生物分离工程解析
第一章绪论
一生物分离工程的特点是什么？
1 发酵液或培养液是产物浓度很低的水溶液
2 培养液是多组分的混合物
3 生化产品的稳定性差
4 对最终产品的质量要求高
二生物分离工程可分为几大部分，分别包括哪些单元操作？
三在设计下游分离过程前，必须考虑哪些问题方能确保我们所设计的工艺过程最为经济、可靠？
1 采用步骤数最少
2 次序要相对合理
3 适应产品的技术规格
4 生产规模
5 进料组成
6 产品形式、产品的稳定性、物性
7 环保和安全要求
8 生产方式
第二章细胞分离与破碎
一如何预处理发酵液?
1. 高价无机离子的去除方法
去除钙离子：通常使用草酸。但由于草酸溶解度较小，不适合用量较大的场合。
去除镁离子：加入三聚磷酸钠，与镁离子形成络合物。
用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。例如：环丝氨酸的提取。
去除铁离子: 加入黄血盐，使其形成普鲁士蓝沉淀而除去。
2 杂蛋白质的除去
(1) 沉淀法盐析调节pH→pI
(2) 吸附法加入吸附剂或沉淀剂
(3) 变性法加热，大幅度调节pH，加有机溶剂或表面活性剂等。
(4) 凝聚Coagulation和絮凝flocculation 目前工业上最常用的预处理方法之一。常用于菌体细小而且粘度大的发酵液的预处理。
3. 有色物质的去除及其他
(1) 使用吸附剂去除有色物质 离子交换剂、离子交换纤维、活性炭等
(2) 用工业酶制剂可净化发酵产物，除去干扰性浑浊物 淀粉酶：不溶性多糖 单糖 (3) 使用惰性助滤剂 硅藻土、纸浆、珍珠岩等
(4) 加入反应剂 环丝氨酸发酵液用CaO 和H3PO4处理
二 凝聚和絮凝的区别
凝聚：向胶体悬浮液中加入电解质，由于双电层电位降低，使胶体体系不稳定，胶体粒子间因相互碰撞而产生凝集（1mm 左右）的现象。常用的凝聚剂有：Al2(SO4)3.18H2O ，AlCl3.6H2O ，FeCl3，ZnSO4，MgCO3
絮凝：指在某些高分子絮凝剂存在下，在悬浮粒子之间发生架桥作用而使胶粒形成粗大（10mm ）的絮凝团的过程。
三 滤饼的重量比阻rB
表示单位滤饼厚度的阻力系数，是衡量过滤特性的主要指标。
对于不可压缩滤饼，比阻值为常数，但对于可压缩滤饼，rB = f （p ）。
如忽略过滤介质的阻力，恒压下的过滤速率方程式为：
22B B p q r X ?τ
=
μ q — 到瞬间τ，通过单位过滤面积的滤液量，m3/m2；
⊿p —操作压差，Pa ； τ —过滤时间，s ； μ — 滤液黏度，Pa.s;
rB — 滤饼的重量比阻,m/kg;
XB — 通过单位体积滤液所形成的滤饼干重,kg/m3;
在不同时间τ测定滤液量,根据过滤面积就可得q 值。以q 为横轴，τ /q 为纵轴作图，所得
直线获得斜率（M ）。2B B
r X q Mq q p τμ=?=?
