人免疫缺陷病毒(HIV)与糖基化
5生物工程进展62001,Vol.21,No.1
专 论
人免疫缺陷病毒(HIV)与糖基化
张树政
(中国科学院微生物所 北京
100080)
图1 HIV 模式图1)
自从1981年在美国发现艾滋病以来,世界各地发现艾滋病病例或带病毒者与日俱增。为了医治这种给人类造成巨大危害的病症,全世界范围内很多研究机构的研究人员都在研究开发更为有效的抗H IV 药剂。多年来已经积累了不少有价值的关于人免疫缺陷病毒的信息资料。但至今仍未设计出一种长效抗御这一迅速变异的逆转录病毒。以HIV 基因逆转录酶和宿主蛋白酶抑制剂和化学药物相配合的制剂(或称/鸡尾酒疗法0)治疗艾滋病虽然能够缓解病情,但最终不能彻底防御其抗药性的发展。尽管在多剂并用时,在H IV 感染者血液中检测不到H IV,但仍有H IV 隐藏在感染者淋巴结内。因此必须开发在不同部位起作用的新型抗HIV 药物。采用糖生物工程技术,特别是对糖链在H IV 感染过程中所起的作用,以及以糖链为靶抑制H IV 或艾滋病发病的研究,近年来取得了飞速的发展。HIV 的结构
图中外层为H IV 的糖蛋白,包括包膜糖蛋白
gpl20和跨膜糖蛋白gp41。病毒内核主要含有两种蛋白亚基,pl8和p24,还有RNA 基因及数个分子的逆转录酶。
HIV 糖蛋白gpl20的结构
H IV 的糖蛋白gpl20和gp41是病毒基因组上env 基因编码的共同前体gpl60经宿主蛋白酶降解为位于膜表面并能结合受体的包膜糖蛋白gpl20和跨膜糖蛋白gp41。gpl20分子中有24个N 2糖链的结合部位,其分子中约一半为糖链。糖蛋白的多肽部分通常折叠成为致密的一团,而糖链则展开在蛋白质的表面上。可以想像gpl20分子是由糖链包起来的,也可以说表面带有这种gpl20分子HIV 自身也是由糖链覆盖着的(图2)2)。HIV 包膜糖蛋白gpl20示意图中示出含有高甘露糖及一些复合或杂交型糖基化部位,其中二硫键连接区域用罗马数码标出,高变区(hyper 2variable regions)则以方块中V12V5标示。
N 2糖链的合成过程及相应的酶抑制剂3)
N 2寡糖生物合成包括从长萜醇载体上将Glc 3Man 9GlcNac 2与翻译同步转移到蛋白质具有Asn 2X 2Ser/T hr 序列位点的天门冬酰胺残基上形成G 2寡糖。其末端的葡萄糖残基很快被内质网上的A 2葡萄糖苷酶切除。A 2葡萄糖苷酶有两个明显不同的活力;葡萄糖苷酶?切除未端A 21,2位连接的葡萄糖残基;葡萄糖苷酶ò水解遗留下来的两个A 21,3位连接的葡萄糖残基,进一步经位于内质网和高尔基体常驻糖基转移酶作用,使后续加工成复合型和杂交型结构。
已经证实,有些化合物可抑制纯化的葡萄糖苷酶。在这些抑制剂存在下,复合型寡糖的合成被阻止。但是在许多系统中显示出,当用这类化合物处理细胞时,某些复合型寡糖的合成仍然生成。这里面应有一定原因。原因中包括抑制剂在内质网中未能达到一定的高浓度,以及内切甘露糖苷酶活力的
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图2HIV糖蛋白gp120的结构
存在,将提供旁路机制而胜过葡萄糖苷酶的抑制作用。还曾发现葡萄糖苷酶的抑制对细胞内不同糖蛋白的影响是有选择性的。某些糖蛋白的外泌和在细胞外表面的表达要求寡糖链的精确加工,而另外一些糖蛋白则不一定要求它们的寡糖链完整的加工。
糖基化抑制剂作为抗病毒制剂
当从一定范围的糖类似物中,筛选在体外有抗-H IV活力的物质时,发现N2丁基脱氧半乳糖野尻酶素(NB2DNJ)是一种强效抑制剂,而且细胞毒性最小。这一化合物对纯化的A2葡萄糖苷酶的抑制常数Ki为0122L m。
H IV的包膜糖蛋白都高度地N2糖基化。HIV -1gp120有20)25个用于N2糖基化的潜在部位,其表观分子量的50%为碳水化合物。在gp120一级氨基酸序列内糖基化的位置,相对而言,对H IV21不同分离物来说是一致的。(参见图2)。至少有13个糖基化部位是保守的,其余部位通常约有10个以上的残基位置不会远离参比菌株HIV21óB中的部位。研究表明:在重组CH O中的gp120分子和在感染病毒的细胞株中的gp120都能出现多种类型的糖链:如高甘露糖型,杂交型以及22天线,32天线和42天线糖链结构。而且,在两种系统中,不同类型糖链结构的比例也相类似。对gp120突变体的分析结果表明,在与CD4结合事件后,gp120和gp41的N2糖基化都是必须的,例如病毒外膜和细胞膜的融合。Dwek等人发现以NB2DNJ在体外抑制HIV复制的同样浓度也能抑制细胞内病毒糖蛋白的加工。他们用代谢标记法,以3H标记甘露糖,在加入NB2DNJ 处理时,用内切糖苷酶H切下糖链,再用凝胶过滤色谱分离,发现有未能正确加工的末端序列Glc A1, 2Glc A,1,3Glc A1,3Man存在(图3)。
慢性感染HIV21óB的H9细胞中的gp120也已得到同样结果。用NB2DNJ处理后产生两种结果,即抑制感染HIV2l细胞生成合胞体(syncytia),和减少感染病毒的释放。感染病毒的减少不是因病毒粒子减少释放所致,而是因为释放病毒的感染力降低而造成的。
与含有24个糖基化部位的H IV包膜糖蛋白相反,乙型肝炎病毒包膜蛋白仅含一两个糖基化部位。在体外用NB2DNJ处理这种病毒,其结果有很高比例的病毒粒子保留在细胞内部。初步数据表明,这些病毒含有大量的endo H敏感寡糖,即高甘露糖。这说明,将乙型肝炎病毒转运出细胞外时需要准确的糖基化过程。对NB2DNJ处理两种病毒的影响进行比较,说明了结合在蛋白质上的同一种寡糖可以有不同的作用。
HIV病毒表面糖蛋白糖链在HIV感染中的重要性4)
H IV的感染是从病毒表面的糖蛋白gpl20分子与靶细胞表面的CD4分子的互相结合开始的。
H IV的靶细胞是在免疫系统中起中心作用的辅助性T细胞。H IV的靶分子CD4也是有糖链的糖蛋
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图3在CHO细胞中未经处理和经NB2DNJ处理后重组gp120的N2糖基化结构上部:未经处理的gp120结构
下部:经NB2DNJ处理后的gp120结构
白。由于无糖链的可溶性CD4分子可以抑制gp120分子与固相上有糖链的CD4分子结合,并能抑制H IV的感染,可知CD4分子上的糖链对于H IV的感染并不重要。
许多研究都证明:病毒表面糖蛋白的糖链与H IV感染有密切关系。在衣霉素(Tunicamycin)(它抑制G寡糖的合成)存在下产生的无糖链gp120分子,或者用糖苷酶处理后,彻底除去糖链的gp120分子不能与CD4分子结合。另一方面,天然的gp120分子可以抑制感染HIV的与未感染的细胞形成合胞体,而无糖链的gp120分子则不具有此种能力。另外,在利用G寡糖合成后的在加工过程中不同的抑制剂的研究也可以证明HIV感染过程中病毒糖蛋白糖链的重要性。例如,用切除葡萄糖苷酶的A2葡萄糖苷酶的抑制剂Castanospermine(澳大利亚栗树种子的植物碱)和12脱氧野尻霉素(12deoxynojir2 imycin)抑制N2糖链的加工,使H IV感染细胞不能和未感染细胞形成合胞体。而且,在这种细胞增殖的病毒也没有感染力。但是,用A2甘露糖苷酶ò的抑制剂苦马豆素(Swaisonine)处理感染细胞则没有发现上述现象。根据以上事实,可以说H IV糖蛋白糖链在感染靶细胞过程中是必不可少的。
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HIV感染过程中起重要作用的糖链结构
如上所述,gp120分子被糖链所覆盖,而且gp120分子对感染H IV是必要的,进一步就需要确定在HIV感染过程中是何种糖链起重要作用。
H IV21(óB)的gp120分子不含O2糖链,含有24个N2糖链的结合部位。通过基因工程在CHO 细胞中产生的H IV2l(óB)重组gp120分子中,其24个部位都与糖链结合着。水落次男等人曾将重组gp120与来自感染了H IV2(óB)的T淋巴细胞H9株细胞gpl20分子的糖链进行了详细的分析,其结果如图4和图5。由图可见,CH O细胞产生的重组gp120分子的去唾液酸化糖链(图4)与来自感染细胞的gp120分子的去唾液酸化糖链(图5)都具有各自的多样性结构。此外,重组gp120和病毒感染H9细胞中的gp120分子都具有与CD4分子相同程度的结合能力和抑制合胞体形成的能力。对这两种gp120分子而言与H IV感染有关的糖链应是相同的,至少应含有一个相同的分子。考虑到H IV21(óB)的gp120分子中有24个结合部位,其中保存着对H IV感染有重要作用的糖链占gp120分子全部糖链的1/24,即412%以上。经过对上述两类糖链结构仔细地比较,如表1所示,满足这些条件的gp120分子的糖链只有3种高甘露糖型糖链: Man9GlcNAc2,Man8GlcNAc2和Man7GlcNAc2。因此,可以说明,这些高甘露糖型糖链在H IV感染过程中起着相当重要的作用(表1)。
表1HIV21(óB)gp120分子所含糖链百分含量
来自C HO细胞的gp120分子(%)
