ors,na mely,cornel and dandeli on,were identified,and their I C 50values and inhibit ory types were further analyzed .This study thus established a good syste m t o screen inhibit ors of SHP 21and de monstrated the potential of traditi onal Chinese medicines in treat m ent of i m munol ogical diseases and diabetes . Key wo rd s:SH22containing tyr osine phos phatase 1(SHP 21);traditi onal Chinese herb;inhibit or;screening 收稿日期:2008201215. 作者简介:李婉南(1975～),女,汉族,博士,讲师,从事蛋白质酪氨酸结构与功能的研究,E 2mail:wyshshk@https://www.wendangku.net/doc/6f15532303.html,.联系人:付学奇(1960～),男,汉族,博士,教授,博士生导师,从事细胞信号传导与药物筛选的研究,E 2mail:fxq@jlu .edu .cn . 基金项目:吉林省科技发展计划项目基金(批准号:20060563;200705394;20080434). 蛋白质酪氨酸磷酸酶(Pr otein Tyr osine Phos phatase,PTPs )与蛋白质酪氨酸激酶(Pr otein Tyr osine Kinases,PTKs )协同作用,控制着蛋白质酪氨酸的磷酸化过程,调节细胞生长发育,并在细胞信号传导过程中发挥重要作用 [1] ,许多生理和病理现象都与此相关 [2] .研究表明,一些疾病如某些癌症、糖尿 病、白血病、免疫缺陷病、努南氏综合症等正是由于PTPs 的基因突变或异常表达导致的[3,4] ,因此 PTPs 已经成为继PTKs 之后又一个热门的研究领域.SHP 21(SH22Containing Tyr osine Phos phatase 1),又称为HCP,SHPTP1或PTP1C,是含有SH2结构域的具有高度保守序列的蛋白质酪氨酸磷酸酶的亚家
酶抑制剂类抗糖尿病药物的分子水平筛选方法研究进展
酶抑制剂类抗糖尿病药物的分子水平筛选方法研究进展 张海枝，刘鹏，李川，刘长鹰 天津药物研究院天津市新药设计与发现重点实验室，天津 300193 摘 要：酶抑制剂类抗糖尿病药物是目前药物研究的热点，而药物筛选技术是制约此类抗糖尿病新药研发速度的关键步骤。主要从分子水平总结近年来报道的与糖尿病相关的酶抑制剂类候选药物的筛选方法，包括传统方法和前沿方法，着重介绍极具潜力的毛细管电泳法、质谱法、生物传感法和微通道筛选方法等。 关键词：抗糖尿病药物；酶抑制剂；分子水平；药物筛选方法 中图分类号：R977.3 文献标志码：A 文章编号：1674 - 5515(2014)08 - 0947 - 06 DOI: 10.7501/j.issn.1674-5515.2014.08.028 Research progress on drug screening methods at the molecular level for enzyme inhibitors used as anti-diabetic drugs ZHANG Hai-zhi, LIU Peng, LI Chuan, LIU Chang-ying Tianjin Key Laboratory of Molecular Design and Drug Discovery, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300193, China Abstract: Various enzyme inhibitors have been demonstrated to be a hotspot in the research area of anti-diabetic drugs, whose development has been greatly limited by the efficiency of diverse drug screening methods. This paper concerns on different types of drug screening methods