2B B M p
r X ?=
μ
四 了解常用固-液分离设备及其特点 1 板框式压滤机
优点：结果简单、价格低廉、过滤面积大。
缺点：不能连续操作、劳动强度大、滤液澄清度不高。 2 鼓式真空过滤机
优点：能连续操作，实现自动化控制，适用于处理量大而固体含量较多的滤浆。 缺点：压差较小，不适用于滤饼阻力较大的物料。 3 错流过滤
优点：过滤速度快。
缺点：固液相的分离不太完全。
五 常用的细胞破碎方法, 了解机械破碎法所用设备 1. 机械破碎
1) 高压匀浆法 设备：高压匀浆器 2) 珠磨 设备：珠磨机
3）撞击破碎 设备：撞击破碎器
4）超声波破碎设备：超声波探头
2. 非机械法
1）酶溶法①外加酶法②自溶法
2）化学法①酸碱处理②化学渗透法3）物理法①渗透压冲击法②冻融法
第三章初级分离
一常用的蛋白质沉淀方法有哪些？
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多价金属离子
聚电解质
非离子型聚合物
特殊沉淀剂
热沉淀
其他沉淀法
有机溶剂沉淀
等电点沉淀
盐析沉淀
沉淀法
二比较Ks盐析法和β盐析法
Ks盐析法由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。
β盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化。
三影响盐析的主要因素有哪些？
(一) 无机盐种类(二) 温度和pH值(三) 蛋白质浓度
四用乙醇沉淀蛋白质时应注意哪些事项？
⑴温度：温度越低，沉淀越完全。－10℃
⑵乙醇浓度：乙醇浓度上升，蛋白质溶解度下降。
⑶pH值：pI
⑷蛋白质浓度：应避免使用很稀的浓度，蛋白质在高浓度下比较稳定。
五泡沫分离定义、原理和操作过程影响因素
定义：泡沫分离是以气泡为介质，利用组分的表面活性差进行分离的一种方法。
原理：利用待分离物质本身具有表面活性或能与表面活性剂结合，在泡沫柱中被吸附在气泡表面，得以富集，气泡上升带出溶剂主体，达到净化主体液、浓缩待分离物质的目的。
影响因素：A 料液性质溶液的pH值、离子强度和其他添加剂
B 表面活性剂浓度不宜超过临界胶束浓度
C 操作条件温度应达到表面活性剂的起泡温度气体流速
D 泡沫柱
第四章膜分离
一何谓膜分离？主要有哪几种膜分离方法？
膜分离的定义：利用具有一定选择性透过特性的过滤介质进行物质的分离纯化。
方法：微滤、超滤、反渗透、透析、电渗析、渗透气化
二膜分离技术有何优缺点？
优点：1 易于操作。常温下可连续使用,可直接放大，易于自动化。
2 成本低，寿命长。维护方便，能耗少。
3 效率高，特别适宜于热敏感物质分离浓缩。
4 无相转变，分离精度高，没有二次污染。
缺点：1 价格高。2 易污染。3 应用受限制。
三分析比较微滤、超滤和反渗透的异同点。
四理解概念：水通量，截留分子量，截留曲线，浓差极化，凝胶极化
水通量：在一定条件下（一般压力为0.1MPa，温度为20℃) ，单位时间透过单位膜面积的纯水体积。（m3 m-2 h-1）
截留分子量：一般将在截留曲线上截留率为0.90的溶质分子量定义为膜的截留分子量。
截留曲线：膜的截留率与溶质分子量之间关系的曲线。
浓差极化：膜分离操作中，不能完全透过膜的溶质受到膜的截留作用，在膜表面附近浓度升高，高于料液主体浓度的现象。
凝胶极化：当膜表面附近的浓度超过溶质的溶解度时，溶质会析出，形成凝胶层。
五影响截留率、膜分离速度的因素有哪些？
影响截留率：溶质分子量
分子特性不同分子截留率大小顺序：球形＞带支链＞线性；
对于荷电膜，与膜相反电荷的分子截留率较低；
若膜对溶质有吸附作用，截留率增大。
其他高分子溶质的影响其他高分子溶质的存在使溶质截留率增大。
操作条件温度升高，膜表面流速增大，截留率降低；pH=pI时，蛋白质的截留率高于其他pH下的截留率。
