基于核酸适体和胶体金技术构建凝血酶的DNA逻辑门

基于核酸适体和胶体金技术构建凝血酶的DNA逻辑门

摘要：DNA逻辑门在分子计算机和分子水平上的计算技术中具有重要作用。我们通过设计核酸适体与凝血酶特异结合导致胶体金团聚的方法，构建了凝血酶的DNA逻辑门。凝血酶作为输入信号与其核酸适体结合，将监测探针上的胶体金结合位点释放，两个核酸功能化修饰的胶体金同时结合到监测探针上，引起胶体金团聚，实现信号输出。根据这个设计原理，成功构建了蛋白质凝血酶的YES逻辑门。关键词：DNA逻辑门；凝血酶：胶体金：核酸适体

以核酸为基础的分子计算机或者分子水平上的信息处理有望代替传统的以硅作为原件的计算机技术，在生物医学领域具有重要意义[1-6]。这是因为核酸与以硅为基础的生物运算相比具有结构简单、能和其互补链杂交，以及能与目标分子f金属离子、小分子、蛋白质）相互作用的特点，在构建DNA计算机方面有巨大优势。设计并构建DNA逻辑门引起了国内外广大研究者的兴趣[7～13]。如：汪尔康院士利用核酸置换技术和G四聚体组装技术构建逻辑门，在体外模拟控制光敏剂PPIX的释放[8]；Song等采用两个DNA origami纳米结构构建用于microRNA检测的逻辑门[9]；Xu等利用连接酶形成环形DNA分子构建逻辑门[10]；Winner等构建了一个基于离子的DNAzyme逻辑门实现U022+的灵敏检测等等[11]。

在本文中，我们利用核酸适体和胶体金技术构建了一种新型的DNA逻辑门，用于蛋白质凝血酶分析。核酸适体是经体外筛选技术SELEX（指数富集配体系统进化）筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段。它是一系列单链核酸分子，与特异靶分子相结合，特异性如同抗体一样，对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。核酸适体在生物传感器、新药开发以及纳米技术等方面有着厂一泛的用途[14]。本文选用凝血酶蛋白质作为逻辑门的输入，利用凝血酶与其核酸适体特异结合，释放出监测探针上的胶体金结合位点，引起胶体金团聚，实现逻辑门信号输出，实现凝血酶分析。

1试验方法

1.1试剂与仪器

试剂：本文中所用寡核苷酸由大连宝生物公司合成。Nl：CTT CTT GGC AGT CCG TGG TAGGGC AGG TGG GGG TGA CT；N2：GCC AAG AAGGGG GAC TGC CAA GAA G：N3：SH - TTTT CT-TCTTGGC。Nl是凝血酶核酸适体序列；N2是监测探针序列；N3序列在5 7端修饰有巯基。HAu-Cl4、BSA、HSA、IgG，柠檬酸三钠购自上海生工生物有限公司，凝血酶购自北京鼎国生物有限公司，所用其他化学试剂均为分析纯。仪器：紫外可见分光光度计（UV 1750日本岛津）。

1.2 实验方法

1 .2.1 胶体金的制备

磁珠法分离纯化DNA原理及其步骤

磁珠法分离纯化DNA原理及其步骤 日期：2012-05-22 来源：互联网 标签：核酸纯化核酸分离磁珠法纯化DNA 摘要: 磁珠法纯化DNA主要是利用利息交换吸附材料吸附核酸，从而将核酸和蛋白质等其细胞中其他物质分离。本文主要概述了磁珠法纯化DNA原理、核酸分离与纯化的原则、核酸分离与纯化的步骤。 欢度大力神杯之夏，参与BRAND竞猜活动，获赠BRAND产品！ GeneCopoeia：qPCR mix免费试用体验活动开始！ 磁珠法纯化DNA主要是利用利息交换吸附材料吸附核酸，从而将核酸和蛋白质等其细胞中其他物质分离。本文主要概述了磁珠法纯化DNA原理、核酸分离与纯化的原则、核酸分离与纯化的步骤。 磁珠法纯化DNA原理 磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。硅磁(Magnetic Silica Particle)就是指磁珠微珠表面包裹一层硅材料，来吸附核酸，其纯化原理类型于玻璃奶的纯化方式。离心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一层可发生离心交换的材料(如DEAE，COOH)等，从而达到吸附核酸目的。不同性质的磁珠微珠所对应的纯化原理是不一致。使用磁珠法来纯化核酸的最大优点就是自动化。磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散，从而可彻底摆脱离心等所需的手工操作流程。Omega拥有全面的磁珠法核酸分离试剂盒，基于这种技术的试剂盒，名称前都有’Mag-Bind’。 核酸分离与纯化的原则 核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。在分离核酸时应遵循以下原则:保证核酸分子一级结构的完整性：排除其他分子污染。 核酸分离与纯化的步骤 大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。 1. 细胞裂解:核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来。细胞裂解可通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。 (1) 机械作用:包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些方法用机械力使细胞破碎,但机械力也可引起核酸链的断裂,因而不适用于高分子量长链核酸的分离。有报道超声裂解法提取的核酸片段长度从< 500bp ～> 20kb 之间,而颗粒匀浆法提取的核酸一般< 10kb。

