比索洛尔对急性心肌梗死大鼠梗死周边区心肌组织中KCNE1和KCNE2表达的影响
固有免疫，与移植物长期生存有关［5］，因此器官移植领域愈加重视IRI对移植物存活的影响，一直在致力寻找防治IRI的有效药物。灯盏细辛主要分布在我国云南地区，文献［6］报道灯盏细辛中含有丰富的咖啡酸乙酯等黄酮类物质，具体成分尚未完全查明，具有抗血栓、抑制凝血、促进纤溶活性及改善血液的高凝状态和微循环等作用。
作者应用大鼠肾冷缺血再灌注观察灯盏细辛对肾脏IRI的保护作用。肾组织匀浆生化结果显示：实验组中SOD活性高于模型对照组，MDA含量低于模型对照组，差异均具有统计学意义。SOD 对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤。MDA是脂质过氧化物，测试MDA的含量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映细胞损伤的程度。肾脏缺血再灌注前应用灯盏细辛可以明显提高SOD的活性，提高机体清除氧自由基的能力，且MDA含量降低，提示氧化损伤减轻。血生化结果显示：实验组缺血再灌注后24h 的BUN、Cr低于模型对照组，差异均具有统计学意义，证实应用灯盏细辛后冷缺血再灌注对肾脏功能的损害减轻。透射电镜观察发现，假手术组肾脏正常，模型对照组肾脏组织中的线粒体等细胞器形态失常，胞质内空泡样改变。实验组较模型对照组损伤明显减轻，2组在肾曲小管的差异最大（该部位是产生氧自由基最多的地方）。氧化损伤是IRI中最重要的途径，在超微结构中线粒体的损伤最明显，该研究中线粒体形态学变化符合IRI过程中该细胞器的功能变化。
有研究报道三七总苷［7］、苦菜总黄酮［8］对肾、心等器官IRI的保护作用也是通过其抗氧化作用实现的。该研究结果表明灯盏细辛能够减轻大鼠肾脏冷IRI中的氧化损伤，证实该药物对靶器官肾脏亦具有保护作用。作者将进一步研究该药物对IRI过程中肾小管上皮细胞的信号传导与细胞凋亡等分子生物学机制的影响。
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（2011-05-13收稿责任编辑赵秋民）
doi：10．3969/j．issn．1671-6825．2012．02．027
比索洛尔对急性心肌梗死大鼠梗死周边区心肌组织中KCNE1和KCNE2表达的影响
刘旭帮，张丽华#，李小威，牛少辉
郑州大学第二附属医院心血管内科郑州450014
#通讯作者，女，1964年3月生，硕士，教授，研究方向：冠心病的防治，E-mail：zlhxp@126．com
关键词急性心肌梗死；KCNE1；KCNE2；比索洛尔；大鼠
中图分类号R542．2
摘要目的：观察急性心肌梗死（AMI）大鼠梗死周边区心肌组织中KCNE1和KCNE2mRNA和蛋白的表达及比索洛尔的干预作用。方法：40只AMI大鼠随机分为24h组、1周组、4周组和比索洛尔组（给药4周），同时设假
手术组，每组10只。分别于各时间点处死大鼠，取左心室梗死周边区心肌组织，假手术组取对应部位的心肌组织，分别采用RT-PCR和Western blot检测KCNE1和KCNE2mRNA和蛋白的表达。结果：各组大鼠梗死周边区心肌组织中KCNE1和KCNE2mRNA和蛋白的表达相比，差异均有统计学意义（mRNA：F=130．418和182．943，蛋白：F= 425．815和619．624，P＜0．001）；梗死后24h，梗死周边区心肌KCNE1、KCNE2mRNA和蛋白的表达逐步增加（P＜0．05），在1周时达到高峰，4周时4周组和比索洛尔组KCNE1和KCNE2mRNA和蛋白的表达仍高于假手术组，但比索洛尔组低于4周组（P＜0．05）。结论：比索洛尔可抑制AMI后梗死周边区心肌组织KCNE1和KCNE2表达的上调，可能是其抗心律失常的机制之一。
Effect of bisoprolol on KCNE1and KCNE2expressions in myocardial in-farction border zone of rats after acute myocardial infarction
LIU Xubang，ZHANG Lihua，LI Xiaowei，NIU Shaohui
Department of Cardiology，the Second Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou450014
Key words acute myocardial infarction；KCNE1；KCNE2；bisoprolol；rat