影响膜分离速度:操作方式、流速、压力、料液浓度
六膜分离设备按膜组件形式可分为几种？相比较的优缺点？
1 管式膜组件优点：结构简单，适合于处理悬浮物含量较高的料液，清洗比较容易；
缺点：造价高，比表面积很小。
2 平板式膜组件优点：保留体积小，比表面积较大，液流稳定。
缺点：造价较高，操作方式为间歇式，主要用于小规模的分离纯化。
3 螺旋卷式膜组件优点：比表面积大，结构简单价格较便宜, 换新膜容易；
缺点：处理悬浮物浓度较高的料液时易堵塞，难清洗。
4 中空纤维（毛细管）式膜组件
优点: 比表面积最大,可方便地进行反洗，造价低，工业上普遍使用
缺点：易堵塞，对料液要求高
七膜污染有哪些途径造成？如何有效防止和清除膜污染？
造成膜污染的主要原因：1凝胶极化现象引起的凝胶层；2溶质在膜表面的吸附；3膜孔堵塞；4膜孔内的溶质吸附。
防止：料液的预处理、改善膜的性质、改变操作条件
八试论述反渗透在工业中的应用。
1培养基除菌；2发酵液中细胞的收集或除去；3细胞破碎后碎片的除去；4目标产物部分纯化后的浓缩或洗滤除去小分子溶质；5最终产品的浓缩和洗滤除盐；6制备无热原水等。
第五章萃取
一分配定律及其适用条件是什么？
一定温度、压力下，溶质在互不相溶的两相中达到分配平衡时，如果其在两相中的相对分子质量相等，则其在两相中的平衡浓度之比为常数,即分配常数A。A=C2/C1 其中：C2为萃取相溶质浓度；C1为萃余相溶质浓度。
适用条件：（1）必须是稀溶液;（2）溶质对溶媒之互溶没有影响；（3）溶质必须是同一种分子类型，不发生缔合或离解。
二理解概念：反萃取化学萃取带溶剂乳化HLB
反萃取：调节水相条件，将目标产物从有机相转入水相的操作。
化学萃取：利用脂溶性萃取剂与溶质的化学反应生成脂溶性复合分子，使溶质向有机相分配。带溶剂：能和欲提取的生物物质形成复合物而易溶于溶剂中，此复合物在一定条件下又容易分解。
乳化：一种液体成细小液滴（分散相）分散在另一不相混合的液体（连续相）中形成的分散体系的现象。
HLB：亲憎平衡值，表示表面活性剂的亲水与亲油程度的相对强弱。
三水相物理条件如何影响溶剂萃取操作？
1 pH值物理萃取时，弱酸性电解质的分配系数随pH降低(即氢离子浓度增大)而增大，而弱碱性电解质则正相反。
2 温度生化产物一般在室温或较低温度下进行。
3 无机盐无机盐可使产物在水中溶解度降低，而易于转入有机溶剂中；还能减少有机溶剂在水中的溶解度。
4 带溶剂能和欲提取的生物物质形成复合物而易溶于溶剂中，此复合物在一定条件下又容易分解。
四发酵液乳化现象是如何产生的？对分离纯化产生何影响? 如何有效消除乳化现象？
乳化现象产生的本质是因为表面活性物质的存在，蛋白质是引起发酵液乳化的表面活性物质。
影响：
消除：1）过滤和离心分离2）加热3）稀释4）加电解质5）吸附法6）顶替法7）转型法
第五-三章双水相萃取
一理解概念：相图双线结构系线临界点交错分配法
二双水相体系可分为哪几类？目前常用的体系有那两种？
高聚物/高聚物体系（分子间斥力）聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dx）
高聚物/无机盐体系（盐析作用）PEG/硫酸盐或PEG/磷酸盐
三双水相萃取的影响因素有哪些？
第五-四章
一名词解释：液膜、流动载体
液膜：是悬浮在液体中很薄的一层乳液微粒。它能把两个组成不同而又互溶的溶液隔开，并通过渗透现象起到分离的作用。
流动载体：在膜相中加入可溶性的萃取剂，在液膜内选择性迁移待分离的物质。
二液膜的组成和分类?
液膜通常是由溶剂、表面活性剂和添加剂制成。
溶剂构成膜基体；表面活性剂起乳化作用，它含有亲水基和疏水基，可以促进液膜传质速度并提高其选择性，添加剂用于控制膜的稳定性和渗透性。
三流动载体必须具备的条件？
溶解性络合性载体不与膜相的表面活性剂反应
四液膜萃取机理分类?
