土壤微生物计数法

土壤微生物计数法

土壤是最复杂、最丰富的微生物基因库，所含微生物不仅数量巨大，而且各类繁多，主要包括细菌、真菌和放线菌三大类，是土壤最活跃的成分。土壤微生物数量测定方法可分为三大类：一类是根据在培养基上生长的菌落数来计算土壤微生物的数量，统称为培养计数法，主要有稀释平板法和最大或然计数法；二类是将土壤微生物染色后，在显微镜下观察计数，称为直接镜检法，包括涂片法、琼脂薄片法和膜过滤法等；三类是直接将微生物从土壤中分离和提取出来后再进行测定，主要有离心分离法。

1.1培养计数法

1.1.1概要

在自然条件下，土壤中的大多数微生物处于休眠状态，一旦供给可利用的碳源（如培养基），一些微生物将快速生长繁殖。因此，根据在培养基上所生长的微生物数量，可以估算土壤中微生物的数量。这种土壤微生物数量测定方法称为培养计数法，主要包括稀释平板计数法（简称稀释平板法）和最大或然计数法。

稀释平板计数法的基本原理：土壤微生物经分散处理成为单个细胞后，在特殊的培养基上生长并形成一个菌落，根据形成的菌落数来计算微生物的数量。

最大或然计数法的基本原理：假设被测定的微生物在稀释液中均匀分布，并在试管或平板上全部存活，随着稀释倍数的加大，稀释液中微生物的数量将越来越少，直到将某一稀释度的土壤稀释液接种到培养基上培养后，没有或很少出现微生物菌落。根据没有出现菌落的最低稀释度和出现菌落的最高稀释度，再用最大或然计数法计算出样品中微生物的数量。

1.1.2稀释平板法

一、试剂配制

常用的培养基各类很多（见附录一），可根据需要测定的微生物种类选择培养基。按配方配制培养基后，先在121℃下灭菌15min，冷却至45～50℃使用。凝固后的培养基可加热溶解后使用。

二、仪器设备

广口瓶或三角瓶及配套的橡皮塞，移液管（1ml、10ml，吸口用棉花塞住后用牛皮纸包好灭菌）培养皿（9㎝，用牛皮纸包好后灭菌）和显微镜等。

（1）土壤系列稀释液制备

取新鲜土壤（＜2㎜）10.00g，放入经灭菌的装有70ml水的广口瓶中，塞上经灭菌的橡皮塞，在振荡机上振荡10min，此为10-1土壤稀释液。迅速用灭菌的移液管吸取10-1土壤稀释液10ml，放入灭菌的装有90ml水的广口瓶中，塞上橡皮塞，混合均匀，此为10-2土壤稀释液。再如此依次配制10-3、10-4、10-5和10-6系列土壤稀释液。上述操作均在无菌条件下进行，以避免污染。

（2）平板制备和培养

从两个稀释倍数的土壤稀释液中（细菌和放线菌通常用10-5和10-6土壤稀释液，真菌用10-2和10-3稀释液）吸取1.00ml（吸前摇匀），分别放入五套培养皿中（注意每变换一次浓度，须更换一支移液管）；再向培养皿内注入45～50℃的培养基10ml，立即混合均匀，静置凝固后，倒置放于培养箱中培养。细菌和放线菌在28℃下培养7～10d，真菌在25℃下培养3～5d。

（3）镜检计数

尽管使用不同的培养基，但细菌、放线菌和真菌都可能在同一个培养基上生长，所以必须用显微镜做进一步的观察。明显有菌丝的一般是真菌，真菌的菌丝为丝状分枝，比较粗大；而放线菌菌丝呈放射状，比较细。细菌有球状和杆状，有些细菌也形成细小的菌丝。酵母菌的菌落与细菌的菌落很相似，但在显微镜下容易分辨。酵母菌个体比较大，一般有圆形、椭圆形、卵形、柠檬形或黄瓜形，有些还有瘤状的芽。

在两级稀释度中，选细菌和放线菌的菌落数为30～200个、真菌菌落数为20～40个的培养皿各5个，取其平均值计算出每组的菌落数。如果菌落很多，可将其分成2～4等份进行计数。微生物生物量可以通过微生物细胞个体大小和密度计算得到。

（4）计算

土壤微生物数量（cfu·g-1）=MD/W

式中M为菌落平均数：D为稀释倍数；W为土壤烘干质量（g）。

1.1.3最大或然计数法（MPN）

一、试剂配制

培养基配制与稀释平板法基本相同，采用试管培养时，培养基中不需加琼脂。

试管（2㎝×18㎝），其他同稀释平板法。

三、操作步骤

（1）土壤系列稀释液中制备

按稀释平板法制备土壤系列稀释液，一般配制10-1～10-6的稀释液。

（2）接种和培养

从上述土壤系列稀释液中各取1ml接种到平板培养基或试管液体培养基中，每个稀释度重复3～5次，同时设置空白对照，以检验是否被污染。因微生物类型和生长速度不同，所要求的稀释倍数、培养基和培养时间都有差别(表1-1)。根据微生物类型分别在28～30℃培养7～30d。培养结束时，记录出现菌落的平板数量或出现特征反应的试管数。

表1-1 几种主要土壤微生物生理群MPN计数方法

（3）计算

通常将有微生物生长的最后3个稀释度中出现微生物菌落的平板数作为微生物生长指标，从最大或然数表中查出最大或然数近似值，按下列公式计算样品中的微生物数量：

土壤微生物数量（cfu·g-1）=MD/W

式中M为最大或然数近似值；D为全部出现菌落的最高稀释倍数；W为土壤烘干质量（g）。

例如，某土壤系列稀释液1ml接种到5个平板，经培养后，10-3～10-5的稀释液全部出现菌落；接种10-6稀释液的5个平板只有4个出现菌落；接种10-7稀释液的只有1个出现菌落；接种10-8稀释液的全部没有菌落。由此得到土壤的微生物生长指标为541，查最大或然数表（见附录三，表三）得到其最大或然数近似值为17，乘以第一位数的稀释倍数105，再除以土壤烘干质量即可得到土壤微生物数量。

微生物生长的数量指标都应当是三位数。但是不管重复数多少，第一位数字如重复数相等，即代表全部重复都出现菌落的最高稀释倍数的数值。后两位数字依次是以下两个稀释度出现菌落的平板数量。如果以下稀释液还出现了微生物菌落，则将其出现微生物菌落的重复数加到第三位数上。例如，10-3～10-8系列稀释液（4个重复）出现菌落的平板数分别为4，4，3，2，1和0.这里10-7稀释液出现菌落的平板数为1，将其加到前一稀释液（10-6）的平板数上，即得该土壤的微生物生长指标为433，查表得最大或然数近似值为30，计算得到每克土壤（新鲜重）的微生物数量为3.0×105。

应注意：如果出现微生物生长的稀释度比没有出现微生物生长的稀释倍数低，则说明微生物在稀释液中不是均匀分布的，在这种情况下就需要对实验方案进行核查。

1.1.4方法评论

最初研究土壤微生物的方法是培养计数法，该方法的优点在于可测定土壤中可培养的、不同类型的微生物数量，包括细菌、真菌和放线菌，特别是可用于测定可培养的、具有特殊功能的微生物种群，如氨化细菌、硝化细菌、反硝化细菌、解磷菌和固氮菌等。该方法存在的问题是，仅能测定在培养基上迅速生长繁殖，并能够形成菌落或有某种特征的土壤微生物种群，而大部分土壤微生物种群不能在培养基上生长。另外，在培养基上所形成的菌落可能来自多个细胞，也有可能由菌丝（或多个细胞）发育成菌落。因此，培养计数法所测定的微生物数量，通常不到土壤中微生物实际数量的1%，故不能作为土壤微生物的真实数量。此外，该方法即使用于测定土壤中可培养的微生物数量，测定结果的精确度和重复性较差。

1.2直接镜检计数法

1.2.1概要

由于土壤微生物的特性和培养基的局限性，通过在培养基上生长的菌落数量来间接地计算土壤微生物数量，一般只能测量出土壤中很少的一部分微生物。因此，一些研究者提出了直接镜检计数法，主要包括涂片法、琼脂薄片法和膜过滤法。使用一般的染色剂进行涂片染色，镜检时很难区别死的微生物细胞和土壤颗粒，这里仅介绍FDA染色涂片测定活菌丝数和FITC染色测定活细菌数的方法。

涂片法的基本原理：将一定量的土壤悬浮液涂抹在载玻片上，风干染色后进行镜检计数，从而计算出单位质量土壤的微生物数量。由于使用特别的染色剂可着色活细胞，从而可测定土壤活体微生物数量。

琼脂薄片法的基本原理：在制备土壤悬浮液时加入一定量琼脂，在进行土壤分散的同时进行加热，取一定量的土壤-琼脂悬浮液制成琼脂薄片，染色后进行镜检计数，再计算出单位质量土壤的微生物数量。

