发根农杆菌Ri质粒的特征及其应用
质粒DNA提取方法与原理
质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA 发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 一、试剂准备 1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl (pH 8.0）1 2.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。 任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。50 mM葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。 NaOH也使DNA变性，但只是个副产物，在溶液3加入后其中的醋酸和NaOH中和，质粒DNA恢复活性 2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。 这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向 micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS 也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为 SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS 呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂。基因组 DNA 的断裂会带来麻烦。 3.溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。 溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往1%的 SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是
质粒提取总结
碱裂解法抽提质粒原理 溶液I，50 mM葡萄糖 /25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH ； （溶菌酶：使细胞壁裂解；RNase：将裂解完的RNA去除，防止RNA污染） 溶液II， N NaOH / 1% SDS； 溶液III，3M醋酸钾 / 2 M醋酸。 溶液I的作用： ①任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。 ②50mM葡萄糖：加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。 ③EDTA：EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10 mM的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。 如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。 溶液II： 这是用新鲜的 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。 要新从浓NaOH稀释制备的NaOH，是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。 事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。
质粒提取有关问题及注意点
质粒提取常见问题解析 涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？ 参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。 原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常? 参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。解决办法： 1、降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。 2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。 3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下！ 【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常： 1、利用你的嗅觉。只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。 2、肉眼观察活化菌株。对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在37℃16h后直径在1mm左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常了。】 未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？ 参考见解： 1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。 2、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。 3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。 4、碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。 