绿色荧光蛋白的基因克隆及表达

绿色荧光蛋白的基因克隆和表达研究

（湖北师范学院生命科学学院生物科学0802班湖北黄石435002）

摘要：目的：研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。方法：通过分别将DH-5α (pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入E.coli DH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸内切酶Not I与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL-21内进行表达，再用IPTG 诱导GFP基因表达，可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。结果：结果显示构建的重组质粒pET-28a-GFP在E.coli中成功表达。关键词：绿色荧光蛋白；质粒重组；原核表达；诱导表达

中图分类号：Q53

Studies On Cloning and Expression of Green Fluorescent

Protein gene

Abstract: Objective:Studies indicated that the cloning and expression of the GFP gene in the E.coli. Methods:Extract the plasmid of the DH-5α(pEGFP-N3) and DH-5α(pET-28a). Then cutting by enzyme and connecting the two plasmids to form pET-28a-GFP recombined plasmid. The recombinant plasmid confirmed by restriction enzyme and PCR transfected into E.coli DH-5α to ensure the expression of green fluorescent protein. Guiding the recombined plasmid, which contains exogenous genes of GFP into E.coli for expression, through transformative method. The expression of GFP gene can be induced by the IPTG and then we can see green. Results: The results suggest that pET-28a-GFP recombined plasmid has successfully expressed in E.coli. Keywords: G ed Fluorescent Protein; Recombined Plasmid; Prokaryote Expression; Induced Expression

绿色荧光蛋白的基因克隆和表达的研究

引言

随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用, 人们根据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过与染色体基因组进行稳定整合，将生物性状传递给子代动物的研究方兴未艾[1]。

基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白[2]。

2008 年10 月8 日，瑞典皇家科学院把今年的诺贝尔化学奖授予绿色荧光蛋白的发现者和推广者。他们分别为日本科学家下村修(Osamu Shimomura)、美国科学家马丁·查尔菲(Martin Chalfie)和钱永健(Roger Tsien)[3]。1962 年，下村修等分离纯化了水母中发光蛋白水母素，并发现一种绿色的荧光蛋白。1974 年，他们分离得到了这个蛋白，当时称绿色蛋白，以后称绿色荧光蛋白(GFP)[4]。1994年，查尔菲等首次在大肠杆菌细胞中表达了能发射绿色荧光的GFP，开创了GFP 研究与应用之先河[5]。

绿色荧光蛋白( green fluorescent p rotein, GFP)是238个氨基酸组成的单体蛋白，其分子量为27 kDa。GFP作为一种新的报告基因，与以往lacZ、CAT 等报告基因相比，有很多无可比拟的优越性: GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；荧光强度高，稳定性高；不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光,尤其适用于体内的即时检测；另外GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒

害,安全可靠；并且通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。正是由于GFP 检测具有高灵敏度，操作简单，无需使用同位素等优点，近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域[ 6～7]。采用GFP 作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段[ 8、9 ]。采用基因工程手段生产GFP 标记的方法，可建立一种简便、快速的免疫诊断技术[10]。

质粒转化进入大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞是分子克隆的关键步骤[11]，是基因克隆以及DNA文库构建等研究中频繁使用的一项重要的常规操作。一般实验室没有电穿孔技术所需要的特殊仪器，而利用氯化钙法将质粒重组入大肠杆菌细胞，操作方便、应用广泛.目前, 感受态细胞的制备主要采用CaCl2法，该方法操作简单、容易掌握、重复性好、转化率高，可广泛应用于一般的实验室。其原理是Ca2+ 破坏细胞膜上的脂质阵列，并与膜上多聚羟基丁酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物以利于外源DNA 的渗入[12]。

PCR 技术是Kary Mullis 在1985 年建立起来的在细胞体外合成DNA 的一种方法。依DNA 半保留复制原理，利用DNA聚合酶依赖于DNA 模板的特性，在附加的两个引物与模板杂交之后，按碱基配对原则经酶促反应合成DNA 片段，包括模板变性、引物退火及用DNA聚合酶延伸两个引物之间DNA 的一定次数的重复循环，使包括在两个引物5'端限定的特异性片段形成指数式积累。整个过程操作简单，可在短时间内在小管中获得大量的特意的DNA 拷贝，这一特点使PCR 技术很快被应用到了分子生物研究的广大领域[13]。

大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景

清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点[14]。而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30 %，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统[15]。大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统,大肠杆菌由于遗传背景清楚、易操作,以及有大量可供选择的克隆或表达载体,使之成为人们克隆表达外源基因的主要菌株[16]。

随着人们对原核和真核生物基因调控的了解，通过综合控制基因转录、翻译、蛋白质稳定性及向胞外分泌等诸多方面的因素，构建出了多种具有不同特点的表达载体和工程菌株，以满足表达不同性质、要求的目的基因的需要。在原核细胞中表达蛋白质的载体常用启动子有T7启动子、Trp 启动子-色氨酸启动子、Tac启动子、T7噬菌体中基因10 的启动子及Lac 启动子等。Lac启动子受分解代谢系统活化蛋白和cAMP的正调控和阻遏物的负调控，当加入乳糖或某些类似物IPTG可与阻遏蛋白形成复合物，使阻遏蛋白构型改变，阻遏蛋白不再能与操纵基因结合，从而使结构基因表达。根据原核生物基因表达特点选着载体进行目的基因克隆，然后转入相应的菌种中表达目的蛋白质[17]。