来自HIV感染H9细胞的gp120子(%)
高甘露糖型糖链
Man9GlcNAc27.515.0 Man8GlcNAc210.422.0 Man7GlcNAc2 6.910.0 Man6GlcNAc2 3.98.0 Man5GlcNAc2 3.9 5.0混合型糖链 4.4 1.8复合型糖链
含有平分型
GlcNAc糖链
2天线0.010.8 3天线0.0 3.0 4天线0.0 2.2不含平分型
GlcNAc糖链
1天线 2.4-
2天线38.3 2.0 3天线12.3 1.6 4天线10.0 2.0未知糖链0.0 6.6
高甘露糖型糖链在病毒感染过程中的重要作用,也可以从上述糖链加工酶抑制剂的效果来说明。糖加工抑制剂Castanospermine和l2脱氧野尻霉素(12deoxynojirimycin)能够抑制高甘露糖型糖链的形成,从而抑制合胞体的形成。而苦马豆素(swainso2 nine)是抑制形成复合型糖链的,所以不影响合胞体的形成。这与H IV与专一识别甘露糖残基的凝集素结合后能够抑制形成合胞体的报道也相符合。但是高甘露糖型糖链的作用机制尚未阐明。由于CD4分子不能结合gp120分子所含的糖链,而且也不能抑制合胞体的形成,说明gp120分子的糖链不是通过CD4分子来识别的。为此,可以认为gp120分子的糖链与维持结合部位的立体构象有关。
HIV感染的防御
H IV表面大量高甘露糖型糖链在H IV感染中起重要作用这一事实表明,与甘露糖型糖链结合的物质可能抑制H IV的感染。这些物质如果对人体安全无害,就有可能以/糖链为靶0开发抗H IV的新药。
1.凝集素防御H IV的可能性
伴刀豆球蛋白A(Concanavalin A)是甘露糖专一性结合的植物凝集素,可以和H IV表面的高甘露糖型糖链结合。已知这种植物凝集素可以在体外抑制H IV感染或抑制形成合胞体,但植物凝集素因有免疫原性而对人类具有毒性,所以不能用作治疗药物。
另一方面,人血清中含有甘露糖结合蛋白(MBP),还有能够识别甘露糖,葡萄糖或N2乙酰葡胺的其它凝集素。这些凝集素能够与侵入人体微生物表面的糖链结合,并活化补体系统,以此参与对微生物感染的初期防御。日本研究人员为了考察人血清中的甘露糖结合蛋白实际上是否和gp120分子相结合,他们用相应量[125?]标记的人MBP与固定化gp120分于结合,进一步将gp120分子的糖链进行人工糖脂化,用薄层色谱(TLC)展开后与人MBP 结合,结果发现人MBP是与gpl20分子中糖链所含729个甘露糖残基的高甘露糖型糖链结合,特别与Man8G1cNAc2反应强烈(图6)。由此,可以设想是人血清中的MBP与gp120相连结的高甘露糖型糖链结合,从而改变了感染部位的立体构象,因该部位被遮盖而阻止了H IV的感染。MBP在体外是能阻止H IV感染的,这样就可能以人体本来具有的以糖链为靶的系统来对付H IV的感染。
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图4CHO细胞中HIV21(óB)重组gp120分子的中性糖链
图中:G=半乳糖(Gal),GN=N2乙酰葡胺(GlcNAc),M=甘露糖(M an),F=岩藻糖(Fuc)含有+/2F的糖链,约90%是与岩藻糖相结合。这种gp120分子含有乳糖胺重复结构的链,但经HIV21感染H9细胞的gp120
分子则不含这种糖链。
图5HIV21(óB)感染H9细胞中gp120分子的中性糖链
图中:G=半乳糖(Gal),GN=N2乙酰葡胺(GlcNAc),M=甘露糖(M an),F=岩藻糖(Fuc)
含有+/-F的糖链,约90%是与岩藻糖相结构合。另外,这种gp120分子含有平分型N2乙酰葡胺,但重组gp120分子则不含。
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图6MBP对gp120分子上糖链的结合性
图中:重组gp120(第1-3行),被感染H9细胞的gp120(第4行)被感染H9细胞的gp120(第4行)和牛胰核糖核酸酶B(第5行)的糖链,经人工糖脂化,并在薄板上展开后与[125?]MB P(m)或[125?]伴刀豆球蛋白A作用(c)。另外,在薄板上用地衣酚2硫酸显色(o)。M52M9表示含有529个甘露糖残基的高甘露糖型糖链(m),经人工糖脂化后的移动位置。
2.结合性抗生素防御H IV的可能性
与H IV一样,真菌也被大量甘露糖所包裹。己发现许多抗生素能够阻止真菌生长和繁殖。虽然尚未明了这些真菌抗生素的功能机制。但作用于真菌表面的糖链可能起着抗真菌活性物质的作用,而这些抗生素可能作用于H IV表面的糖链以阻止HIV 感染。
PradimicinA5)是从Acitinomadura hibisca培养滤液中发现并分离出的一种放线菌抗生素(图7)。PradimicinA和有良好水溶性的衍生物BMY228864对引发真菌感染的白色假丝酵母(Candida albi2 cans),烟曲霉(Aspergillus f umiga tus)和新型隐球菌(Cryptococ cus neof or ma ns)在体外具有很强的抗真菌作用,而且毒性小。其抑制真菌感染的效果已在小鼠实验中得到证实。另有论文报道抗真菌抗生素Pradimicin A能够抑制感染HIV2l(óB)的MOLT24细胞形成合胞体和抑制病毒与细胞结合。
研究了Pradimicin A及其衍生物BMY228864的抗H IV感染的机制,它们对gp120分子中含有的高甘露糖型糖链或拟糖蛋白甘露糖2BSA有很强的结合能力。在测定BMY228864对gp120分子或各种拟糖蛋白的结合能力时,发现在Ca2+存在下可与甘露糖2BSA强烈结合(表2)。而不含甘露糖的其它人工糖蛋白则完全不能结合。可以认为特异结合在gp120分子上的高甘露糖型糖链的甘露糖残基阻止了H IV感染细胞合胞体的形成或病毒感染。
表2Pr adimicin A及其衍生物BMY228864
的gp120分子与人工糖蛋白的结合
BMY-28864的结合性gp120++
甘露糖2BSA++
葡萄糖2BSA-
N2乙酰葡胺2B SA-
半乳糖2BSA-
麦芽糖2BSA-
纤维二糖2BSA-
乳糖2BSA-
蜜二糖2BSA
-
R1R2
Pradimicin A CH3NHCH3
BMY228864CH2O H N(CH3)2
图7Pr adimicin A及其衍生物BMY228864的化学结构
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现在已知与糖链结合的物质是凝集素,识别糖链的抗体和酶等。这些物质都是蛋白质。而Pradimicin A及其衍生物BMY228864是低分子量的有机化合物。这类有机化合物与糖链的结合能力可因分子中氨基酸的改变而丧失。因为不是糖链与糖链之间的相互作用,可以把它们定名为/糖链结合性抗生素0-是迄今发现的新一类抗生素。
可以期望,以/糖链为靶0的抗HIV药物比以/酶为靶0的应更好。后者已经出现抗药问题。用多种药剂治疗的患者可能遇到多种抗药性问题。当然,以糖链为靶的抗H IV药剂也可能出现同样情况,这将是由于缺失高甘露糖型糖链的病毒才出现的抗药性。此类抗药性病毒因不具有感染所必需的高甘露糖型糖链而成为不感染株,也就夫去了病原性。再者,识别甘露糖的抗生素也能作用于表面被甘露糖覆盖的真菌,它们有望对治疗真菌感染的并发症也具有效果。因此,Pradimicin A及其衍生物BMY228864有可能成为以糖链为靶全新概念下治疗艾滋病最重要的起点药物。结束语
近年来飞速发展的糖生物工程领域正着眼于糖链深入了解感染和阻止感染的实验。本文叙述了H IV感染中病毒糖蛋白糖链的重要性,着眼于糖链防止HIV感染的可能性。这里介绍的以/糖链为靶0控制艾滋病的实验仅仅是开始,糖链结合性抗生素是一全新的概念,今后可能会有很大发展。
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Development and application of yeast hybr id system
Liu Weifeng Qin Yujing Gao Dong
(National Laboratory of Microbial T echnology,Shandong University,Jinan250100)
Abstr act In recent years,the advent and development of yeast one2hybrid、two2hybrid and three2hybrid system have became a powerful tool to analyze the interactions between proteins and between protein and DNA or even RNA.H ere a brief elucidation of the development and potential application of the yeast hybrid system is presented.