5、溶液使用不当：溶液2和3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。 6、吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如TB或2×YT，菌液体积必须减少；若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少LB培养液体积。 7、质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) ：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。 8、乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。 9、洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。 10、洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。
质粒提取
1.菌液接种到500ml培养基中，加抗生素至工作浓度，37℃，300rpm过夜 2.4000rpm，15min离心菌液收集菌体。 3.用20ml solutionⅠ溶解菌团，充分打散混合均匀。 4.称取0.1g溶菌酶加入菌液，室温放置5min。 5.加入40ml solution Ⅱ，轻轻混合至澄清,冰上放置5min。 6.加30ml solution Ⅲ，轻轻混匀，冰浴10min。 7.4000rpm，20min，离心后将上清液倒到200ml量筒里面。 8.加入0.6倍体积的异丙醇混匀并室温放置10min。10000rpm离心15min。 9.用6.5ml的TE重悬沉淀，转移到4个EP管中，13000rpm 离心5min。 10.上清转移到15ml的离心管中，加7.2gCsCl和 200ul的10mg/ml的EB，混匀。 11.在超速离心管中加样并封口。60000rpm 10℃离心16h。 12.用一个注射器在超速离心管中上面戳一个孔，留下针头，并用另外一个注射 器从红色质粒带旁边管壁戳进去，吸取1-1.5ml，装入新的离心管中。 13.加5ml TE饱和丁醇，混匀后静置各相分离后去掉上层桃红色丁醇，重复这一 步，直到下层水相中没有桃红色。转移下层水相到EP管中。 14.加入1/10体积5M的Nacl和2倍体积的无水乙醇。在-20℃下放置20min。 15.13000rpm，10min离心后去上清，重悬沉淀于1ml的TE然后转移至EP管。 16.用1倍体积的25/24/1的酚/氯仿/异戊醇抽提两次。 17.每管加1/10体积的2.5M的乙酸钠和2倍体积的乙醇， -20℃下放置20min。 13000rpm离心10min，然后用70%的乙醇轻轻润洗并晾干EP管。 18.重悬于1ml TE中，并在OD260下测量浓度。
发根农杆菌诱导玉米毛状根发生及再生植株
中国科学 C 辑 生命科学 2005, 35 (6): 497~501 497 发根农杆菌诱导玉米毛状根发生及再生植株* 徐洪伟 ①② 周晓馥② 陆静梅① 王俊杰① 王兴智 ①** (① 东北师范大学生命科学学院, 长春 130024; ② 吉林师范大学基因工程研究所, 四平 136000) 摘要 发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes )侵染玉米愈伤组织15天左右获得毛状根. 转化根在不含激素的培养基上快速生长, 并表现出典型的毛状根性状. 在含ZT 1.6 mg/L 和NAA 0.4 mg/L 的MS 培养基上, 毛状根再生成完整转化植株. PCR-Southern 杂交证实T-DNA 已整合入转化株的染色体组. 关键词 发根农杆菌 玉米 毛状根 PCR-Southern 2005-06-24收稿, 2005-09-28收修改稿 * 国家植物转基因中试及产业化基地(批准号: J99-B-001)资助项目 ** 联系人, E-mail: xingzhi@https://www.wendangku.net/doc/762450013.html, 单子叶植物是人类粮食的主要来源. 因此, 单子叶植物的基因转化研究引起人们广泛重视. 农杆菌介导的基因转化系统是一种天然有效的遗传转化工程系统. 但是由于单子叶植物不是农杆菌的天然寄主, 阻碍了其在单子叶植物上的应用. 上世纪80年代初期, 根瘤农杆菌侵染单子叶植物开始获得成功, 利用根瘤农杆菌转化玉米的报道很多[1,2], 但是发根农杆菌能侵染的寄主植物还仅限于双子叶植物[3,4]. 然而, cross-inoculation 实验大大地扩大了发根农杆菌的宿主侵染范围. 从上世纪90年代初期以来有关发根农杆菌诱导极少数单子叶植物[5]和多数双子叶植物[6]产生毛状根的报道开始出现. 发根农杆菌感染寄主时, 被损伤的植物细胞合成特殊的小分子酚类化合物如乙酰丁香酮等, 并与vir A 基因产物结合, 诱导其他基因活化, 从而发生感染过程. Ri 质粒不能侵染的单子叶植物可能缺少这种小分子 酚类化合物. 但最近有人报道小麦的种子和胚、玉米幼苗也存在这种小分子酚类化合物. 然而, 迄今为止, 发根农杆菌遗传转化单子叶植物还未见报道[7~9]. Ri 质粒转化具有很多优点: (ⅰ) Ri 质粒可以不经“解除武装(disarm)”进行转化, 并且转化产生的毛状根能够再生植株; (ⅱ) 毛状根是一个单细胞克隆, 可以避免嵌合体, 并且毛状根每一个细胞都是通过转化而来的有利于遗传操作; (ⅲ) 可直接作为中间载体; (ⅳ) Ri 质粒和Ti 质粒可以配合使用, 建立双元载体, 拓展了两类质粒在植物基因工程中的应用范围; (ⅴ) 毛状根适于进行离体培养, 而且很多植物的毛状根在离体培养条件下都表现出原植株的所有特征. 由于发根农杆菌Ri 质粒的TL-DNA 上有rol A-D 基因群, TR-DNA 有tms 基因, 被感染的寄主植物伤口可产生大量的不定根, 从而改善生根状况, 有益于对干旱的抵抗[12], 因此为培育成抗旱型玉米具有重要
质粒提取操作步骤