膜过滤的基本原理：将土壤悬浮液用无菌水稀释，取一定量的稀释液染色后，用微孔膜过滤，对微孔膜上的微生物进行镜检计数，再计算出单位质量土壤的微生物数量。

1.2.2 FDA染色涂片法测定活菌丝数

一、试剂配制

磷酸盐缓冲液（0.06mol·L-1）：8.28 g 溶于1L去离子水，10.68g 溶于1L去离子水；将两种溶液按28﹕72的比例混合，调节pH值使其与土壤pH值大致相同。

FDA染色液：见附录二。

琼脂溶液（1.5%）：1.5g琼脂溶于100ml磷酸盐缓冲液中（pH7.6）。

二、仪器设备

三角瓶（200ml），试管（15ml），振荡机，载玻片（图1-1），盖玻片，荧光显微镜等。

图1-1 染色-镜检法涂片

外圆面积1cm2，半径5.64㎜，内圆半径3.64㎜，镜检必须在外圆边缘约1.7㎜以内的区域进行

三、操作步骤

（1）土壤分散

取10.00g新鲜土壤（＜2㎜）于200ml三角瓶中，加入95 ml 0.06 mol·L-1磷酸盐缓冲溶液，充分振荡15 min。

（2）染色

取1 ml 土壤悬浮液于15 ml的试管中，加入4 ml磷酸盐缓冲溶液，再加入1 ml FDA染色液。室温下培养3 min 后，加入1 ml琼脂溶液，混匀。

（3）涂片和镜检

取0.1 ml 上述土壤-染色液-琼脂混合液均匀地涂于如图1-1所求的载玻片上，盖上盖玻片，迅速用荧光显微镜进行镜检计数。镜检计数方法见下文的琼脂薄片法。

（4）计算

土壤活菌丝的生物体积及生物量碳计算方法同琼脂薄片法。

1.2.3 FITC染色涂片法测定活细菌数

一、试剂配制

Tris-盐酸溶液I ：6.35 g 三羟基氨基甲烷溶于800 ml 去离子水，用浓盐酸调节pH值至7.5，定溶至 1 L。

Tris-盐酸溶液II ：25.4 g 三羟基氨基甲烷溶于800 ml 去离子水，用浓盐酸调节pH值至7.5，定溶至 1 L。

INT溶液：2 g 氯化2-（p-碘苯基-3-p-硝基苯）-5-苯四氮唑溶于1 L Tris-盐酸溶液II中。

NADH-NADPH混合溶液：0.4 g NADH和0.4 g NADPH溶于100 ml Tris-盐酸溶液II中。

FITC染色液：见附录二。

碳酸盐-重碳酸盐缓冲液（0.5 mol·L-1）：42 g 溶于1 L去离子水；53 g 溶于1 L 去离子水。吸取80 ml 和100 ml溶液混合，加去离子水500 ml并调节pH值至9.6，定容至1 L。

焦磷酸钠溶液（5%，）：8.39 g焦磷酸钠（）溶于100 ml去离子水。

碳酸钠溶液：10.6 g 碳酸钠溶于100 ml去离子水。

甘油溶液：量取45 ml 甘油于5 ml 1 mol·L-1碳酸钠溶液中，摇匀。

磷酸盐缓冲液（0.01 mol·L-1,pH 7.2）：1.38 g 溶于1 L去离子水中，1.78 g 溶于1 L去离子水，将两种溶液按28﹕72的比例混合。

氯化钠溶液：8.77 g 氯化钠溶于1 L去离子水。

甲醛溶液：20 ml 甲醛溶于80 ml去离子水。

二、仪器设备

烧杯（100 ml），搅拌机，闪烁计数瓶，超声波水浴器，载玻片（图1-1），盖玻片，荧光显微镜等。

三、操作步骤

（1）土壤分散

取1.00 g 新鲜土壤（＜2㎜）于100 ml烧杯中，加入20 ml Tris-盐酸溶液I，用搅拌机低速搅拌1 min。

（2）培养

取2.0 ml上述土壤悬浮液于闪烁计数瓶中，加入1 ml IN T溶液，再加入1 ml NADHNADPH混合溶液，在25℃的黑暗条件下培养4 h。再加入1 ml 20%甲醛水溶液，4℃过夜。

（3）涂片和染色

将上述装有经培养的土壤悬浮液的闪烁计数瓶置于超声波水溶器中，低能量（输出功率50W）超声波处理2 min，加入琼脂使其浓度达到0.01%（V/V）。取0.01 ml混合液均匀地涂沫于如图1-1所示的载玻片上（使用前用稀酸洗涤），于酒精灯上加热干燥后用FITC染色液染色3 min。染色后置于0.5 mol·L-1碳酸盐-重碳酸盐缓冲液中浸泡10 min，再转入5%焦磷酸钠溶液中浸泡2 min，取出用去离子水轻轻冲洗。

（4）镜检

洗涤后染色片干燥后，加一滴甘油溶液，盖上盖玻片固定，用荧光显微镜进行镜进行镜检计数，具体方法参见琼脂薄片法。

（5）计算

土壤活细菌的生物体积和生物量碳的计算方法参见琼脂薄片法。

1.2.4琼脂薄片法

一、试剂配制

琼脂-Decon 90溶液：1g琼脂溶于100ml无菌水（过0.20u m滤膜），加热溶解，再与20ml Decon 90稀释液（12ml Decon 90于100ml无菌水）混合均匀。

台酚蓝溶液：5g 苯酚溶于100 ml无菌水，1g台酚蓝溶于100 ml无菌水；按照15﹕1的比例混合；再按4﹕1与冰醋酸混合，用0.2u m 膜过滤。

二、仪器设备

可控温超声波水浴清洗机（300 Ultrasonik NEY），可调慢速搅拌机（1.5V，0～2000rev·min-1，Kanke and Kunkel EKA-labortechnik），显微镜，显相器（Camera lucida），血球计数板（图1-2），盖玻片（厚0.47㎜），加拿大香脂（Canada Balsam）。

图1-2 血球计数板（改进型）

三、操作步骤

（1）土壤分散

取1.00～2.00g（根据土壤微生物含量而定）＜2㎜的新鲜土壤于100 ml塑料杯中，加入60 ml 60℃的琼脂-Decon 90混合溶液。将塑料杯置于超声波清洗机水槽中（土壤琼脂混合溶液的液面要低于水面），最大功率处理15 min。在超声波处理过程中，保持水浴60℃，并不断慢速搅拌土壤琼脂悬浮液。处理结束后仍继续搅拌土壤悬浮液，直到取样前30 s停止。取样必须在10 min内完成。

（2）琼脂薄片制备

将吸管（内径1㎜）插入土壤-琼脂悬浮液液面下1㎝处，吸取约0.02 ml悬浮液，迅速放入血球计数板上，立即盖上盖玻片（厚0.47㎜），冷却凝固后一起放入去离子水（用前经0.2 滤膜过滤）中，使琼脂薄片分离。每个样品至少做4个琼脂薄片，即4次重复。

（3）染色

将琼脂薄片放到普通玻片上，干燥后浸泡在台酚蓝溶液中。1h后先用无菌水冲洗，再用95%酒精脱水。在琼脂薄片上加一滴加拿大香脂，盖上普通的盖玻片，即得琼脂薄片，可永久保存。

（4）镜检

将琼脂薄片置于显微镜下，在目镜上放入New Porton G12分格计数板，根据表1-2进行镜检。仅对被染为深蓝色的球形和圆柱形微生物计数，形状不规则（如破裂开）和其他颜色（如黄色、紫红色）的物体均不计数。

球形微生物分为11级（表1-2），直径在0.34～0.97 的为第1组，计数面积为2.0×102（相应于New Porton G12分格玻璃片左上角的两个方格）。直径在0.97～3.13 的为第2组，计数面积为2.1×103（相应于New Porton G12分格玻璃片的全部方格），第1组和第2组在油镜下镜检。直径在3.13～16.00 的为第3组，在500倍下镜检，计数面积为3.7×104（相应于目镜分格玻璃片的A方格面积）。圆柱形微生物可分为8级，均在500倍下进行镜检，计数面积同球形微生物的第3组。圆柱形微生物的直径用New Porton G12分格玻璃片直接测量，而长度则通过显相器直接描绘在A4纸上，再用测绘轮测定其长度，也可用其他的方法如网格交叉的方法来测定。每一组必须在不同部位镜检20次。如果20次所测定的微生物个数低于40，则必须加测20次。