Key words Yeast,hybrid system,transcriptional activation
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人类免疫缺陷病毒(I型)HIV-RNA核酸定量检测SOP
人类免疫缺陷病毒（I型）核酸定量检测系统标准操作程序1. 目的：规超敏PCR仪器配置系统及人类免疫缺陷病毒（HIV-I RNA）的检测过程，确保检测结果的准确性和重复性。 2. 检测方法和原理 2.1 检测方法：TaqMan探针荧光定量PCR法。 2.2 检测原理：人类免疫缺陷病毒（I型）核算定量检测试剂盒（PCR-荧光法）采用核酸扩增技术，定量检测人血浆中HIV-I RNA。该方法包括三个主要步骤：（1）样品制备以分离HIV-I RNA；（2）靶RNA的逆转录形成互补DNA（cDNA）；（3）靶（cDNA）的PCR扩增以及裂解的、靶特异性的、双标记寡核苷酸探针的检测。 3. 标本要求 3.1 标本类型：血浆（EDTA抗凝）。 3.2 标本的采集与处理 3.2.1 标本采集量：采集患者静脉血6 mL（EDTA抗凝真空采血管）。 3.2.2 标本处理：标本采集后应在2小时送至实验室，实验室收到标本后在1小时处理标本。 3.2.2.1签收：门诊、住院以及CDC标本签收条码，并做好相关登记工作。 3.2.2.2编号：对标本进行唯一编号，容如下：“年月日6位数字+标本号3位数字”，例如2018年1月1日收到一个HIV-RNA标本即编号为：“180101401”。 3.2.2.3离心：800-1600g,20min离心标本。 3.2.2.4标本保存：血浆在室温（25-30℃）最多存储1天；2-8℃最多存储6天；-20℃—-80℃可存储6周。将待检血浆以2管每管1200 uL量存储于2.0mL戴螺旋盖的无菌聚丙烯管，在管壁编写如3.2.2.2的编号。未检标本放置于专用样本盒中，冻存于-80 ℃冰箱。已检血浆置-80oC冰箱保存2个月，到期后按科室有关程序作废弃标本处理。 4.仪器和试剂 4.2 试剂：（配套封闭试剂） 4.2.1 试剂盒（包含核酸提取试剂、质控品及阳性定量参考品组分、PCR 检测试剂组分）保存于2-8℃环境下，有效期22个月。 4.2.3试剂开瓶后，在室温条件下放置时间不应超过72小时；2-8℃条件下不超过30天。 4.2.4 主要组成成份：
人类免疫缺陷病毒(HIV)的发现
人类免疫缺陷病毒(HIV)的发现 ——2008年诺贝尔生理学或医学奖的思考 谢亚南(3100000304) 摘要 2008年诺贝尔生理学或医学奖授给了弗朗索瓦丝·巴尔‐西诺西、吕克·蒙塔尼等3人，其中弗朗索瓦丝·巴尔‐西诺西、吕克·蒙塔尼的获奖原因是发现人类免疫缺陷病毒（HIV）。本文介绍了他们的获奖成果及其意义，并重点介绍了笔者对该项成果的思考。 关键词 诺贝尔生理学或医学奖 人类免疫缺陷病毒 艾滋病防治 人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus, HIV）是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒，属反转录病毒的一种。普遍认为，人类免疫缺陷病毒的感染导致艾滋病，艾滋病是后天性细胞免疫功能出现缺陷而导致严重随机感染及/或继发肿瘤并致命的一种疾病。艾滋病自1981年在美国被识别并发展为全球大流行至2003年底，已累计导致两千余万人死亡，死亡率几乎达到100%，2008年感染人数已达3340万人。人类免疫缺陷病毒的发现对艾滋病传播的防控以及治疗有着重大的意义。弗朗索瓦丝·巴尔‐西诺西和吕克·蒙塔尼因为人类免疫缺陷病毒的发现获得了2008年诺贝尔生理学或医学奖。 1人类免疫缺陷病毒的发现 1981年，美国加利福尼亚州和纽约市先后报道了一种新的医学综合症[1]，这种新的医学综合症也就是我们现在所说的艾滋病。但其早期的病人都是男同性恋者，因此艾滋病曾一度被认为仅仅是一种性传播疾病，并被称作“同性恋病（gay disease）”，没有得到当时里根保守政府的足够重视[2]。 后来发现血友病人通过输血竟也能够感染这种疾病，立刻引起了科学界的极大重视。美国疾病控制与预防中心（CDC）立即成立了一个特别工作组对该疾病进行调查与研究，确定了这是一种新的疾病，并根据其特征首先将其命名为获得性免疫缺陷综合症(Acquired Immunodeficiency Syndrome)，简称为艾滋病(AIDS)。 这种疾病传播很快，在美国首次被发现后很快在欧洲也有发现。很多科学家都开始研究这种疾病的病因。1983年，法国巴斯德研究所肿瘤疾病研究室主任蒙塔尼
人类免疫缺陷病毒抗体检测试剂胶体金法技术参数
人类免疫缺陷病毒抗体检测试剂（胶体金法）技术参数 1. 试剂盒：50人份/盒； 2. 灵敏度：100%； 3. 特异性：99.0%以上； 4. 测定时间：≤30分钟； 5. 检测标本：全血/血清/血浆； 6. 产品有效期：不少于16个月； 7. 认证及注册：通过世界卫生组织WHO和联合国艾滋病规划署、美国FDA、中国国家食品药品监督管理局等认证及注册； 8. 质量评估：连续三年参加中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心参比实验室组织的全国艾滋病病毒（HIV）抗体诊断试剂临床质量评估，连续三年灵敏度不低于100%、特异性不低于99.0%； 9. 其他：按用户计划分批供货和结算，计划收到后7个工作日内交货。 梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒（胶体金法）技术参数 1. 试剂盒：50人份/盒； 2. 灵敏度：99.5%以上； 3. 特异性：99.0%以上； 4. 测定时间：≤20分钟； 5. 检测标本：全血/血清/血浆；
6. 产品有效期：不少于18个月； 7. 认证及注册：通过美国FDA、中国国家食品药品监督管理局等认证及注册； 8. 其他：按用户计划分批供货和结算，计划收到后7个工作日内交货。 促凝采血管技术参数 1、容积：5ml； 2、材质：塑料管； 3、管内添加促凝剂，促凝剂均匀喷涂于采血管内壁上，使血液可快速凝固，析出高纯净度的血清； 4、胶塞类型：安全帽胶塞（塑料盖帽），管内真空、无菌； 5、采血管标贴：刻度、双码、条形码一体化标贴； 6、其他：按用户计划分批供货和结算，计划收到后7个工作日内交货。 抗凝采血管技术参数 1、容积：5ml； 2、材质：塑料管； 3、抗凝剂：EDTAK2； 4、胶塞类型：安全帽胶塞（塑料盖帽），管内真空，无菌； 5、采血管标贴：刻度、双码、条形码一体化标贴； 6、其他：按用户计划分批供货和结算，计划收到后7个工作日内交货。 采血针技术参数 1、规格：7号；
人类免疫缺陷病毒检验
人类免疫缺陷病毒检验 发表时间：2009-08-03T11:16:23.700Z 来源：《中外健康文摘》2009年第19期供稿作者：陈虹 (黑河市人民医院黑龙江黑河 164300) [导读] 人类免疫缺陷病毒检验 人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency vi-rus，HIY）又称艾滋病毒，是获得性免疫缺陷综合征即艾滋病（acpuired immunodeficiency syndrome，AIDS）的病原体，属逆转录病毒科（retroviridae）的慢病毒（lentivinrs）亚科，形态为典型的D病毒，主要通过性传播途径、血液传播途径和母婴传播途径传播。HIV有HIV-1和HIV-2两种类型，目前在世界广泛流行的是HIV-1型。HIV基因有高度的变异性，目前在全球流行的HIV-1毒株已出现3个组，即M组、O组和N组，其中M组又分为A到J十个基因型。HIV-2是逆转录病毒中的另 一个病毒，也可引起人患上艾滋病，但症状多较HIV-1引起的为轻，HIV-2主要在西非国家流行，其与HIV-1在血清学上有一定的交叉反应。 艾滋病是以机会感染及局部肿瘤为特点的致死性传染病。截止2000年底，我国累计报告HIV/AIDS22517例（AIDS880例），死亡496例，估计实际感染人数远超过已发现的感染者人数，加强艾滋病的预防与控制是我国以及全世界面临的一个紧迫的问题。 