操作步骤： 本实验方法适用于从1-10ml过夜培养的大肠杆菌菌液中提取质粒。提取量受菌株、质粒拷贝数、菌液体积和培养时间、培养基类型等因素的综合影响。 1.收菌：将过夜培养（37℃，12-16小时）的菌液于室温≧10,000g 离心1-2分钟，彻底弃除上清。 注意：高拷贝质粒建议使用≦5ml菌液；菌液用量过大不仅不能增加质粒产量，反而会因裂解不完全或杂质封闭硅胶膜而降低产量；培养时间不宜过长，否则会增加开环结构质粒的比例。。 2.重悬：加入250μl含RNase A的细胞悬浮液（S1），充分混悬震荡 或用枪头反复抽打使细菌彻底分散悬浮。 3.裂解：加入250μl细胞裂解液（S2），轻轻上下颠倒混合5次，室 温静置1-5分钟，待细菌充分裂解，溶液变半透明。 注意：避免剧烈震荡导致基因组DNA裂解，裂解时间不能超过5分钟。 4.中和：加入350μl中和缓冲液（S3），轻轻上下颠倒混合5次，充 分混匀，避免剧烈震荡。室温下≧12,000g离心10分钟。 5.DNA结合：小心吸取上清，转移到插入收集管的离心吸附柱内，室 温下≧12,000g离心1分钟，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中。 6.清洗：加入500μl漂洗液（WB,请确认已加入乙醇！）于离心吸附 柱中，室温下≧12,000g离心30秒，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中。 7.再次清洗：加入500μl漂洗液（WB）于离心吸附柱中，室温下≧ 12,000g离心30秒，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插
回收集管中。将离心吸附柱开盖再次离心2分钟，彻底除去残余漂洗液。 8.洗脱：小心取出离心吸附柱，将其套入一个新的1.5ml灭菌离心 管中。向硅胶吸附膜的中央加入100μl洗脱缓冲液（EB），室温放置1分钟后，≧12,000g离心1分钟收集质粒DNA。 注意：为提高质粒浓度，最低可使用30μl的EB溶液，离心收集后壳将洗脱的质粒溶液再次加入离心吸附柱中重复洗脱；使用100μlEB溶液则无需二次洗脱；对6kb以上的质粒，可使用预先加热至55℃的EB溶液洗脱以提高产量；EB溶液不含EDTA，故不会影响荧光测序等后续反应；如必须使用无菌去离子水洗脱，需注意其pH值是否接近中性，否则应使用NaOH溶液将pH值调节至7.0-8.5之间。 9.储存：弃除离心吸附柱，纯化的质粒可直接用于后续反应或于 -20℃长期保存。 注意：经检测，本试剂盒从endAˉ菌株（如DH5α，TOP10，XL1-blue等）中提取的质粒反复冻融20次无降解；如需在4℃长期保存或者保存从endA+菌株（如JM109，HB101，BL21等）中提取的质粒，可向每100μl质粒溶液中加入11μl的10×TE溶液，但含EDTA的质粒溶液不可用作荧光测序模板。
A4发根农杆菌特点及使用说明
北京华越洋生物提供QQ:1733351176 A4发根农杆菌产品简介： A4发根农杆菌是一种天然农杆碱性农杆菌，菌株本身均有卡那霉素的抗性，可在YEB或LB培养基上进行培养，培养的最适温度为28℃，A4农杆菌是耗氧型。通常使用30%的甘油保藏菌种。 A4发根农杆菌操作说明： 1，本产品包含一份甘油菌，使用本甘油菌时可以不用完全融解，在甘油菌表面蘸取少量涂板或进行液体培养即可。也可以完全融解后使用，但随着冻融次数的增加，细菌的活力会逐渐下降。 2，为保证菌种纯正，避免其它细菌污染，尽量先划平板，然后再挑单克隆菌落进行后续操作。 A4发根农杆菌注意事项： 1，为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 2，本产品仅可用于实验室研究，不能用于动物，人体以及作为食品添加剂等用途。 A4发根农杆菌【规格】 冻干粉 【冷冻管开封】 用浸过75%酒精的脱脂棉严格消毒冷冻管盖。 A4发根农杆菌【菌株复溶】 无菌环境中旋开装有复溶液的滴瓶盖，吸取1ml 左右复溶液，加入到冷冻管中。轻轻振荡，使冻干菌 株溶解呈悬浮状。 【菌株复壮】 用无菌吸管吸取菌悬液，转移到复溶液滴瓶中。做好标识，在适宜温度下培养。细菌在30-35℃培养 箱中培养24-48h，真菌在23-28℃培养箱中培养24-72h（必要时，可适当延长培养时间）。 A4发根农杆菌【菌株传代】 将得到的菌株的新鲜培养物转接到适宜的固体培养基及液体培养基中（尽量增大接种量：如用无菌吸 管吸取≥50μl 新鲜培养物至固体培养基，边移动边缓慢释放），适宜温度下培养，用以菌株的保藏、传 代及制备工作菌株。 A4发根农杆菌【注意事项】 1、菌种活化前，将冷冻管保存在低温、清洁、干燥的环境中，长时间室温下放置会导致菌种衰退； 2、冷冻管开封、冻干粉复溶、菌株恢复培养等操作应在无菌条件下进行；
大肠杆菌质粒DNA的提取
一、大肠杆菌质粒DNA的提取 质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法： 碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下： 1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。 2、37℃振荡培养过夜。 3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。 4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。 5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管 8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。 9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。 10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。 