Westernblot原理操作及注意事项
Western blot的原理、操作及注意事项
原理：
通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。
一、抗原的选择和制备
A：样品的制备
1 组织：
组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
2 细胞：
细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
3 分泌蛋白的提取（特例）：
直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。
B：蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因
1.双缩脲法：
双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。双缩脲法常用于0.5g/L～10g/L 含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good 缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1m NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。
2.Lowry法：
此法是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应，即Cu++与蛋白质在碱性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得到深蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L～400mg/L含量的蛋白质溶液。其干扰物质与双缩脲法相同，而且受他们的影响更大，硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重偏差。另外要注意的是，加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性pH环境中才稳定，上述提到的还原反应只有在pH10时才发生，因此，福林试剂加入到碱性的Cu2+-蛋白质溶液中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被Cu2+-蛋白质络合物所还原。
3.紫外吸收法：
大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故，因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。如果没有干扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定0.1～0.5mg/ml含量的蛋白质溶液。部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波长处有最大吸收。有核酸时，所测得的蛋白质浓度必须作适当校正，一般按下述公式粗略计算：
是蛋白质溶液在280nm波长处（光程1厘米）测得的光密度值。
是蛋白质溶液在260nm小波长处（光程1厘米）处所测得的光密度值。
此方程是从烯醇酶（在酵母核酸存在时）得出来的。因此，对其他蛋白质和其他核酸不一定适用。由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量不同，因
此，浓度为0.1%的各种蛋白质在280nm处的消光系数（）在0.5～2.5之间变化。
所有的蛋白质在230nm以下都有强吸收。例如，牛血清白蛋白的α0.1%在225nm和215nm处分别为5.0和11.7，而在280nm处测为0.58。在230nm以下的强吸收是由于肽键的存在，因此，此值对所有的蛋白质都是一样的。从215nm
和225nm处的光密度之差可用于测定浓度为10μl/ml～100μl/ml的蛋白质。蛋白质浓度可以近似地由下式得到：
光密度之差求
得，这一公式是减去溶液中非蛋白质成分产生的误差。但是，蛋白质之间的分子量差异比较大，因此，在比较几种蛋白质含量时，必须作适当的校正。由于蛋白质的吸收峰常因pH改变而变化，所以在制作标准曲线时，必须与样品条件一致。
4. Bradford比色法：
Bradford比色法比Lowry法测定蛋白浓度更简单迅速。用脱氧胆酸/三氯乙酸沉淀蛋白可排除甘油、去污剂、2-巯基乙醇、乙酸、硫酸铵、Tris和一些碱性缓冲系统的干扰。
分别在两组微量离心管中各加入0.5mg/ml牛血清白蛋白（5，10，15和20μl），以0.15mmol/l NaCl补足至100μl，同时以两管100μl的0.15mmol/l NaCl作空白对照。每管各加入1ml考马斯亮蓝染料溶液，振荡混匀，室温放置2分钟。用1cm光径的微量比色杯测A595，取A595吸光值对标准蛋白浓度作图，画标准曲线，并测量待测样品的A595。从BSA标准曲线中确定待测样品的浓度。测定10-100μg的蛋白质，要在较大试管中将染料溶液体积增大5倍进行。样品浓度过高，可稀释后进行，或在10-100μg另作一标准曲线进行测定。
5．电泳估算法（我们选择此法）：
样品倍比稀释，SDS-PAGE电泳，同时做定量marker对照，可以估算样品大概浓度。
以提取癌组织总蛋白为例：
①取等量胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织，用dH2O漂洗5～10次，再用预冷的1×PBS洗涤3次，目的是去除样本中的血液。
②每2克组织加入3ml 1×PBS匀浆，保持在4℃条件进行。
③加入5×STOP Buffer缓冲液1ml，混匀，4℃下超声碎化。再加入0.5ml β-ME，0.5ml溴酚蓝，煮沸10mins，至此，制样过程完成；
④ SDS-PAGE电泳，以BAS作为对照估计样品蛋白浓度。
二、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS－PAGE）
A：实际操作
1.做胶前的准备
1)检查是否有足够的、干净的 spacer、comb 和架子。
2)检查是否有新鲜的，足量10%APS，没有立刻重配。
3)按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量。
2.制胶，电泳
1）装好架子。
2)按照下面配方配制分离胶。(单位：ml，Total： 8ml)
在胶上面加入一层蒸馏水，促进胶更好的凝集。
3)待分离胶凝集后，配制浓缩胶。(单位：ml，Total： 3.5ml)
倒好后插入预先准备好的梳子。
4)待胶凝集好后，上样，电泳。上层胶用60-80V电压，当样品至分离胶时，用100-120V电压。一般电泳时间在1.5小时左右。
B ：注意事项及常遇到的问题
1）分离胶不要倒的太满，需要有一定的浓缩胶空间，否则起不到浓缩效果。
2）上样蛋白量不应超过30ug/mm2 (载荷面即：如果你的胶槽是5mm×1mm，
则载荷面为：1mm×5mm=5mm2) 。
3）gel通常在0.5-1h内凝集最好，过快表示TEMED、APS用量过多，此时胶
太硬易龟裂，而且电泳时容易烧胶。太慢则说明两种试剂用量不够或者系统实际
不纯或实效。
4）混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形。太慢不均匀，
特别是甘油。
5）电泳中常出现的一些现象：
︶条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。
︵条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部