1 样本采集 1.1血清（浆）样本 1.1.1抗原、抗体检测静脉采血，血液样品应在l2h内做到：①送到初筛实验室；②分离出血清；③装入一干净试管内，盖上试管盖； ④按标准编号贴上标签。 分离出的血清应立即进行筛查实验。若因故不能立即检测，应将血清放置－20℃低温保存；无条件时亦可放置4℃，但不得超过3d。检测后的血清应于－20℃或更低温保存，以用于确认实验。 1.1.2核酸检测使用EDTA抗凝血浆标本，抗凝后6h内分离血浆；如使用血清标本，则需在2h内分离血清，标本的保存应在－70℃下，并避免反复冻融。 1.2全血标本 全血标本主要用于提取基因组核酸和病毒核酸，静脉取血后可于4℃下短期保存，如用于提取病毒RNA，则应在取血后尽快提取。 1.3淋巴细胞 淋巴细胞主要用于提取核酸，可从抗凝全血制备，主要有两种方法：一是使用淋巴细胞分离液分离制备；二是使用红细胞裂解液，裂解全血中的红细胞，经生理盐水数次洗涤，即可得到淋巴细胞。淋巴细胞如暂不提取核酸，可保存于－70℃下。 1.4样品采集的注意事项 1.4.1用于ELISA法检测的血浆或血清样本勿用叠氮化钠防腐。 1.4.2本应无微生物污染，避免溶血。 1.4.3核酸检测用的血液标本严禁使用肝素抗凝，因其对PCR扩增有抑制，且无法在核酸提取过程中去除。 2 检验方法 HIV感染最直接的检查方法是从受检者的血液中分离培养HIV或检测HIV特异性抗原、HiV核酸。但HIV分离培养操作繁琐，费用较高，技术难度大，实验场地要求严格（P3实验室）；HIV抗原检测的敏感性不如抗体检测；核酸检测需要较高的实验操作水平和实验室条件。因而，目前最常用的HIV检测技术是抗体检测。 HIV感染后的检测存在“窗口期”，“窗口期”是指从HIV感染后到用现有方法能检出HIV抗原、抗体和核酸前的一段时间。个体差异、检测方法的种类和试剂的敏感性是影响“窗口期”长短的主要因素。每种检测都要等到“窗口期”之后再进行，否则会得到假阴性结果。 2.1 HIV分离培养 用脐血或已建立的T淋巴细胞，经PHA刺激后培养，3～5d后接种标本，每周加强PHA刺激。如有病毒生长可观察到细胞病变，用电镜观察病毒颗粒，也可用ELISA或免疫荧光法检查病毒抗原，或测定细胞培养上清液中逆转录酶的活性来判断标本中是否存在感染性HIV。病毒分离培养检测HIV的“窗口期”约为7d左右，对于HIV感染的早期诊断有重要意义。 2.2 HIV抗原检测 P24抗原是人体感染HIV后最早出现于血液中的病毒成分，通常在感染后2周即开始出现，因此，P24抗原检测可以在感染者血清抗体阳转前即作出早期报告，大约可以使“窗口期”缩短一周。P24抗原检测在新生儿感染的早期诊断和AIDS病程进展的监测上有重要作用。但应该注意到，P24抗原作为HIV-1的感染指标的作用是有限的，因为在HIV感染者血液中检测到P24抗原的比例不高，因而，P24抗原检测目前只是HIV辅助诊断手段。 2.3 HIV抗体检测 HIV抗体检测是卫生部认可的HIV感染诊断方法，由于HIV检测中任何漏诊、误诊都可能导致极为严重的后果和法律纠纷，为了防止检测工作可能出现的问题，卫生部专门制定了《全国艾滋病检测工作规范》，对开展HIV抗体检测的单位、人员、场地和检测试剂等制定了严格的标准。 HIV抗体检测分为初筛试验和确认试验两个阶段，初筛试验阳性的血清一定要进行确认试验，确认试验为阳性的才能肯定为被HIV感染。HIV初筛试验要求敏感性接近100％，不能出现假阴性，对特异性要求不太严格。初筛试验由取得资格的HIV抗体初筛实验室或确认实验室进行，初筛呈阳性反应的标本不得向受检者公布其结果。
人类免疫缺陷病毒抗体诊断指导书(胶体金)
××××××医院 Policy No.：Effective Date：January 01,2006 Revision No.：00 文件编号：实施日期：2006年01月01日修订号：00 Generated department：Total Pages：Three 编制部门：检验科总页数：3 人类免疫缺陷病毒抗体诊断指导书（胶体金法） Prepared by : 编制 --------------------------------------------- Name: 姓名： Position: 职务: Date: December 16,2005 日期：2006年01月01日 Audited by: 审核 --------------------------------------------- Name: 姓名： Position: 职务： Date: December 16,2005 日期：2006年01月01日 Approved by 批准 --------------------------------------------- Name: 姓名： Position: 职务： Date: December 16,2005 日期：2006年01月01日 TOTAL COPIES: TWO 共 2 份 COPY TO: 分发至：检验科、质控科。
文件编号：页码：2/2 文件标题：人类免疫缺陷病毒抗体诊断指导书实施日期：2006.01.01 1.0 目的 规范人类免疫缺陷病毒抗体检测（胶体金法）的操作标准，确保检测结果的准确性。 2.0 范围 适用于本医院实验室对待检标本中人类免疫缺陷病毒抗体（胶体金法）的检测。 3.0 参考 3.1《人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒（胶体金法）使用说明书》 4.0 程序 4.1采集静脉全血或血浆样本。必须在无菌条件下操作，并避免样品溶血。如果标本在收集后7天内检测， 样品须放在2－8℃保存，如果大于7天须冷冻保存。 4.2将待测标本从储存条件下取出并编号，如有低温保存则应平衡至室温。 4.3将胶体金试剂从包装盒中取出，打开铝箔包装袋，平置于台面上。 4.4用微量加样器取50μL样本血清，加到试剂的加样处。 4.5加样后，阳性标本可在1～30分钟内检出，超过30分钟将对实验结果的观察造成影响，建议30分钟最终观察并记录实验结果。 5.0 结果判断： 5.1阳性：试剂在检测区和对照区位置各出现一条紫红色带，如果检测区的紫红色条带隐约可见，建议对 该样本重复测试，并使用其他方法确认。 5.2阴性：试剂只在对照区位置出现一条紫红色条带。 5.3失效：对照区未出现紫红色条带，表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏或者是样本中的抗体含 量过高。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并将待测样本稀释后用新的试剂重新测试。如果问题仍然存在，应立即停止使用此批号产品，并与当地供应商联系。 5.4注意：测试区内的紫红色条带可呈现颜色深浅的现象。但是，在规定的观察时间内，不论该色带颜色 深浅，即使只有非常弱的色带也应判定为阳性结果。 6.0注意事项 6.1实验环境应保持一定湿度、避风。避免在过高温度下进行实验。 6.2试剂从包装中取出后，应尽快进行实验，避免放置于空气中过长时间，导致受潮。 6.3试剂可在室温下保存，谨访受潮。低温下保存的试剂应平衡至室温方可使用。 7.0 附件 7.1实验结果记录单
人类免疫缺陷病毒抗体
湖南省职业病防治院 作业指导书 标题：人类免疫缺陷病毒抗体（酶联免疫法） 修改记录
湖南省职业病防治院作业指导书文件编号： 标题：人类免疫缺陷病毒抗体（酶联免疫法）版号：第 1 版页码1/2 1、目的 用于临床人类免疫缺陷病毒感染的辅助诊断。 2、范围 适用于献血员筛查与临床病例。 3、职责 检测人员按照本规程进行检测操作。 4、原理 采用纯化基因工程人类免疫缺陷病毒“1”型和“2”型（HIV-1/HIV-2）抗原包被的微孔板和酶标记的HIV-1/HIV-2抗原及其他试剂组成，应用双抗原夹心法原理检测人血清或血浆中的HIV-1和HIV-2抗体。 5、样本要求 仅限于检测人体血清或血浆。 常规方法采集。 血清：采血后，室温放置1-2小时，待血液凝固，再于3000转/分钟离心15分钟。 血浆：采血后，样品与抗凝剂反复轻摇混匀，再3000转/分钟离心15分钟。 如果样品没有在8小时内测定，应将其保存于2℃-8℃。如果样品不能在7天内测定，应将血清或血浆与血细胞分离， -20℃保存，避免反复冻融。 6．分析系统 分析仪器：Thermo Mk3型酶标仪，检测波长450nm，参考波长630nm。 37℃恒温箱。 振荡器用于样品、试剂的混匀。 微量加样枪。 试剂准备： 试剂盒于冰箱保存，使用前应取出置37℃。 取试剂盒内洗涤液用蒸馏水作25倍稀释，置洗瓶中备用。 质控试剂：-20℃保存，溶解后随试剂一起冷藏，每天随样品一起检测并保存质控结果，每月一次质控小结，失控要有记录及纠正的结果。 7、分析步骤 样品编号：从6号开始编号。