11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中 煮沸法 1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。 2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。 3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。 4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。 5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。 6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。 7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。 8、取20ml进行电泳检查。 [注意] 1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。 2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。有时不同溶菌酶也能溶菌。 3. 提取的质粒DNA中会含有RNA,但RNA并不干扰进一步实验,如限制性内切酶消化,亚克隆及连接反应等。 质粒DNA的大量提取和纯化 在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。 （一）、碱法 1、取培养至对数生长后期的含pBS质粒的细菌培养液250ml，4℃下5000g离心15分钟,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。 2、将细菌沉淀重新悬浮于50ml用冰预冷的STE中（此步可省略）。 3、同步骤1方法离心以收集细菌细胞。
大肠杆菌质粒提取
质粒小提试剂盒 （离心柱型） 使用前在漂洗液PW中加无水乙醇 1.柱平衡：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入平衡液BL，12000rpm、 离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱放回收集管中。（使用当天处理过的柱子） 2.取1-5ml过夜培养的菌液，12000rpm、离心1min（EP管收集3次）尽量吸 除上清 3.向留有沉淀的离心管中加250μl溶液P1（检查是否已加入RNaseA），涡旋 彻底悬浮菌体沉淀（不要留有菌块，会影响裂解）。 4.向离心管中加250μl溶液P2，温和的上下翻转6~8次使菌体充分裂解，室 温放置3~5min（温和翻转，不要剧烈震荡。此时菌液变得清亮粘稠，时间应不超过5min，以免质粒受破坏）。 5.向离心管中加350μl溶液P3，立即温和的上下翻转6~8次，充分混匀，此 时出现白色絮状沉淀。12000rpm、离心10min。（P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀，如有微小沉淀可再次离心后取上清）。（此时可做胶，以备检测用） 6.取上清转移到吸附柱CP3中，不要吸出沉淀。12000rpm、离心1min，倒掉 收集管中的废液，吸附柱放回收集管中。 7.向吸附柱CP3中加600μl漂洗液PW（检查是否加入无水乙醇），12000rpm、 离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱放回收集管中。 8.重复操作步骤7。 9.将吸附柱CP3放回收集管中，12000rpm、离心2min，将吸附柱中残余漂洗 液除去（可将吸附柱CP3开盖放置数分钟，以彻底晾干残余漂洗液）。 10.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加100μl ddH2O/EB，室温放置2min，12000rpm、离心2min，将质粒溶液收集到离心管中，-20℃保存。 注意：使用前检查平衡液BL、溶液P2、溶液P3是否出现浑浊，如有浑浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清
农杆菌
农杆菌 农杆菌（Agrobacterium）是生活在植物根的表面依靠由根组织渗透出来的营养物质生存的一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌。 分类 冠瘿瘤 农杆菌主要有两种：根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）。根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多种双子叶植物或裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。引发冠瘿瘤的原因是，Ti质粒上的T-DNA上有8个左右的基因在植物细胞内表达，指导合成一种非常寻常的化合物冠瘿碱，进而引起转化细胞癌变。而发根农杆菌则诱导产生发状根，其特征是大量增生高度分支的根系。根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌的Ri质粒上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA 插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系，被誉为“自然界最小的遗传工程师”[1]。可以通过将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，然后通过细胞和组织培养技术，得到转基因植物。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近几年来，农杆菌的介导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应用。