微粒子酶免疫分析法检测BNP和cTnI对慢性心力衰竭的临床价值

酶联免疫法

酶联免疫吸附试验（又称酵素免疫分析法，Enzyme-linked immunoassay，简称ELISA）利用抗原抗体之间专一性键结之特性，对检体进行检测；由于结合于固体承载物(一般为塑胶孔盘)上之抗原或抗体仍可具有免疫活性，因此设计其键结机制后，配合酵素呈色反应，即可显示特定抗原或抗体是否存在，并可利用呈色之深浅进行定量分析。根据待测样品与键结机制的不同，ELISA可设计出各种不同类型的检测方式，主要以三明治法（sandwich）、间接法（indirect）、以及竞争法（Competitive）三种为主，以下为各种方法之介绍. 三明治法 常用于检测大分子抗原，一般之操作步骤为: 1.将具有专一性之抗体固著（coating）于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体 2.加入待测检体，检体中若含有待测之抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专 一性键结 3.洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一之一次抗体，与待测抗原进行键结 4.洗去多余未键结一次抗体，加入带有酵素之二次抗体，与一次抗体键结 5.洗去多余未键结二次抗体，加入酵素受质使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色 结果 三明治法分别以两种抗体对检体中的抗原进行两次专一性辨认，因此专一性相当高，但此待测抗原必须是多价抗原，如此才可获得两种以上的专一性抗体，以分别进行夹心；而且此法需要足够的表位空间以进行抗原抗体的夹心，所以并不适用于半抗原或小分子抗原等分子量较小之标的。 间接法 间接法常用于检测抗体，一般之操作步骤为： 1.将已知之抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余之抗原 2.加入待测检体，检体中若含有待测之一次抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进 行专一性键结 3.洗去多余待测检体，加入带有酵素之二次抗体，与待测之一次抗体键结 4.洗去多余未键结二次抗体，加入酵素受质使酵素呈色，藉仪器（ELISA reader） 测定塑胶盘中的吸光值（OD值），以评估有色终产物的含量即可测量待测抗原 的含量。 竞争法 竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为： 1.将具有专一性之抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体 2.加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结 3.加入带有酵素之抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结，由于 塑胶孔盘上固著的抗体数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酵素之

酶联免疫检测技术的应用

酶联免疫检测技术的应用 真菌毒素的检测：黄曲霉毒素 B 1 、M 1 以及T-2 毒素，脱氧雪腐镰刀菌烯醇(呕吐毒素DON )，二乙酰草镰刀菌烯醇(DAS )，玉米赤霉烯酮，赫曲霉毒素A ( OA )。 农药的检测：主要有除草剂与杀虫剂两大类，例如杀暝松( FN )、甲氟磷酸异已酶( SOMAN )、草不绿( Alachor)、西维因( Carbaryl )、多菌灵及克菌丹( Captan )等。 其他类的检测：盐酸克伦特罗，河豚毒素，植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素，苯并( a)芘，抗生素，激素类以及一些营养物质和食品添加剂如麸蛋白( Gliaclin )，酱油蛋白( Soy protein )，花生蛋白(Peanut protein )，牛乳清蛋白( Borine Whey Protein )等。 随着食品工业的发展，对分析检测的要求越来越高，从而也使ELISA 方法将更趋完善。一方面为提高ELISA方法的灵敏度和特异性，制备单克隆抗体的技术的发展，将和ELISA 法互相结合，从而使食品卫生分析达到DNA分子结构水平，促使食品工业的健康发展。 1 放射免疫分析(RIA) 放射免疫法(Radioimmunoassay,RIA)优点是特异性强、灵敏度高、精确、简便易行。它包括以标记抗原(Antigen,Ag)为特点的放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)和以标记抗体(Antibody,Ab)为特点的免疫放射分析(Immunoradiometric assay,IRMA)。前者以液相竞争结合法居多，既测大分子抗原又测小分子抗原；后者以固相法测大分子抗原为主。 最早建立的农药免疫法中，RIA占了很大比重，建立了狄氏剂、艾氏剂、2,4-D 和2,4，5-T、对硫磷和百草枯等农药的放射免疫法。但由于进行RIA需使用昂贵的计数器，存在放射性防护和废物处理等问题，其应用受到较大限制。1982年后发表的农药免疫分析文章，主要是酶免疫分析法。 2 酶免疫法(EIA) 酶免疫法(Enzyme Immunoassay,EIA)是将抗原、抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来的一种免疫分析方法。酶免疫法的检测原理与放射免疫法类似，通过测定结合于固相的酶的活力来测定被测定物的量。用作标记物的酶有辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP)和碱性磷酸酶(AlkalinePhosphatase)。酶标试剂制备容易、稳定、价廉。酶免疫分析的灵敏度接近放射免疫技术，而可借助于简单的仪器作定量测定，是目前农药监测中应用最广泛的免疫分析技术。 EIA法包括酶联免疫吸附分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent

人内皮素-1(ET-1)酶联免疫分析

人内皮素-1（ET-1）酶联免疫分析 试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用。 检测范围：96T 8pg/ml-200pg/ml 使用目的： 本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中内皮素-1（ET-1）含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人内皮素-1（ET-1）水平。用纯化的人内皮素-1（ET-1）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入内皮素-1（ET-1），再与HRP标记的内皮素-1（ET-1）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的内皮素-1（ET-1）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人内皮素-1（ET-1）浓度。 试剂盒组成 1 30倍浓缩洗涤液20ml×1瓶7 终止液6ml×1瓶 2 酶标试剂6ml×1瓶8 标准品（400pg/ml）0.5ml×1瓶 3 酶标包被板12孔×8条9 标准品稀释液 1.5ml×1瓶 4 样品稀释液6ml×1瓶10 说明书1份 5 显色剂A液6ml×1瓶11 封板膜2张 6 显色剂B液6ml×1/瓶12 密封袋1个 标本要求 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤 1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀 释。 200pg/ml 5号标准品150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液 100pg/ml 4号标准品150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液 50pg/ml 3号标准品150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液 25pg/ml 2号标准品150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液 12.5pg/ml 1号标准品150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、 待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，

酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理

酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体；②酶标记的抗原或抗体；③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 （一）双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： （1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 （2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时问，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 （3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量成正相关。 （4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 根据同样原理，将大分子抗原分别制备固医学教丨育网整理相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。 （二）双位点一步法 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步法不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。 在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再医学教丨育网整理形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 （三）间接法测抗体 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下： （1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。

酶联免疫分析法

酶联免疫分析法 生工121 徐娜 酶联免疫分析法是目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，特别是在食品和饲料中有毒有害物质的检测应用极为广泛。 酶联免疫分析法是把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的一种检测技术。该技术的原理主要有三点：第一、抗原或抗体能结合到固相载体的表面仍具有其免役活性；第二、抗体或抗原与酶结合所形成的结合物仍保持免疫活性和酶的活性；第三，结合物与相应的抗原或抗体反应后，结合的酶仍能催化底物生成有色物质，而颜色的深浅可定量抗体或抗原的含量。 酶联免疫法在医药、食品加工业、农牧渔业等领域有着广泛的应用：如乙型肝炎、莱姆病，急性心肌梗死的早期诊断，定量检测内毒素，HIV抗体初筛，SARS 病毒的快速检测；检测食品中的病毒，残留农药，微生物及其其它成分；检测香蕉有关病毒，小麦黄花叶病毒，检测水产品中氯霉素的残留量，禽脑脊髓抗体等。 一、医学临床中的应用 医学中，检测各种抗原和抗体，为临床疾病的辅助诊断和早期诊断提供了特异性、敏感性强的试验基础。 1、乙型肝炎、原发性肝癌的血清学检测：用血清学方法检测肝炎病毒的抗原或抗体，一直受到各级医疗卫生机构检验科室的高度重视。尤其是对乙型肝炎，甲型肝炎，丙型肝炎的血清学检测，更因为试剂盒的推出而得到广泛开展。上述各种肝炎病毒抗原或抗体的检测方法，绝大部分都是酶联免疫分析法。 2、简化莱姆病的诊断：由于在作出博氏疏螺旋体感染诊断前要进行双重测试，因此莱姆病的测试可能花费很长时间。采用由关键的疏螺旋体抗原决定簇构成的重组蛋白开发出一种新的酶联免疫测定方法。该测试比最常用的商业全细胞酶联免疫测定法特异，而敏感性相同，并且在20分钟就会产生结果。 3、急性心肌梗死的早期诊断：急性心肌梗死为一多发病，病情严重。目前对此病的策略是尽早的确诊并迅速积极的治疗。约有四分之一或更多的患者，在初诊时心电图并不显示典型心肌梗死心电图异常，无Q波。心肌坏死时释放出的Mb可直接快速血液循环。Mb是最早出现的心肌梗死生化标志物，但它在血中滞留时间短。为此，刘宏伟等研制出只需30分钟的酶联免疫快速法，为早期诊断心肌梗死提供了依据。 4、定量检测内毒素：临床上，细菌感染的患者常发生内毒素血症，死亡率高达20%——30%，检测标本中的LPS对早期诊断和防治有重要意义。用优化后的双抗体夹心法检测LPS敏感性为50ng/L,特异性与准确性均高于仪器比浊法和试验定性法。此为内毒素血症提供了一种简便，快速，准确，特异性的诊断参考。 5、快速检测SARS病毒：SARS病毒引起传染性非典型肺炎，发病快，传染性强。2003年4月，北京基因组研究所与军事医学科学院研制出诊断非典的酶联免疫分析法检测试剂，为控制疫情蔓延提供了新的诊断手段。 二、在食品分析中的应用 1、检测食品中的毒素：采用辣根过氧化氢酶标记高亲和力的黄曲霉素B1抗体，建立了直接竞争抑制酶联免疫快速筛选法。该法检测B1抗体的线性范围