设阴性对照3孔，Anti-HIV-1阳性对照1孔，Anti-HIV-2阳性对照1孔，分别加入阴、阳对照各50微升。 每个标本待测孔加入标本血清50微升，充分混匀，封板，置37℃孵育60分钟。 手工洗板：弃去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置30~60秒，甩干，重复6次后拍干。 每孔加酶标工作液50微升，充分混匀，封板，置37℃孵育30分钟。 手工洗板：弃去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置30~60秒，甩干，重复6次后拍干。 每孔加显色剂A液，显色剂B液各50微升，充分混匀，封板，置37℃孵育10分钟。 每孔加入终止液50微升，混匀。 选取相应的程序号，用酶标仪双波长比色。 8、计算 Cutoff值=阴性对照平均A值+。 9、参照区间 阴性对照A值应≤ Anti-HIV-1阳性对照A值应≥ Anti-HIV-2阳性对照A值应≥ 10.临床意义 样品A值≥临界值为HIV抗体阳性 样品A值＜临界值为HIV抗体阴性 11.注意事项 从冷藏环境中取出试剂盒应置37℃平衡30分钟后方可使用，余者应按前述方法保存和使用。在平衡试剂的同时，待测样品需置室温平衡30分钟后再行测试。 使用前试剂应摇匀。 须确保样品加样量准确，如果加样量不准确，可能会导致错误的结果，建议使用微量移液器加所有组份；用滴瓶滴加时，应先弃去1~2滴，垂直匀速地滴加。避免在加样过程中，将液体接触到或溅到微孔边缘上。 封片不能重复使用。 结果判断须在反应终止后10分钟内完成。 不同批号的试剂不可混用。 本试剂盒应视为有传染物质，请按传染病实验室检查规程处理。 12.支持性文件 全国临床检验操作规程（第3版）
人类免疫缺陷病毒抗体检测(乳胶法)
人类免疫缺陷病毒（HIV1/2）抗体检测试剂盒（乳胶法） 说明书 【检测原理】 人类免疫缺陷病毒（HIV1/2）抗体检测盒（乳胶法）采用了高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析乳胶标记技术原理。试剂上含有事先固定在膜上检测区（T）的重组HIV-1和HIV-2型抗原。检测时，将样本滴入试剂的加样孔中，样本中的HIV-1，2型抗体与预包被在膜上的重组抗原--乳胶颗粒标记结合物反应，然后，混合物在毛细效应下向上层析，在检测区（T）与固定在膜上的重组HIV-1和HIV-2型抗原反应。如果样本中含有HIV抗体，在检测区内（T）会出现红色条带，检测区内出现红色线条表明是阳性结果。如果在检测区内（T）没有出现红色条带，则样本中不含有HIV抗体，表明的是阴性结果。无论抗HIV抗体是否存在于样本中，混合物都会继续向上层析至质控区(C),出现一条红色的条带。质控区内（c）所显示的红色条带是判定层析过程中是否正常的标准，同时也是检测试剂的内控标准。 【主要组成成份】 本试剂主要原材料包括：包被用重组HIV1型、包被用重组HIV2型抗原、标记用重组HIV1型、标记用重组HIV2型抗原、链霉亲和素结合物、生物素、乳胶颗粒、硝酸纤维塑膜、聚酯纤维塑膜。 检测需要已提供的材料 注意：不同批号试剂中各组份不可互相使用，以免产生错误结果。 检测时另需准备样本收集容器和计时器。 【样本要求】 静脉采血后离心获得血清/血浆样本，不同的抗凝剂如柠檬酸钠，肝素钠，EDTA，草酸钠，枸橼酸钠的血浆标本均可。在2—8℃条件下可保存一周，长期保存需-20℃冷冻，以避免反复冻融。发臭、溶血等异常样本请勿使用。 【检验方法】 在进行检验前必须先完整阅读使用说明书，并将试剂、样本、和缓冲液恢复至室温（20℃-30℃）。 1.从原包装铝箔袋中取出试剂。 2.将试剂放在干净的平台上，用一次性塑料管吸取1滴血清/血浆（25μl）于加样孔（S） 中，随后加入1滴缓冲液（约40μl），开始计时。 3.等待红色条带的出现，检测结果应在15~20分钟判读，20分钟后判读结果无效。
人类免疫缺陷病毒检测试剂临床研究讲解
附件3 人类免疫缺陷病毒检测试剂临床研究 注册技术审查指导原则 一、前言 人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）检测试剂是指利用免疫学及分子生物学等方法原理对人血清、血浆或其他体液中的特定的HIV生物学标记物，包括HIV 1型（HIV-1 ）p24抗原、HIV抗体、HIV核酸、HIV基因耐药突变等进行定量或定性分析的试剂。据《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》（国食药监械〔2007〕229号）的分类原则，该类产品作为第三类体外诊断试剂（In Vitro Diagnostic,IVD）管理，属高风险管理产品。本指导原则制定的主要目的是让申请人明确在注册申报过程中对本类试剂在临床研究方面重点关注内容，同时规范注册申请人对于注册申报资料中有关临床研究资料的要求。 本指导原则是对HIV检测试剂临床研究的一般性要求，申请人应依据具体产品的特性对临床研究资料的内容进行充实和细化。申请人还应依据具体产品的特性确定其中的具体内容是否适用，若不适用，需具体阐述其理由及相应的科学依据。 本指导原则只是针对HIV检测试剂的特点，强调需重点考虑的问题，临床试验的基本要求应符合《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》（国食药监械〔2007〕240号）的规定，包括临床试验协议、方案、报告的撰写等。 本指导原则不包括行政审批要求，不作为法规强制执行。本指导原则是申请人和技术审评人员的指导文件，如果有能够满足适合的法规要
求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定，随着法规和标准的不断完善、科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将进行适时的调整。 二、适用范围 HIV生物学标记物是指机体在感染HIV后，在不同的感染阶段出现的生物学标记物，包括：HIV抗体、HIV-1p24抗原、HIV核酸、HIV基因耐药突变等。 就方法学而言，本指导原则主要适用于利用免疫印迹法、化学发光法、时间分辨免疫荧光法和微粒子酶联免疫法、胶体金法等免疫学方法对HIV抗原和/或抗体进行定量或定性检测的体外诊断试剂，以及应用核酸检测的方法（如实时荧光聚合酶链反应等）对HIV 核酸（核糖核酸/脱氧核糖核酸）以及基因耐药突变等进行检测和分析的体外诊断试剂，适用于首次注册产品及申请许可事项变更的产品。 本指导原则不适用于国家法定血源筛查用HIV检测试剂。 三、基本要求 （一）临床试验方案及方案中应关注的问题 临床试验实施前，研究人员应从流行病学、统计学、临床医学、检验医学等多方面考虑，设计科学合理的临床研究方案。各临床研究机构的方案设置应基本一致，且保证在整个临床试验过程中遵循预定的方案实施，不可随意改动。整个试验过程应在临床研究机构的实验室内并由本实验室的技术人员操作完成，申报单位的技术人员除进行必要的技术指导外，不得随意干涉实验进程，尤其是数据收集过程。各临床研究单
人免疫缺陷病毒(HIV)与糖基化
