垂直型SDS_PAGE分析发酵豆粕中蛋白类抗营养因子的研究

垂直型SDS-PAGE 分析发酵豆粕中

蛋白类抗营养因子的研究

欧阳亮

李

亮

蔡源锋

摘

要

为探索发酵豆粕中蛋白类抗营养因子的情况，文章详细研究了聚丙酰胺凝胶电泳法分

析固态发酵豆粕蛋白质分子量的操作步骤，试剂配制方法、操作要点，研究结果表明，豆粕经过微生物固态发酵以后，分子量有所降低，抗营养因子有明显改善，但不同发酵豆粕在蛋白类抗营养因子方面的质量有一定差异。

关键词聚丙酰胺凝胶电泳；发酵豆粕；蛋白质分子量；蛋白类抗营养因子中图分类号S816.17

欧阳亮，上海邦成生物科技有限公司，201615，上海市沪松公路1620弄21号。

李亮、蔡源锋，单位及通讯地址同第一作者。收稿日期：2008-06-09

豆粕中蛋白质含量丰富，含有人体所必需的8种氨基酸，是优质的全价蛋白源。但生豆粕中含有多种抗营养因子（antinutritional factors ，ANF ），主要包括大豆抗原蛋白（致敏因子）、胰蛋白酶抑制剂、植酸、大豆凝血素、脲酶、低聚糖、脂肪氧化酶、致甲状腺肿素等，这些抗营养因子阻碍营养成分的消化、吸收和利用，并对动物的生长发育和健康造成不良影响。

大豆中多数抗营养因子已经有了比较成熟的定性和定量测定方法，酶联免疫法比较复杂，不适合于中小饲料企业使用。在豆粕的抗营养因子中，蛋白酶、

11S 蛋白、7S 蛋白等是主要的抗营养因子成分，分子量比较大，通过SDS-PAGE 聚丙酰胺凝胶电泳的方

法，测定蛋白分子量分布大致情况，从一定程度上可以看出发酵工艺对于去除抗营养因子的作用，通过标准分子量图谱比较，可以从一定程度上反映出蛋白类抗营养因子的去除程度，从一定角度上讲，其它类抗营养因子也可能由于细菌的消化分解和利用而被消耗。

SDS-PAGE 是PAGE 的一种特殊形式。SDS 是带负电荷的阴离子去污剂。用SDS-PAGE 测定蛋白质分

子量时，蛋白质需经过样品溶解液处理，在样品溶解液中含有巯基乙醇及SDS ，各种蛋白质在巯基乙醇作用下，还原成单链，再进一步与SDS 结合形成带大量负电荷的SDS-蛋白质复合物。因此，各种蛋白质分子在SDS-PAGE 中，只能按其分子量大小而分离。

电泳分离后，不同蛋白质分子量的条带经过染

色，显示出不同的条带分布，与显色的标准分子量条带相比较，得出样品中蛋白质的分子量分布范围。

1试剂和仪器1.1主要试剂

Na 2HPO 4、NaH 2PO 4·2H 2O 、β-巯基乙醇、SDS 、甘油、溴酚蓝、丙烯酰胺（Acr ）、N ，N'-亚甲基双丙烯酰胺（Bis ）、N ，N ，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED ）、硫酸铵（AP ）、琼脂（糖）、低分子量标准蛋白试剂、甲醇、冰乙酸、考马斯亮蓝R250。

实验中使用的试剂除低分子量标准蛋白试剂为色谱级外，其它均为分析级，所用的水为双蒸水。

1.2主要仪器与试验样品

主要仪器是DYY -6C 型凝胶电泳仪，DYCP -

31DN 型电泳槽，Anke TGL-18G-C 型离心机，北京市六一仪器厂生产。实验测试样品为豆粕样品1个、市场发酵豆粕样品3个。2试剂配制

2.1磷酸盐缓冲液（0.2mol/l 、pH 值7.2）

称取无水磷酸氢二钠（Na 2HPO 4，AR ）20.44g （或Na 2HPO 4·12H 2O 51.58g 或Na 2HPO 4·2H 2O 25.63g ），再称取磷酸二氢钠（NaH 2PO 4·2H 2O ，AR ）8.74g （或