第四章 核酸分离纯化

第四章核酸分离纯化 一、学习目标 掌握 DNA和RNA分离纯化的步骤、原则和常用方法。 熟悉常见临床分子生物学检验标本的种类、标本处理的一般原则。 二、重点和难点内容 （一）临床分子生物学检验标本的主要种类： 血液标本（全血、血清、血浆、外周血单个核细胞）、分泌物标本（鼻咽分泌物、生殖道分泌物、唾液、痰液、胃液等）、组织标本等。 （二）临床分子生物学检验标本的主要处理原则： （1）适时、适量采集标本。 （2）低温运送与保存。 （三）核酸分离纯化的步骤： （1）制备细胞及破碎细胞。 （2）消化蛋白质，去除与核酸结合的蛋白质、多糖及脂类等生物大分子。 （3）去除其它不需要的核酸分子。 （4）沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质。 （四）核酸分离纯化的原则：

（1）维持完整度（抑制DNA酶或RNA酶对DNA或RNA 的降解活性）。 （2）确保高纯度。 （五）分离纯化后的理想DNA样品应具备的条件： （1）不含对后续检测所用酶（如后续PCR检测所用酶：DNA聚合酶）的活性有抑制作用的有机溶剂和高浓度的金属离子。 （2）最大程度上避免蛋白质、多糖和脂类的污染。 （3）排除RNA分子的污染与干扰。 （六）核酸分离纯化的方法： （1）基因组DNA 的分离纯化 酚抽提法 吸附柱法（原理：基于高盐缓冲系统下，DNA与硅基质的可逆结合来分离纯化DNA） 磁珠法（原理：基于磁珠表面修饰的对DNA有吸附作用的官能基团，通过其与DNA的可逆结合、磁场对磁珠的作用来分离纯化DNA） （2）总RNA的分离纯化 Trizol (异硫氰酸胍&苯酚混合液)法 总RNA提取试剂盒(吸附柱法&磁珠法) （3）mRNA的分离纯化 寡聚(dT)-纤维素柱层析法

医学检验的进展与临床应用

医学检验的进展与临床应用 发表时间：2017-02-07T15:28:35.967Z 来源：《医药前沿》2017年1月第2期作者：辛颖 [导读] 临床医学检验发展需要合理的临床实践，按照医学询证辨析的发展标准要求。 （大庆市中医医院黑龙江大庆 163311） 【摘要】临床医学检验发展需要合理的临床实践，按照医学询证辨析的发展标准要求，准确的分析疗程行为的科学性价值，按照实际的前瞻预警措施标准，合理的分析适合实际可实施的技术标准依据。伴随着我国科学仪器使用方法水平的提升和拓展，医学检验临床的微生物需研究、血液免疫性研究出现多类型分支，逐步构成医学检验项目的技术发展特性，根据患者实际的临床治疗标准，合理的分析医学临床检验的发展进行，快速的完善医学家宴的临床应用效果。本文将针对医学检验时间的发展进度水平和进站空间进行合理的分析，充分研究医学检验发展进程和应用的临床表现。 【关键词】医学检验；发展进程；临床应用 【中图分类号】R19 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）02-0177-02 1.医学检验的综合发展进程 1.1 生物分析技术的应用 按照医学生物分析技术的应用标准，准确的分析适合医学检验的技术方式，从医学检验中逐步分析到细胞可以发展到分子阶段，将生物分子进行临床医学性检验判断，对患者的疾病进行基因水平的深入分析，以基因为单位进行诊断，明确实际核酸分析技术标准，制定准确的聚合酶链接物质，以多态形式进行基因技术的分析，构成单链多像分析技术，以荧光杂交染色方式进行分析，以波普核酸形式进行分析，以蛋白质组进行技术分析，实现生物分析技术的应用和发展。 1.2 生物芯片 利用生物芯片基因技术的概念，是通过生物芯片，微阵列，蛋白分析、DNA分析芯片进行基因组成。使用基因芯片集成原位合成技术，实现高分子合成技术。利用生物芯片的精密控制层，完善激光的聚焦显微技术，实现固定高密度的合成效果，通过分析的有效杂交信号处理，实现对加测数据实时分析的可持续发展水平。 1.3 流式细胞的应用 流失细胞与普通细胞又一定的不同，需要根据实际新报的计量数量进行区分，明确实际的检测细胞群类。按照临床检验的技术标准对FCM周围的免疫学血液病理状态进行分析，改变传统免疫学技术的难题和不足，应用外周血T淋巴细胞的检测分析，对器官移植技术的排异反应进行准确的检测分析，使用肺泡灌洗的方式对T淋巴细胞进行亚群检测，快速的判断实际细胞的表面抗原效果，为多肺部疾病的有效诊断进行合理的分析，为发病机制水平提供良好的检测标准。FCM检测是以T新报的总数、TH细胞的量进行准确的分析，明确实际结果报告的准确形式，按照血液表面的细胞类型进行区分，改变传统免疫英冠检验的过程，以人为干扰素的形式，记录细胞的数量，是否存在误差，从而提升细胞检测的精准性。FCM还可以是淋巴免疫性分型，可以对白血病的新报、骨髓移植细胞进行检测。通过使用FCM检测，确定活化血小板免疫检测的技术发展前景，逐步完善细胞免疫的技术发展水平。 1.4 光免疫技术 光学免疫技术的应用主要是以甲状腺技术的免疫测定为主，通过生殖细胞分泌激素的检测，确定心肌蛋白的检测过程，明确实际贫血指标的检测标准，以该技术标准，对实际的灵敏程度进行提升，不断提升检测速度水平，却把检测操作的合理性。按照实际试剂对人体的优点水平，是否存在非放射性免疫问题，明确实际发光免疫技术的研究方法。 1.5 现场随机检验的方式 根据医学急诊急救的需求，往往在急诊科需要对危重病人进行快速纠正，提升现场检验的技术科学水平，有效的完善实际现场快速检验额过程是极其重要的。根据医学检验的标准，使用生物制剂，提升现场快速检验的新生速度和检验质量，确保下场简阳随机效果的准确性。 1.6 细胞耐药性的检验 细胞耐药性检验是受抗生素的应用，临床上的病原菌受抗生素的耐药性影响越来越严重，逐步出现多累广谱抗耐药菌药物。为了有效的完善实际抗生物的敏感效果，需要采用合理的医疗技术，节约医疗成本的同时，提升临床医学微生物的辨析，提升分离检验的感染标准水平，不断完善实际药物敏感实验的处理过程，确保临床医学检验抗生素的合理依据效果。 1.7 散射性比浊分析 根据实际散射比浊分析方法，对血浆、血液的蛋白系列进行特定的检测，分析免疫蛋白、补体系列，急性蛋白，尿微量蛋白的分子药性水平。这些蛋白的实际检测标准，徐亚根据实际临床提供的基础性效果进行病理化分析，明确实际生物标准理论测试水平，以准确的临床诊断标准进行分析，判断临床医学检验和分析的预期效果。 2.医学临床的检测应用方法 临床医学生物检测数据分析中，需要对实际的疾病发展装填原因和发展机制进行判断，分析动脉粥样硬化、代谢病变水平，对实际的发病机制构造合理的治疗标准，对实际的诊断特异性病理水平进行分析，明确实际肌红蛋白对判断临床心肌梗死的依据，为某些患者的及早诊断制定有效的筛选实验。在实际的测定血液甲状腺素过程中，需要以新生儿的先天甲状腺机能水平进行检测分析，明确检验病情转化缓解的过程，如果利用肝功能检验对肝脏实际的疾病水平进行诊断分析，明确实际药物治疗的效果和安全性，采用有效辅助评价分析治疗效果，对实际检测血中存在的抗癌病原体进行治疗，确保临床检验的医学检测标准水平，逐步降低实际缺陷病症的发病率。微生物临床医学检验是综合临床医学、免疫学、病原学、生物学等多个方面的技能，综合实际感染疾病的快速发展水平，准确的分析适合诊断的技术标准，密切的分析综合临床检验的技术治疗方案，提升对微生物耐药性或感染问题的技术处理水平。 3.结语 综上所述，医学临床检验是重要而不可取消的，临床治疗中应用医学林传谷歌检验可以准确的判断患者的致病因子，明确患者的致病水平和活性变化发展程度，这对于临床医学诊断和治疗具有重要的辅助判断作用。临床医学检验过程中，需要结合实际的诊断分析鉴别方