表1-2 直接显微镜检的视野和放大倍数

（5）计算

根据镜检所测定的微生物数量及所计数的面积计算微生物生物体积，再按其密度（1.1g·）、干物质含量（25%）和含碳量（47%）估计微生物生物量碳。

例如0.49～0.69 球形微生物在20次镜检中的结果为20，镜检总面积为4.0×103（20×2.0×102），则可计算得到被镜检（琼脂薄片厚度为0.1㎜）的土壤质量（Ms）为6.7×10-6g（1/60×镜检总面积×10-6×0.1㎜）；单位土壤（g）该球形微生物数量（N=20/Ms）为2.98×106 cfu·g-1；其生物总体积V（0.1×N×10-9）为2.98×10-4（mm3·g-1）。故可按下式计算该球形微生物的生物量碳（Bc；0.424 ）：

Bc=V×1.1×0.25×0.47×103（μg·g-1）

1.2.5膜过滤法

一、试剂配制

Decon90溶液：取12 ml浓溶液于100 ml经0.2滤膜过滤的水中。

NaCl溶液：8.77 g NaCl溶于1L去离子水，0.2 滤膜过滤。

柠檬酸钠系列缓冲溶液（）：21.01 g 溶于1 L去离子水，53.61g 溶于1 L去离子水；吸取13.6 ml、21.6 ml和30.7 ml柠檬酸溶液分别与36.4 ml、28.4 ml和19.3 ml磷酸钠溶液混合，即配制成pH值为6.6，5.5和4.0的柠檬酸盐系列缓冲溶液，制备的溶液均经0.2 滤膜过滤。

甲醛，Cargille油。

二、仪器设备

微孔滤膜（孔径分别为8 、3、0.8 、0.45 ，膜直径25㎜）和过滤装置。

三、操作步骤

（1）土壤分散

取1.00～2.00 g（根据土壤微生物数量而定）＜2㎜的新鲜土壤于100 ml塑料杯中，加入50 ml无菌水和10 ml Decon 90溶液，在5℃下用超声波清洗机处理15 min，同时慢速搅拌，将土壤悬浮液用无菌水稀释到200～500倍。

（2）细菌的过滤、染色及镜检

土壤稀释液摇匀后静置5 min，吸取一定量（根据土壤微生物数量而定，一般50 ml），用孔径为8的微孔膜过滤，以除去土壤颗粒、有机物质和菌丝等。再吸取一定量的过滤液，用孔径为3 的微孔膜过滤。取1.9 ml滤液，加入0.1 ml甲醛，甲醛的最终浓度为2%，再加入0.2 ml AO溶液，黑暗中室温培养10 min。吸取0.25 ml于过滤器上，加入8.0 ml NaCl溶液，用0.45 的微孔膜（黑底）抽滤。再依次用pH值6.6，5.5和4.0的柠檬酸钠缓冲溶液及去离子水洗涤，将滤膜转移到载玻片上，在膜的底部和上部各放一滴Cargille油，盖上盖玻片，用荧光显微镜进行镜检计数，至少重复4次。

（3）真菌的过滤、染色及镜检

适当稀释的土壤悬浮液摇匀后静止30s，用移液管从容量瓶的中部吸取1.00 ml土壤悬浮液，放到已加入5 ml无菌水的膜过滤器中。再加入三滴吕氏美蓝溶液，用无菌水将总体积调节到约15 ml。混合30s后进行抽滤，用无菌水冲洗过滤器壁部2～3次。移下微孔膜（0.8 ，白底），风干后置于载玻片上，在滤膜上下各加一滴Cargille油，盖上盖玻片，同上在普通显微镜下进行镜检。每个样品至少做4次重复。土壤颗粒和有机物质也会被染成蓝色，但形状不规则或者成团，只有被染成蓝色，并具有规则形状的菌丝才计数。

（4）计算

细菌和真菌的生物体积及生物量碳计算参见琼脂薄片法。

1.2.6方法评价与应用

土壤中的微生物大多数附着在土壤颗粒表面，测定时必须使微生物与土壤颗粒分离，所采用的方法包括物理方法和化学方法。前者包括研磨、振荡、高速搅拌或超声波处理等；后者加入分散剂使土壤团聚体分散，常用的分散剂有六偏磷酸钠缓冲溶液、NaCl、离子交换树脂、Decon、胆酸钠。在实际应用中，通常在物理处理的同时加入分散剂，以增加土壤分散效果。

最初是采用研磨方法将微生物与土壤颗粒分散开，Babiuk和Paul改进用高速搅拌机分散，Jenkinson等人比较了研磨、高速搅拌以及后来提出的超声波处理三种方法，结果表明超声波处理分散效果最好；他们还发现加入洗涤剂能加强分散效果，并使琼脂薄片比较清晰而容易观察。林启美对超声波处理时间进行了研究，发现处理15 min时获得的微生物生物量最大，时间太短不能将微生物与土壤颗粒分散，太长则会破碎微生物细胞，二者都会降低测定结果。他还比较了6种土壤分散处理方法，发现各处理方法所测定的结果之间没有显著性的差异，但使用洗涤剂的琼脂薄片比较干净，易于镜检。尽管超声波处理加分散剂的分散效果最好，但是镜检仍然发现有一些细菌团，一些菌丝附着在土壤颗粒尤其是有机残体上，从而难以计数。可见，对于分散方法仍需进一步研究和改进。

染色对琼脂薄片镜检有很大的影响，多种染色方法曾被使用，常用的有吖啶橙、棉蓝、苯胺蓝、台酚蓝、二苯基脒基靛酚、荧光素异硫氰酸盐、荧光素二乙酸盐、Eu（TTA）3等。

不同的染色剂与细胞成分的亲和力不同，有的着色细胞质，有的则着色细胞核。一种染色剂很难使所有的填充微生物着色，并且常常同时使土壤颗粒、腐殖物质和死亡的微生物细胞也着色，导致镜检比较困难。Jones和Mollison发现苯胺蓝能使土壤中的大多数微生物呈现蓝颜色，并且着色的细胞几乎都是活细胞。但也有少量菌丝呈黄色或紫红色，这部分菌丝的数量不到被染成蓝色的菌丝的5%，Jenkinson 等人将这部分菌丝视为死亡菌，不进行计数。由于在分散过程中可能将菌丝撕裂，显微镜下常常见到不规则形状的碎片，也不被计数，仅计数被染成蓝色的并且有规则形状（球形和圆柱形）的微生物。林启美比较了苯胺蓝和台酚蓝，发现用台酚蓝能够使更多的菌丝染色。吖啶橙与DNA、RNA、酸性多糖等细胞成分亲和力较强，因此曾被广泛用作活菌体染色。荧光素异硫氰酸盐与蛋白质的亲和力很强，但不能使真菌着色。FDA常用于测定活菌丝数量。Eu（TTA）3能够使活细胞的核酸着色。荧光增亮素对根际微生物尤其是3～10 大小的微生物有很好的染色效果，但也能使死细胞和有机物质着色。

一般认为荧光染色仅能使活细胞着色，而土壤矿质颗粒和腐殖物质不会着色，从而能够测定出活体微生物数量，并且易于镜检。但荧光染色常常具有专一性，并且荧光停留时间也比较短，从而限制了镜检计数时间。因此，应根据研究需要选择适当的染色剂。

镜检时一般根据微生物的形态，将其分为球形和圆柱状两组，并对每组进行分级，在不同的放大倍数下镜检。土壤中绝大多数细菌单个细胞的直径为0.5～2.0。林启美将直径为0.4～3.13 的球形微生物视为细菌，而大于3.13 球形微生物视为真菌胞子，所有圆柱形微生物都视为真菌菌丝。据此可测定出细菌和真菌的生物量，与采用选择性呼吸抑制方法所得的结果十分接近。

放大倍数对镜检的结果影响较大，高倍下能测到更多的菌丝，Frankland指出相差显微镜比普通显微镜能够检测出更多的菌丝，Lundgren 发现对细菌进行分组比镜检单个细胞获得的细菌数量多25%。

直接镜检计数方法是直接利用显微镜进行观察计数，理论上应该能够测定出土壤微生物总数，反映土壤微生物的现状。但由于受土壤矿物、有机质、染色方法等的干扰和影响，直接镜检计数方法也不能非常准确地测定土壤微生物的总数，而且所测定的微生物主要是生长比较缓慢的微生物类群。另外，直接镜检方法影响因素较多，尤其是在镜检时对菌体的分辨和判断，在很大程度上依赖经验，且费时费力，作为常规土壤微生物细胞分布不均匀，不能准确计量所用的土壤质量以及微生物数量，因而测定结果的精确度比较低。有人采用将已知浓度的色素微粒悬浮液与土壤悬浮按照一定的比例混合，根据色素颗粒与微生物细胞的比例计算所用的悬浮液的土壤质量。尽管这样对测定结果的精确度有所提高，但也不可能准确地测定出土壤微生物总量。

Jenkinson等人采用琼脂薄片法测定土壤微生物总数，并将其换算为生物量，发现与熏蒸培养法所测定的值相吻合。Vance等人也得到类似的结果。Lin和Brookes对该方法进行了改进，所测定的土壤微生物生物量与用熏蒸提取法测到的结果具有极显著的相关性。