NaH 2PO 4·H 2O 7.73g ），溶于去离子水（或双蒸水）中，

并定容至1000ml 。2.2液体样品溶解液

0.01mol/l 、pH 值7.2磷酸盐缓冲液内含2%SDS 、2%巯基乙醇、20%甘油（或40%蔗糖）、0.04%溴酚蓝。

此缓冲液用来溶解标准蛋白质及待测固体蛋白质样品，配制方法如表1所示。

2.3凝胶贮液

称丙烯酰胺（Acr ）30g ，N ，N'-亚甲基双丙烯酰胺

（Bis ）0.8g ，加重蒸水至100ml ，过滤后置棕色瓶，4℃贮存可用1~2个月。

2.4凝胶缓冲液

称0.2g SDS ，加0.2mol/l 、pH 值7.2磷酸盐缓冲

液至100ml ，过滤后置棕色瓶，4℃贮存，用前稍加温使SDS 溶解。

2.51%TEMED

取1ml N ，N ，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED ），加重蒸水至100ml ，置棕色瓶，4℃贮存。2.610%过硫酸铵

称过硫酸铵（AP ）10g ，加重蒸水至100ml ，此液

应每周新配，置棕色瓶，4℃贮存。

2.7电极缓冲溶液（0.1%SDS ，0.1mol/l 、pH 值7.2磷酸盐缓冲液）

称1g SDS ，加500ml 的0.2mol/l 、pH 值7.2磷

酸盐缓冲液，再用蒸馏水定容至1000ml 。

2.81%琼脂（糖）

称琼脂（糖）1g ，加100ml 上述电极缓冲溶液使其溶解，4℃贮存。

2.910%浓度SDS-连续体系凝胶（见表2）

项目

凝胶贮液凝胶缓冲液

1%TEMED

重蒸馏水

混均后，置真空干燥器中抽气10min 10%过硫酸铵（AP ）

配制20ml 不同浓度分离胶所需各种试剂用量(ml)

6.6610.002.001.230.20

表2

SDS-连续体系凝胶配制

注：使用工具是1ml 取液枪，50μl 取液，一次性枪头废弃。

2.10配制0.5~1mg/ml 低分子量标准蛋白试剂样品溶解液

称10mg 低分子量标准蛋白试剂,加0.2mol/l 、

pH 值7.2磷酸盐缓冲液10ml ，溶解。2.11固定液

取50%甲醇454ml ，冰乙酸46ml ，混匀。2.12染色液

称0.125g 考马斯亮蓝R250,加上述固定液250ml,

过滤后备用。

2.13脱色液

冰乙酸75ml,甲醇50ml,加蒸馏水定容至1000ml 。

3实验内容与步骤

3.1配胶及凝胶板的制备

配胶：根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。选择SDS-PAGE 连续系统的配制方法（见表2）。电极缓冲液为0.1mol/l 、pH 值7.2磷酸缓冲液，内含0.1%SDS 。

3.2SDS-连续体系凝胶板的制备

将凝胶密封框（其中0.75mm 的密封条为浅绿色，1.0mm 的密封条为蓝色，1.5mm 的密封条为深灰

色）放在平玻璃上，然后将凹型玻璃与平玻璃重叠，将两块玻璃立起来使其底端接触桌面，用手将两块玻璃板夹住放入电泳槽内，然后插入斜槭板到适中程度，

即可灌胶。

按表2配制20ml 浓度为10%的SDS-连续体系凝胶溶液，用细长头滴管将分离胶混合液加到两块玻璃板的缝隙内直至距离短玻璃板上缘0.5cm 处，插入样品槽模板。为防止渗漏，可在上、下电极槽中加入蒸馏水，但不能超过短板，以防凝胶被稀释，约30min ，凝胶聚合，继续放置20～30min 后，倒去上下电极槽中的蒸馏水，小心拔出梳形样品槽模板，用窄条滤纸吸去残余水分，注意不要弄破凹形加样槽的底面，倒入电极缓冲液即可准备加样。

注意：凝胶聚集后，轻轻取下梳子，用手夹住两块玻璃板，上提斜槭板，使其松开，然后取下玻璃胶室，去掉凝胶密封框，注意在上述过程中手始终给玻璃胶室一个夹紧力，再将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽。插入斜槭板，将缓冲液加至内槽玻璃凹口以上，外槽缓冲液加至距平玻璃上沿3mm 处即可电泳。同时注意避免在胶室下端出现气泡。

3.3制备液体样品

发酵豆粕固体样品经过超微粉碎，过100目。取

1g 样品，用100ml 的0.2mol/l 、pH 值7.2磷酸盐缓冲液溶解，4000r/min 离心10min 。取0.5ml 上清液，加入0.5ml 液体样品溶解液,溶解后,将其转移到带塞小离心管中,轻轻盖上盖子(不要塞紧，以免加热时迸