胶体金的相关知识

免疫层析试纸包被技术简介 试纸生产 过程中一般有三种 溶液的包被处理，即 质控溶液，检测溶 液，和结合物溶液 （胶体金）。质控和 检测溶液就是C/T 线上包被的溶液。 在免疫层 析试纸硝酸纤维素 膜表面进行 C/T线的包被，是试纸生产制作的关键环节之一。免疫诊断试剂中使用的硝酸纤维素膜有两类，一种是免疫渗滤产品用的，按孔径选择一般采用0.45um-1.2um的膜，与分子生物学中用的印迹转移膜一样。Whatman Schleicher & Schuell的膜属于纯采用100%的纯硝酸纤维素，蛋白结合能力较高。另一类即免疫层析用膜，一般按侧向流动速度来划分，常用的范围一般在120-180秒/4cm。目前市场上的硝酸 纤维素膜材以带塑料底衬 为主，也有部分的膜不带 底衬。不带底衬的膜需注 意膜面的正反面，其光滑 度有适当差别。 鉴于流动封闭技 术的普及，C/T线的包被 目前流行先将膜粘贴在塑 料支持底板上，然后直接 将塑料板放入仪器上进行 划线操作，干燥后进行其 他部分的贴板组装，这种 划膜工艺可简称为划板。 但部分产品的工艺要求先直接在膜上划好C/T线，然后用特定配方的溶液将膜进行浸泡封闭处理，干燥后再贴膜及其他部分材料，这种划膜工艺可简称为划膜。 在结合物溶液（胶体金）的包被上，较多的用户倾向于用气动喷头进行定量操作。在科研及研发项目中，往往喷一条线或几条线就够用了，因此在单维往复平台上一次喷一条线也可接受。鉴于胶体金膜切条宽度一般在 3--7mm，不方便一条条依次地在移动平台上固定和取放。因此在批量生产过程中，一般建议采用成片的胶体金垫，用三维平台往复来回地间隔喷线，一次即可喷出二三十条。此后将喷好的金干燥再裁切成条，这样的操作会效率高，适合规模生产。 在某些免疫层析试纸产品生产工艺中，层析膜材或样品垫膜材需要用特定溶液进行整平面包被，要求效果均匀，如层析膜和样品垫的特定封闭处理。