微孔膜过滤可用于测定土壤真菌菌丝长度，并且较为简单快速，林启美报道微孔膜过滤方法与琼脂薄片直接镜检法所测定的菌丝量非常接近。近几年已开发出能够自动计数的计算机软件，使镜检计数自动化，但仍有一些问题有待解决。

1.3多步离心分离法

1.3.1概要

土壤微生物一般与土壤颗粒结合，包藏在土壤团聚体内。Faegri等人提出用多步低速离心方法从土壤中分离细菌和真菌，基本操作步骤如图1-4。由于采用多步离心分离法提取土壤真菌较为困难，这是介绍Vilarino等人提出的土壤菌丝提取方法。

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离心分离法提取土壤细菌的原理：新鲜土壤经多次不同分散处理和低速离心，收集所有上清液，纯化后即得提取的土壤细菌。

Vilarino等人提取土壤真菌的原理：新鲜土壤经分散后，土壤悬浮液中的菌丝可附着在慢速转动的铜丝框上，洗脱后即得提取的土壤真菌。

1.3.2土壤细菌分离

一、试剂配制

胆酸钠溶液（0.1%，）：0.1g胆酸钠（）溶于100 ml去离子水。

钠离子交换树脂：螯合离子交换树脂与溶液中和，再用去离子水反复洗涤至pH值为7.0。

梯度离心介质：5 ml Percoll加入蔗糖0.43（密度≤ ）。

Tris缓冲液（）：0.97 g 三羟基氨基甲烷和6.61 g 三羟基氨基甲烷盐酸溶于1 L去离子水。Tris-盐缓冲液（：24.22 g 三羟基氨基甲烷溶于1 L 0.8% NaCl溶液，用稀盐酸调节至pH7.0.

二、仪器设备

低速离心机，高速离心机，Waring搅拌机，聚碳酸酯离心管，超声波水浴器，振荡机等。三、操作步骤

（1）土壤分散和离心

土壤分散和离心操作步骤如图1-5所示。

图1-5 离心法提取土壤细菌程序

（2）纯化

将上述收集的所有上清液混合，用滤布（＜30 ）过滤，以除去有机物碎片和矿物质颗粒。滤液用Tris-盐缓冲液在10 000g 下离心15 min，去掉清液。沉降物中加入20 ml Tris-盐缓冲液，用Waring搅拌机混合均匀。吸取4 ml放入到聚碳酸酯离心管中，将Percoll注入到离心

管的底部，10 000 g 离心15 min。用蠕动泵抽出细菌浓缩液，用Tris-盐缓冲溶液（1﹕20）洗涤Percoll沉淀物4～6次（10 000g离心15 min）。纯化的细菌可用于各种分析。

1.3.3 土壤真菌分离

一、试剂配制

Ringer溶液：6 g NaCl，0.1 g KCl和0.1 g CaCl2溶于1 L去离子水。

二、仪器设备

离心机，提取菌丝的装置（图1-6），离心管。

三、操作步骤

（1）土壤分散和离心

取10g新鲜土壤（＜2㎜）于100 ml离心管中，加入75 ml Ringer溶液。手摇30 s 后，在2200 g 下离心5 min，除去上清液。

（2）过滤

沉淀物用大约150 ml的Ringer溶液洗涤过滤（＜100 ）至200 ml烧杯中，以除去土壤颗粒和植物根系。

（3）提取

过滤液采用如图1-6所示的菌丝提取装置在慢速转动下进行提取，每个样液提取5次，每次4 min。附着在提取装置铜丝上的菌丝用Ringer 溶液洗脱到0.45 滤膜上，烘干后称重或用于其他分析。

1.3.4方法评价与应用

多步离心分离法既要使微生物与土壤颗粒分离，又要保证基本不破坏微生物细胞。所Faegril等人的研究，在离心力为300 g 时多次离心能使大部分细菌进入上清液，但真菌则与填充颗粒一起沉降。Hopkins等人采用500g离心，Bakken采用630～1060g，Rits等人建议采用小于100 g。现有的离心分离方法对外标细菌的回收率可以达到90%。土壤处理的方法也很多，包括搅拌、匀浆、超声波、振荡等，使用的化学分散剂有Tween 80、Triton X-100、月桂酰肌氨酸钠、胆酸钠、离子交换树脂等。Bakken比较了3种搅拌方法和5种分散剂的效果，发现Waring搅拌机比较合适，水和其他分散剂的处理效果一样，同时指出分离效果受土壤性质尤其是有机质和黏粒含量的影响很大。

Macdonald指出胆酸钠＋离子交换树脂的分离效果较好，Hopkins等人采用10种方法处理，也发现胆酸钠＋钠离子交换树脂分散土壤的效果最好。

为了避免土壤黏粒和有机物质对分离细菌的干扰，Macdonald用30 的滤布去掉胞子、菌丝及根系，再用淘洗的方法将细菌从土壤悬浮液中分离出来。Hopkins等人对淘洗器进行了改进（见图1-7），并发现淘洗流出液达4L就可全部回收外标细菌，但是土壤中的细菌只能

分离出80%左右。该方法的基本原理是：物质颗粒的沉降速度是其大小和密度的函数：

V=（r2g/9η）（ρ-1）

式中V为物质颗粒的沉降速度，r是物质颗粒的半径，g是重力加速度，是介质的黏滞度，是物质颗粒的密度。

从上式可以看出，土壤颗粒越大或密度越高，其沉降速度就越快。土壤黏粒粒径一般小于2，而其密度约为2.6g·cm-3.土壤中大多数细菌的直径为0.5～3 ，密度为1g·cm-3左右。理论上通过淘洗方法很容易将细菌从土壤悬浮液中分离出来，关键是选择合适的水流速度。该方法最大的缺点就是淘洗出来的水溶液体积比较大（4L），需要通过高速离心或膜过滤（＜0.45 ）或超滤浓缩细菌。

淘洗法和多次低速离心法所获得的细菌浓缩液还含有一定量的有机物质和黏粒，需要通过梯度离心方法纯化细菌。Macdonald详细地研究了梯度离心的条件，发现在一定密度的介质中高速离心，细菌被分离并集中在离心管的一定部位。曾被用作梯度离心介质的有蔗糖、CsCl、Ludox（硅胶体颗粒）和Percoll（硅胶体颗粒用聚乙稀吡咯烷酮包被起来）等。但由于渗透压、毒性及黏滞度等原因，前三种物质已很少使用。Percoll对微生物没有毒性，通过加入蔗糖或NaCl可以调节其渗透压，是目前用得较多的梯度离心介质。

由于离心时在Percoll介质中出现多个层次，加上抽取不完全等原因，外标细菌的回收率一般只有70%左右。Bakken报道加入黏壤土、沙壤土和有机土中的外标细菌的分离提取率分别为30%、26%和70%，Hopkins等人发现梯度离心在草炭土中的分离效果仅能提取土壤中10%～20%左右的细菌，并且随土壤性质不同有很大的差异。

从土壤中分离真菌菌丝较为困难，以前采用的方法有空气淘洗方法、蔗糖离心方法。Vilarino等人发现用直径为150 的铜丝，通过慢速

转动，能够收集90%左右的真菌菌丝，比离心方法的效率要高得多。

微生物的计数——血球计数板法

微生物得计数——血球计数板法 【摘要】测定微生物细胞数量得方法很多，有分光光度法、显微直接计数法与平板计数法。分光光度法比较简便，易操作，但就是会使数据严重偏大。而平板计数法则会使实验数据严重偏小.?显微计数法适用于各种含单细胞菌体得纯培养悬浮液,如有杂菌或杂质，常不易分辨.菌体较大得酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板,一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽(PetｒｏｆHausｓｅr)细菌计数板。两种计数板得原理与部件相同，只就是细菌计数板较薄,可以使用油镜观察。而血球计数板较厚,不能使用油镜，计数板下部得细菌不易瞧清.本实验采用血球计数板法，主要目得就是了解血球计数板法得构造与使用方法，学会用血球计数板对酵母菌细胞进行计数。 一、实验目得与要求 １、了解微生物计数常用得三种方法：分光光度法;平板计数法；血球计数板法。 2、了解血球计数板得构造与使用方法。 3、学会用血球计数板对酵母细胞进行计数。 二、基本原理 利用血球计数板在显微镜下直接计数，就是一种常用得微生物计数方法。此法得优点就是直观、快速.将经过适当稀释得菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间得计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室得容积就是一定得（０、1mｍ2），所以可以根据在显微镜下观察到得微生物数目来换算成单位体积内得微生物总数目。由于此法计得得就是活菌体与死菌体得总与，故又称为总菌计数法. 血球计数板,通常就是一块特制得载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间得平台又被一短横槽隔成两半，每一边得平台上各刻有一个方格网,每个方格网共分九个大方格,中间得大方格即为计数室，微生物得计数就在计数室中进行。 计数室得刻度一般有两种规格,一种就是一个大方格分成１６个中方格，而每个中方格又分成25个小方格;另一种就是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但无论就是哪种规格得计数板,每一个大方格中