5生物工程进展62001,Vol.21,No.1 专 论 人免疫缺陷病毒(HIV)与糖基化 张树政 (中国科学院微生物所 北京 100080) 图1 HIV 模式图1) 自从1981年在美国发现艾滋病以来,世界各地发现艾滋病病例或带病毒者与日俱增。为了医治这种给人类造成巨大危害的病症,全世界范围内很多研究机构的研究人员都在研究开发更为有效的抗H IV 药剂。多年来已经积累了不少有价值的关于人免疫缺陷病毒的信息资料。但至今仍未设计出一种长效抗御这一迅速变异的逆转录病毒。以HIV 基因逆转录酶和宿主蛋白酶抑制剂和化学药物相配合的制剂(或称/鸡尾酒疗法0)治疗艾滋病虽然能够缓解病情,但最终不能彻底防御其抗药性的发展。尽管在多剂并用时,在H IV 感染者血液中检测不到H IV,但仍有H IV 隐藏在感染者淋巴结内。因此必须开发在不同部位起作用的新型抗HIV 药物。采用糖生物工程技术,特别是对糖链在H IV 感染过程中所起的作用,以及以糖链为靶抑制H IV 或艾滋病发病的研究,近年来取得了飞速的发展。HIV 的结构 图中外层为H IV 的糖蛋白,包括包膜糖蛋白 gpl20和跨膜糖蛋白gp41。病毒内核主要含有两种蛋白亚基,pl8和p24,还有RNA 基因及数个分子的逆转录酶。 HIV 糖蛋白gpl20的结构 H IV 的糖蛋白gpl20和gp41是病毒基因组上env 基因编码的共同前体gpl60经宿主蛋白酶降解为位于膜表面并能结合受体的包膜糖蛋白gpl20和跨膜糖蛋白gp41。gpl20分子中有24个N 2糖链的结合部位,其分子中约一半为糖链。糖蛋白的多肽部分通常折叠成为致密的一团,而糖链则展开在蛋白质的表面上。可以想像gpl20分子是由糖链包起来的,也可以说表面带有这种gpl20分子HIV 自身也是由糖链覆盖着的(图2)2)。HIV 包膜糖蛋白gpl20示意图中示出含有高甘露糖及一些复合或杂交型糖基化部位,其中二硫键连接区域用罗马数码标出,高变区(hyper 2variable regions)则以方块中V12V5标示。 N 2糖链的合成过程及相应的酶抑制剂3) N 2寡糖生物合成包括从长萜醇载体上将Glc 3Man 9GlcNac 2与翻译同步转移到蛋白质具有Asn 2X 2Ser/T hr 序列位点的天门冬酰胺残基上形成G 2寡糖。其末端的葡萄糖残基很快被内质网上的A 2葡萄糖苷酶切除。A 2葡萄糖苷酶有两个明显不同的活力;葡萄糖苷酶?切除未端A 21,2位连接的葡萄糖残基;葡萄糖苷酶ò水解遗留下来的两个A 21,3位连接的葡萄糖残基,进一步经位于内质网和高尔基体常驻糖基转移酶作用,使后续加工成复合型和杂交型结构。 已经证实,有些化合物可抑制纯化的葡萄糖苷酶。在这些抑制剂存在下,复合型寡糖的合成被阻止。但是在许多系统中显示出,当用这类化合物处理细胞时,某些复合型寡糖的合成仍然生成。这里面应有一定原因。原因中包括抑制剂在内质网中未能达到一定的高浓度,以及内切甘露糖苷酶活力的 4
英科新创人类免疫缺陷病毒抗体检测试剂盒(胶体金法)操作规程
人类免疫缺陷病毒抗体检测试剂盒（胶体金法）操作规程 英科新创（厦门） 操作步骤 1.将待测标本从存储条件下取出，平衡至室温并编号 2.将所需数量的测试试剂从包装盒取出平衡至室温 3.用微量加样器取60μl待检血清/血浆标本滴加到试剂加样处 4.加样后，阳性标本可在1-30分钟内检出，超过30分钟将对实验 结果造成影 响。因此建议30分钟内最终观察并记录实验结果 结果判读 1.阳性结果：测试条在测试区和对照区位置各出现一条紫红色条带。 如果检测区的紫红色条带隐约可见，建议对实验重复检测，并使用 其他方法确认 2.阴性结果：测试条只在对照区位置出现一条紫红色条带 3.无效结果：对照区未出现紫红色条带，表明不正确的操作或试剂 已 变质损坏或是试剂中抗体含量过高。在此情况下，应再次仔细阅读 说明书，并用新的试剂条重新测试。如果问题依然存在，应立即停 止使用此批号产品，并与当地供应商联系 注意事项 1.本试剂用于体外诊断，仅用于人全血、血清或血浆样品，其它体 液样本可能 得不到准确结果 2.本试剂用于定性检测人全血、血清或血浆样品中HIV1/2型抗体，对于所有使 用本试剂条检测的结果必须进一步验证
3.样品的加样建议用微量加样器准确加入 4.实验环境应保持一定湿度、避风，避免在过高温度下进行试验 5.测试条从包装取出后，应尽快实验，避免放置于空气中过长时间，导致受潮 6.对于那些含有感染源和怀疑含有感染源的物质应有合适的生物安 全保证程序 下列有关注意事项： （1）带手套处理样品和试剂 （2）不要用嘴吸样 （3）在处理样本时不能吸烟、吃食物、喝饮料、美容和处理隐形 眼镜 （4）用消毒剂对溅出的样品进行消毒 （5）使用后的试剂和样本等废弃物应按国家相关规定妥善处理 （6）超出有效期的试剂不能使用 7.检测线颜色深浅的程度与样品中抗体滴度没有一定的必然联系 8.任何一种测试都不能绝对保证样品中没有低浓度抗体存在，任何 时候都不能 排除暴露和感染的可能 9.对于下列物质在所给出的浓度下对测试结果不造成影响：胆固醇200mg/ml；血红蛋白≤178g/L；甘油三酯≤200mg/ml；胆红素≤ 1.6mg/100ml
人类免疫缺陷病毒抗体检测
人类免疫缺陷病毒抗体检测（ELISA） 1. 原理 在微孔条上预包被纯化基因工程人类免疫缺陷病毒I型和II型（HIV-1/HIV-2）抗原（合成肽或基因重组蛋白），采用双抗原夹心法检测血清或血浆中人类免疫缺陷病毒抗体。样品加入包被抗原反应孔，在随后的温育过程中，若样品中含特异抗体，则该抗体与包被抗原形成抗原抗体复合物被吸附到固相，再加入酶标记的HIV-1/HIV-2抗原，最终形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，洗涤除去未结合的游离酶，加入显色剂后显色。 2. 标本采集 2.1 采集前病人准备：受检者应空腹 2.2 标本种类：血清或血浆 2.3 标本要求：采集病人静脉血2ml（可用EDTA抗凝），室温放置不超过4小时，分离血清备用。 3. 标本储存：2-8°C保存不应超过48小时，-20°C不应超过3个月，-70°C 长期保存，应避免反复冻融。 4. 标本运输：密封，室温运输。 5. 标本拒收标准：污染、标本量不足、严重溶血或脂血标本不宜作此项检测。 6. 试剂 6.1 试剂名称：人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒 6.2 试剂生产厂家：北京万泰生物工程有限公司。 6.3 包装规格：96Test/Kit 6.4 试剂盒组成：包被反应板，HIV酶标记物，阳性对照血清，阴性对照血清，浓缩洗涤液，底物A，底物B，终止液，封口膜，密封袋。 6.5 试剂储存条件及有效期：2-8°C避光保存，有效期6个月。 7. 仪器设备 7.1 仪器名称：自动酶标仪 7.2 仪器厂家：Rayto 7.3 仪器型号：RT-6100 8. 操作步骤 8.1 平衡：将试剂盒各组分取出，平衡至室温（18-25°C），微孔板开封后，余者及时以自封袋封存。 8.2 配液：浓缩洗涤液配制前充分摇匀（如有晶体应充分溶解），浓缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按1：19稀释后使用。 8.3 编号：将微孔条固定于支架，按序编号。 8.4 加样：用加样器在微孔反应条板孔中加入样品100l；空白孔不加任何液体；阴性对照孔和阳性对照孔，每孔分别加入阴阳对照各100l，标好位置。对照应在所有标本加完以后再加，以保证阈值准确性。 8.5 温育（一）：充分混匀，加上封板膜，置37℃温育60分钟。 8.6 洗涤（一）：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）。 8.7 加酶：分别在每孔中加入酶标记物100l，轻拍混匀。 8.8 温育（二）：充分混匀，加上封板膜，置37℃温育30分钟。 8.9 洗涤（二）：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）。 8.10 显色：每孔加入底物A、B各50l，轻拍混匀，置37℃暗处30分钟。
人类免疫缺陷病毒(HIV12)抗体诊断试剂(胶体金法)