胶体金技术

胶体金技术 问：检测cle ，金标记抗体扩大后，烘干后检测各项指标良好，但室温保存一天后，T 线下降很多是由什么原 因造成的？室内开除湿机，组装好的板子，在自封袋里加干燥剂。我烘干用了一整天，30 多个小时了，还有方法进行改进吗，这个抗体还能用来生产吗？经检测还是金子出了问题，我就是先少量做，找出各个值，然后才扩大的。我就是先3ml ，再10ml 。 T ：（涛哥）那可能是生产放大过程控制的问题。重新试验，先小试，逐步放大。这就不行了啊，这还算不上生产扩大呢，怀疑误操作，重复试验试试，3ml 的、10ml 的都做一下。 0 是啊，有时标记完检测后，T 线就下降（比预实验） T :标记完检测就下降，说明你标记本身就有问题呗。你标记条件太脆弱，主要考虑你标记条件，重新优化下。 0 如果我再调整pH 值，抗体浓度，灵敏度就会达不到了 T：通过其他途径提高灵敏度。 问：请问为什么C 线包被3mg/ml 不出现条带，而2mg/ml 的就有条带出现呢？ T：正常，从蛋白固定基本原理出发，好好想想。NC 结合蛋白的能力是有限的，其结合位点是会饱和的，假 设其结合能力仅仅为2mg ，你包被3mg ，那边必然有相当一部分是结合不牢固或者压根就没固定住的，样本层析之后，金标蛋白结合了这些不牢固的蛋白，就会流走，不会显色。检测线，也会有同样的情况，不过检测线包被过量的影响不止这么简单。我主要指夹心法。 0 一般调整膜上浓度时在湿法时调整还是干法时调整啊？ 问：标记好的胶体金有沉淀是什么原因？ T：常见的原因：标记条件不合适，封闭物质不纯，复溶液不合适都有可能，当然颗粒大了，也容易沉淀。 0 你们主要用什么方法摸索最佳PH 值？ 1.用碳酸钾用量调整，搞一排，然后看变色和离心后现象，还有检测结果啊。 0 这样岂不是需要很多抗体？呵呵 2.标记又用不了多少抗体，又不是包膜。 0 离心后现象，怎么样的是理想的？ 3.就是没有预期想要的略微蓬松有红色的沉淀，比如贴壁、黑点、离不干净等，离心速度时间也要选好。 0 是啊，之前就发现有点贴壁和黑点，我延长了离心时间也没用。 4.小号金子1ml 离心几分钟就够了。越大速度越低时间，这个速度和时间折中下自己调整。 问：不知道那些强假阳性有什么办法可以抑制？ T：你加阻断剂试过没？ 0试过几种，没有效果，能阻断C线，对T线基本没阻断。 T：照这么说的话既然是同一对抗体而且胶体金法临床假阳性率这么高，我觉得你这对抗体可能对某种因素太敏感了吧，ELISA 是共价标记胶体金是物理标记是会有差异。（涛） 0 现在就是找不到原因，那强阳漏检呢？其实也有试过好几个抗体配对，基本都是那样的结果 问：请教一下各位大虾，多抗标记的时候要注意哪些细节呢？ T：尽量别标记多抗，实在是想标记多抗，把标记PH 提高点。 问：划线时的湿度条件是NC膜制备的要点之一，湿度应控制在45 %?65%，有文献支持吗？ T：文献呢是有滴，不过NC 供应商也会给你建议滴，你自己也是可以探索滴，最终都是要以产业化需要为准。 1.主要膜吸收蛋白的时候要是湿度太低会比较疏水，不利于吸收，一般在40% 以上，膜在点之前在这个环境

几种胶体金技术详解

胶体金免疫分析技术详解 随着免疫分析日益广泛应用于以临床为主以及非临床领域的诊断工业，免疫分析正在向两个方向发展：一类为全自动化的免疫分析；另一类为以硝酸纤维膜为载体的快速免疫分析。前者需要价格昂贵的全自动仪器及与仪器严格配套的各种试剂盒，目前只能在医疗及检测中心应用，虽也能较快速给出结果，但仍需一定时间，不适合远离医疗及检测中心的地区，更不能用于“患者床旁检验”和普查的需要，在酶免疫分析的基础上，主要以硝酸纤维素膜为载体的快速诊断方法迅速和广泛地发展起来。这类方法目前在文献及市场上的命名还很不统一。它实际上属于快速斑点免疫结合分析，主要有以下两种方法：斑点免疫渗滤分析DIFA和斑点免疫层析分析DICA。本篇主要介绍以金作为标志物的胶体金免疫分析技术。 金标记免疫分析技术也称免疫胶体金技术，是于1971年建立的一种信号显示技术。此技术最初用于免疫电镜检查，由胶体金颗粒标记抗原或抗体，与组织或细胞中相应的抗体或抗原相结合，在电子显微镜的检查时可起特异的示踪作用。此后，此技术与银染技术相结合建立的免疫金银染色法，使抗原抗体特异反应信号可在光学显微镜下观察。近10多年来，利用硝酸纤维素膜（NC）等为固相载体，以胶体金标记的抗原或抗体与特异配体的反应在膜上进行，建立了快速的金标记免疫渗滤技术和金标记免疫层析技术，并在传染病、心血管病、风湿病、自身免疫病的免疫学检测中广泛应用。 胶体金是指金微小粒子（0-100nm）分散在另一种物质中所形成的体系，通常指金以微小粒子分散在溶液中所形成的金溶胶，用此金溶胶标记蛋白质（抗原、抗体或SPA、SPG），胶体金颗粒具有高电子密度的特性，故在金标蛋白的抗原抗体结合处，显微镜下可见黑褐色颗粒；当这些标记物在相应的标记处大量聚集时，可在载体膜上呈现红色或粉红色斑点，从而用于抗原或抗体物质的半定量或定性。 与ELISA不同之处便是反应时间大大缩短，仅需要数分钟就完成了ELISA需数小时才能显示的结果。因为在GIFA和GICA中，高浓度的抗体集中固定在纤维素的微孔中，待测抗原在渗滤或层析时，流经微孔与固定的高浓度抗体紧密接触，很快完成免疫结合反应。这就是以膜为基础的胶体金快速免疫结合分析中的免疫浓缩作用。在ELISA中，待测抗原要在液相中经过扩散作用，逐渐与吸附在固相表面的抗体结合。同时，标记抗体也需要同样的扩散结合过程形成抗体-抗原-标记抗体复合物，故需时间较长。故此技术做到了名副其实的POCT。 原理： 将氯金酸（HAuCl4）用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒（胶体金），标记金黄色葡萄球菌A