土壤微生物生物量的测定方法

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法） 基本原理 新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生 物生物量碳，用一定体积的LK 2SO 4 溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微 生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。 实验仪器 自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。 实验试剂 1）无乙醇氯仿（CHCL 3 ）； 2）L硫酸钾溶液：称取87g K 2SO 4 溶于1L蒸馏水中 3）工作曲线的配制：用L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、 70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。（其实一般情况下， 仪器会自带的标曲，一般不用自己做的） 操作步骤 土壤的前处理（过筛和水分调节略） 熏蒸 称取新鲜（相当于干土，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO 2 ，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。 抽真空处理 熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完

全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）※ 浸提过滤 从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或—20℃冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）（注意这部分很重要，有研究结果表明：提取液如果不立即分析，请保存在—20℃，否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个的滤头，一个才1元）。 TOC仪器测定 吸取上述土壤提取液10ul（这个要根据仪器自己的性能决定，但是一般情况下，在测定土壤滤液时候，要对其进行稀释，如果不稀释，一方面超过原来仪器的标曲，另一方面可能堵塞仪器。）注入自动总有机碳（TOC）分析仪上，测定提取液有机碳含量。由于总有机碳分析仪型号较多，不同的型号则操作程序存在较大差异，这里以本实验室使用的有机碳分析仪（Shimadzu Model TOC---500,JAPAN）为例。 计算 SMBC=(E C CHCL3—E C CK)*TOC仪器的稀释倍数*原来的水土比/ 2 土壤微生物生物量氮（茚三酮比色法） 土壤微生物生物氮一般占土壤全氮的2%—7%，是土壤中有机—无机态氮转化的一个重要环节，关于土壤微生物氮的测定常见的熏蒸浸提法有两种，一是全氮测定法，另一个是茚三酮比色法，如下 基本原理（茚三酮比色法）

常见的微生物检测方法

常见的微生物检测 方法

摘要：微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义，本文分生长量测定法，微生物计数法，生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量，体积，大小，生理代谢物等指标的二十余种常见的检测方法，简要介绍了这些方法的原理，应用范围和优缺点。 概述： 一个微生物细胞在合适的外界条件下，不断的吸收营养物质，并按自己的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量，体积，大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其体积、重量、密度或浓度作指标来衡量。微生物的生长不同于其它生物的生长，微生物的个体生长在科研上有一定困难，一般情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的，因此，微生物的生长一般指群体的扩增。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标，同

时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病，霉腐微生物的防治都和她们的生长抑制紧密相关。因此有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加，因此测定的方法也都直接或间接的以次为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量，能够从其重量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。 生长量测定法 体积测量法：又称测菌丝浓度法。 经过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10毫升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5分钟）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。 称干重法：

微生物大小的测定及微生物数量的直接计数法

微生物大小的测定及微生物数量的直接计数法摘要：本文使用了目镜测微尺和镜台测微尺来测量野生酵母的细胞大小，得到的结果是宽在5.78~11之间，长在8.25~20之间。然后用血细胞计数板对酵母菌进行计数，并绘制其生长曲线，有四个时期，分别是延滞期、对数期、稳定期和衰亡期。 关键词：细胞大小血细胞计数板酵母菌生长曲线 前言 生产生活中利用微生物时，需要了解微生物的一些基本物理属性，如菌体的大小形状等。本实验利用显微测微尺对野生酵母进行测量，并用血球计数板对酵母菌进行其生长曲线的测定，了解去生长规律。通过此综合性实验加深对无菌操作的印象，并将其掌握。 1实验材料与仪器 1．1实验材料与试剂 麦芽汁培养基、生理盐水、果汁（自制）、活化的酵母菌、酒精 1．2实验仪器 锥形瓶、试管、接种环、移液枪、显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、盖玻片、载玻片、滴管、血细胞计数板、吸水纸、酒精灯 2实验方法 2．1预准备 2.1.1培养基的制备 麦芽汁培养基（130.1g/L）200ml*4瓶 麦芽汁琼脂培养基（145.1g/L）5ml*2支试管150ml*1瓶 生理盐水9ml*20支 （制备后高压蒸汽灭菌121℃，20min） 2.1.2酵母分离纯化 平板划线分离：先倒制无菌琼脂培养基平板,待充分冷却凝固后,用接种环以无菌沾取少量待分离的含菌样品,在无菌琼脂平板表面进行有规则的划线。划线的方式有连续划线、平行划线、扇形划线或其它形式的划线。通过这样在平板上进行划线稀释, 微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少, 并逐步分散开

来。经培养后,可在平板表面形成分散的单 个菌落。但单个菌落并不一定是由单个细 胞形成的，需再重复划线1-2次, 并结合显 微镜检测个体形态特征, 才可获得真正的 纯培养物。 斜面接种是从已生长好的菌种斜面上 挑取少量菌种移植至另一支新鲜斜面培养基上的一种接种方法。具体操作如下：接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。贴在距试管口约2-3cm的位置。点燃酒精灯。用接种环将少许菌种移接到贴好标签的试管斜面上。操作必须按无菌操作法进行。 简述如下：1)手持试管：将菌种和待接斜面的两支试管用大拇指和其他四指握在左手中，使中指位于两试管之间部位。斜面面向操作者，并使它们位于水平位置。2)旋松管塞：先用有于松动棉塞或塑料管盖，以便接种时拔出。3)取接种环：右手拿接种环(如握钢笔一样)，在火焰上将环端灼烧灭菌。然后将有可能伸入试管的其余部分均灼烧灭菌，重复此操作，再灼烧一次。4)拔管塞：用右手的无名指、小指和手掌边先后取下菌种管和待接试管的管塞，然后让试管口缓缓过火灭菌(切勿烧得过烫)。5)接种环冷却：将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却。6)取菌：待接种环冷却后，轻轻沾取少量菌体或胞子，然后将接种环移出菌种管，注意不要使接种环的部分碰到管壁，取出后不可使带菌接种环通过火焰。7)接种：在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面培养基的底部向上部作“Z”形来回密集划线，切勿划破培养基。有时也可用接种针仅在斜面培养基的中央拉一条直线作斜面接种，直线接种可观察不同菌种的生长特点。8)塞管塞：取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将管塞旋上。塞棉塞时不要用试管去迎棉塞，以免试管在移动时纳入不洁空气。9)将接种环灼烧灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧。

土壤微生物量碳测定方法

土壤微生物量碳测定方法及应用 土壤微生物量碳（Soil microbial biomass）不仅对土壤有机质和养分的循环起着主要作用，同时是一个重要活性养分库，直接调控着土壤养分（如氮、磷和硫等）的保持和释放及其植物有效性。近40年来，土壤微生物生物量的研究已成为土壤学研究热点之一。由于土壤微生物的碳含量通常是恒定的，因此采用土壤微生物碳(Microbial biomass carbon, Bc)来表示土壤微生物生物量的大小。测定土壤微生物碳的主要方法为熏蒸培养法（Fumigation-incubation, FI）和熏蒸提取法（Fumigation-extraction, FE）。 熏蒸提取法（FE法） 由于熏蒸培养法测定土壤微生物量碳不仅需要较长的时间而且不适合于强酸性土壤、加 入新鲜有机底物的土壤以及水田土壤。Voroney (1983)发现熏蒸土壤用·L-1K 2SO 4 提取液提取 的碳量与生物微生物量有很好的相关性。Vance等(1987)建立了熏蒸提取法测定土壤微生物 碳的基本方法：该方法用·L-1K 2SO 4 提取剂（水土比1：4）直接提取熏蒸和不熏蒸土壤，提取 液中有机碳含量用重铬酸钾氧化法测定；以熏蒸与不熏蒸土壤提取的有机碳增加量除以转换 系数K EC (取值来计算土壤微生物碳。 Wu等（1990）通过采用熏蒸培养法和熏蒸提取法比较研究，建立了熏蒸提取——碳自动一起法测定土壤微生物碳。该方法大幅度提高提取液中有机碳的测定速度和测定结果的准确度。 林启美等（1999）对熏蒸提取-重铬酸钾氧化法中提取液的水土比以及氧化剂进行了改进，以提高该方法的测定结果的重复性和准确性。 对于熏蒸提取法测定土壤微生物生物碳的转换系数K EC 的取值，有很多研究进行了大量的 研究。测定K EC 值的实验方法有：直接法（加入培养微生物、用14C底物标记土壤微生物）和间接法（与熏蒸培养法、显微镜观测法、ATP法及底物诱导呼吸法比较）。提取液中有机碳的 测定方法不同（如氧化法和仪器法），那么转换系数K EC 取值也不同，如采用氧化法和一起法 K EC 值分别为（Vance等，1987）和（Wu等，1990）。不同类型土壤（表层）的K EC 值有较大不 同，其值变化为（Sparling等，1988，1990；Bremer等，1990）。Dictor等（1998）研究表 明同一土壤剖面中不同浓度土层土壤的转换系数K EC 有较大的差异，从表层0-20cm土壤的K EC 为，逐步降低到180-220cm土壤的K EC 为。 一、基本原理 熏蒸提取法测定微生物碳的基本原理是：氯仿熏蒸土壤时由于微生物的细胞膜被氯仿破 坏而杀死，微生物中部分组分成分特别是细胞质在酶的作用下自溶和转化为K 2SO 4 溶液可提取 成分（Joergensen,1996）。采用重铬酸钾氧化法或碳-自动分析仪器法测定提取液中的碳含量，以熏蒸与不熏蒸土壤中提取碳增量除以转换系数K EC 来估计土壤微生物碳。 二、试剂配制 （1）硫酸钾提取剂（·L-1）：取分析纯硫酸钾溶解于蒸馏水中，定溶至10L。由于硫酸钾较难溶解，配制时可用20L塑料桶密闭后置于苗床上（60-100rev·min-1）12小时即可完全溶解。 （2） mol·L-1（1/6K 2Cr 2 O 7 ）标准溶液：称取130℃烘2-3小时的K 2 Cr 2 O 7 （分析纯）9.806g 于1L大烧杯中，加去离子水使其溶解，定溶至1L。K 2Cr 2 O 7 较难溶解，可加热加快其溶 解。 （3） mol·L-1（1/6K 2Cr 2 O 7 ）标准溶液：取经130℃烘2-3小时的分析纯重铬酸钾4.903g， 用蒸馏水溶解并定溶至1L。

