金胺O荧光染色LED镜检结核分枝杆菌的假阳性研究_廖东宁_刘庆华_石晓婷

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果相似，而与陈琦等[1,7]的研究结果相悖。焦盼盼等[2]调查的人群是医院的住院患者，本研究调查的人群是社区卫生服务机构的老年健康体检人群，二者的移情性得分都最低，首先这可能与我国社区卫生服务机构的医护人员大多来自于医院[8]，服务理念仍主要是按照以患者为中心的医院的服务模式进行有关；其次我国社区卫生服务的人力资源相对匮乏，按照规定社区卫生服务合理的医护配备比为1:8~1:12，我国人力资源在社区卫生服务的配置距达到这一标准还相去甚远[9]，因此只能根据实际情况逐步开展预防、保健、医疗、康复、健康教育、计划生育等社区卫生服务基本项目，尽管这远远落后于社区居民对社区卫生服务的期望。此外社区卫生服务机构的医护人员要实现“从我是你的医生/护士向我是你的朋友转变”，与社区居民进行积极有效的沟通交流，了解他们的真正需求，进而有的放矢为其提供服务。参考文献

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收稿日期：2016-11-22 责任编辑：郭燕红　翟淑娜

金胺O荧光染色LED镜检结核分枝杆菌的假阳

性研究

廖东宁，刘庆华，石晓婷

宁乡县疾病预防控制中心检验科，湖南 410600

摘要：目的 探讨金胺O荧光染色后用LED显微镜镜检结核分枝杆菌的假阳性率和原因。方法 选取宁乡县疾病预防控

制中心2015年金胺O荧光染色LED镜检初涂阳性的痰标本用酸性罗氏培养基简单法进行分离培养。结果 全年132

例金胺O荧光染色镜检初涂阳性标本经培养证实共有3例假阳性病例，假阳性率为2.3%。AFB阳性（报菌数）13例，

AFB阳性（+）16例，AFB阳性（++）35例，AFB阳性（+++）46例，AFB阳性（++++）22例。结论 LED镜检假阳性集中

出现在镜检报告菌量较少的标本中，食物残渣等其他抗酸物质和标本交叉污染是产生假阳性的主要原因。

关键词：结核分枝杆菌；金胺O荧光染色；LED镜检；假阳性

中图分类号：R446.5 文献标志码：A 文章编号：1672-4208（2017）05-0029-03

Research on the false positivity of the tuberculosis micobacteria checked with LED microscope following dyeing with auramine O fluorescence

LIAO Dong-ning,LIU Qing-hua,SHI Xiao-ting

Department of Clinical Laboratory, Ningxiang Center for Disease Control and Prevention, Hunan 410600,China

Abstract:Objective To explore the false positivity and cause of the micobacteria checked with LED microscope following dyeing

with auramine O fluorescence. Methods The initial positive sample of phlegm checked with LED microscope following dyeing

with auramine O fluorescence in 2015 were selected by Ningxiang center of disease control and prevention. Results Among

·论 著·

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132 initial positive samples of phlegm checked with LED microscope following dyeing with auramine O fluorescence, 3 samples had been authenticated as false positive through fostering. The rate of false positivity was 2.3%.There are 13 cases of AFB positive(provide number of bacteria),16 cases of AFB positive(+),35 cases of AFB positive(++),46 cases of AFB positive(+++),22

cases of AFB positive(++++). Conclusion False positivity checked through LED microscope collectively appears in the samples with relatively less bacteria in microscope check report. The major cause of false positivity is due to the other antiacid materials in the food remains and cross pollution of samples.