研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

克隆菌E.coli DH-5a、表达菌BL-21为本实验室收藏菌种，质粒pET-28a 和pEGFP-N3，引物，限制性内切酶Bam H1、Not Ⅰ购自大连宝生物工程有限公司。

1.1.2 仪器设备

SIM-f140 SANYO Ice Maker(made in Japan)

Eppendof离心机5430R（Made in Germany）

电泳仪（DYY-12型，北京市六一仪器厂）

电子天平（AB204-N 型，Mettler-Toleda Group）

台式离心机（TGL-16C型，上海安亭科学仪器厂）

控温磁力搅拌器（HJ-3型，江苏金坛市金南仪器厂）

调温电热套（KDM型，武汉精华科教仪器有限公司）

pH计（雷磁PHS-3C型，上海精密科学仪器有限公司）

冰箱（BCD-208K/A NCJN型，青岛海尔股份有限公司）

台式冷冻恒温振荡器（THZ-C-1型，太仓市实验设备厂）

手提紫外灯（WD-9403E型，北京市丰台区造甲街128号）

生物洁净工作台（BCM-1000型，苏州净化设备有限公司）

电热恒温水温箱（SHW 21-420型，湖北省黄石市恒丰医疗器械有限公司）

琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、

移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、Parafilm膜、离心管

1.1.3 试剂及溶液

50×TAE电泳缓冲母液（50 mL）

Tris-碱12.1 g

冰醋酸 2.85 mL

0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 5 ml

6×DNA电泳缓冲液

溴酚蓝0.25 %

蔗糖水溶液40%（W/V）

液体LB培养基（pH7.0）

胰蛋白胨10 g/L

酵母提取物 5 g/L

NaCl 10 g/L

NaOH(1 mol/L) 1 mL/L

分装后于121 ℃高压灭菌20 min。（LB固体培养基是在液体LB中加琼脂粉至1 %）；

溶液Ⅰ50 mL

葡萄糖50 mmol/L

Tris-Cl (pH 8.0) 25 mmol/L

EDTA (pH 8.0) 10 mmol/L

121℃高压灭菌15 min后置于0~4℃贮存；

溶液Ⅱ100 mL

NaOH 0.2 mol/L

SDS 1% (W/V)

用时由母液2 mol/L NaOH、10%(W/V) SDS稀释现配；

溶液Ⅲ100 mL

KOAc (5 mol/L) 60 mL

冰乙酸11.5 mL

H2O 28.5 mL

121 ℃高压灭菌15 min后置于0~4 ℃贮存；

氯仿；

琼脂糖；

灭菌的去离子水；

10×酶切缓冲液；

TaqDNA聚合酶；

TaqDNA聚合酶缓冲液；

灭菌的0.1 mol/L CaCl2

标准相对分子质量的DNA；

溴乙锭（EB）储存液0.5 μg/mL；

LB/Kan（50 μg/mL）固体培养基；

IPTG配成浓度为400 mM水溶液，-20 ℃保存备用；

卡那霉素（Kan）配成浓度为100 ug/mL水溶液，-20 ℃保存备用；

70%乙醇：用新开装的乙醇和灭菌无离子水配成，放在0~4 ℃；

无水乙醇（分析纯，武汉市中天化工有限公司）放在0~4 ℃；

RNase 母液：将RNase 溶于10 mmol/L Tris·Cl(pH 7.5)、15 mmol/L NaCl 配成的试剂中，配成10 mg/mL的溶液，在100 ℃加热15 min，使可能溶有的DNase失活，然后缓慢冷却至室温，分装成小份保存于－20 ℃；

1.2 方法

1.2.1 重组质粒的构建

图1重组质粒pET-28a-GFP的构建流程

Fig.1 The formed technological process of pET-28a-GFP recombined plasmid

1.2.2 DH-5α和BL-21感受态细胞的制备

1)将0~4 ℃保存的DH-5α和BL-21菌种分别接种在LB液体培养基中37 ℃下250

r/min过夜培养16 h 。

2)将分别接种过夜菌：LB按1:50的比例接种于2 mL的LB液体培养基中，37 ℃活化

培养2～3 h至OD=0.3～0.5 。

3)取1.5 mL菌液转入EP管中，置于冰上10 min, 然后于4 ℃下5000 r/min离心5 min。

弃上清液，沉淀加入0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2缓和悬菌。冰上放置15-30 min 后，4 ℃下5000 r/min离心10 min。

4)弃上清液，沉淀用0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2（含15%甘油）缓和悬菌，放在

－20 ℃冰箱内保存。

1.2.3 感受态细胞的转化

1) 取制备好的感受态细胞100 μl，冰上解冻，均匀悬浮。

2) 加入2 μl酶连产物，轻轻混匀，冰上静置10-30 min。

3) 42 ℃水浴中热击70 sec后，冰上放置2 min。

4) 加入200 μl LB液体培养基，37 ℃，50-100 rpm振荡培养1 h。

5) 取200 μl悬浮细胞涂布在含合适抗生素的LB固体培养基上，用涂布器均匀涂布，平皿正放静置1-2 h后，封口膜封好平皿，37 ℃培养倒置12-16 h。

1.2.4 碱法提质粒

1) 感受态细胞经转化培养后，平皿内有但菌落长出。

2) 用灭菌吸头挑取单菌落，浸没于2 mL含有抗生素的LB液体培养基中，37 ℃, 180 r/min振荡培养过夜。

3) 取1.5 ml 培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4 ℃、11000 r/min 离心1分钟，吸弃上清。