微生物计数方法

微生物的显微直接计数法 一、实验目的 了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。 二、实验原理 测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。 显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。 血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区（图21-1），计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。 计数区边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。 使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。 已知：1mm3体积=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3 所以：1mm3体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4×106个小方格，即系数K=4×106。 因此：每ml菌悬液中含有细胞数= 每个小格中细胞平均数（N）×系数（K）×菌液稀释倍数（d） 三、实验器材 1．活材料：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面或培养液。 2．器材：显微镜、血球计数板、盖玻片（22mm×22mm）、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。 四、实验方法 1．视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释到10-2），以每小格的菌数可数为度。 2．取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。 3．将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。4．静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。 5．计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央l个大方格的菌数（即80个小格）。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。

凯氏定氮法：土壤微生物量氮测定

土壤微生物量氮的测定方法 1.试剂配制： (1)混合催化剂：按照硫酸钾：五水硫酸铜：硒粉=100：10：1，称取硫酸钾100g、 五水硫酸铜10g、硒粉1g。均匀混合后研细,贮于瓶中。 (2)密度为1.84浓硫酸。 (3)40%氢氧化钠：称400g氢氧化钠于烧杯中，加蒸馏水600ml，搅拌使之全部溶 解定容至1L。 (4)2%硼酸溶液：称20g硼酸溶于1000ml水中，再加入20ml混合指示剂。（按体 积比100:2加入混合指示剂） (5)混合指示剂：称取溴甲酚绿0.5g和甲基红0.1克,溶解在100ml95%的乙醇中, 用稀氢氧化钠或盐酸调节使之呈淡紫色，此溶液pH应为4.5。 (6)0.01mol的盐酸标准溶液：取比重1.19的浓盐酸0.84ml，用蒸馏水稀释至 1000ml，用基准物质标定之。 (7)0.5M K2SO4溶液：称取K2SO4 87.165g溶解于蒸馏水中，搅拌溶解，（可加 热）定容至1L。 (8)去乙醇氯仿的配制：在通风柜中，量取100毫升氯仿至500毫升的分液漏斗 中，加入200毫升的蒸馏水，加塞，上下振荡10下，打开塞子放气，而后加塞再振荡10下，反复3次，将分液漏斗置于铁架台上，静止溶液分层，打开分液漏斗下端的阀，将下层溶液（氯仿）放入200毫升的烧杯中，将剩余的溶液倒入水槽，用自来水冲洗。再将烧杯中的氯仿倒入分液漏斗中，反复3次。将精制后的氯仿倒入棕色瓶中，加入无水分析纯的CaCl2 10g，置于暗处保存。 2.试验步骤：。 （1）制样：称取新鲜土壤（30.0g）于放置烧杯中，加约等于田间持水量60%水在25℃下培养7~15d。取15.0g土于烧杯，置于真空干燥器中，同时内放一装有用100ml精制氯仿的小烧杯，密封真空干燥器，密封好的真空干燥器连到真空泵上，抽真空至氯仿沸腾5分钟，静置5分钟，再抽滤5分钟，同样操作三次。干燥器放入25℃培养箱中24小时后，抽真空15-30分钟以除尽土壤吸附的氯仿。按照土：0.5M K2SO4=1:4(烘干土算，一般就是湿土：0.5M K2SO4=1：2)，加入0.5M K2SO4溶液（空白直接称取15.0g土，加同样比例0.5M K2SO4溶液）震荡30分钟，过滤。 （2）测定：滤液要是不及时测定，需立即在-15℃以下保存，此滤液可用于微生物碳氮的测定。微生物碳测定只吸取2ml，采用重铬酸钾-硫酸亚铁滴定法测定。微生物氮吸取滤液10ml于消化管中，加入2g催化剂，在再加5ml浓硫酸，管口放一弯颈小漏斗，将消化管置于通风橱内远红外消煮炉的加热孔中。打开消煮炉上的所有加热开关进行消化，加热至微沸，关闭高档开关，继续加热。消煮至

土壤中的微生物

1．土壤是微生物生长和栖息的良好基地 土壤具有绝大多数微生物生活所需的各种条件，是自然界微生物生长繁殖的良好基地：其原因在于土壤舍有丰富的动植物和微生物残体，可供微生物作为碳源、氮源和能源。土壤台有大量而全面的矿质元素，供微生物生命活动所需。土壤中的水分都可满足微生物对水分的需求。不论通气条件如何，都可适宜某些微生物类群的生长。通气条件好可为好氧性微生物创造生活条件；通气条件差，处于厌氧状态时又成了厌氧性微生物发育的理想环境。土壤中的通气状况变化时，生活其问的微生物各类群之间的相对数量也起变化。土壤的pH值范围。3．5～10．0之间，多数在5.5～8．5之间，而大多数微生物的适宜生长pH也在这一范围。即使在较酸或较碱性的土壤中．也有较耐酸、喜酸或较耐碱、喜碱的微生物发育繁殖，各得其所地生活着。土壤温度变化幅度小而缓慢．夏季比空气温度低，而冬季又比空气温度高，这一特性极有利于微生物的生长。土壤的温度范围恰是中温性和低温性微生物生长的适宜范围。 因此，土壤是微生物资源的巨大宝库。事实上，许多对人类有重大影响的微生物种大多是从土壤中分离获得的，如大多数产生抗生素的放线菌就是分离自土壤。 2．土壤中的微生物数量与分布 土壤中微生物的类群、数量与分布，由于土壤质地发育母质、发育历史、肥力、季节、作物种埴状况、土壤深度和层次等等不同而有很大差异。lg肥沃的菜园土中常可含有108个甚至更多的微生物，而在贫瘠土壤如生荒土中仅有103～107个微生物，甚至更低。土壤微生物中细菌最多，作用强度和影响最大，放线菌和真菌类次之，藻类和原生动物等数量较少，影响也小。 (1)细菌 土壤中细菌可占土壤微生物总量的70％～90％，其生物量可占土壤重量的 1/10000左右。但它们数量大，个体小，与土壤接触的表面积特别大，是土壤中最大的生命活动面，也是土壤中最活跃的生物因素．推动着土壤中的各种物质循环。细菌占土壤有机质的1％左右。土壤中的细菌大多为异养型细菌，少数为自养型细菌。土壤细菌有许多不同的生理类群，如固氮细菌、氨化细菌、纤维分解细菌、硝化细菌、反硝化细菌、硫酸盐还原细菌、产甲烷细菌等在土壤中都有存在。细茼在土壤中的分布方式一般是黏附于土壤团粒表面，形成菌落或菌团，也有一部分散布于土壤溶液中，且大多处于代谢活动活跃的营养体状态。但由于它们本身的特点和土壤状况不一样．其分布也很不一样。 细菌积极参与着有机物的分解、腐殖质的合成和各种矿质元素的转化； (2)放线菌 土壤中放线菌的数量仅次于细菌．它们以分枝丝状营养体缠绕于有机物或土粒表面，并伸是于土壤孔隙中。1g土壤中的放线菌孢子可达107～108个．占土壤微生物总数的5％～30%．在有机物含量丰富和偏碱性土壤中这个比例更高。