有气泡，或者两边聚合不完全。
拖尾：样品溶解不好。
纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。
条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。
条带两边扩散：加样量过多。
三、转移
在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上。
膜的选择：印迹中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF等。
我们选用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有
更好的化学兼容性。有两种规格：Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ(0.2um for MW<20kDa)。
A 半干法
即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲
液传导电流，起到转移的效果。因为电流直接作用在膜胶上，所以其转移条件比
较严酷，但是其转移时间短，效率高。
1 实验条件的选择
电流1mA-2mA/cm2，我们通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、胶浓度选
择转移时间，具体可以根据实际适当调整。
2 实验操作
（1）滤纸和膜的准备 (在电泳结束前20分钟应开始准备工作)。
A.检查是否有足够的transfer buffer，没有立即配制。
B.检查是否有合适大小的滤纸和膜。
C.将膜泡入甲醇中，约1-2分钟。再转入transfer buffer中。
D.将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入transfer buffer 中。
（2）转移
A.在电转移仪上铺好下层滤纸。一般用三层。
B.将膜铺在靠膜滤纸上，注意和滤纸间不要有气泡，再倒一些transfer
buffer到膜上，保持膜的湿润。
C.将胶剥出，去掉stack gel，小心的移到膜上。
D.剪去膜的左上角，在膜上用铅笔标记出胶的位置。
E.将一张靠胶滤纸覆盖在胶上。倒上些transfer buffer，再铺两张靠
胶滤纸。
F.装好电转移仪，根据需要选定所需的电流和时间。
G.转移过程中要随时观察电压的变化，如有异常应及时调整。
3 注意事项及常遇到的问题
1）滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸>=膜>=胶。
2）滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。
3）因为膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中，
膜也必须随时保持湿润（干膜法除外）。
4）滤纸可以重复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有很多转移透过的蛋白质，
所以上下滤纸一定不能弄混，在不能分辨的情况下，可以将靠胶滤纸换新的。
5）转移时间一般为 1.5 小时，( 1mA-2mA/cm2，10% gel)，可根据分子量大小调整转移时间和电流大小。
B 湿法
我们基本上不用此方法，这里暂不做介绍。
C 转移后效果的鉴定
1．染胶
用考马斯亮兰染色经destain脱色后，看胶上是否还有蛋白来反映转移的效
果。
2．染膜
有两类染液选择，可逆的和不可逆的。可逆的有ponceau-s red 、Fastgreen
FC、CPTS等，这类染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做进一步的分析用。
但是不可逆的染料，如考马斯亮兰、india ink、Amido.black 10B等，染色后
膜就不能用于进一步的分析。
四、封闭（block）
封闭是为了使我们的抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合。
常用的封闭液有bovine serum albumin(BSA)，non-fat milk，casein，gelatin，tween-20等，我们一般用non-fat milk。
在转移结束前配好5%的Milk(TBST溶解)。转移结束后将膜放入milk中block(一定要放在干净的容器里，避免污染而且要足以覆盖膜)，并清洗整理好
用过的滤纸，以便下次使用。 Block 4°C O/N，或 RT 1小时。
五、孵育一抗
A.先将需要检测的抗体准备好，并决定好它们的稀释度。
B.配好5%的Milk(TBST溶解)，按要求稀释好抗体。注意，如需高比例稀释，最好采用梯度稀释。
C.将稀释好的抗体和膜一起孵育。一般采用RT 1小时，可根据抗体量和膜上抗原量适当延长或缩短时间。
注意：为了便于后面分析结果，我们一般会选用已确定分子量大小而且纯度
高的抗体作为marker与一抗同时孵育。
六、洗涤
用 TBST先快速洗三次，把milk尽快的wash掉。然后5mins *5。
洗涤是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景
的深浅。
七、孵育二抗
孵育 RT 1.5 小时。一般采用HRP标记的二抗，稀释比例为1:5000。
二抗的稀释比例不能太低，否则容易导致非特异性的结合。
注意二抗的选择有多种，要根据一抗来选择抗兔、抗鼠或者抗羊的二抗，以
及根据后面的显色条件来选择HRP、AP或者GOD（葡萄糖氧化酶）酶链的二抗或
者标志其他探针（如核素等）的。
八、洗涤
用 TBST先快速洗三次，把milk尽快的wash掉。然后5mins *5。
洗涤是为了洗去二抗的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅，所以洗涤一定要干净。
九、显色（HRP酶）
1．增强化学发光法(ECL)
Ecl 显色原理：氨基苯二酰肼类主要是鲁米诺及异鲁米诺衍生物，是最常用的一类化学发光剂。鲁米诺（luminol，5＇-氨基-2，3-二氢-1，4-酞嗪二酮）的分子结构及化学反应式如下：
鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物。在Ecl 底物中，含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光来。
试验步骤：
1）将两种显色底物1：1等体积混合（一般各1ml/membrane）。
2）将混合物覆盖在膜表面，1-2分钟，摇晃使均匀。
3）用保鲜膜把膜包起来，放入夹板中。
4）在暗室中将X光片，覆盖在膜的上面，夹好夹子，曝光1min。
5）显影、定影。
6）根据结果调整曝光时间和曝光区域，得到最佳结果。
注意：荧光在一段时间后会越来越弱。
2.DAB显色
DAB（3,3二氨基联苯胺）和HRP反应产生棕色的不溶终产物。这种棕色沉淀不溶于酒精和其它有机溶剂，对于必需使用传统复染和封固介质的免疫组化染色应用特别理想。
对于AP标记的二抗我们选用BCIP and NBT 显色，它们在碱性磷酸酶（AP）作用下反应可生成一种不溶性黑紫色沉淀的强信号。
十、分析结果及其判断
常见问题原因分析及处理方法：见附录一、二。
附录一：Troubleshooting Blotting Problems （P43－48）
附录二：Western Blotting Troubleshooting Logic Tree （P390－394）
附录三：试验中所用到的试剂和缓冲溶液
1)5x Stop Solution (Sample buffer) pH6.7:
Stock: to use: 20% Glycerol 100ml take 9.5ml stock 10% SDS 50g or 250ml 20% SDS add BME 0.5ml
250mM Tris 15.14g bromphenol blue or
total 475.00ml pyronine 4 to taste
2) Gel solution (30% w/v acrylamide mix):
0.8 bis-acrylamide 0.8g
29.2% acrylamide 29.2g
total 100ml
3) 2x Laemmli Separation Buffer:
0.75M Tris-HCl 90.825g
0.2% SDS 10ml 20% SDS
total 1000ml
pH8.8
4) 2x Laemmli Stacking Buffer:
0.25M Tris 15.14g
0.2% SDS 1g
total 500ml
pH6.8
5) 10x Laemmli Running Buffer:
250mM Tris 60.55g
1.9M Glycine 285.27g
1% SDS 20g
total 2 liters
pH8.3
6) Transfer Buffer:
48mM Tris base 5.81g
39mM Glycine 2.93g
0.037% SDS 0.375g
20% MeOH 200ml
total 1000ml
7) TBST:
10mM Tris-HCl， 1.21g
100mM NaCl
0.2% Tween-20
Total 1000ml
pH7.4
8) Coomassie Stain :
40%MeOH 400ml
10%HAc 100ml
0.1%BBR 1g Brilliant Blue R total 1000ml
9) Destain:
30%MeOH 300ml
7.5%HAc 75ml
total 1000ml
10) 10×丽春红染液配方：
丽春红 2g
磺基水杨酸 30g
三氯醋酸 30g
total 100ml
11）DAB
DAB 50mg
0.05mol/L TB （PH7.6） 100ml
30%H
2O
2
30-40ul
先配成2-5倍的储存液，过滤后分装，-20℃避光保存，H
2O
2
在工作液中终浓
度0.01％。
westernblot详细图解
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以
检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材 电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素 膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
(完整word版)WB原理、步骤及总结,推荐文档
实验原理 蛋白质印迹是把电泳分离的蛋白质转移到固定基质上，然后利用抗原抗体反应来检测特异性的蛋白分子的技术，包括三个部分：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳转移，免疫印迹分析。 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质相对分子质量，SDS是阴离子去污剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏其高级结构。SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4:1，由于SDS带有大量的负电荷，与蛋白质结合时掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使各种蛋白质带有相同密度的负电荷，形似长椭圆棒，蛋白迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系。因此，利用相对分子质量标准蛋白所作的标准曲线，可以求得未知蛋白的相对分子质量。 电泳后蛋白质分子嵌在凝胶介质中，探针分子很难通过凝胶孔，将蛋白质从凝胶转移到固定基质上可以对蛋白质进行免疫检测分析。方法有两种：①水平半干式转移即将凝胶和固定基质似三明治样夹在缓冲液浸湿的滤纸中间，通电10~30min可完成②垂直湿式转移即将凝胶和固定基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电2~4h或过夜可完成。固定基质通常有硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜和尼龙膜。 蛋白质转移到固定化膜上之后，通过蛋白质染料如丽春红S检测膜上的总蛋白，或用考马斯亮蓝检测凝胶上的蛋白剩余量，以验证转移是否成功。用抗体作为探针进行特异性的免疫反应检测抗原蛋白，分为4步：①用非特异性、非反应活性分子封阻固定化膜上未吸附蛋白的自由结合区，以防止作为探针的抗体结合到膜上，出现检测时的高背景②固定化膜用专一性的一抗温育，使一抗与膜上的抗原蛋白分子特异性结合③酶标二抗与一抗特异结合④加入酶底物，适当保温，膜上便可见到颜色反应，检测出抗原蛋白区带。 主要溶液 10%分离胶 水 3.3mL、30% 丙烯酰胺混合液 4.0mL、1.0mol/L Tris（pH8.8）2.5mL、10% SDS 0.1mL、10%过硫酸铵0.1mL、TEMED 0.004mL 5%浓缩胶 水 2.7mL、30%丙烯酰胺混合液0.67mL、1.0mol/L Tris0.5mL、10%SDS0.04Ml/10%过硫酸铵0.04mL、TEMED0.004mL 1×Tris –甘氨酸电泳缓冲液 Tris碱3.03g、甘氨酸18.77g、SDS 1g，用去离子水定容至1L 2×SDS凝胶加样缓冲液 Tris-HCl（pH6.8） 100mmol/L，β-巯基乙醇10%，10%甘油，0.01%溴酚蓝，10%SDS 转移缓冲液 Tris 2.45g，甘氨酸11.25g，甲醇100mL，加去离子水至1L TBST Tris 1.21g NaCl 8.77g，Tween-20 1 mL，加去离子水至1L Stripping 1.3mL Tris （pH 6.8），4mL10%SDS，140μlβ-巯基乙醇，用水定容到20mL 实验步骤 1 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
WB实验步骤
Western blotting实验步骤 1．蛋白质的样品制备： 取心肌组织50mg，待组织块自行溶解，用滤纸吸去其表面水分，将组织块放入玻璃匀浆器球状部位，用组织剪尽量将其剪碎，将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌组织的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），将玻璃匀浆器插入冰中，匀浆约30分钟。 将心肌组织匀浆转移到离心管中，4℃12000g离心5分钟，收集上清（如有粘稠物进一步用超声处理），样品分装冻存于-20℃备用。 2 .测定蛋白浓度： 2.1 按50：1配置BCA工作液。 2.2 10ulC液（蛋白标准）+90ulPBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。 2.3 分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第1~8标准孔中，在其他样品孔中加入10ul待测样品。 2.4 分别加PBS定容至20ul。 2.5 各孔中加入200ulBCA工作液，室温放置2小时。 2.6 用酶标仪测定蛋白浓度：测定A562，依标准曲线算出蛋白浓度。 3 SDS-PAGE电泳： 3.1 制胶: 按比例配制分离胶，缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40min。同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，连续