单纯迁移反萃相化学反应促进迁移膜相载体输送
第五-五章反胶团萃取
一临界胶团浓度、反胶团
临界胶团浓度：是胶团形成时所需表面活性剂的最低浓度，用CMC来表示，这是体系特性，与表面活性剂的化学结构、溶剂、温度和压力等因素有关。
反胶团：两性表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水基团自发地向内聚集而成的，内含微小水滴的，空间尺度仅为纳米级的集合型胶体。
二反胶团形成的条件，反胶团和胶团的比较
形成条件：
比较：胶团：表面活性剂的极性头朝外，疏水的尾部朝内，中间形成非极性的“核”
反胶团：表面活性剂的极性头朝内，疏水的尾部向外，中间形成极性的“核”
三影响反胶团萃取蛋白质的主要因素
第五-六章 超临界流体萃取 一 超临界流体的性质
超临界流体密度接近液体，溶解能力与液体相近；低黏度、高扩散系数易流动。
二 理解概念：夹带剂
在纯流体中加入少量与被萃取物亲和力强的组分，以提高其对被萃取组分的选择性和溶解度，添加的这类物质称为夹带剂。
三 超临界流体萃取的基本过程
(1)依靠压力变化的萃取分离法(等温法) (2)依靠温度变化的萃取分离法(等压法) (3)用吸附剂进行的萃取分离法(吸附法)
四 阐述超临界流体萃取的优缺点
优点：1) 超临界萃取同时具有液相萃取和精馏 的特点。
2) 超临界流体萃取的独特的优点是它的萃取能力取决于流体的密度，而密度很容易通过调节温度和压力来加以控制。
3) 超临界流体萃取中的溶剂回收很简便，并能大大节省能源。
4) 超临界流体萃取工艺可以不在高温下操作，因此特别适合于热稳定性较差的物质。同时产品中无其他物质残留。
5) 超临界流体萃取的操作压力可根据分离对象选择适当的萃取剂或添加夹带剂来控制以避免高压带来的影响。 缺点：超临界流体萃取的主要缺点是由于高压带来的高昂设备投资和维护费用，所以目前应用面不宽。
第六章 吸附和离子交换
一 什么是离子交换？离子交换树脂的结构﹑类型﹑命名和工作过程？
利用离子交换剂作为吸附剂，通过静电引力将溶液中带相反电荷的物质吸附在离子交换剂上，然后用合适的洗脱剂将吸附物从离子交换剂上洗脱下来，达到分离的目的。 结构：具有三维空间立体结构的网络骨架 联接在骨架上的活性基团
活性基团所带的相反电荷的活性离子（可交换离子） 类型：（1）阳离子交换树脂：含-SO3H 或-COOH 。a.强酸性：含-SO3H 等强酸性基团b. 弱
酸性：含-COOH和酚羟基-OH。
（2）阴离子交换树脂：结合有季胺基、伯胺基、仲胺基、叔胺基的聚合物。a.强碱性：含季胺基-NR3’OH。b. 弱碱性：含伯胺基-NH2、仲胺基-NHR’、叔胺基-NR2’。
按骨架结构不同，离子交换树脂可分为凝胶型和大孔型树脂。
a 凝胶树脂：吸附无机离子等
b 大孔树脂：吸附大分子有机物
命名：离子交换树脂的全名称：分类名称、骨架名称、基本名称组成。
001×7 强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂交联度为7 (凝胶型)
D201 大孔型强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂
工作过程：
二离子交换选择性受哪些因素影响？
1）离子水化半径无机离子的水化半径越小，越易被吸附。
2）离子化合价低浓度溶液中树脂优先吸附高价离子
3）溶液的pH （1）弱酸性树脂在碱性下吸附力强
（2）弱碱性树脂在酸性下吸附力强
（3）强酸强碱树脂吸附不受pH影响
（4）交换物为弱酸，弱碱或两性物质pH影响电离度或电荷
4）有机溶剂不利于有机离子吸附，而易吸附无机离子。
5）树脂物理结构: （1）交联度大﹑膨胀度小的树脂选择性好。
（2）利用交联度不同将大分子与小离子分开（分子筛法）。
6）树脂与交换离子之间的辅助力氢键：磺酸基树脂吸附青霉素范德华力
三膨胀床吸附的操作过程？
第七章色谱
一色谱法阻滞因子分离度排阻极限
色谱法：利用混合物中的溶质在固定相和流动相之间分配行为的差别引起的随流动相移动速度的不同进行分离的方法。
阻滞因子(Rf)：溶质移动速度（距离）与流动相移动速度（距离）比值。
分离度(Rs)：两个相邻洗脱峰之间的距离与两个峰宽的代数平均值之比。Rs=1~1.5良好分离排阻极限:指不能扩散到凝胶基质内部的最小分子的分子量。
二 色谱法的特点、分类 特点：分离效率高 可选操作参数多 应用范围广 高灵敏度的在线快速检测 分离过程自动化操作
分类：??
?????????????
??