in the molecular level for enzyme inhibitors used in diabete treatment, including both traditional and advanced methods. Importantly, several screening methods with great potential have been emphasized here, such as capillary electrophoresis, mass spectrometry, biosensors, screening methods based on microchannel and so on. Key words: anti-diabetic drugs; enzyme inhibitors; molecular level; drug screening methods 糖尿病是全世界发病率最高的疾病之一，是一种与胰岛素产生和作用异常相关、以高血糖为主要特征的代谢性疾病。现有报道证实，体内参与血糖调节的多种酶已经成为抗糖尿病药物作用的关键靶点，可为研制治疗糖尿病的药物提供新途径。以靶标酶为作用对象的酶抑制剂可有效抑制血糖的升高，减缓糖尿病并发症的发生和发展，是抗糖尿病药物研发的希望所在[1-2]。目前报道的可用于治疗糖尿病的酶抑制剂包括α-葡萄糖苷酶抑制剂、醛糖还原酶（AR）抑制剂、一氧化氮合酶（NOS）抑制剂、血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂、基质金属蛋白酶（MMPs）抑制剂、蛋白质酪氨酸磷酸酶1B （PTP-1B）抑制剂、果糖-1,6-二磷酸酶抑制剂、磷酸二酯酶（PDE）抑制剂、环氧酶-2（COX-2）抑制剂、二肽基肽酶-Ⅳ（DPP-Ⅳ）抑制剂等[3]。 近年来，组合化学的快速发展已经解决了酶抑制剂类候选药物的大批量合成问题，而如何快速高效准确地筛选出此类抗糖尿病新药是药物研发中的关键难题。现有报道中关于酶抑制剂类候选药物的筛选方法较多，根据所选用的材料和药物作用的对象以及操作特点，可将这些方法大致分为4个水平：整体动物水平、组织器官水平、细胞水平和分子水平。其中，基于分子水平的酶抑制剂类药物筛选方法具有反应体积小、筛选速度快、药物作用机制明确，可实现大规模筛选等优点，在药物筛选方面具有广阔的应用前景。基于此，本文详细综述了酶抑制剂类抗糖尿病药物的分子水平筛选方法，力图为此类药物的高通量筛选提供借鉴和参考，以期提高抗糖尿病新药的研发速度。目前文献中报道的与糖尿病相关的酶抑制剂类药物分子水平筛选方法主要 收稿日期：2014-06-28 作者简介：张海枝（1985—），女，湖北黄冈市人，博士，助理研究员，研究方向为分析化学。Tel: (022)23006859 E-mail: zhanghz@https://www.wendangku.net/doc/6f15532303.html,
mTOR抑制剂的筛选方法
mTOR抑制剂的筛选方法 【摘要】雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是是丝氨酸/苏氨酸激酶分子靶位。mTOR是细胞生长增生的中心调控者，直接或间接参与细胞生长增生有关环节的调控。人体多种肿瘤细胞中可见mTOR通路的失调。近年来，有关mTOR抑制剂的专利申请不断增加，设计、合成、筛选结构新颖的mTOR抑制剂已经成为抗肿瘤药物研发的重大课题。本文就mTOR的结构功能、信号转导通路及mTOR抑制剂的筛选方法进行简单的介绍。 【关键词】雷帕霉素靶蛋白雷帕霉素靶蛋白抑制剂药物筛选 TOR(target of rapamycin，雷帕霉素靶蛋白)是一类进化上非常保守的蛋白激酶家族，广泛存在于各种生物细胞中。 1994年，Brown等证实并克隆了哺乳动物TOR基因，其产物只有一种蛋白，即mTOR(mammalian target of rapamycin，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)。mTOR属P13K蛋白激酶类家族，是P13K／PKB信号通路下游的一个效应蛋白，其底物主要控制与细胞生长和增殖密切相关的蛋白质的合成。mTOR控制细胞内mRNA的翻译，参与膜蛋白转运，蛋白质降解，蛋白激酶C信号转导和核糖体合成等一系列生理病理过程。 1.mTOR的分子结构 mTOR分子结构复杂，由2 549个氨基酸残基组成，分子中有数个各自独立而保守的结构域，类似于酵母中TOR的结构。mToR分子的氨基端存在20个串联重复序列，每一个重复序列包含2个分别由40个氨基酸残基组成的α螺旋，每个螺旋都有一个亲水基团和一个疏水基团。这种重复结构介导蛋白质之间的相互作用，并有利于mTOR定位于浆膜。 mTOR分子羧基端的中部是蛋白激酶域，结构和P13K激酶的催