4) 向离心管中加入150 μl用冰预冷的溶液Ⅰ，用微量移液器吹打重悬沉淀。

5) 加入200 μl新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，冰上放置5分钟。

6) 加入150 μl用冰预冷的溶液Ⅲ，轻轻混匀，冰上放置3~5分钟。

7) 用微量离心机于4 ℃、11000 r/min离心5分钟，吸取上清转移到另一离心管。

8) 加等体积氯仿400 μl抽提，振荡混匀，用微量离心机于4 ℃、11000 rpm离心2分钟，将上清转移到另一离心管中。

9) 吸取上清液300 μl，向上清中加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，于室温放置2分钟；用微量离心机于4 ℃、11000 rpm离心5分钟，弃上清。

10) 用70%乙醇洗涤2次，再次4 ℃、11000 rpm离心5分钟，沉淀于空气中干燥。向已干燥的离心管内加20 μl超纯水溶解质粒DNA，加入2 μl 10 mg/ml RNA酶，37 ℃处理1小时后于-20 ℃贮存。

1.2.5 酶切鉴定

1) 取提取的质粒8 μl于另一微量离心管中，加入2 μl Bam H I和Not I的酶切混合液，轻弹管外混匀反应物。

2) 离心，使溶液聚集在管底部。

3) 37 ℃，酶切反应。

1.2.6 琼脂糖凝胶电泳

1) 称取0.8 g琼脂糖，放入到锥形瓶中，加入100 mL 1×TAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全融化，冷却至60 ℃左右。

2) 轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上。

3) 将胶板除去封胶带，加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米，轻轻拔除梳子。

4) 吸取10 μl的质粒与2 μl的上样液混匀，吸取混合液将加入加样孔。

5) 接通电泳槽与电泳仪的电源，设置电泳数据U=100 V, I=30 mA。

6) 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2 cm处，停止电泳。

7) 在凝胶成像分析系统中观察结果。

1.2.7 PCR-聚合酶链式反应

1) 将PCR管放置在冰盒上，按如下表格加入PCR反应体系各成分

PCR反应体系各成分的量

template 0.1 μl

P1(20 mM) 0.2 μl

P2(20 mM) 0.2 μl

dNTPs(10 mM) 0.4 μl

Taqs(5 U/μl) 0.2 μl

10×PCR buffer 2 μl

ddH2O 16.9 μl

Total 20 μl

2) 将PCR管放入PCR仪中，设定PCR仪的循环参数。预变性95 ℃ 3 min，变性95 ℃30 s，退火60-55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min 10个循环，每个循环降0.5 ℃。变性95 ℃30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min 20个循环，72 ℃延伸2 min。

3) PCR扩增完毕后，取出PCP管放在冰盒上。

4) 取8 l扩增后产物，进行琼脂糖电泳检测。

1.2.8 pET-28a-GFP重组质粒转化到表达菌BL-21

1) 取100 μl感受态BL-21，冰上慢速解冻，均匀悬浮。加入2 μl经过酶切鉴定成功提取重组质粒pET-28a-GFP，轻轻混匀，冰上静置10-30 min。

2) 42℃水浴热激70 s，冰上放置2 min。

3) 加入200 μl 含抗生素的LB液体培养基，37 ℃，60 r/min震荡培养30 min。四支EP 管中加入0.5 μl 的100 mM的IPTG诱导，另外EP管中不加入IPTG诱导。

4) 吸取200 μl菌液涂布于含抗生素的LB平板上，用涂布器均匀涂布，平皿正放静置1-2 h后，封口膜封好平皿，37 ℃培养倒置12-16 h。

1.2.9 重组绿色荧光蛋白（GFP）的诱导表达

1) 取GFP重组菌接种于2 ml LB培养液(含Kana 100 mg/l)中，37 ℃150-220 r/min 过夜培养。

2) 将20 μl菌液按1：50—100接种于2 ml LB培养液(含Kana 100 mg/l)中，37 ℃200r/min培养2h。

3）按IPTG: LB培养基按1:1000加入2 μl的IPTG诱导表达，继续培养，对照组不加IPTG诱导。

4）用紫外线照射菌体沉淀，保存照片。

2 结果与分析

2.1 提取质粒

图1 提取质粒时加入各溶液的现象

A. 加入溶液1浑浊；

B. 加入溶液2变澄清；

C. 加入溶液3出现白色絮状沉淀；

D. 加入氯仿抽提溶液分层

2.2 重组质粒构建的鉴定

图2 酶切重组质粒pET-28a-GFP

Fig.2 indentification of pET-28a-GFP plasmid cleavage

Lane1：Marker protein；Lane 2：含目的基因的重组质粒，得到有两条带，可知前面第一条带为GFP基因片段，第二条带为质粒载体，故成功构建了重组质粒pET-28a-GFP。

2.3 PCR检测结果

图3 重组质粒的PCR鉴定

Fig. 3 PCR indentification of pET-28a-GFP

PCR扩增后产物经过电泳检测，可以看到明显的一条亮带，其大小约为750 bp。可知eGFP基因成功连接到pET-28a载体。其前面不明显的弥散的条带为引物二聚体。