胶体金法与酶联免疫法相结合快速检测克伦特罗

胶体金法与酶联免疫法相结合 快速检测克伦特罗 苏存举,陈福生3,高志贤3①,苗颂②,刘楠①,冯屹 (华中农业大学食品科技学院,武汉430070) 摘要:目的研究胶体金免疫层析法(GIC A)与酶联免疫吸附法(E LIS A)相结合,以建立对饲养、屠宰、流通各环节的畜尿克伦特罗(Clenbutero1,C L)定性和定量检测的方法。方法用柠檬酸三钠还原氯金酸,制备20nm粒径的胶体金,胶体金标记单抗后喷涂到玻璃纤维膜上,特异性抗原(C L2BS A)以线状包被在硝酸纤维素膜上,制成快速检测试纸条。用E LIS A进行定量。结果对 G C2MS不确定的36份阴性样品和24份阳性样品用GIC A方法检测,其阴性符合率为97%,阳性 符合率为96%。同样样品用E LIS A方法检测,其符合率为100%。最低检测限为5.0ng/m L;用GIC A法只需在试纸条上滴加4～5滴样液5～10min就可出结果;在2个月的随机抽查中,试纸条的检测结果没有变化。结论本方法准确性高、稳定性好,操作过程简单,适合于作现场大规模、高通量检测。因此本方法具有广泛的应用及推广价值。 关键词:　胶体金;　克伦特罗;　酶联免疫吸附法 中图分类号:R155.5 文献标识码:A 文章编号:1001-5248(2008)03-0176-04 克伦特罗(Clenbutero1,C L)俗称“瘦肉精”,是β2肾2上腺受体激动剂。在家畜养殖中加入C L可以提高瘦肉率或者加速动物的生长。C L作为药物使用时可以治疗哮喘等疾病,但是如果用作家畜生长调节剂,其剂量通常是治疗疾病剂量的5～10倍,这样就可能残留于食品中而引起人体的不良反应,主要包括心跳过快和四肢肌肉颤动等中枢神经中毒后的失控症状,甚至导致死亡〔1〕。目前已有多种方法用于对C L的残留分析,主要包括酶联免疫检测法(E LIS A)、高效液相色谱法(HP LC)、气相色谱2质谱联用法(G C2MS)、液相色谱2质谱联用法(LC2MS)等,主要是依靠特殊仪器进行分析,不能适应市场监督需要快速、简便、价廉的要求。而E LIS A分析法操作简便、检测快捷、灵敏度高、特异性强,适用基层日常应用〔2〕。胶体金免疫层析法(GIC A)解决了以往在现场不能进行快速和定性检测的难题。因此, 基金项目:国家科技支撑计划(2006BAK02A09) 天津市科技攻关基金项目课题(N o.06VFG ZSH02200) 作者简介:苏存举(1981-),男,硕士研究生。从事食品安全快速检测研究。 3通讯作者 ①军事医学科学院卫生学环境医学研究所 ②山东大学将E LIS A和GIC A相结合应用于C L筛选检测已成为各地开展C L检测工作的主要技术手段。 1　材料与方法 1.1　材料　氯金酸为上海化学试剂厂产品;克伦特罗标准品为Sigma公司产品;克伦特罗单克隆抗体为浙江台州金芯生物工程公司产品;硝酸纤维膜(NC)、玻璃纤维膜、吸水纸、PVC背板均为美国Mill2 pore公司产品;克伦特罗检测试剂盒为江苏微生物研究所产品;其他试剂为国产分析纯。 1.2　仪器　紫外可见光分光光度计,Du2530型, Beckman公司;透射电镜,H27500型,日本HIT ACHI 公司;原子力显微镜,SPM29500型,日本岛津公司;磁力恒温搅拌器,79.3型,上海市曹行无线电元件厂;点膜机,Bio2Dot公司;普通离心机,TG L21613型,上海安亭科学仪器公司;纯水制备装置,AS D型,军事医学科学院卫生装备研究所。 1.3　方法 1.3.1　胶体金的制备　按照文献〔324〕采用柠檬酸三钠还原法制备20nm胶体金颗粒〔5〕。取0.01%氯金酸水溶液100m L,用恒温电磁搅拌器加热至沸腾,一次性加入l%柠檬酸三钠水溶液 2.52m L,再加热