【免费下载】核酸的提取与纯化

核酸的提取与纯化 一 DNA的提取与纯化 （一）实验目的与主要原理 DNA存在于细胞核中。通过裂解组织与细胞，使细胞膜破碎， 暴露出DNA与蛋白质的混合物。此时，通过蛋白酶的消化，使 DNA与蛋白质进行分离，而后利用硅胶柱或者酚：氯仿法，去 除蛋白质，从而提取高纯度DNA。 （二）实验材料 蛋白质K（20mg/ml）,裂解液（100mmol/l Tris(pH 8.0), 500mmol/L EDTA(pH 8.0),20mmol/l NaCl,10% SDS）,硅胶柱，TE（10mmol/l Tris-HCl,1mmol/L EDTA(pH 8.0),0.5*TAE (20mmol/l Tris-乙酸，0.5mmol/l EDTA,pH 8.0),10*Loading buffer(50mmol/l EDTA,60%甘油，0.25%溴酚蓝，pH 7.0)。 （三）实验方法 DNA提取的方法目前主要有两种，一种是利用酚：氯仿抽 提的方法，另一种是利用硅胶柱吸附的方法。其中酚：氯仿抽提法 由于试剂具有较强的腐蚀性和毒性，且对环境污染较大,目前使用者较少。而硅胶柱的方法操作比较简单，且毒性很低，对环境的影响 较少，故而被广大实验者所使用。目前硅胶柱的生产厂家较多，以 沉淀方法较为多见，主要步骤如下。 1 样本前处理 哺乳动物细胞：提前准备55℃冰浴。

（1）对于贴壁细胞，用胰蛋白酶或其他方法收集细胞，对于悬浮细胞，直接收集细胞。用PBS洗3次。 （2）加入3倍体积的裂解液，加入蛋白液K终浓度达到 500ug/ml，37℃孵育4~6小时。 动物组织：提前准备55℃，70℃水浴。 （1）将25mg动物组织切碎，置于一无菌的1.5ml离心管中（注意，尽量越碎越好）。 （2）加入150~200ul的裂解液（含500ug/ml的蛋白酶K），55℃孵育直至完全裂解，（因组织不同而异，鼠尾6~8h, 可以过夜裂解，每小时颠倒2~3次）。 （3）如果需要去除RNA，可以加入适量Rnase A于样品中，室温孵育2min。 （4）12000r离心5min，转移上清于一无菌的离心管。 2 DNA提取过程 （1）利用2倍体积无水乙醇和1/10体积的3mmol/L醋酸钠沉淀DNA（注意沉淀为DNA，不能弃去） （2）将上述混合物加入硅胶柱中，12000r离心1min，后用75%的乙醇清洗杂质，洗2~3次。 （3）将硅胶吸附柱置于干净的离心管中，在柱的中央加入200ul预热TE（60℃），或去离子水（pH）7.0），室温静 置1min，12000r离心1min，洗脱ＤＮＡ。洗脱出的 ＤＮＡ置于－２０℃保存。