此外，生物技术学家还可以通过发根农杆菌转化，在液体培养基中培养高密度的根，作为一种在转基因植物中获得大量蛋白质的方法。 生存与形状 根癌农杆菌生活在土壤——特别是耕种过的田地里，因为经过耕种的土壤疏松，适宜根癌农杆菌生长。根癌农杆菌的身体为棒状，有两三个微米长，靠几根鞭毛运动，鞭毛一般生在侧边。用显微镜放大到1000倍时，人们就能把它看得很清楚了。根癌农杆菌虽小，也有细胞壁，按以前的生物两界分类法，它当然属于植物界，就是说，它曾被当作是一种低等植物。在许多双子叶植物靠近地面的根茎交界处，根癌农杆菌能诱发一种帽状肿瘤，人们称之为冠瘿瘤病。这种病曾在法国、东欧和澳大利亚的葡萄等果树上大面积发生，造成很大的危害。在其他地方，甚至城市园林绿化中，也有不少植物患上此病。人们发现，根癌农杆菌所产生的冠瘿瘤病，与豆科植物根部的固氮根瘤细菌所产生的根瘤相似；然而，事实上，两者的作用方式并不一样。豆科植物的固氮根瘤菌会钻到植物细胞内部，与植物细胞共生，根瘤细菌为豆科植物提供氮肥，植物细胞则供给根瘤细胞其他各种营养。
质粒转化大肠杆菌实习报告--附实验图片
细胞转基因技术研究进展 1实验内容：原核细胞转基因:大肠杆菌感受态细胞的制备, 转化和鉴定 2实验原理及技术介绍： 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。但是在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。 所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA的结合和加工等。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。目前对感受态细胞能接受外来DNA分子的本质看法不一。主要有两种假说:一种是局部原生质体化假说——细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA分子能通过质膜进细胞。另一种是酶受体假说——感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点，使DNA分子能进入细胞。 本实验通过CaCl2对特定的大肠杆菌处理，制备感受态的细菌。这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA，如一些插入目的DNA片段的重组质粒，产生5×106~2×107个转化的菌落。当质粒与这些大肠杆菌混合后，质粒粘附在大肠杆菌的表面，在42℃的温度时，大肠杆菌出现热休克，质粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内。随后，加入LB培养液，于37℃振动培养可使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性基因，提高转化效率。转化成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代，形成菌落。 本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与质粒共保温,实现转化。由于质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Amp)，可通过Amp抗性来 1
发根农杆菌转化茶树方法
最佳发根诱导体系为： OD600 为0.5~0.8 的发根农杆菌菌液侵染已培养60~70 d苗龄无菌苗茎段10~50 min，在添加100 mmol/L 乙酰丁香酮的YMB 固体培养基上共培养2 d，在含500 mg/L头胞噻肟钠的MS 培养基上诱导发根。 外植体处理： 茶树无菌苗培养于含2.0 mg/L BAP、0.5 mg/L IBA 和 2 mg/L GA3的MS 培养基，培养基添加30 g/L 蔗糖和 6.8 g/L 琼脂。培养基在高压灭菌前用0.1 mol/L NaOH 溶液调pH 值为5.8，121℃灭菌15 min。培养条件为25±2℃，光照强度2000 lux，每天光照16 h，黑暗8 h，每 3 个月继代培养一次。切取0.5~1.0 cm 长茎段和0.5 cm2叶片切块作为转化受体。 农杆菌培养： 发根农杆菌15834和LBA902，在添加100 mg/L 利福平的YMB 固体培养基上，28℃黑暗培养活化两次。挑取单菌落接种于20 ml 含100 mmol/L 乙酰丁香酮（AS）液体YMB 培养基中，28℃250 r/min 震荡培养至OD600 为0.5~0.8 用于侵染。 侵染方式： 将无菌苗的茎段和叶片切块，置于发根农杆菌菌液中，侵染一定时间后，无菌滤纸吸干多余的菌液，转移于含100 mmol/L AS的YMB 培养基（共培养培养基）黑暗共培养 2 d 后，无菌水冲洗3~4 次，1000 mg/L 头孢噻肟钠（齐鲁制药有限公司）浸泡20 min 以杀死农杆菌，无菌滤纸吸干材料表面水分，转移于含500 mg/L 头孢噻肟钠的MS培养基（抑菌培养基）。25±2℃，黑暗培养。30 d 后统计发根和愈伤组织诱导频率。
质粒提取的原理(原始版)