Abstract Aim：To observe changes of the expressions of KCNE1and KCNE2mRNA and protein in infarcted border zone of acute myocardial infarction（AMI）rat heart and the effect of bisoprolol on them．Methods：Forty AMI rats were ran-domly allocated into24-hour group，1-week group，4-week group，and bisoprolol group．Ten rats in sham operation group．The myocardial tissue from left ventricular infarcted border zone was harvested at each time point，while corresponding myo-cardial tissue in sham-operated rats was harvested．KCNE1and KCNE2mRNA and protein expressions were measured by RT-PCR and Western blot，respectively．Results：The expressions of KCNE1，KCNE2mRNA and protein in the above groups were statistically significant（mRNA：F=130．418and182．943；protein：F=425．815and619．624，P＜0．001）．The above indexes all exhibited an ascending tendency at24h after AMI，reached peak value at1week after AMI，and de-scended at4weeks after AMI．The above indexes in4-week group and bisoprolol group were still higher than those in sham operation group，but those of bisoprolol group were lower than4-week group（P＜0．05）．Conclusion：Bisoprolol could in-hibit the upregulation of the expressions of KCNE1and KCNE2in myocardial infarcted border zone after AMI，which may be one of the mechanisms of its antiarrhythmic action．
急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）后室性心律失常是AMI早期严重的并发症和猝死的主要原因。心肌梗死后心律失常的发生机制尚不完全清楚，但是AMI后梗死周边区存活的心肌离子通道的电重构是心律失常发生的主要机制。研究［1］发现KCNE基因家族成员中KC-NE1、KCNE2主要在心肌表达，作为β-亚单位与电压依赖性钾离子通道α-亚基形成完整的钾通道复合体并对其进行调节，稳定细胞膜电生理特性。另有研究［2］表明KCNE基因表达异常可导致心肌细胞电通道功能障碍，诱发各种恶性心律失常。作者观察了AMI后梗死周边区心肌组织中KC-NE1、KCNE2mRNA和蛋白表达的变化及β受体阻滞剂比索洛尔对上述指标表达的影响，为研究抗心律失常作用提供理论基础。
1材料与方法
1．1材料健康清洁级SD大鼠，体质量200 250g（郑州大学实验动物中心）。富马酸比索洛尔（5 mg/片，批号105832，商品名康忻，Merck KGaA公司）；RNAiso Plus、RT-PCR试剂盒（北京全式金生物科技有限公司）；兔抗鼠KCNE1一抗（Santa Cruz公司）；兔抗鼠KCNE2一抗（Chem Icon公司）；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）。小动物呼吸机（HX-300S，成都泰盟科技有限公司）；生物信号采集分析系统（ASB240U，遨生电子有限公司）。
1．2动物模型的制备、分组与处理SD大鼠用100g/L水合氯醛（35mg/kg）腹腔注射麻醉后仰卧位固定，气管插管并连接小动物呼吸机及生物信号采集系统，标准肢体导联Ⅱ动态监测心电图。于胸骨左缘外四、五肋间心脏搏动最强处纵行切开皮肤，止血钳依次分离各层组织至肋骨，充分暴露心脏，在左心耳和肺动脉锥间距主动脉根部约2 3mm处用6．0无创伤缝线穿过冠状动脉左前降支（left anterior descending of coronary artery，
LAD）并结扎。结扎后，前壁心肌组织由鲜红色迅速变为暗红色，逐渐变为苍白，心电图监测肢体导联ST段较前上抬＞0．2mV为心梗模型制作成功。关闭胸腔后逐层缝合组织。术后存活的40只大鼠，按照随机数字表法分为AMI24h组、1周组、4周组和比索洛尔组，每组10只。假手术组于LAD下穿过缝合线，不结扎，余操作同AMI 各组。假手术组大鼠共30只，随机分配到上述3个时间点，每个时间点10只。比索洛尔组给予比索洛尔0．5mg/（kg·d）灌胃给药4周，其余各组给予等量生理盐水。术后于各时间点以100 g/L水合氯醛麻醉大鼠后迅速开胸取出心脏，用生理盐水冲洗后速取心梗区周围组织均分为2份，液氮中保存备用。