临床抗生素应用调查分析

临床抗生素应用调查分析 发表时间：2018-05-07T14:38:52.203Z 来源：《医师在线》2018年2月上第3期作者：杜峰 [导读] 但是抗生素滥用的现象在临床上也相当常见,滥用不仅给治疗带来困难,同时还造成巨大的资源浪费,加重社会和个人的医药负担,危害极大。 浙江省兰溪市人民医院药剂科（321100） [摘要]目的：调查分析抗生素临床应用存在的不合理性，探讨合理的应用方法。方法：回顾分析586例住院患者使用抗生素的种类，毒副作用以及注意问题等。结果：规范临床抗生素的合理应用，可以降低医疗费，减少药物不良反应。结论：要重视病原学、进一步掌握联合用药的指证，坚持合理、安全、有效的使用抗生素。 [关键词]抗生素应用；调查分析；对策与措施 引言 抗生素是目前临床上应用最广、发展最快、产品最多的药物之一。高效、广谱、低毒的新型抗生素不断出现,为临床用药提供了较大的选择余地。但是抗生素滥用的现象在临床上也相当常见,滥用不仅给治疗带来困难,同时还造成巨大的资源浪费,加重社会和个人的医药负担,危害极大。该院对门诊的处方实行限价管理,根据门诊不同科室、不同病种的用药情况,规定每张处方用药金额不得超过标准,对超过标准的处方实行经济处罚,为了调查实行处方限价的执行情况,我们对2017年4月至2017年12月的门诊处方进行了抽查。 1资料与方法 1.1一般资料 本次调查选取我市人民医院2017年4月至2017年12月份全院住院患者共586例作为调查对象，凡在调查日正使用抗生素者均列入调查范围，包括调查日新使用抗生素者至调查日尚在使用者。 1.2方法 分别统计患者姓名、性别、年龄、住院时间、原患疾病、手术类型和愈合情况、抗生素使用情况和不良反应等。 1.3抗生素用药合理性判断标准[1] 合理:绝对适应证，细菌对药物敏感，剂量、给药方法正确，疗程3～7d，预防用药术前1h，术后3d。基本合理:相对适应证，细菌对药物敏感或中度敏感，剂量、给药方法正确，疗程2～10d，预防用药为当天至术后7d。不合理:无适应证，细菌对药物不敏感，剂量、给药方法不妥，有不合理性配伍，疗程＜1d或＞10d，预防用药术前＞1d或术后＞7d。 2结果 2.1抗生素使用率 在参与调查的586例患者中，使用抗生素的有345例，占所有患者的58.87%。其中儿科的使用率最高，达82.05%；内科的使用率最低，为36.10%。用于预防218例，占63.19%；治疗用药127例,占36.81%。 2.2抗生素应用种类 全院共使用的抗生素有34种，分属10类，涉及359例。在各品种中，使用前10位的抗生素依次为：头孢拉啶、青霉素、头孢噻肟钠、妥布霉素、头孢三嗪、克林霉素、氨苄西林、丁胺卡那霉素、羟氨苄青霉素与氧氟沙星。 2.3联合用药及给药途径 在联合用药方面，3种及3种以上联用为18.35%，2种联用34.29%，单一种抗菌药占47.36%。而在给药途径方面，主要是静脉给药，占59.37%，口服给药占21.43%，肌注相对较少，占19.20%。联合用药的方式多为头孢拉啶复合丁胺卡那霉素，头孢噻肟钠复合妥布霉素。 2.4手术与非手术科室的抗生素使用 抗生素在手术科室的使用率为74.03%，在其他非手术科室（如：皮肤科、中西医结合科、风湿免疫科、内分泌代谢科等）的使用率为36.36%。在手术科室中，接受手术者的抗生素使用率为72.43%，其中I类切口患者的抗生素使用率为67.86%，II类切口使用率为95.00%，III类切口使用率为94.12%；而非手术患者抗生素使用率为62.70%。 2.5细菌培养与药敏试验 在接受抗生素治疗的345例中，有88例送细菌培养，比率仅占25.51%，提示仅有8.86%。并未根据病原菌与药敏试验结果选择使用抗生素。 3讨论 本次临床抗生素应用调查表明：抗菌药物主要为治疗性用药。从58.87%的住院患者使用抗生素来看，说明抗生素的使用率维持在正常范围内。 在345例使用抗生素的病人中，有148例联合用药，联合用药使用率为42.90%，联合用药率不高，但联合用药中仍存在不掌握联用指征或联用不当的情况，如头孢拉啶复合头孢哌酮或者青霉素复合氨苄青霉素等。一般认为，临床多数细菌感染可用一种抗生素控制。虽然控制重症感染时联合应用抗生素效果会更明显些，但必须严格适应症和合理配合，若联用不当或不掌握联用指征，非但达不到控制感染的效果，反而会产生严重的不良反应[2]。 调查结果显示，外科手术抗生素使用率为72.43%，且I、II类切口抗生素使用率分别高达67.86%、95.00%，这些数据表明抗生素使用存在不合理应用的情况。 抗生素的使用中，仅有8.86%会根据细菌磁头与药敏试验结果来选择用药，其余均为经验用药。而确立病原是合理选用抗菌药物的先决条件。本调查表明，临床医生对病原学不够重视，标本送检率仅有25.51%，许多医生选用抗菌药物只凭经验，在临床治疗效果不佳时，又盲目更换抗生素以致耐药株产生。总之，为有效控制感染，做到合理使用抗生素的常态化，除坚持用药原则，还应从以下3点加强管理：①加强领导：将合理使用抗生素纳入医院质量管理项目，制定措施可依据职称、资格并结合医师技术能力，经考核后，该院将执业医师技术能力经考核后，该院将执业医师分别聘为一级、二级、三级：一级及以上医师授予非限制使用抗菌药物处方权，二级以上医师授予限制使用级抗菌药物处方权，三级医师授予特殊使用级抗菌药物处方权；②该院增设抗菌药物分级管理系统，医生在工作站下达医嘱时，系统

免疫胶体金技术常见影响因素分析

免疫胶体金技术常见影响因素分析 自胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。免疫胶体金技术的反应过程就是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响与制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。 1耗材的选择 1、1不同型号膜的筛选。硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物与表面活性剂的来源、类型与数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响——膜的孔径与分布结构不同。膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但就是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就就是假阳性越高。用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小与分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标记物在膜上的流动速率为最佳。 1、2结合垫的选择。结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物与待检测样品,而不被吸附;玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。 1、3样品垫及吸水纸的选择。样品垫与吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫与吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸与样品垫。吸水纸则要有很好的蓄水能力,保证样品中所用的液体都经过膜的反应区而被样品垫吸收与蓄积。 2关于胶体金的制备 制备颗粒均匀、分散度好的胶体金在金标免疫快速试验中非常关键,如果金颗粒直径的变异范围太大就会影响到试验的稳定性与重复性,如果金颗粒的形状不规则或粒径不均一,使得胶体金标记物容易解离与沉淀而产生金标扩散不完全、反应区底色过深与假阳性现象;而且胶体金质量不好,胶体金结合物就不能快速而完整的从玻璃纤维上解离,从而影响试验结果。