一、导论 质粒提取的原理：转自复旦大学一位老师的帖子，后面是方法介绍碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。可是我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。追其原因，我想大概是因为《分子克隆》里面只讲实验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述。这是导致我的学生误入歧途的主要原因。后来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生水平都差不多，甚至有很多“老师”也是这个状态。这就不得不让人感到悲哀了。 我想这恐怕和我们的文化有点关系。中国人崇尚读书，“学而优则仕”的观念深入人心。经常听到的是父母对他们的独苗说，你只要专心读好书就可以了。所以这读书的定义就是将教课书上的东西记住，考试的时候能拿高分……这就是现代科学没有在中国萌发的根本原因。如果中国文化在这一点上不发生变化，那么科学是不能在中国真正扎根的，它只能蜕化成新的“八股学”。生命科学是实验科学，它讲究动手。如果实验科学只要看看书就可以了，那我想问有那位神仙看看书就会骑自行车了?或者听听体育老师的讲解就会滑冰了?可是光动手不思考，不就成了一个工匠?一个合格的生命科学研究者，需要在这两方面完善自己。一个杰出的科学工作者，是一个熟知科学原理并善于应用的“艺术家”。每个曾经用碱法抽提过质粒的同学，希望你看本文后能有所思考，让中国的未来有希望。 为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢?说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢?大家知道EDTA是Ca2 和Mg2 等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE 缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢?实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。 有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。轮到溶液II了。这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2%的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢?那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过
细菌质粒提取原理及步骤(精)
质粒提取原理及步骤 一、导论 已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA ，这些方法都含有以下3个步骤： 1. 细菌培养物的生长。 2. 细菌的收获和裂解 3. 质粒DNA 的纯化。 （一）细菌培养物的生长 从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。现在使用的许多质粒载体（如pUC 系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。此时，不必造反性地扩增质粒DNA 。然而，较长一代的载体(如pB R322 由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。这样，像pBR ３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA 量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。 （二）细菌的收获和裂解 细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于
纯化质粒DNA 的技术。尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。 1 大质粒(大于15kb 容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA 进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS 一类去污剂溶解球形体。这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。 2 可用更剧烈的方法来分离小质粒。在加入EDTA 后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA 变性，但闭环质粒DNA 链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒DNA 链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。 3 一些大肠杆菌菌株(如HB101的一些变种衍生株用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类，当随后用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNA 所占位置形成一致密的、模糊的区带。因此很难避免质粒DNA 内污染有糖类，而糖类可抑制多种限制酶的活性。故从诸如HB101和TG1等大肠杆菌蓖株中大量制备质粒时，不宜使用煮沸法。 4 当从表达内切核酸酶A 的大肠杆菌菌株(endA+株，如HB101 中小量制备质粒时，建议不使用煮沸法。因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A ，以后在温育(如用限制酶消化时，质粒DNA 会被降解。但如果通过一个附加步骤(用酚：氯仿进行抽提可以避免此问题。５目前这一代质粒的拷贝数都非常高，以致于不需要用氯霉素进行选择性扩增就可获得高产。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加质粒DNA 的产量，而是要降低细菌细胞在用于大量制备的溶液中所占体积。大量高度粘稠的浓缩细菌裂解物，处理起来煞为费事，而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质粒DNA 的量以与不加氯霉素时从较大量细胞所得到的质粒DNA 的量大致相等。
发根农杆菌转化不同种植物研究综述