平稳的注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制60min以上以保证完全聚合。 3.2 预电泳：将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。（目的是清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通）。 3.3 样品准备：首先计算上样体积，然后按样品：上样buffer=4：1的比例加入上样bufer混匀，沸水煮10分钟，冰上5分钟。 3.4 加样：预电泳后依次加入标准品（Marker）和待分析样品。（加样时间要尽量短，以免样品扩散，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。每个泳道加5ul。 3.5 电泳：加样完毕，选择80V恒压进行电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿到达两胶交界处（一般约20分钟），更换至100V恒压电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳（一般约为1小时20分钟）。 4．转膜： 4.1 切胶：将电泳完毕的胶完整的放在盛有电转液的玻璃皿中，将目的蛋白所在区域切下来，测量其长宽，并记录。 4.2 剪膜和滤纸：按胶的尺寸剪膜和滤纸（滤纸长宽较凝胶小0.5~1mm，PVDF 膜长宽较凝胶大0.5~1mm），滤纸浸入盛有电转液的玻璃皿中10秒钟，膜放入盛有10%甲醇的玻璃皿中10秒钟，然后将两者都放入盛有去离子水的玻璃皿中3分钟，进一步放入盛有电转液的玻璃皿中3分钟。 4.3 向电转槽中倒入部分电转液，将海绵浸入。按如下顺序制作“三明治”（注意避免两边滤纸相互接触，以免发生短路）。从正极到负极按如下顺序排列：
WesternBlot原理和操作方法(全)讲解
Western Blot 原理和操作方法（全） Western Blot 工作原理 蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol 的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广旱挠τ? SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量. PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS 变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基. 样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳. 另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部. 重要参数 ①聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算: T%=(a+b)/m*100%; 和C%=a/(a+b)*100% 其中: a=双体(bis)的重量;b=单体(arc)的重量;m=溶液的体积(ml) ②当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度: 蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%) <104 20-30
药房日常操作规程及注意事项
药房发药、收费日常操作规程 以病人为中心，做有良心的医生，办负责任的医院，树立良好的口碑，为病人提供满意的诊疗服务。 一、班前准备： 1．在上班时间前10—15分钟到达科室。 2．签到，整理工作台、更换工作服、平底鞋、整理头发、化淡妆。3．清点数量，把药品按规定整齐摆放在药架上，保障药品供应。4．收费人员检查零钱备用金、收据、复写纸、计算器、验钞机等必要办公用品。 5．参与临床医生、化验、治疗、护理等其他岗位员工的碰头会，对住院欠费情况与病房医生交流沟通，保证不影响患者治疗用药，更好地为病人服务。 二、划价、收费、发药、核对工作的开展 ㈠划价收费工作流程 1、划价时见到病人到达药房窗口应立即站立并接过处方，确认药品 的品名、规格和数量，当天药房的库存是否足够药房人员要做到心中有数。 2、认真审阅处方后（对处方不明或书写不清之处应立即亲自咨询开 处方的医生但不得随意更改处方）按规定划价,如果药房没有处方所开的药品，可告知医生换用相同效果的同类其他药品。
3、划价时将“挂号费、注射费、输液费、诊查费”合并入“诊疗费” 计价。 4、计算：第一次计算出费用总和,记在心里或写在其他稿纸上，重 新计算第二遍结果与第一遍相同后，把得数留在计算器上，同时记录在处方或检查单上并站立报数，（若在医院优惠活动期内，报价应说明“总额XX，优惠XX，实收XX”如有优惠，则按优惠价计算），注意计算器上的得数不要消除。 5、划价人员报价后，把处方交予收费人员，收费人员收到钱款后， 在处方上写明金额，并签上收费员的名字，盖上“现金收讫章” 后开具三联票据。 6、住院病人记账前要落实有无欠费，若有欠费，应婉转说服患者补 交住院费（或者电话通知病房主管医生），无欠费直接记账并加盖记账章后交给病人，指引其前往相应科室做检查。 注： A：报价时应当站立报出病人的名字和收费金额（语气要柔和，如有优惠，则先报原价，再报优惠幅度和优惠后的价格）,病人如对收费有异议，收费人员应对其解释如： （1）让利50%——应说明药品利润按照国家标准只有15%，我们是严格按照国家物价标准收费的，也就是说我们现在只收了7.5%，让出了利润的一半； （2）优惠10%——应说明的是总费用优惠10%。（或是各项费用分别优惠的幅度。） （3）若病人提到药费贵时，可以告知患者----医院药价严格执行
westernblot实验详细步骤(1)
Western Blot实验技术一、制胶 SDS-PAGE分离胶配方表 1、检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分
2、配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口1.5mL停止加胶。 3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。 二、上样 1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。 2、拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。 3、拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。 4、上样时从左到右依次上样。 5、若上样组不多时，左右第一孔不加样。 6、要预留Marker的上样孔。 三、电泳 四、转膜
PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。 （转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。） 1、转印滤纸：全胶长8.5cm，宽5.5cm，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 2、海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。 3、PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm ，需在甲醇中浸润2min（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 4、凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。 三明治夹心法：负极（黑）-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极（白） 转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h
（注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。 装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。 装置运行时需冰浴。） 五、封闭 在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。 封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5%BSA，10%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭）。 1、将脱脂奶粉封闭液（1xTBST:脱脂奶粉=20mL：2g一块膜用量。牛血清蛋白、5%BSA 效果更好）倒好。 2、将PVDF膜取出放入封闭液中，盖子改好。 3、封膜一般常温1-2小时即可，也可4℃封闭过夜。 六、一抗 抗体反应主要采用间接法: 即先加入未标记特异性一抗与膜上抗原结合后，再加入标记的二抗进行杂交检测，标记二
高中会考复习Word操作要点
1 W ord 操作要点 一、文本编辑 文本编辑先选中对象，再施加命令（这是Windows 系统操作的特征） 1、字体设置（格式/字体）
2 2.段落设置（格式/段落。必须先选中要编辑的段落，再设置命令） 选定文本技巧：鼠标在文本左侧，进行单击、双击和三击的不同作用。 经过西安交通大学附属中学与欧盟教育基金会长期准备，备受教育界关注的第四届世界名中学校长论坛于 4月4日在古城西安隆重开幕。 第四届世界名中学校长论坛是全球教育界最为重要的盛会之一。世界名中学校长论坛由欧盟教育基金会于2005 年发起，
3 使用标尺滑竿也可调整左右缩进与首行缩进。特别注意对标题居中处理时，首行缩进为0，否则不能达到标题完全居中。 3、页面设置（文件/页面设置）
4 4、插入页眉/页脚（视图/
5 5、图文混排编辑 （1）插入图片（插入/图片/来自文件） 插入剪贴画与艺术字的方法类似 选择插入点，插入图片，默认插入的图片是“嵌入式”，图片四周有八个调整柄，用它可以调整图的大小。（当鼠标指针变为 时，可调整图片大小） （2）在图中右击，选择“设置图片格式”，弹出对话框设置图的环绕格式，一般使用“四周型”环绕。（在“高级”中还可对环绕方式做更为详细的设置）
6 （3）鼠标移到图内，变为十字箭头形状时，拖动鼠标，调整图片位置。 第四届世界名中学校长论坛是全球教育界最为重要的盛会之一。世界名中学校长论坛由欧盟教育基金会于2005年发起，旨在促进中外基础教育的交流与合作，提供表达观点、交换意见、形成共识的平台，此前已经分别在上海、伦敦、北京成功地举办了三次。本届论坛不仅秉承传统，而且盛况空前，参加此次盛会的中外教育专家、政府官员近200人，英国伊顿公学校长Tony Little 、英国GDST 基金会总裁Barbara Harrison 、美国大学理事会高级副总裁James Michael Montoya 、英国剑桥大学国际考试委员会课程开发主任Kevin Stannard 、欧盟教育基金会董事长Berry Bock 、美国密歇根大学副校长 Lester.P.Monts 、美国 宾夕法尼亚大学研究生院副院长Davis Cheng 、德国联邦外交部国际教育司中国区专员Diana Amann 、美国University School 校长Stephen Murray 、中国教育国际交流协会会长柳斌、中国信息化推进联盟专家委员会刘延宁、中国教育学会高中教育专业委员会理事长王本中、北京大学法学院教授孙东东、北京市第四中学校长刘长铭等知名教育专家出席了会议。 6、插入文本框（插入/文本框）
机床操作规程以及注意事项
机床操作规程以及注意事项 一、操作者必须经过考试合格，持有本机床的《设备操作证》方可操作本机床。 二、工作前认真作到： 1、仔细阅读交接班记录，了解上一班机床的运转情况和存在问题。 2、检查机床、工作台、导轨以及各主要滑动面，如有障碍物、工具、铁屑、杂质等，必须清理、擦拭干净、上油。 3、检查工作台，导轨及主要滑动面有无新的拉、研、碰伤，如有应通知班组长或设备员一起查看，并作好记录。 4、检查安全防护、制动（止动）、限位和换向等装置应齐全完好。 5、检查机械、液压、气动等操作手柄、伐门、开关等应处于非工作的位置上。 6、检查各刀架应处于非工作位置。 7、检查电器配电箱应关闭牢靠，电气接地良好。 8、检查润滑系统储油部位的油量应符合规定，封闭良好。油标、油窗、油杯、油嘴、油线、油毡、油管和分油器等应齐全完好，安装正确。按润滑指示图表规定作人工加油或机动（手位）泵打油，查看油窗是否来油。 9、停车一个班以上的机床，应按说明书规定及液体静压装置使用规定（详见附录Ⅰ）的开车程序和要求作空动转试车3~5分钟。检查： ①操纵手柄、阀门、开关等是否灵活、准确、可靠。 ②安全防护、制动（止动）、联锁、夹紧机构等装置是否起作用。 ③校对机构运动是否有足够行程，调正并固定限位、定程挡铁和换向碰块等。 ④由机动泵或手拉泵润滑部位是否有油，润滑是否良好。 ⑤机械、液压、静压、气动、靠模、仿形等装置的动作、工作循环、温升、声音等是否正常。压力（液压、气压）是否符合规定。确认
一切正常后，方可开始工作。 凡连班交接班的设备，交接班人应一起按上述（9条）规定进行检查，待交接班清楚后，交班人方可离去。凡隔班接班的设备，如发现上一班有严重违犯操作规程现象，必须通知班组长或设备员一起查看，并作好记录，否则按本班违犯操作规程处理。 在设备检修或调整之后，也必须按上述（9条）规定详细检查设备，认为一切无误后方可开始工作。 三、工作中认真作到： 1、坚守岗位，精心操作，不做与工作无关的事。因事离开机床时要停车，关闭电源、气源。 2、按工艺规定进行加工。不准任意加大进刀量、磨削量和切（磨）削速度。不准超规范、超负荷、超重量使用机床。不准精机粗用和大机小用。 3、刀具、工件应装夹正确、紧固牢靠。装卸时不得碰伤机床。找正刀具、工件不准重锤敲打。不准用加长搬手柄增加力矩的方法紧固刀具、工件。 4、不准在机床主轴锥孔、尾座套筒锥孔及其他工具安装孔内，安装与其锥度或孔径不符、表面有刻痕和不清洁的顶针、刀具、刀套等。 5、传动及进给机构的机械变速、刀具与工件的装夹、调正以及工件的工序间的人工测量等均应在切削、磨削终止，刀具、磨具退离工件后停车进行。 6、应保持刀具、磨具的锋利，如变钝或崩裂应及时磨锋或更换。
Westernblot基本操作步骤