2.4 IPTG诱导表达

图4 日光灯和紫外灯下的表达结果

在日光灯和紫外光下，携带重组质粒pET-28a-GFP的大肠杆菌BL-21用IPTG诱导表达后呈现绿色，说明含外源基因GFP的质粒在大肠杆菌BL-21体内成功表达；而没有经IPTG诱导的菌体则不发出绿色荧光。

3 讨论

本实验是一个综合性实验，与我们平时的实验相比对我们的要求更多更严。它主要要求我们形成认真思考的习惯，自己查阅本实验的相关文献，分析本实验的目的，通过本实验要达到什么样的结果，达到预计的结果需要通过怎样的方案实现，根据实验需要和自己的相关了解自己设置适合的实验方案，增强我们的思维能力和动手能力，同时也使我们的团队合作精神得到了提高，并学会把我们所学的知识有机的结合到一起。跟我们平时的实验相比较我们的实验素养可以得到很大的提高，有利于我们今后的学习和研究。通过本次实验我深刻的认识到了，在我们做研究的过程中一定要认真，每一步都不能出错，否则将功亏一篑，从头开始。

实验中重组质粒转化进入E.coli DH 5α中的转化率很低，本组从E.coli DH 5α中提取的质粒共9管，酶切发现有重组质粒存在的只有1管，转化率不高。造成重组质粒转化率不高的原因可能有以下几点：

（1）生长时期：实验发现在对数中期的大肠杆菌易生感受态，转化时菌浓度应控制在不超过107个/ml。浓度过高或者过低都会影响转化效率。（2）CaCl2法0 ℃放置时间的影响：细菌经0 ℃ CaCl2处理后转化率随时间的推移而增加，24 h达到最高，之后转化率逐渐下降。

（3）化合物及无机离子的影响：在钙离子的基础上，联合其他二价金属离子或还原剂等物质处理细菌，可使转化率提高100-1000倍。

（4）质粒大小、构型的影响：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。1 ng超螺旋DNA即可使50 ul 的感受态细胞达到饱和。一般情况下DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。

（5）防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在冰浴低温和无菌条件下进行，所用器皿，如离心管、EP管等均应彻底洗净，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其他试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。

（6）试剂的质量：所用的试剂，如CaCl2等均需是最高纯度的，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。

（7）42 ℃热处理时间很关键，转移速度要快，且温度要准确，同时注意热处理过程中离心管不要摇动。

（8）菌液涂平皿操作时，应避免反复来回涂，因为感受态细胞的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。

在重组质粒转化BL-21 细胞后,在平皿中用IPTG诱导长出菌苔，但未出现单菌落，可能的原因有：（1）菌液没有涂开；（2）涂完后未先正放1h使菌液充分被LB吸收；（3）平皿上有水珠，未除去；（4）摇菌时间过长，菌过多。最后经过IPTG诱导表达，本组中未有一管表达成功，仅有老师的两管表达出绿色的荧光蛋白，表达量很低，可能的原因：（1）在转化过程中，由于操作不当，使重组质粒本身转化进入BL-21的量很少，故经IPTG诱导表达量就很少。（2）pET-28a质粒在菌体中的拷贝数本来就很低，和其他质粒相比量会少一些，可以多摇一段时间，16-18h都可以，略微提高抗生素的浓度，有助于提高拷贝数，加入IPTG后，有助于提高表达量。（3）由于表达菌株BL-21没有end-A突变，质粒的完整性和保真性都不如DH5α，因为裂解时会有大量多糖干扰，质和量都不如DH5α，pET质粒拷贝数很低，故重组质粒转化BL-21的效率相对较低；DH5α是重组酶缺陷型，质粒在细胞内相对稳定，而BL-21为非重组酶缺陷型，转化进入其中的重组质粒不能稳定存在，故GFP诱导表达量就相对较低。

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实验绿色荧光蛋白

生物技术实验报告 姓名：张龙龙 学号：2011506066 班级：11级生技02班

前言：绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水 母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。GFP 由3 个外显子组成，长2.6kb；GFP 是由238 个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27. 0kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由 3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成. 一.实验目的 1、了解表达用基因克隆引物设计的原理和方法。 2、了解利用原核表达系统表达外源基因的原理、流程及方法。 3、掌握PCR、DNA片段的酶切与连接、细菌转化、阳性克隆筛选、质粒提取、DNA样品的纯化、核酸电泳等分子生物学基本技术。 二．实验原理 基因工程一般包括四个步骤：一是取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；三是把重组DNA引入某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。 本实验根据绿色荧光蛋白（GFP）的基因序列设计一对引物，用该引物将GFP基因从含GFP基因的质粒中扩增出来。再利用双酶切切开表达载体pET23b 和目的基因的两端接头，通过T4连接酶GFP基因与表达载体重组。将含GFP 基因的重组表达载体导入宿主菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下，使GFP基因表达 三.实验材料及仪器 1、实验材料：含有GFP的质粒；DNA Marker；DH5α；BL21； 2、仪器：恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、制冰机、台式离心机、涡旋振荡器、冰箱、电泳仪、透射仪、PCR仪、PCR管、刀片、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、吸水纸、微型离心管、台式冷冻离心机、塑料手套、1.5ml离心管。 四.实验内容 4.1 质粒的提取、酶切及电泳鉴定： 1)实验试剂：LB培养基；溶液Ⅰ；Tris-HCl（pH=8）；溶液Ⅱ；溶液Ⅲ； 酚/氯仿抽提液；无水乙醇；电泳缓冲液；加样缓冲液；GoldView核酸 DNA 染色剂；1%的琼脂糖凝胶；XhoⅠ(10U/μl)；NdeⅠ（10U/μl）；T 4 lisase。 2)实验步骤： 质粒的提取与鉴定

