沈阳药科大学考研生化笔记 第一章 蛋白质的结构与功能

第一章 蛋白质的结构与功能
蛋白质在生命活动中的中重要功能
1. 蛋白质是生命的物质基础，一切生命活动离不开蛋白质。
蛋白质普遍存在于生物界，从病毒、细菌到动、植物都含有蛋白质，病毒除核酸外几乎都由蛋白质组成，甚至朊病毒（prion）就只含蛋白质而不含核酸。蛋白质也是各种生物体内含量最多的有机物质。人体内蛋白质含量就约占其干重的45%左右，细菌占50%～80%。占本书的篇幅最多。核酸是遗传大分子，蛋白质是功能大分子，都是生命的物质基础。
2. 体内一些蛋白质的重要生理功能：
（一） 催化功能（二） 调节功能（三） 保护和支持功能（四） 运输功能
（五） 储存和营养功能（六）收缩和运动功能（七）防御功能（八） 识别功能
（九） 信息传递功能（十） 基因表达调控功能（十一）凝血功能
（十二）蛋白质的其他众多生理功能
3. 氧化功能
第一节 蛋白质的分子组成
一、蛋白质的元素组成及特点
蛋白质是大分子化合物，相对分子质量（Mr）一般上万，结构十分复杂，但都是由C、H、O、N、S等基本元素组成，有些蛋白质分子中还含有少量Fe、P、Zn、Mn、Cu、I等元素，而其中氮的含量相对恒定，占13%～19%，平均为16%，因此通过样品中含氮量的测定，乘以6.25，即可推算出其中蛋白质的含量。
二、组成蛋白质的基本结构单位---氨基酸（三字符）
（一）氨基酸的结构
1.结构通式：大分子蛋白质的基本组成单位或构件分子（building-block molecule）是氨基酸（amino acid，AA）。在种类上，虽然自然界中存在着300多种氨基酸，但构成蛋白质的只有20种氨基酸，且都是L,α-氨基酸，在蛋白质生物合成时它们受遗传密码控制。另外,组成蛋白质的氨基酸，不存在种族差异和个体差异。
氨基酸分子的结构通式为：
2.结构特点：
①在20种氨基酸中，除甘氨酸不具有不对称碳原子外，其余均为Ｌ,α-氨基酸。
②除脯氨酰是亚氨基酸外，其余均为Ｌ,α-氨基酸。
蛋白质分子中尚含有一些经修饰的氨基酸，并无遗传密码编码，它们往往是在蛋白质生物合成后，由其中相应氨基酸经加工修饰生成。如胱氨酸是由2个半胱氨酸脱氢氧化生成，含有二硫键，存在于部分蛋白质分子中；而羟赖氨酸与羟脯氨酸来自蛋白质中赖氨酸和脯氨酸的羟化，主要存在于胶原蛋白分子中，它与胶原蛋白分子结构的稳定与功能均有关；一些凝血因子分子中含有γ－羧基谷氨酸，也来自蛋白质分子中谷氨酸的羧化，且与其凝血活性密切有关；而一些酶蛋白分子中的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸羟基，还可与磷酸结合被磷酸化等，更与酶活性的调节功能密切相关。