表1

连续体系样品溶解液配制（0.01mol/l 、pH 值7.2磷酸盐缓冲液）

注：液体样品与样品溶解液等体积混合，若样品为固体，则用稀释一半的样品溶解液。

SDS

200mg

巯基乙醇

0.2ml 甘油

2ml 溴酚蓝

4mg

0.2mol/l 、pH 值7.2磷酸盐缓冲液

1ml

加重蒸水至最后总体积为

10ml

项目含量

出),在100℃沸水浴中保温3min，取出冷却即为液体样品。注:如处理好的样品暂时不用,可放在-20℃冰箱保存较长时间,使用前在100℃沸水浴中加热3min,以除去亚稳态聚合。

3.4加样

一般每个凹形样品槽内只加一种样品或已知分子量的混合标准蛋白质,加样体积要根据凝胶厚度及样品浓度灵活掌握,一般加样体积为10~15μl（即2~ 10μg蛋白）,如样品较稀,加样体积可达100μl,如样品槽中有气泡,可用注射器针头挑除。加样时,将微量注射器的针头通过电极缓冲液伸入加样槽内,尽量接近底部,轻轻推动微量注射器,注意针头勿碰破凹形槽胶面。由于样品溶解液中含有比重较大的蔗糖和甘油,因此样品溶液会自动沉降在凝胶表面形成样品层。

3.5预电泳

分离胶聚合后是否预电泳应根据需要而定，SDS 连续系统预电泳采用30mA电流，60~120min。

3.6连续系统电泳

在电极槽中倒入0.1%SDS pH值7.2的0.1mol/l 磷酸盐缓冲液,连接电泳仪与电泳槽,打开电源,将电流调到20mA,待样品进入分离胶后,将电流调至50mA,待染料前沿迁移至距硅橡胶框底边1～1.5cm处，停止电泳，一般需5～6h。

3.7凝胶板剥离与固定

电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅橡胶框，用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板，在凝胶板切下一角作为加样标志，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。将凝胶板放在大培养皿内，加入固定液，固定过夜。

3.8染色与脱色

将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。4结果与分析

在大豆蛋白中，大多数大豆抗营养因子的分子量集中在35000～600000道尔顿，从SDS-PAGE垂直电泳图(见图1)上可以看出，与低分子量蛋白标准图谱对照，豆粕发酵之前，抗营养因子较多，而发酵之后，B2发酵豆粕样品中分子量在43000以上的大分子蛋白质大部分被分解，分子量在20100～43000的大分子几乎全部被分解，其蛋白分子量多数在14400以下；而B1和B3发酵豆粕样品中的分子量稍大，但大部分抗营养因子也已经被降解去除，说明微生物发酵法确实能够降解豆粕中的大部分抗营养因子，但发酵批次之间的稳定性、不同厂家不同的发酵菌种和发酵参数对去除大分子蛋白类的抗营养因子有一定差异。

A B1B2B3C

97，400

66，200

43，000

31，000

20，100

14，400

注：A——

—发酵前豆粕样；B1——

—发酵豆粕样品1；B2——

—发酵豆粕样品2；B3——

—发酵豆粕样品3；C——

—低分子量蛋白标准，分子量14400～97400道尔顿。

图1发酵前后豆粕中蛋白质的SDS-PAGE垂直电泳

5小结

微生物发酵法是利用微生物在繁殖过程中所分泌的复杂蛋白酶对豆粕中的蛋白质类抗营养因子的降解和部分消耗（如大豆抗原蛋白、胰蛋白酶抑制剂、大豆凝血素、脲酶、脂肪氧化酶），对非蛋白类抗营养因子的利用（如植酸、低聚糖、致甲状腺肿素等）来降低抗营养因子的水平。在发酵过程中使用的菌种种类、菌种产蛋白酶水平、菌种接种量、菌种培养条件、菌种总生物量决定了固态发酵工艺对豆粕中抗营养因子的去除水平。经过诱变和优化产酶水平的枯草芽孢杆菌，产蛋白酶水平和总量高，对蛋白类抗营养因子的去除非常明显，植物乳杆菌、酿酒酵母菌、枯草芽孢杆菌的协同生长对非蛋白类抗营养因子的消耗起着重要作用。

发酵豆粕中抗营养因子的情况可通过酶联免疫法、SDS-PAGE聚丙酰胺凝胶电泳法测定，也能通过测定发酵豆粕产品中有关产物的水平来协助衡量，比如测定发酵豆粕中可溶物含量、小肽含量、乳酸含量、湿物料中活菌总数量等。总之，酶联免疫法定量准确，SDS-PAGE聚丙酰胺凝胶电泳法比较直观，测定发酵豆粕产品中有关产物的水平来协助衡量更简单易行,所以要结合本公司的检验条件,对各种方法的检测经验、熟练程度,对不同厂家产品的使用经验来检测是比较恰当的。（参考文献15篇，刊略，需者可函索）

（编辑：刘敏跃，lm-y@https://www.wendangku.net/doc/752127172.html,）