绿色荧光蛋白GFP

绿色荧光蛋白GFP综述 生命科学学院 2010级李积锋 1241410007 【摘要】绿色荧光蛋白(GFP) 是一种最先来源于水母的蛋白质，现已成为在生物化学和细胞生物学中研究和开发应用得最广泛的蛋白质之一。其内源荧光基团在受到紫外光或蓝光激发时小峰可高效发射清晰可见的绿光。它已成为一个监测在完整细胞和组织内基因表达和蛋白质定位的理想标记。在生理指示剂、生物传感器、光化学领域以及生产发光纤维等方面展示了广阔前景。 【关键词】水母绿色荧光蛋白生色团变种 1绿色荧光蛋白简介 绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白，当受到紫外或蓝光激发时，发射绿色荧光。其独特之处在于：它产生荧光无需底物或辅因子，发色团是其蛋白质一级序列固有的来源于水母的氨基酸残基组成。 水母的绿色荧光蛋白很稳定，无种属限制，已在多种动植物细胞中表达成功并产生荧光。GFP的荧光受外界的影响较小，另外GFP的检测十分方便，而对细胞的伤害极小。由于这些优点，GFP已经成为检测体内基因表达及细胞内蛋白质原位定位的极为重要的报告分子。 2绿色荧光蛋白的表达和成熟 GFP的表达水平受多种因素的影响。在植物细胞中表达GFP时，改变一些原GFP 基因的密码子为该植物使用的偏爱密码子，并消除潜在的剪接位点。目前适用于哺乳动物的表达系统不受影响。GFP还可以顺利的在无细胞的体外翻译系统中表达并自发折叠。 用一些小体积的氨基酸残基取代大体积残基可以提高GFP在高温下正确折叠的速度。这些突变位点分布于成熟蛋白质三维结构的各个部位，几乎不能提供如

何帮助GFP折叠和成熟的线索。另外，分子伴侣的存在也有助于GFP的折叠，反过来，这个发现也使GFP成为检测分子伴侣功能的一个好底物，因为GFP可以提供一个连续的、无破坏性的检测蛋白折叠成功的分析方法。 3绿色荧光蛋白的应用 3.1报告基因和细胞标记 GFP作为报告分子和细胞标记最明显的优势是无需底物或辅因子参与；无论在活细胞还是在完整的转基因胚胎和动物中，都能有效地监测基因转移的效率。但在这方面的应用中，最大的缺点就是没有放大作用，它不能象酶一样能通过加工无数的底物分子而将信号放大所以一般都需强启动子以驱动GFP基因在细胞内足量的表达也可用亚细胞分辨率的显微成像系统检测基因产物，靶入的基因被限制于一个细胞器内，GFP的浓度则相对提高了许多倍。 3.2融合标记 应用得最多和最成功的是GFP同宿主蛋白构成融合子来监测宿主蛋白的定位 和最后归宿既有荧光又有宿主蛋白原有的正常功能和定位的融合蛋白效果最佳GFP可融合于宿主蛋白的C端或N端，也可插入其内部迄今为止，GFP已成功地靶入了大部分细胞器中，如质膜、细胞核、内质网、高尔基体、分泌小体、线粒体、液泡和吞噬体等。 3.3 其它 GFP分子生色团的坚固外层保护荧光不被熄灭，但同时也降低了GFP分子的荧光对环境的敏感性通过随机重组和基因定向突变得到了多种对环境敏感的GFP，它们可用作环境指示剂如：对PH敏感GFP的可以测定细胞器内的PH值；通过基因工程，可GFP在中插入磷酸化位点以便用磷酸化控制GFP的荧光。另外，最近报道的利用靶入了水母GFP基因的丝蛋白昆虫病毒，感染蚕的幼虫，用改造的基因取代了蚕的正常基因，当蚕吐丝时这种丝是一种能在黑暗中发绿色荧光的纤维。 4应用特点 GFP这一新型报告基因，在短短几年时间内就得到了众多研究者的青睐，其原因就在于它具有以下优点：

绿色荧光蛋白GF基因的克隆表达和粗提取

绿色荧光蛋白G F基因 的克隆表达和粗提取 SANY标准化小组 #QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#

绿色荧光蛋白(G F P)基因的克隆、表达和粗提取 南方医科大学 2011预防医学（卫生检验检疫） 摘要 目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。方法：从 DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞 BL-21中，用LB培养基对转化后的进行扩大培养。用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。 关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取 目录