核酸提取经验整理

一、核酸 核苷酸单体聚合而成的生物大分子，是生物细胞最基本和最重要的成分。一般认为，生物进化即始于核酸，因为在所有生命物质中只有核酸能够自我复制。今天已知核酸是生物遗传信息的贮藏所和传递者。一种生物的蓝图就编码在其核酸分子中。核酸是1869年米歇尔(F.Miescher)在脓液的白细胞中发现的。他当时称之为核素。阿尔特曼(R.Altmann)于1889年认识其酸性后，定名为核酸。 二、核酸的分类和功能 核酸分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两大类。这两类核酸有某些共同的结构特点，但生物功能不同。 DNA贮存遗传信息，在细胞分裂过程中复制，使每个子细胞接受与母细胞结构和信息含量相同的DNA；RNA主要在蛋白质合成中起作用，负责将DNA的遗传信息转变成特定蛋白质的氨基酸序列。 核酸的基本结构单元是核苷酸，核苷酸含有含氮碱基、戊糖和磷酸3种组分。碱基与戊糖构成核苷，核苷的磷酸酯为核苷酸。DNA和RNA中的戊糖不同，RNA中的戊糖是D-核糖；DNA不含核糖而含D-2-脱氧核糖(核糖中2位碳原子上的羟基为氢所取代)。核酸就是根据其中戊糖种类来分类的，DNA和RNA的碱基也有所不同。 三、核酸的理化性质 RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离核酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L，DNA钠盐在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离DNA。 四、细胞裂解： （一）裂解原理在核酸提取过程中，细胞裂解是非常重要的。 经典的裂解液几乎都含有去污剂 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和 盐 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境 (如 Tris)，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏 (如 EDTA)、维持核酸结构的稳 定 (如 NaCl) 等。去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶，利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等) 裂解的，该方法已经成为 了 RNA 抽提的主流，却不是基因组 DNA 抽提的主流。

尼克地尔在临床应用的分析

尼克地尔在临床应用的分析 发表时间：2015-03-25T16:11:14.907Z 来源：《医药前沿》2014年第31期供稿作者：房晓莉 [导读] 综上认为，尼可地尔用于临床治疗冠心病和心绞痛的效果显著，可以有效提高患者的治疗有效率，降低不良反应的发生率，值得临床推广。 房晓莉 （安徽省第二人民医院安徽合肥 230011） 【摘要】目的探讨尼可地尔在临床应用的分析。方法选取2013年7月到2014年11月我院心脑血管科室收治的87例冠心病和心绞痛患者，按照入院的先后顺序分为两组，观察组47例采用尼可地尔药物，对照组40例采用常规药物，观察两组患者的临床治疗效果。结果观察组患者的治疗总有效率、不良反应的发生率明显优于对照组，差异显著，有统计学意义（P<0.05）。结论尼可地尔用于临床治疗冠心病和心绞痛的效果显著，可以有效提高患者的治疗有效率，降低不良反应的发生率，值得临床推广。 【关键词】尼可地尔冠心病心绞痛临床应用 【中图分类号】R969 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）31-0172-02 尼可地尔是一种硝酸酯类化合物，是由2-羟乙基烟酰胺维生素和有机硝酸酯的部分结构连接而成的化合物，主要作用于平滑肌的钾通道开放剂，可解除冠脉痉挛，增加冠脉血流量[1]。本文选取2013年7月到2014年11月我院心脑血管科室收治的87例冠心病和心绞痛患者，按照入院的先后顺序分为两组，观察组采用尼可地尔药物，对照组采用常规药物，观察两组患者的临床应用情况，现报告如下。 1 资料和方法 1.1 一般资料 选取2013年7月到2014年11月我院心脑血管科室收治的87例冠心病和心绞痛患者，按照入院的先后顺序分为两组，观察组和对照组，观察组47例，其中男性27例，女性20例，年龄范围：42-79岁，平均年龄：（55.67±6.24）岁；疾病类型：心脏病21例，心绞痛26例。对照组40例，其中男性19例，女性21例，年龄范围：45-76岁，平均年龄：（56.18±6.72）岁；疾病类型：心脏病15例，心绞痛25例。比较两组患者的年龄、性别、疾病类型等基本资料，差异较小，无统计学意义（P>0.05），具有可比性。 1.2 方法 两组患者入院后进行常规检查，24h监测动态心电图情况。在此基础上，观察组采用尼可地尔药物，5mg/次，3次/d；对照组采用常规药物，主要包括阿司匹林、氯匹格雷、硝酸酯类等，按照医生指定的服用方法按时服药。1个月为一个疗程，共治疗2个疗程，观察两组患者的治疗效果及不良反应的发生率。 1.3 统计学分析 对本文所得实验数据均采用SPSS 17.0统计学软件进行检验，所得计量资料采用t检验，所得计数资料采用χ?检验，以P<0.05为有统计学意义。 1.4疗效评价标准 显效：经过治疗后，患者的临床症状明显改善，心肌缺血情况明显好转，心绞痛的发作时间和持续时间缩短，心电图显示心脏基本恢复正常。有效：经过治疗后，患者的临床症状有改善，心肌缺血情况好转，心电图显示心脏部分恢复正常。无效：患者的临床症状未见改善，心电图显示与治疗前无差别。 2 结果 2.1比较两组患者的治疗有效性治疗后，47例观察组患者的治疗总有效率为95.7%；40例对照组患者的治疗总有效率为87.5%；观察组患者的治疗总有效率明显高于对照组，差异显著，有统计学意义（P<0.05），见表1。 表1 比较两组患者的治疗有效性（x-±s） 2.2比较两组患者不良反应的发生率 47例观察组患者出现2例不良反应，其中恶心1例，头痛1例，不良反应的发生率4.3%；40例对照组患者出现6例不良反应，其中恶心2例，头痛3例，心悸1例，不良反应的发生率15%；观察组患者不良反应的发生率明显低于对照组，差异显著，有统计学意义（P<0.05）。 3 讨论 本文选取2013年7月到2014年11月我院心脑血管科室收治的87例冠心病和心绞痛患者，按照入院的先后顺序分为两组，观察组采用尼可地尔药物，对照组采用常规药物，观察两组患者的临床应用情况。尼可地尔不仅能够促进机体血钙、扩张冠状动脉，还可以对纤溶功能进行一定程度的增强，降低冠状动脉血栓，减少急性冠脉综合征的发生率[2]。本文通过对比试验发现，尼可地尔组的治疗总有效率为95.7%，不良反应的发生率4.3%；常规药物组的治疗总有效率为87.5%，不良反应的发生率15%；尼可地尔组的治疗总有效率和不良反应的发生率明显优于常规药物组，因此，尼可地尔是治疗冠心病、心绞痛的良药，并且口服后30min内血药浓度就达到峰值，还不影响血压、心率及传导，非常适用于冠心病和各类心绞痛疾病，拥有很高的临床治疗效果。 综上认为，尼可地尔用于临床治疗冠心病和心绞痛的效果显著，可以有效提高患者的治疗有效率，降低不良反应的发生率，值得临床推广。 参考文献 [1] 李悦玮,孙景辉,张文琪,张科强.尼克地尔后处理对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用[J].临床儿科杂志,2013,02:182-185. [2] 郭道安.尼可地尔在治疗120例稳定性心绞痛中的临床疗效分析[J].中国现代药物应用.2014,16:121-122.