③胱氨酸、羟脯氨酸、羟赖氨酸等是蛋白质合成后加工来的。
④鸟氨酸、瓜氨酸不参与蛋白质的组成，参与蛋白质代谢。β-丙氨酸参与组成维生素。
3.氨基酸的三字头符号
4.氨基酸的分类：
20种天然氨基酸按侧链的理化性质分为4类:
（1）非极性疏水性氨基酸,包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸七种。
(2)极性中性氨基酸,包括色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸等共8种氨基酸。
(3)酸性氨基酸,包括天冬氨酸和谷氨酸。
（4）碱性氨基酸,包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸。
其他分类方法
20种氨基酸按其侧链R结构的不同，在化学中可分为脂肪族、芳香族和杂环氨基酸三大类，分别含15种、2种和3种氨基酸。在脂肪族氨基酸中，3种是支链氨基酸，而大多是直链氨基酸。在20种氨基酸中，有2种是含硫氨基酸和3种是含羟基的氨基酸。
在生物化学中，氨基酸是根据其酸性基团（羧基）和碱性基团（氨基、胍基、咪唑基）的多寡而分为酸性氨基酸、碱性氨基酸和中性氨基酸三类，其中酸性氨基酸含2个羧基和1个氨基，碱性氨基酸含2个或2个以上碱性基团和一个羧基，都属于含有可解离基团的极性氨基酸，而中性氨基酸只含有1个羧基和1个氨基，在形成蛋白质分子时都被结合掉，因此根据其侧链R有无极性再分为中性极性氨基酸和中性非极性氨基酸二个亚类，中性极性氨基酸（polar AA）较亲水（hydrophilic），中性非极性氨基酸（non-polar AA）较疏水（hydrophobic）。在形成大分子蛋白质严密的空间结构中，其组成氨基酸侧链R的大小、形状，带电与极性与否，对蛋白质分子空间结构形成和生理功能关系密切。
a) 按侧链基团结构分类 脂肪族、芳香族和杂环氨基酸三大类
b) 按侧链基团酸碱性分类
c) 按医学营养学分类
（二）氨基酸的理化性质：
等电点: 两性电离与等电点（概念）
氨基酸的等电点：在某一pH溶液中，氨基酸解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，氨基酸所带的正电荷和负电荷相等，净电荷为零，此溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。
紫外吸收；色氨酸和酪氨酸在280nm 波长处有最大光吸收，而绝大多数蛋白质都含有色氨酸和酪氨酸，因此紫外吸收法是分析溶液中蛋白质含量的简便方法。
（三）氨基酸间脱水成肽反应（化学反应式）
1.肽键：两分子 氨基酸脱去一分子水后形成的酰胺键称为肽键 。
2.多肽链中肽键与α－碳原子形成一条主链骨架,氨基酸的侧链在此骨架上向外伸出,按规定,多肽链中氨基末端写在左侧,羧基末端写在肽链的右侧,如果把氨基酸序

列标上数码,应以氨基末端的氨基酸为1号,从左向右顺序排列，肽单元的概念。
3.氨基酸通过肽键相连而成肽链，少于10个氨基酸的肽链称为寡肽，大于10个氨基酸的肽链称为多肽。
体内有许多生物活性肽。例如谷胱甘肽，谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成的三肽,第一个肽键不是α－肽键而由谷氨酸γ－羧基与半胱氨酸的氨基组成,GSH的SH代表半胱氨酸残基上的疏基,是该化合物的主要功能基团。 功能： (1)解毒功能：SH基团的嗜核性，能与外源的嗜电子毒物如致癌剂和药物等结合，从而避免这些毒物和DNA、RNA及蛋白质结合，以保护机体免遭毒物损害。(2)GSH是细胞内重要还原剂，它保护蛋白质分子中的SH基团免遭氧化，使蛋白质或酶处在活性状态。(3)GSH上的氢，在谷胱甘肽过氧化物酶的催化下，能还原细胞内产生的H2O2，使其变成H2O，同时GSH成为氧化型即GSSG，后者又在谷胱甘肽还原酶催化下，再生成GSH。因此，GSH是细胞内十分重要的还原剂。
肽 → 蛋白质 → 引出蛋白质的分子结构
第二节蛋白质的分子结构
蛋白质的结构分为一级结构和高级结构。高级结构又分为二级，三级，四级结构。蛋白质结构与功能密切相关。
一．蛋白质的一级结构（primary structure）
1.蛋白质的一级结构的概念：多肽链中氨基酸的线性排列顺序称为蛋白质的一级结构。
2.蛋白质一级结构中的主要化学键是肽键，有些蛋白质还包含二硫键。
3.各种蛋白质分子中氨基酸的序列都不同，甚至同一种族的不同个体的同一种蛋白质的组成和序列也有差别。个体差异、排异反应。
4.有三种形式：开链多肽、分枝开链多肽、环状多肽。
5.蛋白质一级结构是高级结构的基础，但不是唯一决定因素。（提出问题：还有分子伴侣 chaperon ）
二、蛋白质的二级结构 (secondary structure)
（一）肽单元（peptide unit）：参与肽键的6个原子—Cα1，C，O，N，H，Cα2位于同一平面，Cα1和Cα2在平面上所处的位置为反式（trans）构型，此同一平面上的6个原子构成肽单元。
蛋白质的二级结构是指肽链主链的空间构象，即肽链主链的折叠方式，不涉及侧链的空间排布。构成蛋白质主链空间构象的基本单位是肽单元。 20世纪30年代，pauling 和 corey教授应用x衍射技术研究了很多寡肽和氨基酸的晶体结构，获得了一组标准键角和键长，以推导肽的构象，最终提出了肽单元。
C—N键：单键长0.149nm，双键0.127nm，而他0.132nm 。介于单键和双键之间，具有部分双键性质，不能自由旋转。可能是分子间产生共振，C=O双键的性质有40％转给了C—N键，而使肽键6 个原子位于同一平面，不能自由旋转。C?可以自由旋转