1 前言 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿

色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。1962 年，下村修等分离纯化了水母中发光蛋白水母素，并发现一种绿色的荧光蛋白。1974 年，他们分离得到了这个蛋白，当时称绿色蛋白，以后称绿色荧光蛋白(GFP)[1] GFP 作为一种新的报告基因，其优点在于①荧光强度高，稳定性高；②GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害，安全可靠；③不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光，尤其适用于体内的即时检测； ④GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；⑤通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域[ 2～3]。采用GFP 作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段[ 4、5 ]。采用基因工程手段生产GFP标记的方法，可建立一种简便、快速的免疫诊断技术[6]。 质粒转化进入大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞是分子克隆的关键步骤[7]，是基因克隆以及DNA文库构建等研究中一项重要的常规操作。目前，感受态 法，该方法操作简单、容易掌握、重复性好、转化率 细胞的制备主要采用CaCl 2 高，可广泛应用于一般的实验室。其原理是Ca2+ 破坏细胞膜上的脂质阵列，并与膜上多聚羟基丁酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物以利于外源DNA的渗入[8]。 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产

南方医科大学分生实验-绿色荧光蛋白(EGFP)的基因克隆

绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆 南方医科大学学院 摘要 本实验旨在学习基因克隆并检验，绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后，把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5α(克隆菌)中，从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。 关键词：绿色荧光蛋白克隆表达 实验名称绿色荧光蛋白的基因克隆 2015- ~ 实验日期 实验地点 2015- 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1.学习使用限制性内切酶进行DNA酶切的原理和方法。 2.学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。 3.掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。 4.学习PCR产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。 5.了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和方 法。

6.掌握双酶切法鉴定重组DNA的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR鉴定重组DNA的基本原 理和方法。 7.掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤 二、实验原理 1.pEGFP-N1质粒 2.T载体

三、材料与方法： 1.实验材料： 质粒：pEGFP-N1 T载体：pUCm-T 菌种：DH5(克隆菌) PCR引物： F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGA R——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTC Tm=56 实验试剂： 即用型蓝白T载体（pMD18-T vector cloning kit） 快速DNA连接试剂盒 限制性内切酶：EcoR I（Fermentas） Axygen质粒提取试剂盒 抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan) X-gal、IPTG等 实验仪器： 超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱，台式高速离心机，大容量冷冻离心机，PCR仪，紫外分光光度计，水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统，制冰机、超低温冰箱等 2.方法 分离目的基因→限制酶切割目的基因与载体→连接重组体→转入受体细胞→筛选重组体、转化子 四、实验具体流程 1.获取外源基因 1)碱裂解法提取质粒 使用Axygen质粒提取试剂盒

红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析 开题报告 于凯

毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校

华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告

癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。 另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取之欧阳歌谷创作

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表 达和粗提取 欧阳歌谷（2021.02.01） 南方医科大学 2011预防医学（卫生检验检疫） 摘要 目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。方法：从 E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞 E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。 关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取

目录 1 前言3 2 实验目的4 3 实验设备4 4 材料及试剂5 5 实验操作步骤5 5.1操作流程5 5.2质粒DNA的分离与纯化6 5.2.1 质粒的培养6 5.2.2 质粒的DNA的碱提取法6 5.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化7 5.3酶切及连接8 5.3.1 双酶切8 5.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收）8 5.3.3 连接9 5.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化9 5.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附 录）9

绿色荧光蛋白在转基因动物中的应用

绿色荧光蛋白在转基因动物中的应用 杨军廷 201141804054 华大基因 摘要来源于水母 (AequoreaVictoria)的绿色荧光蛋白 (Greenfluorescentprotein ,GFP) ,现已成为细胞生物学和分子生物学中应用最广泛的分子标记之一。其内源性荧光基团在受到紫外或蓝光激发时可发 现清晰可见的绿光。由于检测方便 ,对生物体基本没有毒性 ,在很多领域已有取代LacZ ,荧光素酶等传统标记方法的趋势 ,在制作转基因动物过程中更是如此。本文综述了GFP在标记目的基因、筛选阳性胚胎等方面的应 用 关键词绿色荧光蛋白；转基因 在研究基因的表达或蛋白质的定位与时序变化时常用荧光物质或报告基因作为标记。传统的荧光标记是通过纯化蛋白质再共价结合到荧光染料上!此方法难以控制化学剂量和染料附着部位!若该标记蛋白用于活细胞内检测!则难以通过细胞膜。因此，该方法已基本淘汰现在常用的报告基因如荧光素酶（LUX）基因和β-葡萄糖苷酶（GUS）基因也不尽人意。LUX所检测到的荧光产生部位不一定反映荧光素酶基因的特异表达部位；GUS则需要昂贵的反应底物且由于其它因素的干扰。反应颜色的深浅有时不能说明GUS活性的高低或有无.源于水母等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白(GFP)可吸收蓝光而后发出绿光是生物发光现象中能量传递的受体之一。它克服了上述缺陷，具有灵敏度高、操作简便，不需要添加任何底物或辅助因子，不使用同位素，也不需要测定酶的活性等优点。已成为目前最优良的标记基因之一。 1GFP的生化性质及其发光原理 1.1 GFP的发光特性 GFP吸收的光谱,最大峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副峰(蓝光);发射光谱最大峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰(Shouder)。GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似,因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片组合同样适用于GFP观察。尽管450～490nm(蓝光)是GFP的副吸收峰,但由于长波能量低,细胞忍受能力强,因此更适合于活体检测. 1.2GFP的性质特点 GFP荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强,特别在450～490nm蓝光波长下更稳定。GFP需要在氧化状态下产生荧光,强还原剂能使GFP转变为非荧光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂并不影响GFP荧光.中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定,脱水剂戊二酸或甲醛等。GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析。但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白。由于GFP荧光是生物细胞的自主功能,荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。 1.3GFP的发光原理