微粒子酶免分析技术与酶联免疫吸附试验检测乙肝两对半的临床比较

微粒子酶免分析技术与酶联免疫吸附试验检测乙肝两对半的临床比较 发表时间：2016-12-23T13:55:31.897Z 来源：《航空军医》2016年第23期作者：刘军[导读] 探讨微粒子酶免分析技术（MEIA）与酶联免疫吸附（ELISA）试验在乙肝两对半检测中的差异。 安化县大福中心医院湖南安化 413517 【摘要】目的探讨微粒子酶免分析技术（MEIA）与酶联免疫吸附（ELISA）试验在乙肝两对半检测中的差异。方法选取我院2013年1月-2016年1月收治的疑似乙肝患者的临床资料，共入选85例，均采用微粒子酶免分析技术与酶联免疫吸附试验检测，对比分析两种检测方法的检测结果。结果 85例血清通过MEIA检出45例患者HBsAg为阳性，而ELISA检测方法则检出31例HBsAg阳性，两种检测方法的检 出率比较差异有统计学意义（x2=4.664，p<0.05）；本研究中选取采用ELISA方法检测乙肝两对半仅抗-HBe（+）、抗HBc（+）此2项阳性的30例患者、仅HBeAg（+）1项呈阳性的1例患者和仅HBeAg（+）、抗-HBc（+）2项呈阳性的1例患者，再采用MEIA检测法进行HBsAg测定，仅HBeAg（+）和仅HBeAg（+）、抗-HBc（+）检测阳性率均为100%。结论微粒子酶免分析技术操作简单、影响因素少、灵敏度高，且能够观察患者临床疗效和特殊乙肝两对半模式，有较高的临床应用价值。 【关键词】微粒子酶免分析技术；酶联免疫吸附试验；乙肝两对半 乙型肝炎是常见传染病、多发病，如病情得不到有效控制能进展为肝硬化、肝癌等，严重影响患者的身体健康。资料显示，乙肝的传染性和病死率问题一直是全球严重的社会公共卫生难题[1]。目前，临床上主要通过实验室检测血清病毒标志物来筛查患者是否感染乙型病毒，其中微粒子酶免分析技术（microparticle enzyme immunoassay，MEIA）与酶联免疫吸附检测试验是临床上常用的检测乙肝两对半的方法，本文对比分析了该两种方法应用于乙肝两对半检测的结果，现将结果报道如下。 1资料与方法 1.1一般资料选取我院2013年1月-2016年1月采集的85例疑似乙肝患者的血清标本，其HBsAg均呈阳性，均符合2000年中华医学会制定的相关病毒性肝炎诊断标准[2]，其中男45例，女40例，年龄18-68岁，平均（27.4±5.7）岁，症状表现：均伴有不同程度的恶心、乏力、腹胀、畏食、肝区疼痛等，严重者伴肝掌、蜘蛛痣、慢性肝病面容、脾大、肝功能持续异常等。 1.2 方法 1. 2.1入组标准肝脏检查结果为慢性肝炎；HBsAg阳性超过6个月；血清HBV-DNA＞10-5copies/ml；患者的谷丙转氨酶或谷草转氨酶呈间歇性或持续性升高状态。 1.2.2 仪器及试剂酶联免疫吸附试剂由上海科华生物技术有限公司提供，仪器采用美国Bio-Rad680全自动酶标仪；微粒子酶免分析采用美国雅培全自动微粒子酶免分析仪和HBsAg试剂盒，两种试验均严格按照说明书进行，结果判断标准严格按照说明书评定。 1.2.3 血清采集采集入选患者的清晨空腹静脉血2-3ml，采集后12h内进行血清分离，以3000rpm/min离心15min，取上层血浆，如能够在48h内进行检测，则可将血浆置于2-8℃的冷藏条件下保存，备用；如不能及时进行检测，则应将血浆置于-20℃保存，备用，尽快进行实验室检测。两种方法均对血清进行HBsAg、HbeAg、抗-HBs、抗-Hbe、抗-HBc检测。 1.2.4 检测方法和原理 ELISA检测HBsAg采用夹心法包被抗体-被测抗原-酶标记抗体复合物，然后催化出O2使得底物显色，以P/N≥2.1判定为阳性；MEIA检测法则是用HBsAg抗原与微粒子相应的抗体结合后形成抗体，然后分析物-复合物和酶联结合而成抗体-分析物-酶联复合物，然后加入荧光底物，使之与酶联发生反应，形成荧光产物，对荧光强度和标准浓度进行测量比较，计算分析物的浓度。以S/N≥2判定为HBsAg阳性。 1.3统计学处理试验结果数据均采用SPSS19.0处理分析，计量资料用（）表示，配对资料采用t检验；计数资料用%表示，数据间比较采用x2检验。P<0.05差异有统计学意义。 2结果 2.1 两种检测方法检测HBsAg结果比较 85例血清中通过MEIA检出45例患者HBsAg为阳性，而ELISA检测方法则检出31例HBsAg阳性，两种检测方法的检出率比较差异有统计学意义（x2=4.664，p<0.05），见表1；可见，MEIA检测方法对患者HBsAg标志物的灵敏度更高。