土壤微生物量测定方法

土壤微生物量测定方法 一、土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸－K2SO4提取-碳分析仪器法） 1、试剂 （1）去乙醇氯仿制备：在通风橱中，将分析纯氯仿与蒸馏水按1 ? 2（v : v）加入分液漏斗中，充分摇动1 min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。得到的无乙醇氯仿中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。纯化后的氯仿置于试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存。 （2）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 1 mol L-1]：通常分析纯固体氢氧化钠中含有碳酸钠，与酸作用时生成二氧化碳，从而影响滴定终点判断和测定的准确度。配制时应先除去碳酸钠，根据碳酸钠不溶于浓碱，可先将氢氧化钠配成50%（w : v）的浓氧溶液，密闭放置3～4 d。待碳酸钠沉降后，取56 ml 50%氢氧化钠上清液（约19 mol L-1），用新煮沸冷却的除去二氧化碳的蒸馏水释稀到1 L，即为浓度1 mol L-1 NaOH溶液，用橡皮塞密闭保存。 （3）硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= mol L-1]：取1742.5 g分析纯硫酸钾，用研钵磨成粉末状，倒于25 L塑料桶中，加蒸馏水至20 L，盖紧螺旋盖置于摇床（150 r min-1）上溶解24 h 即可。 （4）六偏磷酸钠溶液[ρ（Na）= 5 g 100 ml-1，pH ]：称取50.0 g分析纯六偏磷酸钠溶于800 ml高纯度去离子水中，用分析纯浓磷酸调节至pH ，用高纯度去离子水定容至1 L。要注意的是六偏磷酸钠溶解速度很慢应提前配制；由于其易粘于烧杯底部，若加热常因受热不均使烧杯破裂。 ) （5）过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2 g 100 ml-1]：称取20.0 g分析纯过硫酸钾，溶于高纯度去离子水中，定容至1 L。值得注意过硫酸钾溶液易被氧化，应避光存放且最多使用7 d。 （6）磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100 ml-1]：量取37 ml 分析纯浓磷酸（85%），慢慢加入到188 ml高纯度去离子水中即可。 （7）邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（）= 1000 mg C L-1]）：取2.1254 g经105℃烘2～3 h的分析纯邻苯二甲酸氢钾，溶于高纯度去离子水，定容至1 L。 2、仪器设备 碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100 ml）、振荡器（300 r min-1）、可调加液器（50 ml）、可调移液器（5 ml）、烧杯（盛滤液用）（50~100 ml）、聚乙烯提取瓶（100，150 ml），聚乙烯塑料桶（20 L，带螺旋盖），三角瓶（150 ml）、其它常规仪器。 3、操作步骤 ; （1）土样前处理 新鲜土壤应立即处理或保存于4℃冰箱中，测定前先仔细除去土样中可见植物残体（如根、茎和叶）及土壤动物（如蚯蚓等），过筛（孔径< 2 mm），彻底混匀。如果土壤过湿，应在室内适当风干，以手感湿润疏松但不结块为宜（约为饱和持水量的40%）。如果土壤过于干燥，用蒸馏水调节至饱和持水量的40%。将土壤置于密封的大塑料桶内在25℃条件下预培养7～15 d，桶内有适量水以保持相对湿度为100%，并在桶内放一小杯1 mol L-1 NaOH 溶液以吸收土壤呼吸产生的CO2。经过预培养的土壤应立即分析。如需保留，应放置于4℃

土壤微生物计数法

土壤微生物计数法 土壤是最复杂、最丰富的微生物基因库，所含微生物不仅数量巨大，而且各类繁多，主要包括细菌、真菌和放线菌三大类，是土壤最活跃的成分。土壤微生物数量测定方法可分为三大类：一类是根据在培养基上生长的菌落数来计算土壤微生物的数量，统称为培养计数法，主要有稀释平板法和最大或然计数法；二类是将土壤微生物染色后，在显微镜下观察计数，称为直接镜检法，包括涂片法、琼脂薄片法和膜过滤法等；三类是直接将微生物从土壤中分离和提取出来后再进行测定，主要有离心分离法。 1.1培养计数法 1.1.1概要 在自然条件下，土壤中的大多数微生物处于休眠状态，一旦供给可利用的碳源（如培养基），一些微生物将快速生长繁殖。因此，根据在培养基上所生长的微生物数量，可以估算土壤中微生物的数量。这种土壤微生物数量测定方法称为培养计数法，主要包括稀释平板计数法（简称稀释平板法）和最大或然计数法。 稀释平板计数法的基本原理：土壤微生物经分散处理成为单个细胞后，在特殊的培养基上生长并形成一个菌落，根据形成的菌落数来计算微生物的数量。 最大或然计数法的基本原理：假设被测定的微生物在稀释液中均匀分布，并在试管或平板上全部存活，随着稀释倍数的加大，稀释液中微生物的数量将越来越少，直到将某一稀释度的土壤稀释液接种到培养基上培养后，没有或很少出现微生物菌落。根据没有出现菌落的最低稀释度和出现菌落的最高稀释度，再用最大或然计数法计算出样品中微生物的数量。 1.1.2稀释平板法 一、试剂配制

常用的培养基各类很多（见附录一），可根据需要测定的微生物种类选择培养基。按配方配制培养基后，先在121℃下灭菌15min，冷却至45～50℃使用。凝固后的培养基可加热溶解后使用。 二、仪器设备 广口瓶或三角瓶及配套的橡皮塞，移液管（1ml、10ml，吸口用棉花塞住后用牛皮纸包好灭菌）培养皿（9㎝，用牛皮纸包好后灭菌）和显微镜等。 三、操作步骤 （1）土壤系列稀释液制备 取新鲜土壤（＜2㎜）10.00g，放入经灭菌的装有70ml水的广口瓶中，塞上经灭菌的橡皮塞，在振荡机上振荡10min，此为10-1土壤稀释液。迅速用灭菌的移液管吸取10-1土壤稀释液10ml，放入灭菌的装有90ml水的广口瓶中，塞上橡皮塞，混合均匀，此为10-2土壤稀释液。再如此依次配制10-3、10-4、10-5和10-6系列土壤稀释液。上述操作均在无菌条件下进行，以避免污染。 （2）平板制备和培养 从两个稀释倍数的土壤稀释液中（细菌和放线菌通常用10-5和10-6土壤稀释液，真菌用10-2和10-3稀释液）吸取1.00ml（吸前摇匀），分别放入五套培养皿中（注意每变换一次浓度，须更换一支移液管）；再向培养皿内注入45～50℃的培养基10ml，立即混合均匀，静置凝固后，倒置放于培养箱中培养。细菌和放线菌在28℃下培养7～10d，真菌在25℃下培养3～5d。 （3）镜检计数

微生物大小测定和显微镜直接计数

实验五微生物大小测定和显微镜直接计数 一、实验目的： 1、了解显微测微尺的结构； 2、掌握显微测微尺用于测量菌体的方法； 3、学习使用血细胞计数板计算酵母细胞数的原理和方法； 4、了解微生物活体染色的原理的技术的方法。 二、实验原理： 1、显微测微尺可用于测量微生物细胞或孢子的大小，包括镜台测微尺和目镜测微尺两个部件。镜台测微尺全长1mm，等分为100格，每格0.01mm。用于校正目镜测微尺没小哥的长度.目镜测微尺其中央刻有50等分或100等分的小格.测量前应预先用镜台测微尺来校正并计算出在某一放大镜下,目镜测微尺每小格所代表的实际长度,再以后作为测量微生物 细胞的长度.目镜测微尺每格长度/μm = 两条重合线间镜台测微尺的格数×10/两条重合线间目镜测微尺的格数 2、利用血球计数板直接在显微镜下计数微生物的细胞（或孢子）数目。优点：直观、快速、操作简便，其缺点为：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察 1ml菌液中的总菌数=（5个方格中的总菌数/5）×25×104×稀释倍数 本实验中暂规定：计上不计下，计左不计右，即位于本格上线和左线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中 三、实验步骤： （一）微生物大小的测定： 1、放置目镜测微尺：取出目镜，旋开目透镜，目镜测微尺放在光阑上，旋上目镜，将目镜插入镜筒 2、将镜台测微尺放在井台上，调焦看清镜台测微尺的刻度 3、低倍镜下使镜台测微尺与目镜测微尺刻度平行，一段起止线重合，分别数出格数并求出目镜测微尺每小格的实际长度，同样的方法在高倍镜下重复进行 4、按公式计算目镜测微尺每格的长度 5、测量菌体的大小：取下镜台测微尺，制作酵母菌涂片，分别在低倍镜、高倍镜下测量10个菌体的长宽，求其平均值，用长（μm)*宽（μm）表示 （二）显微镜直接计数 1、制备酵母菌的稀释液，将菌液稀释10倍 2、将计数板的盖玻片放在计数室上面的两边平台架上，混匀后酵母菌悬液吸取滴加在盖玻片与计数板的边缘缝隙处，待菌液渗入计数室，菌体自然沉降与稳定后计数 3、在计数室移至视野中央，选取25中格（4觉与中央）计含菌数，重复计数2-4个计数室内的含菌量，求其平均值。 四、材料和器皿： 酵母菌液，显微镜，镜台测微尺，目镜测微尺，擦镜纸，二甲苯，血细胞计数板，配套的计数板厚盖玻片，试管，移液管，吸水纸。 五、实验结果：