1．3KCNE1，KCNE2mRNA表达的检测采取RT-PCR法。取心肌标本组织约100mg，加入液氮完全研碎。按试剂盒说明提取RNA，逆转录为cD-NA。KCNE1上游引物：5’-GGCAGGAAACAGAT-GAGC-3’，下游引物：5’-GTGAAGAAGC-CGAAGAAAC-3’；KCNE2上游引物：5’-CACTT-TAGCCAACTTGACGC-3’，下游引物：5’-ATACT-TCTGCTGCCAATCCT-3’（北京赛百盛生物技术有限公司合成），扩增产物分别为127和283bp；β-actin 上游引物：5’-CCCATCTATGAGGGTTAC-3’，下游引物：5’-GGAAGGTGGACAGTGAG-3’，扩增产物为568bp。PCR扩增体系：取逆转录产物2μL，上、下游引物各1μL，酶缓冲液5μL，dNTPs4μL，Taq酶0．5μL，补水到50μL。扩增条件：94预变性2min；94?变性30s，55?退火30s，72?延伸2min，共30个循环；72?延伸6min。取PCR产物，用20g/ L琼脂糖凝胶电泳，全自动凝胶成像分析系统对凝胶成像，Quantity One软件分析后分别计算KCNE1，KCNE2与β-actin灰度值的比值代表其相对表达量。
1．4KCNE1、KCNE2蛋白表达的检测采用Western blot法。取心肌标本组织约100mg剪切成小块，加入1mL的全蛋白提取液匀浆15min，4?、14000r/min离心20min，取上清20μL，根据标准曲线计算出蛋白浓度，其余上清中按照1∶4加入上样缓冲液，100?加热5min。100g/L SDS-PAGE凝胶电泳分离KCNE1，KCNE2蛋白，50g/L脱脂奶粉封闭，弃去封闭液后，加入一抗，弃去一抗后，用TBS 洗涤10min，共3次。弃去TBS，加入二抗，37?孵育1h后弃去二抗，用TBS洗涤10min，共3次。采用增强化学发光法显影，将胶片扫描后用Band-scan5．0软件进行灰度分析。
1．5统计学处理应用SPSS17．0处理数据，定量资料用珋x?s表示，各组间mRNA及蛋白的表达采用单因素方差分析和SNK-q检验，检验水准α=0．05。
2结果
假手术24h组、1周组及4周组大鼠左心室相应部位心肌组织KCNE1、KCNE2mRNA及蛋白均有表达，但各组间差异无统计学意义（mRNA：F= 2．980和0．070，P=0．068和0．993；蛋白：F=0．802和0．115，P=0．459和0．891），故以假手术4周组用于比较分析。各组大鼠梗死周边区心肌组织中KCNE1、KCNE2mRNA和蛋白的表达水平见图1、2及表1
。
表1各组大鼠梗死周边区心肌
组织中KCNE1、KCNE2mRNA和蛋白的表达
组别n KCNE1mRNA KCNE2mRNA KCNE1蛋白KCNE2蛋白
假手术组100．17?0．020．13?0．010．16?0．020．15?0．03
24h组100．26?0．03*0．23?0．02*0．31?0．04*0．29?0．02*
1周组100．49?0．05*#0．43?0．04*#0．65?0．05*#0．52?0．03*#
4周组100．26?0．03＊△0．25?0．02*#△0．32?0．03＊△0．28?0．02＊△比索洛尔组100．19?0．02＊▲0．18?0．01＊▲0．19?0．03＊▲0．17?0．01＊▲F130．418182．943425．815619．624
P＜0．001＜0．001＜0．001＜0．001
*与假手术组相比，#与24h组相比，△与1周组相比，▲与4周组相比，P均＜0．05。
3讨论
AMI后梗死周边区心室肌细胞动作电位时程（action potential duration，APD）缩短，延迟整流钾通道电流（delayed rectifier potassuim current，IK）密度增加以及心脏起搏通道（HCN）电流增加可能是心肌梗死后易发生心律失常的离子机制之一。Ben-dahhou等［3］的研究证实，将KCNE1与KCNQ1、HERG（α-亚基）在体外进行共同表达，发现KCNE1使全细胞的电流密度升高，通道整体电导增加，电压依赖性增强，慢激活的IK和快激活的IK增加，最终导致平台期缩短，3相复极加速，APD时程缩短，进而诱发心律失常。KCNE2基因编码的β-亚单位（MiRP1蛋白）参与HCN阳离子通道的构成并对其进行调节。有研究［4］报道KCNE2表达的增加伴随HCN电流增快，与心律失常密切相关；研究［5］也证实了在病理状态下，HCN通道与心律失常有关。
该研究发现，AMI后梗死周边区心肌组织KC-NE1、KCNE2mRNA和蛋白表达量明显升高，在心肌梗死1周，二者升至峰值，与已有研究［6］AMI1周各种室性心律失常发生率最高相符。推测缺血心肌组织中KCNE1和KCNE2的表达上调，可能引起相应离子通道的动力参数发生改变，从而导致心肌细胞异常复极和自律性改变，诱导梗死后心律失常的产生；同时还可能通过肾上腺系统和肾素血管紧张素系统及内皮素、缺氧等多种刺激因素调节［7］。β受体阻滞剂如比索洛尔具有抗交感神经活性、下调血管紧张素Ⅱ水平等多种抗心律失常作用。该研究结果显示，AMI后4周，比索洛尔组和4周组KCNE1、KCNE2的表达虽高于假手术组，但比索洛尔组低于4周组，提示比索洛尔可抑制AMI后梗死周边区心肌组织KCNE1和KCNE2表达的上调，可能是其抗心律失常的机制之一。
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（2011-12-05收稿责任编辑徐春燕）