植物NADPH酶联免疫分析(ELISA)

植物NADPH酶联免疫分析（ELISA） 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定植物组织，细胞及其它相关样本中植物NADPH含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中植物NADPH水平。用纯化的植物NADPH抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入植物NADPH，再与HRP标记的NADPH抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的植物NADPH呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中植物NADPH浓度。 标本要求： 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤： 1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标 准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，

混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为120U/L，80U/L ，40U/L，20U/L，10U/L）。 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样 品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。 9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15分钟. 10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止 液后15分钟以内进行。 注意事项： 1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。 5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 6．底物请避光保存。 7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准. 8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 9．本试剂不同批号组分不得混用。 10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。

酶联免疫吸附测定法

酶联免疫吸附测定法（ELISA） 1.定义 (3) 2.原理 (3) 2.1抗原抗体反应 (3) 2.2免疫测定在临床检验中的应用 (5) 3.ELISA的类型 (5) 3.1双抗体夹心法测抗原： (6) 3.2双抗原夹心法测抗体 (6) 3.3间接法测抗体 (6) 3.4竞争法测抗体 (7) 3.5竞争性测抗原 (7) 3.6捕获包被法测抗体 (7) 3.7ABS-ELISA法 (8) 4.ELISA试剂的组成 (9) 4.1固相载体： (9) 4.2包被的方式 (9) 4.3包被用抗原：天然抗原、重组抗原、合成多肽抗原。 (10) 4.4包被的条件： (10) 4.5洗涤液： (10) 4.7酶的催化性； (11) 4.8结合物的制备 (11) 4.9结合物的保存 (12) 4.10酶的底物 (12) 4.11酶反应终止液 (12) 4.12参考标准品 (13) 4.13加样： (13) 4.14保温 (13)

4.15保温方式： (13) 4.16室温温育的反应 (13) 4.17洗涤 (14) 4.18显色 (14) 4.19比色 (14) 4.20酶标比色仪 (15) 4.21结果判定 (15) 4.22定量测定 (16) 4.23ELISA的操作要点 (16)

1.定义 酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA，采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，对受检物质进行定性或定量分析的一种检测方法。 2.原理 采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，可对受检物质的定性或定量分析。 2.1抗原抗体反应 2.1.1可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为： Ag+Ab→Ag·Ab 抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]，Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原和抗体均能保持原有的结构和活性。 2.1.2特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。因此，在很多时候，测定某一特定的物质不需分离待测物。2.1.3最适比例 只有当抗原抗体的浓度比例是当时，才出现可见反应。 以沉淀反应为例（Ab量固定，Ag量递增）

化学发光微粒子免疫分析法在HIV检测中假阳性的应用分析

化学发光微粒子免疫分析法在HIV检测中假阳性的应用分 析 唐春雪;杨涛;赵静;朱琳 【期刊名称】《医药前沿》 【年(卷),期】2018(008)015 【摘要】目的:在HIV检测中应用化学发光微粒子免疫分析法,分析假阳性的发生情况.方法:选择HIV检测的16263例患者,化学发光微粒子免疫分析法检测.结果:16263例HIV检测的患者经化学发光微粒子免疫分析法检测,筛查出阳性标本54例,阳性检出率为0.33％;之后,经免疫印迹法检测,确定有阳性标本37例(阳性检出率为0.23％),8例为阴性和9例为不确定.结论:化学发光微粒子免疫分析法在HIV检测中的假阳性率较高,需要结合多种试验结果进行综合诊断.%Objective To analyze the occurrence of false positive by chemiluminescence microparticle immunoassay in HIV detection. Methods 16263 HIV patients were detected by chemiluminescence microparticle immunoassay. Results In 16263 HIV patients, 54 positive samples were screened by chemiluminescence microparticle immunoassay, the positive rate was 0.33 ％. After that, 37 positive specimens were identified by western blotting (positive detection rate was 0.23 ％), 8 were negative and 9 were uncertain. Conclusion Chemiluminescence microparticle immunoassay has a high false positive rate in HIV detection, which needs to be combined with various test results for comprehensive diagnosis.