Key words:Mycobacterium tuberculosis;Dyeing with auramine O fluorescence;LED microscope inspection;False positivity

结核病是人类最古老的传染病之一，是一种以呼吸系统感染为主的慢性传染病，其病原体为结核分枝杆菌。我国的结核病发病率位于世界第二，仅次于印度，年发病人数约为130万，其检查、治疗费用负担已居全球前列[1-2]。为了快速、准确地诊断结核感染，基层实验室多采用传统的萋-尼氏抗酸染色法直接涂片镜检，该法因操作繁琐已逐渐被金胺O 荧光染色LED 镜检代替。多项研究显示，LED 荧光染色镜检的敏感性和特异性比传统镜检方法高[3]。但在临床工作中，检验工作人员发现金胺O 荧光染色LED 镜检结核分枝杆菌存在一定的假阳性，为了探讨该法的假阳性率及假阳性产生的原因，降低结核病诊断时的涂阳误诊率，收集金胺O 荧光染色LED 镜检阳性的痰液标本132份，进行结核分枝杆菌分离培养，检验假阳性率并分析原因，现将结果报告如下。1 资料与方法

1.1 一般资料 收集宁乡县疾病预防控制中心结核病实验室2015年1月1日—12月31日初诊金胺O 荧光染色LED 镜检阳性的痰标本132份，取样时均嘱患者清晨嗽口，然后从深部咳出2～3 ml 痰标本，置于无菌痰盒内送检。通过简单法培养得到129例培养阳性的标本。

1.2 仪器与试剂 LED 显微镜（宁波舜宇EX30），生物安全柜（Haier HR40-ⅡA2），电热恒温培养箱（上海HH.B11.600-BS-Ⅱ），Ⅱ型酸性罗氏培养管和金胺O 荧光染色试剂（均为珠海贝素生物技术有限公司生产，且都在有效期内使用）。

1.2.1 金胺O 荧光染色方法 操作方法按照《WS288-2008肺结核诊断标准》执行[4]。用竹签挑取痰样品约0.05~0.10 ml 于玻片上均匀涂抹成10 mm×20 mm 卵

圆形痰膜，厚薄适中，每份痰样品各涂片3张，待自然干燥后火焰法固定再染色。滴加金胺O 染色剂，染色10~15 min 水洗，加0.5%盐酸乙醇脱色剂1~3 min，脱

至无黄色后水洗，加高锰酸钾复染剂，染色1~2 min 水洗。晾干待检。

1.2.2 LED 镜检方法 先以10倍目镜、20倍物镜观

察，发现疑似抗酸菌的杆状荧光颗粒时用40倍物镜确认菌体形态，在暗色背景下，抗酸杆菌呈黄色或橙色荧光，稍弯曲有的有分枝。按下列标准报告检查结果：AFB 阴性（-）：镜检50个视野未发现抗酸杆菌者；AFB 阳性（报菌数）：1～9条/50视野；AFB 阳性（+）：10～99条/50视野；AFB 阳性（++）：1～9条/每视野；AFB 阳性（+++）：10～99条/每视野；AFB 阳性（++++）：≥100条/每视野。

1.2.3 分离培养方法 选取镜检阳性的痰标本，视标本性状加1~2倍体积的4%NaOH 溶液震荡混匀2~3 min，从加入NaOH 开始计时，室温放置15 min，用无菌滴管吸取消化处理后的标本0.1 ml 接种于两管酸性罗氏培养基斜面，并使标本与斜面充分接触，于37 ℃恒温培养箱培养，每周观察1次。按下列标准报告检查结果：培养阳性：结核分枝杆菌菌落一般于第2周开始生长，菌落微黄，干燥。培阳标本送湖南省结防院确认并做耐多药检测。培养阴性：至第8周无菌落生长。污染：培养基液化或其他杂菌生长。2 结 果

2.1 LED 显微镜检查结果 痰涂片金胺O 荧光染色后显微镜下观察到的结核分枝杆菌形态见图1，其中AFB 阳性（报菌数）13例，AFB 阳性（+）16例，AFB 阳性（++）35例，AFB 阳性（+++）46例，AFB 阳性（++++）22

例。

图1 金胺O 荧光染色LED 显微镜下AFB 阅片形态结果（×400）

注：A：AFB 阳性（+）；B：AFB 阳性（++）；C：AFB 阳性（+++）；D：AFB 阳性（++++）

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2.2 痰培养结果 132例镜检阳性的痰标本经简单法培养后得到129例阳性菌株，镜检假阳性率为2.3%（3/132）， 其中镜检AFB菌数阳性报告的假阳性2例，假阳性率为15.4%；镜检AFB阳性（+）报告的假阳性1例，假阳性率为6.3%；镜检AFB阳性（++）、AFB阳性（+++）、AFB阳性（++++）报告的假阳性均为0例，假阳性率均为0.0%。不同镜检培养结果见表1。