发根农杆菌转化不同种植物研究综述 摘要：发根农杆菌诱导产生发状根，其特征是大量增生高度分支的根系。发根农杆菌的Ri 质粒上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系，被誉为“自然界最小的遗传工程师”[1]。因此可以通过将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，然后通过细胞和组织培养技术，得到转基因植物。发根农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近几年来，发根农杆菌的介导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应用。此外，生物技术学家还可以通过发根农杆菌转化，在液体培养基中培养高密度的根，作为一种在转基因植物中获得大量蛋白质的方法。 关键词：发根农杆菌Ri质粒T-DNA 转化因素 1.发根农杆菌特点和培养 1.1发根农杆菌特点 发根农杆菌（g r o b a c t e r i u m r h i z o g e n e s )是根瘤菌科( Rh i z o b i a c e a e )农杆菌属(A g r o b a c t e r i u m) 的种革兰氏阴性土壤细菌。它可以侵染大量的双子叶植物以及部分单子叶植物。发根农杆菌体内含有Ri质粒。Ri质粒的T- DNA上带有冠瘿碱( o p i n e ) 合成酶基因，该基因在植物细胞中表达能产生特异氨基酸衍生物即冠瘿碱。根据发根农杆菌转化植物细胞合成冠瘿碱的差异，可将R i质粒分为4种类型，即农杆碱( a g r o p i n e ) 型、黄瓜碱( c u c r o n o p i n e ) 型、甘露碱( ma n n o p i n e ) 型和异黄瓜碱( mi k i mo p i n e ) 型[2]。Ki y o k a w a S[3]等研究发现，带有农杆碱型Ri质粒的发根农杆菌有更广的寄主范围。 1.2发根农杆菌培养基种类及培养条件 R1601 于LB (附加卡那霉素50mg·L - 1)平板上继代保存. 转化前挑单菌落于LB 液体培 养基, 28 ℃、150 r·m in- 1振荡培养至D (600 nm )为0 . 6- 0 . 8, 离心, 用M S 液体培养基重悬备用.余家平等在发根农杆菌介导药用甘薯西蒙1号的遗传转化[4]中将发根农杆菌菌株A 4 用前于Y E B固体培养基划线三次2 5℃培养，再挑取单菌落转接到Y E B液体培养基中，2 5℃、l 2 0 r／m i n黑暗条件振荡培养2 4 h ， 5 0 0 0 r／m i n离心收集农杆菌，用MS 培养液调节菌液O D600nm值为0 .6左右，即可用于感染外植体。付建喜等在发根农杆菌介导的怀地黄遗传转化[4]研究中，将摇好的菌液加入终浓度为100／μmo l／L 的乙酰丁香酮，振荡暗培养2h后用于感染。用MS培养基重新悬浮菌体后再用于感染，有助于转化频率的提高[6] 2.OD值对农杆菌转化效率影响 农杆菌的OD值对转化过程的影响很大，过高和过低的OD值都不利于转化的成功。这是因为过低的菌液密度使外植体感染不充分，而过高的菌液密度一方面可能造成对外植体的过度感染而导致宿主细胞损伤，且造成转化后除菌困难。赵东利等发根农杆菌对苦豆子高频转化条件的优化[7]中不同光密度的A4发根农杆菌MS悬浮液对苦豆子子叶外植体的转化频率的影响结果显示，最高转化率达15％，最佳光密度为OD = 0 .6 。而高于或低于该密度,转化率都呈下降的趋势。王志成，易自力，农杆菌介导转化水稻方法的改进[8]中的
大肠杆菌质粒转染实验-QIAGEN大提试剂盒
质粒抽提 一、溶液及培养基配制： 1、LB液体培养基 （1）配方： 酵母提取物(Yeast extract) 5g/L 胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L （2）配制： A、称量：称取培养基各成分所需量，置于烧杯中。 B、溶化：加入所需水量2/3的蒸馏水于锥形瓶中，搅拌使药品全部溶化。 C、定容。 D、加塞、包扎。 F、高压灭菌121℃，30min，灭菌后室温保存备用。若要分装需要在超净台内。 G、培养基完全溶解，降至室温后，加氨苄霉素（AMP）。先将AMP用三蒸水配制为100mg/ml母液，而后每1ml母液加至1000ml培养基。（可以多配制一些，分装为1ml/管）2、LB固体培养基 （1）配方： 酵母提取物(Yeast extract) 5g/L 氯化钠(NaCl) 5g/L 胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L 氨苄青霉素溶液100μg/ml（终浓度）（即100mg溶于1ml超纯水或生理盐水或PBS，再加入1000ml培养基） 琼脂粉15g/L （2）配制： A、称量：称取培养基各成分所需量，置于烧杯中。 B、溶化：加入所需水量2/3的蒸馏水于烧杯中，搅拌使药品全部溶化。 C、5mol/L NaOH溶液调pH到7.4。 D、定容。 E、分装、加塞、包扎。 F、高压灭菌121℃，30min。 G、灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中（或室温），待培养基温度降 到55℃时（手可触摸）加入抗生素，（免温度过高导致抗生素失效），并充分摇匀。（3）倒板： 一般20ml倒1块板，培养基倒入培养皿后，打开盖子，水分晾干后盖上盖子并用封口膜封口，4℃保存备用，使用前提前拿出，防止水蒸气滴入板中。 首要检查是否有足够的固体和液体LB培养基，基本上每个质粒需要一块固体培养基，小摇的2ml和大摇的250ml LB培养基。小摇的可以在一个50ml离心管中预备着，每次直接取用。转化所需L形玻璃棒需确认已灭菌 摇菌器申请，张评浒老师，王雪师姐； 注意：考虑到多种东西需要灭菌，可以在转化之前或者小摇大摇那天一起灭菌。所有需要提前灭菌的东西有：足量液体LB培养基灭菌后加入AMP；蓝黄白枪头至少个一盒，备用； 1.5ml doff管；Beckman离心机专用离心管；锡箔纸；250ml锥形瓶，500或者1000ml锥形瓶；电动移液器所用移液管（可以考虑用5ml移液枪，则先灭菌5ml枪头）；超纯水和TE buffer