农药残留检测酶联免疫抗体及快速检测试剂盒项目商业计划书131210

农药残留检测酶联免疫抗体及快速检测试剂盒项目 商业计划书 2013年12月8日

目录 1.项目概述 (1) 1.1项目背景 (1) 1.2项目简介 (2) 1.2.1农药残留检测技术及发展 (2) 1.2.2项目概述 (3) 2.农药残留检测行业和市场分析 (4) 2.1农药残留检测行业 (4) 2.2市场需求分析 (5) 2.3竞争和优势分析 (6) 2.4本项目的目标市场 (7) 2.5项目风险 (8) 3.产品与服务 (10) 3.1 酶联免疫检测方法 (10) 3.2酶联免疫技术优势 (11) 3.3 本项目的技术创新点及所处水平 (11) 3.4.本项目目前现有的主要技术产品 (12) 4.项目商业模式 (13) 4.1经营主体 (13) 4.2盈利模式 (13) 4.3销售体系 (14) 4.4营销策略 (14) 5.项目投资和融资情况说明 (15) 51资金需求情况 (15) 5.2资金使用计划及进度 (15) 5.3融资方案 (16) 5.3.1融资形式 (16) 5.3.2退出机制 (16) 6.财务预测与分析 (17) 6.1项目投资估算 (17) 6.1.1固定资产投资估算 (17) 6.1.2运行成本估算 (18) 6.2项目效益分析 (19) 6.2.1财务现金流分析 (19) 6.3.2敏感性分析 (19) 7.项目环境与社会效益评价 (21)

1.项目概述 1.1项目背景 随着我国经济的快速发展和生活水平的提高，人们再对食品安全有了更高的要求同时，由于我国在市场经济建设过程中由于制度建设和监管水平等多种原因导致我国食品安全问题日益严重。引起食品安全问题的原因很多，农副产品中农药残留问题是影响食品安全的重要因素之一。 农药残留是指农药使用后残存于环境、生物体和食品中的农药母体、衍生物、代谢物、降解物和杂质的总称。造成蔬菜农药残留量超标的主要是一些国家禁止在蔬菜生产中使用的有机磷农药和氨基甲酸酯类农药，如甲胺磷、氧化乐果、甲拌磷、对硫磷、甲基对硫磷等。食用含有大量高毒、剧毒农药残留引起的食物会导致人、畜急性中毒事故。长期食用农药残留超标的农副产品，虽然不会导致急性中毒，但可能引起人和动物的慢性中毒，导致疾病的发生，甚至影响到下一代。农产品中的农药残留量超标不仅影响人民身体健康，而且影响我国农产品在国际市场的竞争力。在世界贸易一体化的今天，农药最高残留限量也成为各贸易国之间重要的技术壁垒，对此已经引起我国政府高度重视和社会公众的广泛关注。为了加强农产品中农药残留的控制和监测工作，全面提高我国农产品质量，适应我国农业和农村经济发展新阶段的需求，农业部制定了农副产品中的农药最高残留量国家标准来规范农药的使用。世界各国对农产品安全生产和质量控制越来越严格，除严格限制使用高毒、高残留农药外，对农药残留实施快速检测是行之有效的办法。

酶免疫技术的特点方法原理

酶免疫技术的特点方法原理 免疫酶技术是指在一定的生物反应器内,利用酶的催化作用,进行物质转化的技术.其应用范围已遍及工业、医药、农业、化学分析、环境保护、能源开发和生命科学理论研究等各个方面。下面是给大家的酶免疫技术的特点，希望能帮到大家! (1)酶和酶作用的底物： ①辣根过氧化酶(HRP)：是一种糖蛋白，含糖量约18%;分子量为44kD;是一种复合酶，由主酶(酶蛋白)和辅基(亚铁血红素)结合而成的一种卟啉蛋白质。主酶为无色糖蛋白，在275nm波长处有最高吸收峰;辅基是深棕色的含铁卟啉环，在403nm波长处有最高吸收峰。在反应中H2O2是受氢体底物，DH2无色的供氢体底物，在HRP的催化下脱氢而显色，此即HRP作为示踪物的原理。 ②碱性磷酸酶(AP)：是从牛肠粘膜或大肠杆菌中提取。从大肠杆菌提取的最适pH为8.0;用小牛肠粘膜提取的AP最适pH为9.6。 ③其他的酶：有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。 (2)酶标记的抗体或抗原： 称为结合物。制备方法通常有戊二醛交联法(包括有一步法和二步法)和过碘酸盐氧化法。标记抗体的最佳用量：通常采用棋盘滴定法进行滴定。 (3)固相载体： 主要试剂：固相的抗原或抗体、医学`教育网搜集酶标记的抗原或抗体和与标记酶直接关联的酶反应底物。可作固相载体物质最常用