W e s t e r n b l o t基本操作步骤 一、细胞蛋白的提取 弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含1mM PMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm 培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液12000rpm离心10 min。取上清，用BCA法测定蛋白浓度。用于western blot的蛋白样品取一定量加4×loading buffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。离心，使蛋白沉底。将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。 二、BCA法测蛋白浓度操作步骤 将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl 分装，-20℃冷冻保存。 完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。 据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20μl。 加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS 到20μl。 各孔加入100μl BCA工作液，37℃放置30分钟。 测定580nm条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 三、Western blot基本操作步骤 1、溶液配制： ①Runnig Buffer(1×)：SDS Runnig Buffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L； ②Transfer Buffer(1×): Transfer Buffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%，v/v），加MiliQ水至1L； ③TBST缓冲液 1M Tris·HCl（pH7.6）：60.5g Tris-base，加入约30ml浓盐酸，调PH至7.6，加MiliQ 水至500ml。 TBS缓冲液（10×）：1M Tris·HCl 100ml+80g NaCl加MiliQ水1L TBST缓冲液（1×）：TBS缓冲液（10×）100ml+0.5ml Tween-20（0.05%，v/v），加MiliQ水至1L。 ④封闭液：5% BSA（5g/100ml，称取1g BSA至20ml TBST，充分混匀溶解） 2、样品准备与加样 ①用4×SDS loading buffer, 10×reducing与蛋白质样品混合，并将此EP 管放在水浴锅中沸水煮5min，使蛋白质变性。 ②将预制胶固定到电泳装置中，并在装置中加满Runnig Buffer(1×)，内槽加入0.5mL 抗氧化剂，小心拔下梳子； ③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品（总蛋白量20μg以上）。向marker孔中加入2.5μl marker（按照实验要求设定marker量），向空白孔中加入一定体积的加样缓冲液(loading buffer)。注意采用相同（或相近）的上样体积，以保证蛋白的各带宽度相同。防止体积较大的上样孔中的蛋白质将向相邻的泳道扩散。 3、电泳
(完整word版)呼吸机的操作步骤及注意事项
操作步骤 1、连接电源、气源（压缩气和氧气），湿化罐中加入灭菌注射用水并安装，正确紧密连接管道。 2、开机程序：依次打开压缩机开关→主机开关→湿化器开关。 3、根据病情遵医嘱选择呼吸模式和正确设置参数及报警范围。 4、接模拟肺，观察呼吸机运行是否正常。 5、脱模拟肺，将呼吸机和病人人工气道正确连接。 6、观察胸廓起伏，听诊两肺呼吸音，评估病人通气后状况。 7、严密观察神志、血氧饱和度、呼吸、循环、等各项指标，及时排除呼吸机故障，并作好记录。 8、通气半小时后抽动脉血气分析，根据血气结果调节参数。 9、掌握撤机指征，病人自主呼吸恢复，血气分析正常可试脱机。 10、备好氧气装置和呼吸囊。 11、脱开呼吸机，吸氧。 12、关机程序：脱机→关主机开关→压缩机开关→湿化器开关→拔电源、气源。 13、整理床单位，协助病人舒适体位。 14、清洁消毒呼吸机管道，清洁呼吸机表面。 15、洗手，正确记录护理单。 注意事项 1、清醒的病人给以解释，躁动的病人给以适当镇静或约束。 2、呼吸机管路连接正确。 3、湿化罐护理：保持湿化罐灭菌注射用水在所需刻度，保持吸入气温度在32℃~36℃。 4、保持集水杯处于低位，底处于朝下方向，及时倾倒集水。 5、调节呼吸机机臂时，先取下管道再安装，以免在调节过程中将导管拉出。 6、及时处理报警。 7、定期更换呼吸机管道，建议：48小时更换呼吸机管道。 8、合理消毒呼吸机各种管道。 呼吸机操作相关理论 1、相对禁忌证：（没有绝对禁忌证） 肺大泡、肺囊肿、气胸未行引流者、纵隔气肿、气管食管瘘、大咯血 2、根据病人病情及体重选择模式 控制通气CMV IPPV 辅助通气SIMV 自主通气CPAP PSV 3、呼吸机通气模式 IPPV（间歇正压通气）； CMV (机械控制通气) ； SIMV (同步间歇指令性通气) ； PSV （压力支持通气）； PEEP（呼气末正压通气）；
(完整版)切割机安全操作规程及注意事项
切割机安全操作规程及注意事项切割机安全操作规程 一、切割前准备 (一)、使用前必须认真检查设备的性能，确保各部件的完好性。 (二)、电源闸刀开关、锯片的松紧度、锯片护罩或安全挡板进行详细检查，操作台必须稳固，夜间作业时应有足够的照明亮度。 (三)、使用之前，先打开总开关，空载试转几圈，待确认安全无误后才允许启动。 (四)、操作前必须查看电源是否与电动工具上的常规额定220VA 电压相符，以免错接到380VA的电源上。 二、切割注意事项 (一)、切割机工作时务必要全神贯注，不但要保持头脑清醒，更要理性的操作电动工具。严禁疲惫、酒后或服用兴奋剂、药物之后操作切割机。 (二)、电源线路必须安全可靠，严禁私自乱拉，小心电源线摆放，不要被切断。使用前必须认真检查设备的性能，确保各部件完好。 (三)、穿好合适的工作服，不可穿过于宽松的工作服，更不要戴首饰或留长发，严禁戴手套及袖口不扣而操作。 (四)、加工的工件必须夹持牢靠，严禁工件装夹不紧就开始切割。 (五)、严禁在砂轮平面上，修磨工件的毛刺，防止砂轮片碎裂。 (六)、切割时操作者必须偏离砂轮片正面，并戴好防护眼镜。 (七)、严禁使用已有残缺的砂轮片，切割时应防止火星四溅，并
远离易燃易爆物品。 (八)、装夹工件时应装夹平稳牢固，防护罩必须安装正确，装夹后应开机空运转检查，不得有抖动和异常噪声。 (九)、中途更换新切割片或砂轮片时，不要将锁紧螺母过于用力，防止锯片或砂轮片崩裂发生意外。 (十)、必须稳握切割机手把均匀用力垂直下切，而且固定端要牢固可靠。 (十一)、不得试图切锯未夹紧的小工件或带棱边严重的型材。 (十二)、为了提高工作效率。对单支或多支一起锯切之前，一定要做好好辅助性装夹定位工作。 (十三)、不得进行强力切锯操作，在切割前要待电机转速达到全速即可。 (十四)、不允许任何人站在锯后面，停电、休息或离开工作地时，应立即切断电源。 (十五)、锯片未停止时不得从锯或工件上松开任何一只手或抬起手臂。 (十六)、护罩未到位时不得操作，不得将手放在距锯片15厘米以内。不得探身越过或绕过锯机，操作时身体斜侧45度为宜。 (十七)、出现有不正常声音，应立刻停止检查;维修或更换配件前必须先切断电源，并等锯片完全停止。 (十八)、使用切割机如在潮湿地方工作时，必须站在绝缘垫或干燥的木板上进行。登高或在防爆等危险区域内使用必须做好安全防护
最详细的WesternBlot过程步骤详解
最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解
最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解 Pleasure Group Office【T985AB-B866SYT-B182C-BS682T-STT18】
Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问
8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
WB的原理、操作及注意事项
WB的原理、操作及注意事项 原理： 通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western 印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1?5ng （最低可到10- 100pg）中等大小的靶蛋白。 一、抗原的选择和制备 A：样品的制备 1 组织： 组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS0C研磨，加入5X STOFbuffer , 180W6mins , 0C 超声波破碎，5000rpm,5mins 离心，取上清。加入B -ME（9.5ml 加入0.5ml）, 溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml ）煮沸10min，分装后于-20 C保存，用时取出，直接溶解上样。 2 细胞： 细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入 5 x STOPbuffer，收集， 180W6mins , 0C超声波破碎，5000rpm,5mins 离心，取上清。加入B -ME（9.5ml 加入0.5ml）, 溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml ）煮沸10min，分装后于-20 C保存，用时取出，直接溶解上样。3 分泌蛋白的提取（特例）： 直接收集分泌液，加入B -ME、溴酚蓝制样。 B:蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因 1. 双缩脲法： 双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。双缩脲法常用于0.5g/L ?10g/L 含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%^的三 氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1mNaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量 测定。 2. Lowry 法： 此法是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应，即Cu++与蛋白质在碱性 溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得到深 蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L?400mg/L 含量的蛋白质溶液。其干扰物质与双缩脲法相同，而且受他们的影响更大，硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重偏差。另外要注意的是，加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性pH环境中才稳定，上 述提到的还原反应只有在pH10时才发生，因此，福林试剂加入到碱性的Cu2+-蛋白质溶液 中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被Cu2+-蛋白质络 合物所还原。 3. 紫外吸收法： 大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故，因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。如果没有干扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定0.1?0.5mg/ml含量的蛋白质溶液。部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波长处有最大吸收。有核酸时，所测得的蛋白质浓度必须作适当校正，一般按下述公式粗略计算： M 白虜浓皮（m”/mi）—1 ” 55A”? - 0.76 \ m 280 260
WORD注意事项
问：WORD里边怎样设置每页不同的页眉？如何使不同的章节显示的页眉不同？ 答：分节，每节可以设置不同的页眉。文件——页面设置——版式——页眉和页脚——首页不同 问：请问word中怎样让每一章用不同的页眉？怎么我现在只能用一个页眉，一改就全部改了？ 答：在插入分隔符里，选插入分节符，可以选连续的那个，然后下一页改页眉前，按一下“同前”钮，再做的改动就不影响前面的了。简言之，分节符使得它们独立了。这个工具栏上的“同前”按钮就显示在工具栏上，不过是图标的形式，把光标移到上面就显示出”同前“两个字来了 问：如何合并两个WORD文档，不同的页眉需要先写两个文件，然后合并，如何做？ 答：页眉设置中，选择奇偶页不同/与前不同等选项 问：WORD编辑页眉设置，如何实现奇偶页不同？比如：单页浙江大学学位论文，这一个容易设；双页：（每章标题），这一个有什么技巧啊？ 答：插入节分隔符，与前节设置相同去掉，再设置奇偶页不同 问：怎样使WORD文档只有第一页没有页眉，页脚？ 答：页面设置－页眉和页脚，选首页不同，然后选中首页页眉中的小箭头，格式－边框和底纹，选择无，这个只要在“视图”——“页眉页脚”，其中的页面设置里，不要整个文档，就可以看到一个“同前”的标志，不选，前后的设置情况就不同了。 问：如何从第三页起设置页眉？ 答：在第二页末插入分节符，在第三页的页眉格式中去掉同前节，如果第一、二页还有页眉，把它设置成正文就可以了 ●在新建文档中，菜单—视图—页脚—插入页码—页码格式—起始页码为0，确定；
●菜单—文件—页面设置—版式—首页不同，确定； ●将光标放到第一页末，菜单—文件—页面设置—版式—首页不同—应用于插入点之后，确定。 第2步与第三步差别在于第2步应用于整篇文档，第3步应用于插入点之后。这样，做两次首页不同以后，页码从第三页开始从1编号，完成。 问：WORD页眉自动出现一根直线，请问怎么处理？ 答：格式从“页眉”改为“清除格式”，就在“格式”快捷工具栏最左边；选中页眉文字和箭头，格式－边框和底纹－设置选无 问：页眉一般是---------，上面写上题目或者其它，想做的是把这根线变为双线，WORD中修改页眉的那根线怎么改成双线的？ 答：按以下步骤操作去做： ●选中页眉的文字，包括最后面的箭头 ●格式－边框和底纹 ●选线性为双线的 ●在预览里，点击左下小方块，预览的图形会出现双线 ●确定 ▲上面和下面自己可以设置，点击在预览周围的四个小方块，页眉线就可以在不同的位置 问：Word中的脚注如何删除？把正文相应的符号删除，内容可以删除，但最后那个格式还在，应该怎么办？ 答：步骤如下： 1、切换到普通视图，菜单中“视图”——“脚注”，这时最下方出现了尾注的编辑栏。
纸机操作规程及注意事项资料