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。

绿色荧光蛋白基因克隆及表达结果分析

3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒

受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致 培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃 上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图 四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果

生化绿色荧光蛋白的基因克隆及表达开题报告

题目：绿色荧光蛋白（GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达 李宏远 2014236053 立题依据： 随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用, 人们根据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过与染色体基因组进行稳定整合，将生物性状传递给子代动物的研究方兴未艾[1]。 1.选材：大肠杆菌 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点。而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30 %，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。 2.基因标记技术 基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白[2]。

3.绿色荧光蛋白 从水母(Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。分子质量为 26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。 【实验目的】 研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 【研究意义】 研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。 GFP的应用特点 检测方便：不需要外加底物和辅助因子，用内眼就可以观察到，在长紫外光照射下特别漂亮，以此作为标记，观察表达产物。

绿色荧光蛋白

知识介绍 绿色荧光蛋白 马金石 (中国科学院化学研究所 北京 100190) 摘 要 绿色荧光蛋白是46多年前从多管水母体内发现的,它可以在蓝光或紫外光激发下发射绿光。 由于它稳定的结构和光物理性质,又易于在细胞内表达,近些年作为标记物已经被广泛地应用于生命科学领 域。本文简要介绍了水母发光蛋白与绿色荧光蛋白的关系、绿色荧光蛋白的结构、发色团的形成、发光机制、变异体以及它的特点和应用。 关键词 绿色荧光蛋白 基因表达 结构 发色团 生物发光 Green Fluorescent Protein Ma Jinshi (Insti tute of Chemistry,Chinese Academy of Sciences,Beijing100190) Abstract Green fluorescent protein(GFP)was discovered46years ago from A equorea V ictoria,it can emit green light under exci tation of blue or UV irradiation.GFP as a marker for gene expression and localization of gene products has been widely used in life sciences for the past years because of its stable structure and photophysical property and easy expression in cells.A brief introduction on the relationship of aequorin and GFP,GFP structure,chromophore formation,and the mechanism of bioluminescence,also the variants,characteri stic and application are presented in this paper. Keywords Green fluorescent protein,Gene expression,Structure,Chromophore,Bioluminescence 由于对绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)的发现、机理研究以及利用做出的特殊贡献,瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会将2008年度诺贝尔化学奖授予美国科学家下村修(Osamu Shimomura)、马丁 沙尔菲(Martin Chalfie)和美籍华裔化学家钱永健(Roger Y Tsien)。 化学奖评选委员会主席贡纳尔 冯 海伊内和评委莫恩斯 艾伦贝里对绿色荧光蛋白的评价指出,这是当代生物学的重要工具,借助这一 指路标 ,科学家们已经研究出监控脑神经细胞生长过程的方法,这在以前是不可能实现的。他们说,下村修1962年在北美西海岸的水母中首次发现了一种在紫外线下发出绿色荧光的蛋白质,即GFP。随后,马丁 沙尔菲在利用GFP做生物示踪分子方面做出了贡献;钱永健让科学界更全面地理解GFP的发光机理,对GFP作了改造,通过改变其氨基酸排序合成出了能吸收、发射不同颜色(蓝色、蓝绿色和黄色)光的荧光蛋白,为同时追踪多种生物细胞变化的研究奠定了基础。 我国在生命科学领域已经广泛应用GFP,对它的介绍和应用的文章也有很多[1~6]。国外的综述可阅读钱永健和Zimmer的文章,最新的是Shaner等的文章[7~9]。化学界对它的了解可能较少,在此做个简单介绍。 1 生物发光与水母 先从生物发光说起,生物体的发光现象称为生物发光。植物界有细菌植物门的发光细菌和真菌植物门的发光蘑菇,动物界从原生动物到脊椎动物都有,脊椎动物中主要是鱼类。从发光生物的分布来 2008 10 25收稿,2008 11 04接受