??超临界流体
固定相
层以固体为载体的液体薄液体固体液相气相流动相
三 简述凝胶色谱、色谱聚焦、羟基磷灰石色谱的工作原理？
凝胶色谱：利用凝胶粒子（凝胶过滤介质）为固定相，根据料液中溶质相对分子质量的差别进行分离的液相层析法。
色谱聚焦：利用蛋白质分子或其他两性分子等电点的不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH 梯度中进行蛋白质的分离纯化。 羟基磷灰石色谱：在中性pH 环境下酸性蛋白质（pI ＜7 ）主要吸附于C 点，碱性蛋白质（pI ＞7）主要吸附于P 点。利用磷酸盐缓冲液（K2HPO4＋KH2PO4）为流动相洗脱展开时，磷酸根离子在C 点竞争性吸附，交换出酸性蛋白质，而K ＋在P 点竞争性吸附，交换出碱性蛋白质。
四 IEC （离子交换色谱）操作为什么很少采用恒定洗脱?
1蛋白质的分配系数对离子强度非常敏感，即离子强度的微小改变，引起分配系数的很大变化；
2在同一离子强度下不同蛋白质分配系数可能相差非常大。
3若采用离子强度不变的流动相进行恒定洗脱，不同蛋白质的洗脱体积相差很大，甚至分配系数大的蛋白质很难洗脱，造成洗脱剂的大量消耗和洗脱时间的大幅度增加。
五 HIC （疏水性相互作用色谱）操作中影响疏水性吸附的因素有哪些? 离子强度及种类 破坏水化作用的物质 表面活性剂 温度
第八章 亲和色谱
一 影响亲和作用的因素
离子强度pH 抑制氢键形成的物质 温度 离液离子 螯合剂
二 配基 特异性洗脱与非特异性洗脱 配基：将亲和体系中的一种分子与固体粒子共价偶联，可特异性结合另一种分子(目标产物)，使其从混合物中高选择性地分离纯化。一般将被固定的分子称为其亲和结合对象的配基（ligand ），用L 表示。 特异性洗脱：利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，脱附目标产物。
非特异性洗脱：非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH 值、离子强度、离子种类或温度等理化性质降低目标产物的亲和吸附作用，是使用较多的洗脱方法。
三 亲和色谱操作步骤
1进料 2杂质清洗 3目标产物洗脱 4色谱柱再生
四膜亲和过滤方法的两个分支及原理?
1）亲和膜分离技术以亲和膜为亲和吸附介质纯化目标产物的分离方法，是亲和色谱的变型。又称亲和膜色谱
2）亲和错流过滤又称亲和过滤（affinity filtration）或亲和超滤（affinity ultrafiltration），是生物亲和相互作用与膜分离相结合的生物大分子的分离纯化技术。
第九章电泳
一聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子筛效应
凝胶中的大分子分离取决于它的电荷、尺寸和形状。凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力（size sieving capacity），这种现象被称为分子筛效应（molecular sieving effect）。
二SDS-PAGE 的原理
蛋白质分子的解聚
三试阐述等速电泳的浓缩作用原理
四等电聚焦技术的关键?
利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。
利用等电聚焦技术分离、分析的对象仅限于蛋白质和两性分子。
五双相电泳
第一相IEF（等电点）第二相SDS－PAGE（分子大小）
目的：为了获得更详细的组分信息
第十章蛋白质复性
蛋白质常用的复性方法有哪些?
1稀释复性与透析复性2色谱复性
第十一章结晶
一结晶的三个过程？结晶的首要条件是什么?
1 过饱和溶液的形成：结晶的首要条件
2 晶核的形成
3 晶体生长
二过饱和溶液的形成有哪几种方法？
自然冷却间壁冷却（冷却剂与溶液隔开）直接接触冷却（在溶液中通入冷却剂）
三晶体质量包括哪三个方面的内容？
晶体大小、形状和纯度
四结晶法与沉淀法的比较？
第十二章干燥
一喷雾干燥的优缺点
喷雾干燥的优点：
1）干燥时间短，对热不稳定性产品的性质影响小。
2）成品的定性指标（平均密度、颗粒直径、含水率和温度）可以调节和改变。
3）成品在大多数的情况下，不需要进一步磨粉而具有很好的溶解度。
4）有很高的生产能力，维护保修简单。
缺点：雾化和成品分离设备昂贵和复杂；成品损耗大；能耗增加，干燥后产品密度小，包装体积增加。
二冷冻升华干燥的定义、操作过程及应用
定义：将湿物料在较低的温度（-10℃～-50℃）下冻结成固态，然后在高度真空（1～0.001mmHg）下将其中水分不经液态而直接由固态升华成气态而脱水的干燥过程。
操作过程：1. 预冻 2. 升华干燥 3. 解吸附干燥
应用：