，根据实验数据提出了主链原子的局部空间构想。
由于肽键中的C?－C键是一般的单键，可以自由旋转，其转角称为?（psi）角，肽键中的N－C?键也可以自由旋转，其转角称为?（phi）角。在不同的二级结构类型中，?与?角的角度是不同但却是固定的（表2-1）。从表2-1可知，不同的二级结构类型，这两个转角的角度不同。N－C?键从N向C?方向看，C?－C键从C?向羧基C方向看，若顺时针方向旋转则其角度为正，逆时针方向旋转的转角为负。图2-2中的?角为逆时针旋转，其角度为负值；而?角是顺时针方向旋转的，所以其值为正值。

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（二）蛋白质二级结构的定义：蛋白质分子中主链骨架原子的局部空间排列，并不涉及氨基酸残基侧链的构象、及与其它肽段的关系。
（三）蛋白质二级结构：包括α—螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲。维持蛋白质二级结构的化学键是氢键。
1．α-螺旋：（1）多肽链的主链围绕中心轴呈有规律的螺旋式上升，螺旋的走向为顺时钟方向，即右手螺旋；（2）氨基酸侧链伸向螺旋外侧；（3）每个肽键的亚氨基氢和第四个肽键的羰基氧形成氢键，依此类推，肽链中的全部肽键都形成氢键，以稳固α-螺旋结构；（4）每3.6个氨基酸残基螺旋上升一圈，螺距为0.54nm，所以每个氨基酸残基上升的高度为0.15nm。
2．β-折叠：（1）多肽链充分伸展，每个肽单元以Cα为旋转点，依次折叠成锯齿结构；（2）氨基酸侧链交替地位于锯齿状结构的上、下方；（3）两条以上肽链或一条肽链内的若干肽段平行排列，通过链间羰基氧和亚氨基氢形成氢键，从而稳固β-折叠结构；（4）肽链有顺式平行和反式平行两种。
3．β-转角：（1）常发生于肽链180°回折时的转角上；（2）通常有4个氨基酸残基组成，其第一个残基的羰基氧与第四个残基的亚氨基氢可形成氢键。
4．无规卷曲：没有确定规律性的那部分肽链结构。
（四）维持二级结构的力：氢键。
（五）模体（motif）：在许多蛋白质分子中，二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个具有特殊功能的空间结构。一个模序总有其特征性的氨基酸序列，并发挥特殊的功能，如锌指结构，α-螺旋-环-α-螺旋。它们的特点是存在于不同的蛋白质中，但具有相同（或相似）的功能。Motif一词也译为模序或模体。
三、蛋白质的三级结构（tertiary structure of protein）：
1.概念 整条肽链中所有原子的空间排列，即整条肽链所有原子在三维空间的排布位置。蛋白质三级结构的形成和稳定主要靠次级键——疏水作用，离子键、氢键和Van der waals等。一些蛋白质的三级结构可形成数个结构域，