16万吨抄纸操作规程及注意事项 化学品： 1、阳离子淀粉系统： 开车时把整个系统全部打到自动状态。首先开启自动程序，当制备槽液位>50%时，可启动加热程序对整个系统进行须热（喷射蒸渚器应使其温度达到120℃），1#容积泵启动时，先用手动将电机频率提至30%以上，待泵运转正常时（预热过程完成），投入到自动状态。 注意：因该螺旋泵低频时启动因难，停车时先停下加热程序，再启动清洗程序，确保整个系统清洁后，方可停止。 2、品兰系统： 开车时开启品兰传送系统，先把品兰加药泵的电机频率提高至50%，待泵运转电流150%以下时，再投入到自动状态。 3、助留助滤系统： 开车时，先开启助留剂传送系统，再开启助滤剂系统，停车时，先停止助滤剂系统，再停止助留剂系统，因该助滤剂系统加入点在助留剂系统混合，助留剂开关阀控制整个加入量，如先停助留剂，可造成助滤剂软管破裂、鼓开。 4、一楼化学品
开车时检查放料阀是否打开，先打开清水泵子，然后再开启加药泵。停车时，先停各加药泵，再停下清水泵（因为先停清水泵对整个加药管道起不到清洗作用。 杀菌剂、抑菌剂更改流量时，流量计中倒入药品，测完之后要用水冲洗，因为药品对流量计有腐蚀作用。 开车时，消泡剂罐中液位不能很低，液位很低对泵子会有损坏。 流送： 1、开机前观察各个槽、池、白水桶液位及所有排污处于关闭状态。 2、检查所有密封水的压力、流量以及各个设备情况。 3、压力筛内先冲满水。 4、网部真空OK，进头箱压缩气阀打开。 5、待大班长发出开机信号后，启动“短循环”，注意除气器的液位及 真空度是否正常。 6、开“水上网”注意观察白水桶的液位，待压头稳定后开“浆上 网”。 7、浆上网前先把料门开得少大一些，保证伏辊真空度满足，引纸时再 关到正常状态。 注意事项：
WB操作步骤-自己整理
Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法） 人工肝实验室学习姚瑶 （一）目的蛋白提取： （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。 2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。 共洗三次，每次十分钟。 3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP 管内，-20℃裂解30min。 4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。（可不做） 5、4℃，12000转离心10min。 6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。 （2）组织中总蛋白的提取： 1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。冰上裂解30min。
2、配平后，4℃，14000转离心10min。 3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用（二）蛋白含量的测定： 1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。 2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。 3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。 4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。 5、37℃水浴30min。 6、酶标仪测定各孔OD值（A570，Mode1）。 7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。 （三）SDS-PAGE电泳： （1）清洗玻璃板 （2）灌胶与上样： 1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。
WB实验原理
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹技术 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术首先在1967年由Shapiro等建立，主要用于测定蛋白质亚基分子量。Western 印迹是在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳基础上，将电泳分离的蛋白组分从凝胶转移至一种固相支持物上，应用抗体可与附着于固相支持物上的靶蛋白发生特异性反应的特点，针对特定蛋白进行鉴别和定量。 原理 1．SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂，例如巯基乙醇和二硫苏糖醇则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚，使其氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。在水溶液中蛋白质-SDS胶束的长度与亚基分子量的大小成正比。因此这种胶束在SDS聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质或亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15KD～200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。由此可见，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳不仅可以分离蛋白质，而且可以根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量。 2．Western 印迹 在Western印迹法中，待测样品溶解于去污剂和还原剂的溶液中，经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后被转移到固相支持物上（常用硝酸纤维素滤膜），然后可被染色。随后滤膜可与抗靶蛋白的一抗反应。最后，结合上的抗体可用多种二级免疫学试剂（与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的A蛋白或抗免疫球蛋白）检测。Western 印记法可测出1-5ng中等大小的待检蛋白。 方法 1.样品的制备 从细胞中提取蛋白质样品用于Western印记的方法有两种，一是可以在加样缓冲液中直接溶解完整细胞；二是制备细胞提取液。可根据不同的目的采用不同的方法。如果仅是定性实验，可应用第一种方法；如果需测定蛋白含量并进行定量实验，可应用后一种方法。1.1 凝胶加样缓冲液裂解哺乳动物细胞和组织制备蛋白质样品 1）裂解细胞或组织 a.单层培养细胞：用PBS缓冲液漂洗细胞2次，弃去洗液并吸尽残余的PBS液体， 加入一定体积（50～200μl）的加热到85℃的1×SDS凝胶加样缓冲液[50mmol/L Tris.Cl(pH 6.8), 100mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）, 2% SDS, 0.1% 溴酚蓝，10%甘油] 溶解细胞，用细胞刮刀把粘稠状的细胞裂解物收集于一个微量离心管中，用于步骤2）。 b.悬浮培养细胞：用冷的PBS充分洗涤细胞后，去尽残液，加入一定体积用冰预冷 的悬浮缓冲液[0.1mol/L NaCl，0.01mol/L Tris.Cl（pH 7.6），0.001mol/L EDTA （pH 8.0），1μg/ml Aprotinin，100μg/ml PMSF]，涡流振荡混匀后，加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液[100mmol/L Tris.Cl(pH 6.8), 200mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）, 4% SDS, 0.2% 溴酚蓝，20% 甘油]，混匀后，用于步骤2）。