的是聚苯乙烯。与聚苯乙烯类似的塑料为聚氯乙烯。聚苯乙烯作为ELISA固相载体，载体还包括微孔滤膜和含铁磁性微粒。聚氯乙烯板的特点为质软板薄，可切割，价廉、但光洁度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有时也略高。 (4)免疫吸附剂： 固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗原或抗体固相化的过 程称为包被。如在包被后再用1%～5%牛血清白蛋白包被一次，可以 消除这种干扰。这一过程称为封闭。包被好的ELISA板在低温可放置一段时间而不失去其免疫活性。 ACA(抗心磷脂抗体)主要通过抑制血管内皮细胞合成PGI2，干 扰血栓调节素、纤溶酶原激活剂和蛋白质C系统的活性，抑制抗凝血酶III的活化等而致凝血前高凝状态，与复发性动静脉血栓形成、反复自然流产及血小板减少症关系密切。 其主要程序为用纯心磷脂的无水乙醇溶液包被聚苯乙烯板，封 闭后分别于标本孔和对照孔中加入一定稀释度的被检血清及阳性与 阴性对照血清，之后加入酶标二抗和酶底物，终止反应后肉眼观察结果或测吸光度(A)值。 具体步骤如下： 预步骤：先用一定浓度的心磷脂溶液包被聚苯乙烯板的小孔，4℃冰箱过夜，次日取出甩尽液体备用。 (1)用微量移液器分别加待检血清、阳性对照、阴性对照各100μl于1、2、3孔中，370C水浴箱温育30min。

人C反应蛋白CRP酶联免疫分析试剂盒使用方法

人C-反应蛋白(CRP)酶联免疫分析试剂盒使用方法 检测范围：96T 30μg/L -800μg/L 使用目的： 本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中C-反应蛋白(CRP)含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人C-反应蛋白(CRP)水平。用纯化的人C-反应蛋白(CRP)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入C-反应蛋白(CRP)，再与HRP标记的C-反应蛋白(CRP)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的C-反应蛋白(CRP)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中C-反应蛋白(CRP)浓度。 试剂盒组成 标本要求 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤 1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀 待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。 9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色

酶联免疫(ELISA)使用试剂盒检测过程中值得关注的问题

酶联免疫（ELISA）使用试剂盒检测过程中值得关注的问题 1、仪器质控 为使仪器保持最佳工作状态，应建立维护和校正仪器的标准操作程序（SOP），所要控制的仪器包括移液器（加样枪）、温箱、洗板机和酶标仪。 ◎移液器：ELISA加样量小（20-200μl），其准确性直接影响实验结果，利用称重法检查：低、中、高三个刻度分别吸取指示量的水，万分之一天平称重后计算吸量是否准确，一般应在±5%以内； ◎恒温箱：经常检查恒温箱温度计所示的温度和水中（或温箱内）实测温度是否一致，允许有±1℃的误差；◎洗板机：每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定，一般不超过2μl；人工扣板时，垫纸不湿；定期检查管孔是否堵塞； ◎酶标仪：经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。 2、试剂盒选择 ◎应尽量选择正规厂家，产品经相应政府部门审核认可，试剂应从灵敏度、特异性、精密度、稳定性、简便性、安全性及经济性全面评价。 ◎灵敏度：有二层含义，1）为试剂检出被检物质的最低量的能力；2）为试剂对大量样品中阳性检出的能力。 ◎特异性：常用交叉反应率表示。含有与待测物相近结构部份的物质可能存在交叉反应，使测定结果升高，可能导致假阳性，所以交叉反应是评价其质量的关键指标。 ◎精密度：ELISA试剂一般指其批内CV%，其值应小于15%；定量试剂应同时考察线性范围。 ◎准确度：通过添加回收实验进行评价。 ◎简便性：指在不影响试剂的前三项指标的前题下，实验和测定步骤越少越好，在定性实验中结果判断简