各结构域都有特殊的功能。例如纤连蛋白每条多肽链含有6个结构域，分别与细胞，胶原，DNA，肝素等结合。
2. 结构域（domain），蛋白质中长的肽链常折叠、卷曲成多个半独立的区域，每个区域都有其特定的空间构象，具有独立的生物学功能，具有疏水的核心和极性外表。这些相对半独立的区域称为结构域。如纤连蛋白含有6个结构域。（纤连蛋白是黏附蛋白的一种，影响细胞的形态、组织器官的整体性、与黏附、移动、增殖、分化、吞噬等功能密切有关。）多结构域蛋白的各结构域之间以无规卷曲相连接，形成裂隙或低密度的区间。不同的蛋白质其结构域有不同的功能
3. 分子伴侣。蛋白质空间构象的正确形成，除一级结构为决定因素外，还需分子伴侣的参与。分子伴侣是一类帮助新生多肽链正确折叠的蛋白质，其作用：1．蛋白质在合成时，分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。2．分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。3．分子伴侣对蛋白质分子中二硫键的正确形成，起到重要作用。
4.只有一条多肽链的蛋白质有了三级结构就有活性。
（四）蛋白质的四级结构（quaternary structrue of protein）：
1.亚基 有些蛋白质分子含有二条或多条肽链，才能完整地表达功能，每一条多肽链都有其完整的三级结构，称为蛋白质的亚基。亚基可相同也可不同，数目可多可少。
2.亚基与亚基之间呈特定的三维空间分布，并以非共价链相连接，蛋白质分子中各亚基间相互作用及亚基接触部位的立体布局，称为蛋白质的四级结构。
3. 维系四级结构的作用力主要是疏水作用，氢键和离子键也参与维持四级结构。
4.并非所有蛋白质都有四级结构。含有四级结构的蛋白质，单独的亚基一般没有生物学功能。
第三节 蛋白质结构与功能的关系
这一节研究的内容是从分子水平认识生命现象的一个极为重要的领域。eg：1.酶和激素的作用原理。
2. 疾病发生的机理
一、蛋白质一级结构与功能的关系：
1.一级结构相似功能相似eg：
①Insolin ； ② ACTH与α-MSH 、β-MSH ；③ cytc
2.一级结构中关键部位相同，其生物活性也相同。eg②
3. 一级结构与生物进化。eg③
4.一级结构中关键部位改变，其生物活性也改变。
多肽或蛋白质 氨基酸的位置 相对活性
脑啡肽（5肽） 甘2 蛋5 1.0
衍生物 D-丙 蛋-酰氨 10.0
胰岛素(51肽) A-甘1 天胺21 B组10 苯丙25 1.0
衍生物 × 一 一 一 0.5
一 一 天 一 2.5
5.一级结构预疾病的关系。eg：镰刀型红细胞性贫血。镰刀型红细胞贫血发生的根本原因是

血红蛋白的一级结构发生了差错，人血红蛋白β亚基的第6位氨基酸应该是谷氨酸，而在镰刀型贫血的血红蛋白中却是缬氨酸，本是水溶性的血红蛋白，就会聚集成丝，相互粘着，导致红细胞变形成镰刀状而极易破裂，产生贫血。
6.一级结构是空间结构的基础，但也不尽然。eg：chaperon
① 二硫键的正确形成。
② 初分泌时把疏水部分遮盖，防止错误折叠。
③ 与很多疾病有关，研究手段困难。是研究的热点，后基因组计划研究的内容恣意之一。
二、二级结构与功能的关系
1.模体（花色品种）螺旋环螺旋、锌指结构可指向DNA的大沟，与转录调控有关。
2. α-螺旋和β-折叠存尊在的部位不一样，功能不一样。
三、三级结构与功能的关系
以核糖核酸酶为例说明。核糖核酸酶是由124个氨基酸残基组成的一条多肽链，有4对二硫键。加入尿素（或盐酸胍，作用是破坏氢键）和β-巯基乙醇（可将二硫键还原成巯基，破坏二硫键），导致此酶的二、三级结构遭到破坏，酶活性丧失，但肽键不受影响，所以一级结构不变，采用透析去除尿素和β-巯基乙醇后，理论上二硫键的形成有105种方式，即正错配对率低于1%，而实验结果发现正确配对率为95%～100%。证明空间构象遭到破坏的核糖核酸酶，只要其一级结构未被破坏，松散的多肽链可循其特定的氨基酸顺序，卷曲折叠成天然的空间构象，酶活性又逐渐恢复至原来水平。
四、四结构与功能的关系
以血红蛋白为例说明。Hb由2条α链和2条β链组成。4个亚基间通过8个盐键，紧密结合形成亲水的球状蛋白。未结合O2时，α1与β1，α2与β2呈对角排列，结构紧密，称紧张态（tense state, T态），Hb与O2亲和力小，此时Fe2+半径比卟啉环中间的孔大，高出卟啉环0.075nm，当第1个O2与Fe2+结合后，Fe2+半径变小，进入卟啉环的孔中，引起F肽的微小的移动，影响附近肽段的构象，α1、α2间的盐键断裂，结合松弛，促进α2与O2结合，依此方式影响第三、四个亚基与O2结合。随着与O2的结合，4个亚基间的盐键断裂，四级结构发生剧烈的变化，α2/β2相对α1/β1移动15°夹角，Hb结构变得松驰，称为松驰态（relaxed state, R态），最后四个亚基全处于R态。
第四节 蛋白质的理化性质及其分离纯化
一、蛋白质的理化性质
（一）蛋白质的两性电离：
1. 两性电离
2. 等电点 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，侧链中某些基团在一定条件下可解离成带正电荷或负电荷的基团。在某一pH溶液中，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，蛋白质所带的正电荷和负电荷相等，净电荷为零，此溶液的pH值称为该蛋白质的等电点。
3. 应