常用的五大类降脂药
常用的五大类降脂药 高脂血症根据发生异常改变的血脂成分的不同，可分为以下四种：1.单纯性高胆固醇血症（正常人的血总胆固醇应低于5.2mmol/L，如超过5.7mmol/L，即可诊断为高胆固醇血症）。2.单纯性高甘油三酯血症（指血甘油三酯超过1.7mmol/L）。 3.混合型高脂血症（指既有血浆胆固醇水平升高，又有血浆甘油三酯水平升高）。 4.低高密度脂蛋白血症（高密度脂蛋白小于40mg/dl）。 目前，在临床上常用的降脂药物有许多，归纳起来大体上可分为五大类。 1 他汀类 三甲基戊二酰辅酶A（HMG－CoA）还原酶抑制剂，即胆固醇生物合成酶抑制剂（他汀类药物），是细胞内胆固醇合成限速酶，即HMG－CoA还原酶的抑制剂，为目前临床上应用最广泛的一类调脂药物。由于这类药物的英文名称均含有“statin”，故常简称为他汀类。 现已有5种他汀类药物可供临床选用：（1）洛伐他汀（lovastatin），常见药物有美降之、罗华宁、洛特、洛之特等，血脂康的主要成分也是洛伐他汀。（2）辛伐他汀（simvastatin），常见药物为舒降之、理舒达、京必舒新、泽之浩、苏之、辛可等。（3）普伐他汀（pravastatin），常用药有普拉固、美百乐镇。（4）氟伐他汀（fluvastatin），常见药有来适可。（5）阿托伐他汀（atorvastatin），常见药为立普妥、阿乐。 他汀类药物是目前治疗高胆固醇血症的主要药物。该类药物最常见的不良反应主要是轻度胃肠反应、头痛。与其他降脂药物合用时可能出现肌肉毒性。 2 贝特类 贝特类药物的主要适应症为：高甘油三酯血症或以甘油三酯升高为主的混合型高脂血症。目前临床应用的贝特类药物，主要有环丙贝特、苯扎贝特、非诺贝特及吉非贝齐。据临床实践，这些药物可有效降低甘油三酯22％～43％，而降低TC 仅为6％～15％，且有不同程度升高高密度脂蛋白的作用。该药常见的不良反应为胃肠反应、恶心、腹泻，严重者可导致肝损害。 3 烟酸类 烟酸类药物属B族维生素，当用量超过其作为维生素作用的剂量时，可有明显的降脂作用。该类药物的适用范围较广，可用于除纯合子型家族性高胆固醇血症，及I型高脂蛋白血症以外的任何类型高脂血症。但是，该药的速释制剂不良反应大，我们一般不单独应用。对于烟酸的降脂作用机制，目前医学界尚不十分明确。缓释制剂大大减少，主要为颜面潮红。 4 胆酸螯合剂 这类药物也称为胆酸隔置剂。有考来烯胺（Cholestyramine），常用药物有降胆宁。该药常见的不良反应为胃肠反应、恶心、便秘或腹泻，肠梗阻或头痛等。
酶反应与酶抑制剂
酶反应与酶抑制剂 2．1 酶反应 酶是生物体内化学反应的催化剂，象细菌这样简单的生物，细胞内大约有3000种酶，分别催化3000种不同化学变化。 在生命活动中，有时在瞬间要消耗巨大能量。动物在原野奔腾追逐，禽鸟在高空展翅翱翔，伴随着肌肉迅速收缩，需要代谢反应迅速进行，将储存的能量高速释放，酶在这里起提高反应速率的催化作用。如果没有酶的帮助，我们一次进餐得化上50年的时间才能消化完毕，而在酶的帮助下，要不了几个小时，肚子又饿了。糖或脂肪氧化会产生能量，把糖或脂肪放在空气里燃烧，氧化作用很快完成，热量一下释放出来。这样的反应如果在体内进行，放热产生高温，会损伤机体。因此，在生命活动中，氧化作用必须缓慢进行，以便最有效地利用能量；同时热量必须温和地放出，以便长期保持一定的体温。所以代谢分解必须和燃烧有所不同，代谢分解每步反应由不同的酶催化。我们摄取食物后消化，由一系列酶催化分解，酶由体内各个部分分泌。唾液和胰腺分泌淀粉酶，化解淀粉；胃分泌蛋白酶；肠分泌蛋白酶和糜蛋白酶，水解蛋白质。肠还释放脂酶，水解脂肪，于是食物从大分子分级分解成小分子。当食物变成单糖，氨基酸，脂酸后，便在肠壁吸收，渗入到血流，运输到各种组织。 当食物代谢分解释放的能量有盈余时，酶的催化作用又促使产生一些化学物质，把能量暂时储存起来，而当需用时，又可迅速释出。例如三磷酸腺苷（A TP ）即为能量储存物质，分子内有3个磷酸基，在分解而裂去一个磷酸基时，可释出33千焦能量，变为二磷酸腺苷（ADP ）。同样，二磷酸腺苷再水解，脱去一个磷酸基，变成单磷酸腺苷，又可释出33千焦能量，但单磷酸腺苷再水解脱去最后一个磷酸基时，只释出12.5千焦能量。 2.2 青霉素 许多药物的作用机理，在于抑制酶的催化作用，从而干扰生命活动。这种药物的结构，可能与酶反应的底物的结构相似。