土壤微生物生物量碳及其影响因子研究进展(精)

土壤微生物生物量碳及其影响因子研究进展3 黄辉(1陈光水(1谢锦升(1黄朝法(2 (1.福建师范大学福州350007;2.福建省林业调查规划院福州350003 摘要:笔者较为全面地综述了国内外土壤微生物生物量碳的研究成果。笔者针对土壤微生物生物量碳主要受到碳氮限制、树种类型、土地利用方式、管理措施、土壤湿度和温度、土壤质地等因素的影响,提出了今后的研究应集中在以下几个方面:(1加强不同尺度土壤微生物生物量碳的影响因子及调控机理研究;(2进一步加强不同土壤类型下土壤微生物生物量碳动态及调控机理研究;(3对影响土壤微生物生物量碳高低不确定性的因子进行深入研究;(4加强其他因子对土壤微生物生物量碳影响的研究;(5探讨全球气候变化对土壤微生物生物量碳的影响。 关键词:微生物生物量碳;土壤;影响因子;全球变化 Adva nces on Soil Microbial Biomass Ca rbon a nd Its Effect Factor Huang Hui(1Che n Gua ngshui(1Xie J ingsheng(1Huang Chaof a(1 (1.Fujia n N or mal U niversity Fuzhou350007;2.Fujian Provincial Forest ry Survey a nd Planning Institute Fuzhou350003 Abstract:The aut hors review current knowledge of t he p roperty and deter mination of soil microbial biomass carbon a nd several f act ors cont rolling its dynamics bot h at home a nd abroad.By now,t here are several f ac2 t ors influe ncing soil microbial biomass carbon w hich include inhere nt p roperties of t he soil like texture,mois2 ture and temp erature a nd etc.Besides t hese,external f act ors(C a nd N limitation,sp ecies typ e,ma nageme nt measures and diff ere nces in la nd usealso cont rol on soil microbial biomass carbon.Despite intensive resear2 ches in recent years,t he uncertainties of soil microbial biomass still re main f or f urt her studies:(1St re ngt he2 ning eff ect f act ors of soil microbial biomass carbon a nd its cont rol mecha nism at diff erent scale;(2Paying

大学土壤微生物分离实验报告

从土壤中分离纯培养微生物并作初步观察鉴定 实验报告 生物科学与技术系 09食品（2）班 姓名：xxx 学号：xxx

从土壤中分离纯培养微生物并作初步观察鉴定 【摘要】利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离与纯化，根据菌落形态观察及一系列的生理生化试验的结果，对照种属特征初步鉴定分离纯化的微生物所属的类群。 【关键词】细菌放线菌霉菌划线分离培养基的配制高压蒸汽灭菌 前言： 在自然条件下，微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。群落是不同种类微物的混和体。为了生产和科研的需要，人们往往需要从自然界混杂的微生物群体中分离出 具有特殊功能的纯种微生物；或重新分离被其他微生物污染或因自发突变而丧失原 有优良性状的菌株；或通过诱变及遗传改造后选出优良性状的突变株及重组株。这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离纯化技术。纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。 分离纯化技术主要由采集样品、富集培养、纯种分离和性能测定等几个基本环节组成。 实验目的： 1、学习从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。 2、学习、掌握微生物的鉴定方法。 3、对提取的土样进行微生物分离、纯化培养，根据菌落的形态特征判断未知菌的类别。实验原理： 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。通过如下几种方法可以分离纯化微生物：稀释倒平板法(pour plate method)、涂布平板法(spread plate method)、稀释摇管法(dilution shake culture method)、平板划线分离法（stesak plate method）。 此次实验采取的是平板分离法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其基本原理主要包括两个方面：（一）选择适合于待分离微生物的生长条件或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰大部分不需要的微生物。（二）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细

非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法

湖南湘大兽药有限公司工作标准文件 一、目的：为规定非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法的检测方法和操作要求，特制定本操作规程。 二、引用标准：中华人民共和国兽药典（2015年版一部附录P179）。 三、适用范围：适用于本公司检品采用非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法的质量检测。 四、责任者：理化分析员对本标准的实施负责。 五、正文： 1简述： 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。 微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。 如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。 供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。 2.计数方法 计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-Number Method，简称MPN 法）。MPN 法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，

MPN 法可能是更适合的方法。 供试品检查时,应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，检测的样品量应能保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。所选方法的适用性须经确认。 3.计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验 供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。 供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。 若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。 表 1 试验菌液的制备和使用

土壤微生物生物量的测定(滴定法)(精)

1. 土壤微生物生物量的测定 (滴定法 一、实验目的和内容 土壤微生物生物量是指土壤中体积小于5~10μm 3活的微生物总量, 是土壤有机质中最活跃的和最易变化的部分。耕地表层土壤中,土壤微生物量碳(Bc 一般占土壤有机碳总量的 3%左右,其变化可直接或间接地反映土壤耕作制度和微生物肥力的变化,并可以反映土壤污染的程度。近 30年来,国外许多学者对土壤微生物生物量的测定方法进行了比较系统的研究,但由于土壤微生物的多样性和复杂性,还没有发现一种简单、快速、准确、适应性广的方法。目前广泛应用的方法包括:氯仿熏蒸培养法(FI 、氯仿熏蒸浸提法(FE 、基质诱导呼吸法(SIR 、精氨酸诱导氨化法和三磷酸腺苷(A TP 法。 氯仿熏蒸浸提法(FE 的原理是:土壤经氯仿熏蒸处理,微生物被杀死,细胞破裂后, 细胞内容物释放到土壤中,导致土壤中的可提取碳、氨基酸、氮、磷和硫等大幅度增加。通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物生物量碳。 二、实验材料和用具 仪器:培养箱;真空干燥器;真空泵;往复式振荡机(速率 200次每 min ; 1L 广口玻璃瓶;定量滤纸;紫外分光光度计; LNK-872型消煮炉(江苏省宜兴市科教仪器研究所试剂: 1. 无乙醇氯仿:市售的氯仿都含有乙醇(作为稳定剂 ,使用前必须除去乙醇。方法为:量取 500ml 氯仿于 1000ml 分液漏斗中,加入 50ml 硫酸溶液[ρ(H2SO 4=5%], 充分摇匀, 弃除下层硫酸溶液, 如此进行 3次。再加入 50ml 去离子水, 同上摇匀, 弃去上部的水分,如此进行 5次。将下层的氯仿转移存放在棕色瓶中,并加入约 20g 无水 K 2CO 3,在冰箱的冷藏室中保存备用。 2. 硫酸钾溶液 [c(K2SO4=0.5mol·L -1]称取硫酸钾(K 2SO 4,化学纯 87.10g ,先溶于

微生物直接计数法及测微技术

微生物直接计数法及测微技术 实验类型：基础 学时：4(参考) 内容： 一、实验目的 1.了解血球计数板计数原理，并掌握计数方法。 2.掌握用测微尺测定微生物大小的方法。 二、实验原理 显微镜直接计数法是将一定稀释的菌体或孢子悬液注入血球计数板的计数室中，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。因为计数板是一块特别的载玻片。其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格(见图2—3—44)；另一种是一个大方格分成16个中方格，每个中方格又分成25个小方格，无论哪种每个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为0．1mm，所以计数室的容积为0．1mm3。计数时，通常只用5个中格内的菌体(孢子)数即可。然后求出每个中方格的平均值，再乘上25或16，得出一个大方格中的总茵数，再换算成lml菌液中的总菌数。若设5个中方格中总菌数为N，菌液稀释倍数为M，如果是25个中方格计数板，则计算方法为： lml菌液中的总菌数=平均每个中格中菌的个数×25×104×M=50000N·M(个) 微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具——测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般是将1mm等分为100格，每格长0．01mm(即10pm)。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度。 三、试剂与器材 1.材料酿酒酵母、藤黄微球菌和大肠杆菌的染色标本片、酿酒酵母24h马铃薯斜面培养物。 2.实验器材细胞计数板、显微镜、盖玻片、无菌毛细滴管、目镜测微尺、镜台测微尺、载玻片、盖玻片、显微镜等。 四、实验内容 1.微生物直接计数法 菌悬液制备→镜检计数室→加样品→显微镜计数→清洗血细胞计数板 2.微生物测微技术 装目镜测微尺→校正→菌体大小测定 五、关键步骤及注意事项 1.防止加样空气泡产生。 2.调节显微镜光线的强弱适当。 六、思考题 1.根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面?应如何尽量减少误差、力求准确? 2.某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计1～2种可行的检测方法。 3.为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正?