人类免疫缺陷病毒（HIV1+2）抗体诊断试剂（胶体金法）Diagnostic kit for Antibody to Human lmmunode ficiency Virus （Colloidal Gold） [ 产品名称] 通用名称：人类免疫缺陷病毒（HIV1+2）抗体诊断试剂(胶体金法) 英文名字：Diagnostic kit for Antibody to Human lmmunode ficiency Virus （Colloidal Gold） [包装规格] 单支/袋，25/盒；10支/袋，5袋/盒；25支/袋，8袋/盒。 [临床意义] 检测人血清或血浆中的HIV-1、HIV-2特异性抗体。用于无偿献血的现场筛查，及临床术前的筛查。 [检验原理] 应用免疫层析式双抗原夹心法原理。 [主要组成成分] 由纯化的基因重组HIV-1和HIV-2区段抗原，免抗HIV抗体，固相硝酸纤维膜，胶体金标记的基因重组HIV-1和HIV-2区段抗原及其他试剂组成。 [储存条件及有效期] 4℃-30℃避光干燥处密封储存，切勿冰冻。有效期24个月。[样本要求] 采取静脉血1-2ml于干净容器中分离得到血清或血浆样本。 如不及时测试可置4℃冰箱贮存，超过3天应加入0.1%硫柳汞防腐，测试前注意恢复至室温。不可使用冻干样本。 [使用方法] 1、被检样本和测试卡等在室温平衡。 2、沿缺口撕开铝箔袋，取出测试卡。 3、将80微升血清或血浆样本（用吸管滴加2-3滴）加入测试卡加样孔，平置于温室，20 分钟内观察显示结果。 [检验结果的解释] 阳性：在检测区上、下两端先后出现反应线，即对照线（C）和检测线（T）。 阴性：仅测试区上端有一条反应线，下端无反应线出现。 无效：测试区上、下两端均无红色反应线出现或仅在检测去（T）出现一条红色反应线，表明实验失败或试剂失效。请用新测试卡重试。如果问题仍然存在，请停止使用本批产品，并于当地经销商联系。 [检验方法局限性] 1、本品仅用于人血清或血浆样本中的HIV抗体检查，其检测结果必须结合其他对于医师有 用的临床信息。在所有的临床和试验进行评价后，只有医师才可以给出确切的临床诊断结论。
人类免疫缺陷病毒抗体检测胶体金法
人类免疫缺陷病毒抗体检测胶体金法 试剂厂家：英科新创（厦门）科技有限公司 检测原理：采用胶体金免疫技术和层析原理，定性检测人全血，血清或血浆样本中的HIV1／2型抗体。检测阳性样本时，样本中HIV抗体与胶体金标记抗原（大肠杆菌中表达）结合形成复合物，由于层析作用复合物没纸条向前移动，经过检测线时与预包被的重组HIV-Ag（大肠杆菌表达）结合形成金标记重组“Au-HIV（1+2）-Ag-HIV-Ab-HIV（1+2）-Ag”夹心物而凝聚显色，游离的胶体金标记重组Au-HIV（1+2）-Ag 则在对照线处与鼠抗HIV单克隆抗体结合而富集显色。阴性标本则仅在对照线处显色，30分钟内观察结果即可。 检测方法：一，血清血浆样本： 将待测标本从储存条件下取出，平衡至室温并编号。 将所需数量的测试试剂从包装盒中取出平衡至室温，打开铝箔包装袋，平置于台面上。 用微量加样器取60Ul血清腻味血浆样本，滴加至试剂的加样处。 加样后，阳性标本可在1-30分钟内检出，经过试验确证，反应时间（从加样后计算起）超过30分钟将对实验结果的观察造成影响，因此，建议30分钟内最终观察并记录实验结
果。 二，全血样本： 1将待测标本从储存条件下取出，平衡至室温并编号。 2将所需数量的测试试剂从包装盒中取出平衡至室温，打开铝箔包装袋，平置于台面上。 3用微量加样器取60Ul全血样本，或用试剂盒内所配塑料滴管吸取样本，垂直滴加两滴于试剂的加样处，随即加一滴金标全血样本稀释液。 4加样后，阳性标本可在1-30分钟内检出。经过试验确证，反应时间（从加样后算起）超过30分钟将对实验结果的观察造成影响，因此，建议30分钟内最终观察并记录实验结果。 检验结果的解释 阳性：测试条／卡在检测区和对照区位置各出现一条紫红色条带。如果检测区的紫红色条带隐约可见，建议对该样本重复试验，并使用其他方法确认。 阴性：测试条／卡在对照区位置出现一条紫红色条带。 失效：对照区示出现紫红色条带，表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏或者是样本中抗体的含量过高。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并将待测样本稀释后用新的测试条／卡重新测试。如果问题仍然存在，应立即停止使用 止批 号产品，并与当地供应商联系。
HIV人类免疫缺陷病毒危害评估
人类免疫缺陷病毒（HIV）病毒特异性地侵犯CD4+T淋巴细胞，造成机体细胞免疫受损。临床上初始表现为无症状病毒感染者，继续发展为持续性全身淋巴结肿大综合征和艾滋病综合征，最后并发各种严重机会性感染和恶性肿瘤，成为AIDS，病死率极高。到目前为上，还没有找到一种治愈该病的方法。 1．病原学 1．1 HIV是单链RNA毒，属逆转录毒科，慢病毒属，包括HIV－1型和HIV －2型，两者均能引起起AIDS（但多数AIDS乃由HIV－1型引起，HIV既有嗜林巴细胞性又有嗜神经性，主要感染CD4+T淋巴细胞，也能感染单核巨细胞，B细胞和小神经胶质细胞、骨髓干细胞等。 1．2 HIV的抵抗力 HIV对外界抵抗力较弱，对热敏感，56°30分钟能灭活。25％度以上的酒精即能灭活病毒，70%效果最好；5%～8%甲醛及有机氯溶液等均能灭活病毒。但对0.1%甲醛溶液、紫外线和γ射线不敏感。在实验室条件下，HIV在干燥环境中很快失去活性，在厚血块中可存活十几天，在干燥的玻璃上可维持几天。美国CDC证明干燥环境中的HIV浓度在几小时内降低90％-99％。 2. 流行病学 2．1传染源：病人和无症状病毒携带者是主要的传染源，前者的传染性最强后者在流行病学上意义更大，病毒主要存在于血液、精液、子宫和阴道分泌物中；乳汁、唾液、泪水等均能检出病毒。 2．2传播途径：世界公认的传播途径有三种，即性传播、血液传播及母婴传播。 2．3人群易感性：各个年龄均可感染，但同性恋和性乱交者，静脉毒瘾者，血友病患者，接受血、血制品或器官移植者，父母是HIV感染者的儿童，受感染的危险性比较大，属高危人群，发病年龄主要为40岁以下的青壮年。 3．临床表现 本病潜伏期较长，HIV-1侵入机体后2～10年左右可以发展为AIDS，HIV-2所需的时间更长。HIV感染人体后分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四期，HIV对CD4+T淋巴细胞有特殊的亲嗜性，发病与HIV含量、毒力、变异及CD4+T淋巴细胞数量功能和机体免疫状况有关。临床上可表现为原因不名的免疫缺陷，往往以淋巴结肿大、厌食、慢性腹満、体重减轻、发热、乏力等全身症状起病，逐渐发展至各种机会性感染、继发性肿瘤、精神神经障碍而死亡。 4．实验模式及危害因素分析 4．1HIV抗体和抗原检测：最常用的样品是血液，包括血清、血浆和全血。HIV的主要传播途径就是血液传播，，在进行采样和检测等过程中，都可能接触到血液，因此对于未知样品的检测具有潜在危险性；而对于直接接触HIV感染者或艾滋病病人血液和体液时，实验危险性较高，更应注意个人防护。 4．2 HIV核酸检测：样品有全血、血浆、组织和其他分泌物，有时还包括生物制品，此类标本具有潜在危险性，对于HIV感染者或艾滋病病人的样品，实验危险性较高。 4．3HIV病毒培养：培物中含大量的HIV，对于实验人员具有相当高的传染危险性。应该在P3实验室进行操作，同时格做好个人防护工作。 5．安全保障措施 5．1个人防护 5．1．1高标准的个人保健对于减少感染的危险性很重要。皮肤受损、生病
人免疫缺陷病毒抗体测定
人免疫缺陷病毒抗体测定 1．样品的接收、登记和处理 1.1 采血3-4ml，收集到促凝管中（可采用常规用量的肝素或枸橼酸钠抗凝） 1.2检查样品的状况，有无严重溶血、微生物污染、血脂过多以及黄疸等情况。如果污染过重或者认为样品不能被接受，要将样品情况立即通知送样人。 1.3仔细核对样本与送检单,然后编号 1.4样品为全血（抗凝），用3.000r/min离心15min，血清/血浆备用。打开标本容器时要小心，以防内容物泼溅。样品处理时若内容物有可能溅出，则应在生物安全柜中戴手套进行。同时应戴口罩、防护眼镜，以防皮肤或粘膜污染。 1.5 每天上午进行样品的检测。节假日（短期1周内）进行检测的样品存放于2～8℃，需长期存放的样品，应置于-20℃以下。需保存的血清在采集、保存过程中应注意无菌操作。 2.检测方法和步骤 2.1检测方法（一） 酶联免疫吸附试验（ELISA） 2.1.1 基本原理 以珠海丽珠试剂股份有限公司的ELISA（双抗原夹心法）为例。