青霉素和头孢菌素的抑制细菌作用，是由于干扰细菌合成细胞壁。细菌依赖着细胞壁保护其细胞，细胞壁由一些多糖链和多肽链交织而成。在交织构成过程中，一条包括由D －丙氨酰－D －丙氨酸二肽的链加到一条有几个甘氨酸组成的肽链上，这加成反应由转肽酶与羧肽酶所催化。青霉素和头孢菌素的构象和D －丙氨酰－D －丙氨酸的构象十分相象，因之青霉素正好适应D －丙氨酰－D －丙氨酸在酶上的作用部位。而药物与酶分子作用部位的结合，意味着占有这部位而排斥了丙氨酸二肽的结合，这样就干扰了肽链的交织，从而阻止了细胞壁的构成，于是危及细菌的生长。这作用称为代谢拮抗（Biological antagonism ），丙氨酸肽链是代谢物，青霉素是拮抗物。拮抗物（ Antaganist ）与代谢物（Metabilite ）间存在一定构象关系。青霉素和头孢菌素的半合成类似物中，也存在类似构效关系，只有构象与前述青霉素或D －丙氨酰－D －丙氨酸相似的，才有抑菌作用。 S C H 3C H 3 N C O C O O H C O N H R C H 3N H C O O H C O N H 2 C H 3 A －P －P －P +H 2O P －O H +33K g A －P －P +H 2O A －P A －P ++P －O H P －O H +33K g H 2O +12.5K g A++A －P －P
HMG-CoA还原酶抑制剂研究进展
HMG-CoA还原酶抑制剂的研究进展 关键词：HMG-CoA还原酶抑制剂他汀类构效关系降血脂药 HMG-CoA还原酶即3-羟基-3-甲基戊二肽辅酶A(3-Hydroxy-s-Methylglutary-Coenzyme)，简称HMGR，是胆固醇生物合成的限速酶。它是降血脂药物设计的重要靶标，抑制该酶的活性可以有效地降低血浆总胆固醇(Choleterol.CH)水平，从而降低罹患心脑血管疾病的几率[1]。HMG-CoA还原酶抑制剂（HMGRI）是一类新型降血脂药物，对HMG-CoA有抑制作用。以他汀类药物为代表，具有选择性好、疗效高、副作用少，是目前临床应用最广、疗效最好、深受广大医生和患者好评的降血脂药。 1.HMG-CoA还原酶抑制剂的分类 目前已上市的HMG-CoA还原酶抑制剂（他汀类）有洛伐他汀(Lovastatin)、辛伐他汀(Simvastatin)、普伐他汀(Pravastatin)、阿托伐他汀(Atovastatin)、氟伐他汀(Fluvastatin)、长效氟伐他汀缓释片、西立伐他汀(Cerivastatin)，由于其严重的横纹肌溶解副作用已从市场撤销。最新上市的有罗苏伐他汀(Rosuvastatin)、匹伐他汀(Pitavastatin)。其中，匹伐他汀是一个潜在的“超级他汀”，低剂量降LDL-C疗效与十倍剂量的阿托伐他汀相似，且对糖尿病合并高胆固醇血症的患者更为有效[2]。 依据他汀类药物的来源的化学结构[3],将来源于微生物培养基、培养液的美伐他汀及其衍生物的洛伐他汀、辛伐他汀和普伐他汀作为第1代他汀类药物,将人工合成的含氮杂环和氟苯环的氟伐他汀、阿托伐他汀视为第2代他汀类药物。 2.HMG-CoA还原酶抑制剂的作用机制[4] 人体胆固醇来源于体内的生化合成和从饮食中摄入，前者约占人体胆固醇的70%—80%。所以降低胆固醇的方法除了注意饮食外，更重要的是抑制其在体内的合成。由于HMG-CoARI与HMG-CoA还原酶底物结构相似，可以竞争结合该酶的活性中心，并抑制其活性，而阻止细胞内胆固醇的合成，从而降低血降胆固醇浓度。 在血浆中低密度脂蛋白（LDL）水平过高时，巨噬细胞等由于摄入了经氧化变性的LDL，变成泡沫细胞，这是动脉硬化的原因，所以为了防止动脉硬化，希望降低血中的LDL、IDL （中密度脂蛋白）和VLDL（极低密度脂蛋白）的水平，增加HDL（高密度脂蛋白）的水平。HMG-CoARI能降低肝细胞内胆固醇的浓度，使血中除去更多的LDL，最终使LDL减少。而LDL 的减少受LDL受体的控制，其受体的浓度又受细胞内胆固醇浓度的调节，所以人肝细胞内胆固醇浓度降低则刺激LDL受体的合成，促使LDL进入肝细胞从而降低血中LDL水平。 3.他汀类药物的结构类型[5] 洛伐他汀以内酯型结构应用，本身无活性，口服后在肝脏内易水解出有活性的β羟酸发挥作用。噻伐他汀为人工半合成的强效HMGR抑制剂，它的化学结构和药理特性与洛伐他汀相似，属前体药物与HMGR的亲和力是洛伐他汀的2倍，所以抑制体内胆固醇的合成效果略强于洛伐他汀。普伐他汀是以美伐他汀为原料经真菌进行微生物转化而制得的HMGR 抑制剂，其活性高于M，但低于L和P。[4] 4.他汀类药物的构效关系[6] HMG-CoA还原酶抑制剂的基本结构见图2，其构效关系分为母环、连接链和侧链3个部分讨论。