用 分离蛋白质、氨基酸，电泳技术。
（二）蛋白质的胶体性质：
1.稳定因素 蛋白质分子颗粒大小在1—-100nm胶体范围之内。维持蛋白质溶液稳定的因素有两个：（1）水化膜：蛋白质颗粒表面大多为亲水基团，可吸引水分子，使颗粒表面形成一层水化膜，从而阻断蛋白质颗粒的相互聚集，防止溶液中蛋白质的沉淀析出。（2）同种电荷：在pH≠pI的溶液中，蛋白质带有同种电荷。pH>pI，蛋白质带负电荷；pH2.不易透过半透膜 透析的原理及临床应用。
（三）蛋白质的变性,复性和凝固：
1.变性的概念（denaturation of protein） 在某些物理和化学因素(如加热，强酸，强碱，有机溶剂，重金属离子及生物碱等)作用下，其特定的空间构象被破坏，从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失，称为蛋白质的变性。
2.变性的因素、本质
3.变性的特征
4.变形的应用
5.变形与沉淀的关系
变性的蛋白质易于沉淀，但是沉淀的蛋白质不一定变性。
变性的蛋白质，只要其一级结构仍完好，可在一定条件下恢复其空间结构，随之理化性质和生物学性质也重现，这称为复性。蛋白质在强酸，强碱溶液中发生变性后，仍能溶解于该溶液中。若将pH调至蛋白质的等电点，变性蛋白质成絮状析出，若再加热，絮状物可形成比较坚固的凝块，这就是蛋白质的凝固作用。
（四）蛋白质沉淀
常用的方法有：
（1）盐析法：在蛋白质溶液中加入大量的硫酸铵，硫酸钠或氯化钠等中性盐，破坏蛋白质的水化膜和同种电荷，使蛋白质颗粒相互聚集，发生沉淀。例如：白蛋白溶于半饱和的硫酸铵溶液中，而球蛋白溶于饱和的硫酸铵溶液中。（pH=7）
（2）有机溶剂沉淀法：使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积，蛋白质被丙酮沉淀时，应立即分离，否则蛋白质会变性，除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。
还有重金属盐沉淀法和生物碱试剂沉淀法。
（（五）蛋白质的紫外吸收：由于蛋白质分子中含有色氨酸和酪氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰，可作蛋白质定量测定。
（六）蛋白质的呈色反应：有茚三酮反应，双缩脲反应等。
二、蛋白质的分离纯化：
蛋白质分离纯化的方法主要有：盐析、透析、超离心、电泳、离子交换层析、分子筛层析等方法。
（一）盐析是应用中性盐加入蛋白质溶液，使蛋白聚集而沉淀。
（二）电泳
（三）透析 透析方法是利用仅能通透小分子化合物的半透膜，使大分子蛋白质和小分子化合物分离，达到浓缩蛋白质或去除

盐类小分子的目的。
（四）层析
（五）超离心
三、多肽链中氨基酸序列分析
自1952年sanger首次完成胰岛素的氨基酸序列测定以来，方法有很大的改进，已有了自动化分析仪器，但基本原理还是sanger 提出的方法。
首先：分析纯化的蛋白质的氨基酸组成，盐酸水解成单个氨基酸，粒子交换层析将各种氨基酸分开，定量算出百分比和个数；
第二步 末端氨基酸分析：N段 sanger当年用二硝基氟苯（DNP)，现在用丹酰氯，该物质有强烈荧光更易辨别。羧基端 用羧肽酶。
第三步 把肽链水解成片段，分别进行分析。
近年来还有用核酸推演蛋白质序列的。
四、蛋白质空间结构的测定
蛋白质空间结构的测定复杂。晶体、x衍射。
x衍射图：即x线穿过晶体的一系列平面剖面所表示的电子云密度图，然后通过计算机绘制出三维空间的电子云密度图。
另外，二维磁共振技术也可用以测定蛋白质的三维空间结构。但有的蛋白质很难获得晶体，例如：糖蛋白。
预测蛋白质空间结构的方法主要有两类：
第一类 用分子力学和分子动力学的方法，根据物理学的基本原理，从理论上算蛋白质的空间结构。
第二类 通过抑制空间结构的蛋白质分析，找出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新的蛋白质空间结构的预测。
例如：发现了锌指结构，有结合钙离子的模体，这个蛋白质就可能有研究的价值。