采用双抗原夹心ELISA方法检测血清或血浆中人类免疫缺陷病毒HIV（1+2）型抗体。在微孔条中预包被高纯度HIV（1+2）抗原，通过检品中抗HIV抗体桥连作用，与后面加入的HRP 标记抗原结合，HRP对底物TMB作用显色。通过酶标仪检测吸光度（OD值）从而判定检品中是否存在抗HIV抗体。 2.1.2检测步骤 实验准备：试验开始前将试剂和样品放置在室温(18～23℃)，平衡30分钟后使用。 配液：将浓缩洗液用蒸馏水或去离子水20倍稀释备用 备好试剂盒、待检样品和外部对照质控血清后，按试剂盒说明书以及质控和安全防护要求进行筛查检测。 准备实验原始记录表 2.1.3 实验操作 2.1. 3.1装好所需使用数目的孔条,每孔均加入50μl样品稀释液。留一孔作空白对照,暂不加任何液体。另设3个阴性对照孔，1个HIV-1阳性对照孔，若需要可再设1个HIV-2阳性对照孔。 2.1. 3.2每孔加入50μl待检样品及对照（对照要后加），加样时吹打混匀则效果更佳。在反应板上加盖封板膜,振荡混匀,置37±2℃温箱或水浴锅中，孵育40min。 2.1. 3.3置洗板机上洗涤6遍, 每次静置30～60S, 洗完后
人类免疫缺陷病毒抗体阳性22例结果分析
实用医技杂志2013年2月第20卷第2期Journal of Practical Medical Techniques，February2013，Vol.20，No.2 人类免疫缺陷病毒抗体阳性22例结果分析 山西省吕梁市人民医院（033000）高光萍 获得性免疫缺陷综合征（acquired immune deficiency syn-drome，AIDS），又称艾滋病，是由人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）引起的传染病。截至2011年底，全国艾滋病病毒感染者和患者约78万，我国的艾滋病感染者和患者数约占全球的2%，属于低流行国家[1]。我国艾滋病防治工作目标是减少艾滋病新发感染、降低艾滋病病死率、减少社会歧视、提高感染者和患者生存质量，到2015年将艾滋病感染者和患者数控制在120万人左右。 完成上述目标，需要动员全社会的力量进行群防群治，其中地方医院检验科可发挥重要的作用[2]。我院从2007年发现第1例HIV感染者以来，到2012年9月30日共检测出HIV 抗体阳性（确诊）患者22例，检测结果报告如下。 1材料与方法 1.1标本来源：我院2007年1月至2012年9月，所有因输血（或血液制品）、孕产期检测、术前检测的门诊和住院患者，做输血前传染病标志物检查，包括乙型肝炎病毒五项（HBV）、丙型肝炎病毒抗体（抗-HCV）、梅毒螺旋体抗体（抗-TP）、人类免疫缺陷病毒抗体（抗-HIV），以及自愿咨询检测、健康体检的人员。 1.2试剂和仪器：抗-HIV、HBV、抗-HCV，抗-TP试剂均由英科新创公司提供的酶联免疫吸附试验（ELISA）诊断试剂盒。2007—2010年使用洗板机为Biocell anthos fluido，酶标仪为Biocell2010型。2011—2012年9月使用Bio-Rad Evolis全自动酶免分析仪。 1.3方法：对需做输血前系列的就诊者或患者抽取3~4mL 静脉血，标本凝固后分离血清，抗-HIV、抗-TP、抗-HCV、HBV 均采用ELISA法检测，操作及结果判断严格按试剂盒说明书进行，经ELISA初筛，抗-HIV阳性者标本按流程送山西省疾病预防控制中心艾滋病确证实验室用免疫印迹法（WB法）确认，试剂均有合格批准文号且在有效期内。 2结果 2007年1月至2012年9月，共计66737人次行输血前传染病标志物检查，合并自愿咨询检测及健康体检人员，发现合计HIV阳性22例，其中男性20例，女性2例，年龄19~61 HDL-C是由肝脏和小肠合成的一种异质性蛋白，HDL-C在脂肪运转中发挥作用，除此之外，HDL-C所含的氧磷酸抑制LDL-C氧化，起到抗冠心病的作用，对冠心病的发展有保护作用[6]，是名副其实的“好脂蛋白”。HDL-C与动脉粥样硬化明显负相关，HDL-C每下降0.03mmol/L，冠心病事件的相对危险性增加2%～3%。HDL-C≥1.55mmol/L被认为是冠心病的负危险因素[7]。LP（a）是一种富含胆固醇的血浆脂蛋白，大量流行病学和前瞻性研究显示LP（a）代谢异常具有促进动脉粥样硬化和血栓形成的作用。Rath等[6]通过研究107例患者的活检标本发现在动脉血管壁上有LP（a）沉积，且随着血清LP（a）水平的增高动脉管壁上沉积的LP（a）也增多，两者呈正相关。另有研究从冠状动脉粥样硬化病变的尸检标本中发现，冠状动脉血管内皮有LP（a）的聚集[8]；而从无冠状动脉粥样硬化的尸检中没有检测到LP（a）的聚集。这些研究表明，LP（a）在冠心病的发生发展中起重要作用。 hs-CRP作为炎症因子在预测冠心病中有重要意义，而与LP（a）、HDL-C联合检测，对冠心病的早期诊断有重大的应用价值[9-11]。 参考文献 [1]Schwartz EA，Reaven PD.Molecular and signaling mechanisms of atherosclerosis in insulin resistance.Endocrinol Metab Clin North Am，2006，27（3）：781-787. [2]Bastard JP，Maachi M，Lagathu C，et al．Recent advances in the relationship between obesity，inflammation and insulin resis- tance．Eur Cytokine Netw，2006，17（1）：412. [3]Hoffmeister HM，Ehlers R，Buttcher E，et al.Relationship between minorm yocardialdam age and inflammatory acute-phase reaction in acute coronary syndromes.J Thromb Throm Bolysis，2008，15（1）：33-39. [4]汤涌，黄进，陆冶平，等.冠心病患者高密度脂蛋白胆固醇状 况分析.实用全科医学，2006，4（4）：386-387. [5]李永伟，王春霞，张新春.心血管疾病检测C反应蛋白的临床 应用.医学信息（上旬刊），2005，18（11）：152-153. [6]Rath M，Niendor A，Reblin T，et al.Detection and quan- tification of lipoprotein（a）in the arterial wall of107coronary bypass patients.Arteriosclerosis，1989，9（5）：579-592. [7]鄢盛恺．冠心病的危险因素及其临床应用价值．中华检验医学 杂志，2001，24（6）：384-385. [8]Dangas G，Mehran R，Harpel PC，et al.Lipiprotein（a）and inflammation in human coronary atheroma：association with the severity of clinical presentation.J Am Coll Cardiol，1998，32：2035. [9]石喜.超敏C反应蛋白与冠状动脉粥样硬化性心脏病的关系. 实用医技杂志，2012，19（8）：846-847. [10]杨惠聪，林洁，吴阿阳，等.超敏C反应蛋白低密度脂蛋白与 高密度脂蛋白检测在冠心病诊断中的应用价值.实用医技杂 志，2011，18（11）：1179-1180. [11]宋萱.同型半胱氨酸超敏C反应蛋白载脂蛋白联合检测对心 脑血管疾病的探讨.实用医技杂志，2012，19（4）：392-393. （收稿日期：2012-10-08） 169 ··