表1 不同镜检结果的痰标本培养情况[例（%）]

项目镜检阳性培养阳性培养阴性培养污染AFB阳性（报菌数）1311（84.6）2（15.4）0（0.0）AFB阳性（+）1615（93.8）1（6.3）0（0.0）AFB阳性（++）3535（100.0）0（0.0）0（0.0）AFB阳性（+++）4646（100.0）0（0.0）0（0.0）AFB阳性（++++）2222（100.0）0（0.0）0（0.0）合计132129（97.7）3（2.3）0（0.0） 注：小数部分和不为1为数值修约所致

3 讨 论

金胺O荧光染色LED镜检诊断结核感染花费低、实施性强，可广泛地常规使用[5]。但荧光染色在40倍物镜下镜检因为荧光素造成的假象，有的形态与抗酸杆菌形态十分相似，可产生假阳性，但有报道称其假阳性明显低于萋尼氏染色法[6]。上述实验中用金胺O荧光染色LED镜检阳性的132份标本做细菌培养进行验证，分离培养得到129株结核分枝杆菌，假阳性率为2.3%，镜检AFB菌数阳性报告的假阳性率为15.4%，镜检AFB阳性（+）报告的假阳性率为6.3%，镜检AFB阳性（++）、AFB阳性（+++）、AFB阳性（++++）报告的假阳性率均为0.0%，因此金胺O荧光染色镜检结核分枝杆菌确实存在一定的假阳性。假阳性病例多集中出现在镜检菌量较少的情况下，痰中的含菌量越少，假阳性发生率越大，据推测每毫升痰中所含的菌量低于5 000个时，痰涂片便很难查到结核分枝杆菌。涂片镜检的菌量较多时，容易找到在暗色背景下呈黄绿色或橙色荧光，形态稍弯曲或有分枝的典型结核分枝杆菌，相对来说假阳性报告率就低，而菌量很少的标本，检验人员在找遍50个甚至更多视野才发现几条可疑菌体时，在检出率本身就低的情况下一般不想轻易放弃成果，假阳性的报告也就时有发生，因此在LED荧光染色痰涂片镜检时，当视野可疑菌量较少时须特别注意其形态学甄别，最好结合临床及影像等其他辅助检查结果综合判断。虽然细菌分离培养的检测时间较长，不利于结核杆菌的快速检出，但金胺O荧光染色不能确定的可疑标本最好用细菌分离培养予以确认[7]。

形态学上假阳性的主要原因经推测为抗酸杆菌以外的染料残渣、食物残渣、毛发、纤维、细菌的芽孢、孢子、腐生寄生性抗酸菌等干扰，实际工作中常用的方法为痰标本采取法，痰液易被咽喉部寄殖菌及口腔物质污染，使痰涂片荧光染色镜检时出现假阳性，因此留痰时一定要叮嘱患者用清水漱口或刷牙后再用清水漱口，以减少口腔常存菌或杂物的污染。同时，标本受阳性标本的污染也可造成镜检假阳性[8]，如火焰固定含菌量较多的玻片时可能产生气溶胶，气溶胶中的结核分枝杆菌落入其他标本导致假阳性。阳性不仅有关疾病诊断，还能提示患者疾病的严重程度和传染程度，因此各种原因引起的假阳性会造成严重影响，故用金胺O荧光染色LED镜检结核分枝杆菌时一定要严守操作规程，避免假阳性的发生。

综上所述，虽然金胺O荧光染色LED镜检结核分枝杆菌的阳性检出率比传统萋尼染色高，但其存在一定的假阳性，但假阳性集中出现在菌量较少或污染的标本中，食物残渣等其他抗酸物质和标本交叉污染是产生假阳性的主要原因，检验工作人员使用该法镜检痰涂片时一定要加强质量控制，尽量降低假阳性的发生。

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收稿日期：2016-11-22 责任编辑：郭燕红　翟淑娜