基因克隆和表达

Cloning and expression of peroxisomal Ascorbate Peroxidase gene from wheat Yaping Chen,Huazhong Wang,Xiue Wang,Aizhong Cao&Peidu Chen* State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing Agricultural University, Nanjing210095,People’s Republic of China;*Author for correspondence(Phone:+86-25-84396026;E-mail: pdchen@https://www.wendangku.net/doc/6c18363396.html,) Accepted24October2005 Key words:peroxisomal ascorbate peroxidase,powdery mildew,SSH,wheat Abstract A full-length cDNA encoding wheat peroxisomal ascorbate peroxidase(pAPX)was cloned by Suppression Subtractive Hybridization(SSH)and in silico approach.The cDNA was1027bp in length and contained a complete ORF of876bp,which encodes a protein of292amino acid residues.Its deduced amino acids sequence had84%identity with that of pAPX from barley.The gene was designated as Ta-pAPX.The Ta-pAPX homologous genes were mapped on wheat chromosome7A and7D using Chinese Spring nulli-tetrasomic lines analysis.Northern analysis indicated that,after inoculation by Erysiphe graminis Dc.f.sp. tritici,the expression of Ta-pAPX gene in Yangmai5was enhanced,but its expression in wheat-Haynaldia villosa6VS/6AL translocation lines changed a little.The results implied that Ta-pAPX may be related to susceptibility of wheat to powdery mildew.The complete coding sequence of Ta-pAPX was cloned into an expression vector pET32(a+)and a protein with the same deduced molecular weight(MW)was expressed in E.coli BL21(DE3),which showed ascorbate peroxidase activity. Abbreviations:APX–ascorbate peroxidase;ESTs–expressed sequence tags;IPTG–isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside;MW–molecular weight;ORF–open reading frame;pAPX–peroxisomal ascorbate peroxidase;SSH–Suppression Subtractive Hybridization. Introduction Ascorbate peroxidase(APX),found in higher plants,cyanobacteria,and algae[1],is the key enzyme in degradation hydrogen peroxide.So far, at least?ve APX isoforms have been identi?ed in plants:cytosolic isoforms,mitochondria isoforms, peroxisomal/glyoxysomal isoform and two chlo-roplastie isoforms,one in stroma and the other associated with the thylakoid membranes,all of which catalyze the reaction: 2ascorbate peroxidasetH2O2! 2monodehydroascorbatet2H2O APXs activity increased in response to a num-ber of stress conditions,such as drought[2],salt [3],high temperature[4]and pathogen infection [5].Relationship between di?erent stress condi-tions and changes of APX activity were observed. Powdery mildew caused by E.graminis DC.f.sp.tritici is one of the most serious diseases of common wheat in China and many other countries.The Triticum aestivum(‘‘Yangmai5’’)–Haynaldia villosa6VS/6AL translocation line carrying powdery mildew resistance gene Pm:21 confers e?ective resistance to all current powdery mildew races.To investigate the mechanism of Molecular Biology Reports(2006)33:207–213 DOI10.1007/s11033-005-4536-1óSpringer2006

绿色荧光蛋白和PCR技术

绿色萤光蛋白 (green fluorescent protein)，简称GFP，这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用。 由水母Aequorea victoria中发现的野生型绿色萤光蛋白，395nm和475nm 分别是最大和次大的激发波长，它的发射波长的峰点是在509nm，在可见光绿光的范围下是较弱的位置。由海肾(sea pansy)所得的绿色萤光蛋白，仅有在498nm有一个较高的激发峰点。 在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色萤光蛋白基因常被用作为一个报导基因(reporter gene)。一些经修饰过的型式可作为生物探针，绿色萤光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物(例如:兔子上进行表现，并拿来映证某种假设的实验方法。 2008年10月8日，日本科学家下村修（伍兹霍尔海洋生物学研究所）、美国科学家马丁·查尔菲（哥伦比亚大学）和钱永健（加利福尼亚大学圣迭戈分校）因为发现和改造绿色荧光蛋白而获得了当年（2008）的诺贝尔化学奖。 GFP的性质 GFP荧光极其稳定,在激发光照射下，GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强，特别在450～ 490nm蓝光波长下更稳定。 GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP 转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，GFP荧光 便立即得到恢复。而一些弱还原剂并不影响GFP荧光。中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等。 GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析。但因为GFP不是酶，荧光信号没有酶学放大效果，因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白。 由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。 GFP在肿瘤发病机制研究中的应用 GFP是一个分子量较小的蛋白，易与其他一些目的基因形成融合蛋白且不影响自身的目的基因产物的空间构象和功能。GFP 与目的基因融合，将目的基因标记为绿色，即可定量分析目的基因的表达水平，显示其在肿瘤细胞内的表达位置和量的变化，为探讨该基因在肿瘤发生、发展中的作用及其分子机制提供便利条件。 在肿瘤的形成过程中，增殖和凋亡是一对相互矛盾的统一体。若肿瘤细胞凋亡占优势，肿瘤组织将长期处于休眠状态或自行消亡。肿瘤细胞的凋亡受凋亡相关基因调控。用GFP转染肿瘤细胞凋亡相关基因，并与正常组织进行比较，则大致可判断此基因为抑制肿瘤细胞凋亡的基因；反之，为促进肿瘤细胞凋亡的基因。 肿瘤细胞浸润是肿瘤细胞粘连、酶降解、移动和基质内增殖等一系列过程的表现，其根本原因在于肿瘤细胞内某些基因表达异常。利用GFP 的示踪特性，研究肿瘤细胞内某些基因异常表达与肿瘤细胞浸润的关系，即可揭示肿瘤细胞浸润的某些

克隆绿色荧光蛋白分子生物学实验报告

南方医科大学 绿色荧光蛋白的克隆 实验报告 年级专业 2014级生物技术 姓名朱旭峰 学号 3147020042

摘要 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，下面主要介绍碱裂解法提取质粒DNA的方法。 Cloning of green fluorescent protein Abstract： Bacterial plasmid is a kind of double chain, closed-loop DNA, ranging from 1KB to 200kb. All plasmid is present in the cytoplasm, independently from the chromosome of autonomously replicating genetic component, usually under the condition of sustainable and stable in staining in the free state, but under certain conditions will irreversibly integrated into the host chromosome, with the replication of the chromosome replication and by cell split passed on to future generations. Plasmids have become the most commonly used gene cloning vector molecules, the important condition is to obtain a large number of purified plasmid DNA molecules. There are many methods can be used to extract plasmid DNA, the following are mainly introduced the method of extracting plasmid DNA by alkaline lysis method. 关键词 GFP 质粒提取感受态细菌细菌转化 1.前言 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