单明了，定量试验结果计算也应简单。 ◎安全性：指试剂对操作者和环境安全无害无传染性。 ◎经济性：试剂在同等质量条件下通过大规模生产或技术进步降低成本，而市场价格比较合理。 ◎试剂评价：需要有权威的确证方法和确证的样品进行检测。 3、样本前处理注意事项 3.1 均质 组织样本:肉、肝食品类切细，用绞肉机反复绞碎，混合均匀。 水产样本：去除样品的非食用部分，食用部分切细，用均质器均浆；原料表面较脏时,需适当用蒸馏水清洗。蛋类：鲜蛋去壳，蛋黄和蛋白充分混匀。 水果、蔬菜类：先用水洗去泥沙，然后除去表面的水分，取食用部分。 3.2 振荡提取 将提取溶剂加入到装有样品的具塞容器中，振荡，使提取溶剂与容器内的样品充分接触以深入到样本组织内部，提取待测组分。 3.2.1振荡方式：振荡器上进行上下、往返式振荡、手摇式上下振荡。 3.2.2 在组织样本中加入有机溶剂之间提取时，应边加边振荡，防止组织凝结成团，不利于提取。 3.3. 在用有机溶剂提取过程中，如果出现乳化现象，解决的方法有：①用细头轻轻的搅拌，破坏乳化后，再重复离心。②再加入适量的提取剂，重新振荡。注意离心后要保证样本的稀释倍数不变。 3.4 浓缩 由于净化过程中引入的溶剂，可能会降低待测组分的浓度或者不适宜直接分析，需要去除全部有机溶剂。即试剂盒前处理步骤中把样本在60℃氮气下吹干，再用复溶液溶解干燥残留物。 浓缩方式： 氮气吹干除杂、压缩空气吹干除杂。 注意： 3.4.1在吹干样本之前，用甲醇清洗针头，防止杂质干扰。 3.4.2在吹样本时，针头应在液面上空，避免与样本接触，防止产生交叉污染。 3.4.3样本吹干后应立即取下，避免吹的时间过长，影响最终检测结果。 3.4.4不同的药物，吹干后样本的保质期不同，提倡待样本回到室温后立即复溶。 3.5 净化 经过提取的待测组分中通常含有一些会干扰试剂盒中抗原抗体反应的杂质或者是含有与待测物结构相似 的杂质。将待测组分与杂质分离的过程，我们称为试剂盒中样本的净化。在我们现有的试剂盒前处理方法中涉及到的最常见的净化是：液液分配法。 比如：用复溶液溶解干燥残留物之前先加入适量的正己烷，在加入正己烷和复溶液涡动后如果出现乳化现象，可以60℃水浴加热，至乳化现象消失或减弱后，加大离心转速进行离心。 实例： A、氟喹诺酮类药物试剂盒现有的水产样本前处理方法中，用二氯甲烷作为提取剂。 注意：

酶免疫分析法

免疫分析法（immunoassay，IA）是基于抗原和抗体特征性反应的一种技术。由于疫分析试剂在免疫反应中所体现出的独特的选择性和极低的检测限，使这种分析手段在临床、生物制药和环境化学等领域得到广泛应用。 1、酶免疫分析（EIA） 酶免疫分析是一种非放射性标记免疫分析技术，以酶标记抗原或抗体作为示踪物，由高活性的酶催化底物显色或发光，达到定量分析的目的。这种方法是对细胞融合技术的一项重要应用。因其操作简便，不需昂贵设备，不污染环境，加之酶标记物相当稳定，有效期长，应用范围广泛而受环境检验工作者青睐。最初应用的EIA技术，多采用HRP标记抗体或抗原，灵敏度不高。后来逐步发展了各种放大体系，如底物循环放大体系、酶联级放大体系、生物素-亲和素放大体系、脂质体或红细胞等作为标记物载体以包载大量标记物的放大体系，以及采用PCR技术的PCR-EIA分析，使灵敏度有很大改进。 1.1生物素-链亲和素酶免分析（biotin avidin system BAS-EIA）[1] 生物素（botin）广泛存在于动植物组织中，在生物体内是羧化酶的辅酶；亲合素又名抗生物素蛋白，与生物素具有高度的亲和性，利用这一点，以生物素和亲和素为中介，可增强抗原-抗体反应的结合提高检测方法的灵敏度。但亲和素的非特异性结合高，后又发现另一种亲合素，称之为链亲合素（Streptavin，SA），克服了亲合素非特异性结合高的缺点。免疫分析技术中，目前均采用SA供标记酶或其它示踪剂。一个完整的SA分子上的4个相同亚基，都可以和一个生物素分子结合，其Ka值达1015L/mo1，是抗体抗原反应的10~100万倍。又加之一个抗体或抗原分子结合多个生物素分子，不改变其免疫活性。 1.2脂质体免疫分析法（liposome immunoassay，LIA）[1] 脂质体是一种生物摸拟膜，它是磷脂分子分散于水相介质中形成的密闭的双子单层或多层的囊泡。其膜内可包容上万个标记物分子，具有很高的信号放大作用。因此，将脂质体用于免疫分析是提高非放射免疫分析灵敏度的有效途径之一，由此所建立起来的方法即为脂质体免疫分析法。 1.3PCR-EIA分析[1] PCR-EIA技术是运用PCR的高度敏感性来放大抗原抗体反应的特异性，它以一段特定的双链或单链DNA来标记抗体，用PCR扩增抗体所连接的DNA，