甾体5α-还原酶抑制剂
Steroidal 5α-Reductase Inhibitors: A Comparative 3D-QSAR Study Review 甾体5α-还原酶抑制剂：一项类比性的三维定量构效关系(3D-QSAR)研究报告Suresh Thareja* （作者姓名） School of Pharmaceutical Sciences, Guru Ghasidas Central University, Bilaspur, Chhattisgarh 495 009, India 医药科学院，古鲁加思达斯中央大学，比拉斯普尔市，恰蒂斯加尔邦495009，印度 CONTENTS 目录 1. Introduction简介2883 2. Historical Aspect of Published 2D-QSAR Studies 已发布的二维定量构效关系（2D-QSAR）的历史概况2884 3. Current Aspect of 3D-QSAR Studies 三维定量构效关系研究的目前情况2885 4. 3D-QSAR Methodology Employed for Steroidal 5α-Reductase Inhibitors 甾体5α-还原酶抑制剂的三位定量构效关系的研究方法论2885 4.1. Selection of Data Sets and Inhibitory Activities 数据集和抑制活性数据精选2885 4.2. Selection of Training and Test Sets 实验和练习册精选2885 4.3. Molecular Modeling and Alignment 分子建模和校正2886 4.4. 3D-QSAR Models 三维定量构效关系模型2886 4.5. Statistical Analyses 统计学分析2886 5. Results and Discussion of 3D-QSAR Studies on Steroidal 5α-Reductase Inhibitors 甾体5α-还原酶抑制剂的三维定量构效关系研究的结论和研讨2886 5.1. Finasteride Analogues (4-Azasteroids) As Inhibitors of Steroidal 5α-Reductase-II 非那雄胺类似物（4-氮杂类甾醇）作为甾体5α-还原酶-II的抑制剂2886 5.2. Epristeride Analogues (3-Carboxysteroids) As Inhibitors of Steroidal 5α-Reductase-II依立雄胺类似物（3-羧基甾体化合物）作为甾体5α-还原酶-II的抑制剂2888 5.3. Pregnane Derivatives As Inhibitors of Human Steroidal 5α-Reductase-II孕烷衍生物作为人类的甾体5α-还原酶-II的抑制剂2888 5.4. 6-Azasteroids As Dual Inhibitors of Both Isoforms of Steroidal 5α-Reductase 6-氮杂类甾醇作为甾体5α-还原酶-II的两个亚型的双重抑制剂2888 6. Conclusions结论2890 Author Information 作者信息2892 Corresponding Author 联系人2892 Notes 注解2892 Biography 档案2892 Acknowledgments 特别感谢2892 References 参考文献2892 1. INTRODUCTION 简介 良性前列腺增生（BPH）是由于其机制增生和前列腺的腺体元素造成的非癌前列腺增长。其结果是近端尿道梗阻，从而导致了尿流紊乱①。这是由雄激素双氢睾酮（DHT）的增强水平导致的，这种激素在前列腺生长中起到了重要作用。 甾体5α-还原酶(EC 1.3.99.5)是一种细胞核核膜结合酶，它能在NADPH的辅助下将内源性睾酮（T）转化为双氢睾酮。②DHT 在这些组织中刺激细胞增长，因此造成了中老年人体中的前列腺迅速肥大。我们针对使用5α-还原酶抑制从T到DHT的转换过程所提出的化学机理，涉及到了酶和NADPH之间的二元复合物的形成。紧接着的是以T为基层的三元复合物的形成。③甾体5α-还原酶在提升DHT含量的许多情境和恶疾中都扮演着重要角色，包括前列腺增生症，前列腺癌，多毛症，痤疮和男性秃顶。④ 甾体5α-还原酶有两种亚型，也就是I 型和II型，存在于人类和老鼠的互补DNA