胶体金免疫技术在食品检测中的应用

胶体金免疫技术在食品检测中的应用 摘要：胶体金免疫技术（GICA）是免疫技术中的重要组成部分，是一种具有广阔发展前景的快速便捷的新技术。结合GICA技术的原理，着重探讨GICA技术在食品检测中的应用，为食品质量安全的监控提供理论依据。 关键字：胶体金免疫残留 The application of immune colloidal gold technique in food detection Abstract:Immune colloidal gold technique (GICA) is an important part of immune technique, It has a broad prospects for development of new technology in food detection .Combined with the principle of GICA, the author discussed application of GICA in food detection, which provides the theoretical basis of food quality and safety. Key words:colloidal gold immunoassay residue 正文：胶体金免疫技术是固相免疫标记技术，它是伴随着荧光标记、同位素标记以及酶标记等盛行起来的一种技术。胶体金免疫法作为一种新型快速的检测手段，具有灵敏度高、特异性强、快速简便、无污染等优点，被广泛应用在农副产品及环境卫生的检测中。 1 原理 胶体金免疫技术(gold immunoassay，GICA)是将金标记法与层析法相结合的一种免疫形式原理为:将具有特异性的蛋白固定在层析带上，样品溶液通过毛细管层析作用在层析带上泳动，层析带上待测物的受体与样品中的待测物发生高特异性和高亲和性的反应，最终检测带上富集了相应复合物，通过酶促显色或直接目测着色标记物几分钟内即可观测到结果[1]。 与酶联免疫相比，基于实验者肉眼可观测到的颜色结果，且不需要大型仪器及特殊试剂，操作简单，短时间即可得到结果并保留。胶体金颗粒在放射性物质的比较，金颗粒具有一定使用优势[2]。该方法简单、快速。不同的抗原可能是共轭对不同大小的金颗粒，因此逐一确认。在一定条件下定位精确、定量分析是可能的，由于金颗粒清晰可辨因此与其他结构或内源性物质可避免混乱。 2 制备 通过加入某些特定还原剂（如抗坏血酸、白磷、柠檬酸三钠等)，使氯金酸(HAuCl4)能够利用聚合反应聚合成一定大小的金颗粒，它们是带有负电的疏水性胶溶液，在静电力作用下其胶体状态不易破坏，该制备方法为化学还原法[3]。在制备过程中，加入还原剂的种类和浓度直接影响胶体金颗粒的大小，相关研究表明，欲制得直径较小的金颗粒，试验应选择还原能力较强的还原剂[4]。电子显微镜及光谱法能够准确地测定其含量，对其纯度能够较好地分析[5]。

医疗技术临床应用情况调查报告

医疗技术临床应用情况调查报告 1

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镇卫医便[ ] 号 关于开展医疗机构手术分级管理及第二、三类 医疗技术临床应用情况调查的函 各辖市(区)卫生局、新区社发局、各有关医疗机构: 为加强我市各级各类医疗机构手术分级管理和第二、三类医疗技术临床应用管理,确保医疗质量和安全,根据卫生部<医疗技术临床应用管理办法>和<江苏省手术分级管理规范( )>,决定对我市各级各类医疗机构手术分级管理及医疗技术临床应用情况进行摸底调查,为我市制定<镇江市手术分级管理实施细则>提供依据。请各辖市(区)卫生局、新区社发局和各有关医疗机构根据<江苏省手术分级目录( )>(见省厅网站)及当前已公布的第二、三类医疗技术目录(见附件),按照下面附表要求认真组织填写,于5月25日前报市卫生局医政处。各辖市(区)一级医疗机构填报后由属地卫生局统一填写汇总表。 联系人:严金二,联系电话:88912856,。 二○一一年五月十六日附件: 江苏省卫生厅公布的第二类医疗技术目录 第一批: - 3 -

1、下颌角、下颌骨各型截骨术; 2、游离皮瓣移植技术; 3、人工肝支持系统; 4、各型脊柱侧凸以及后突畸形的矫形手术; 5、人工椎体植入手术; 6、抽搐性电休克治疗; 7、无抽搐性电休克治疗; 8、经皮穿刺脑血管腔内成形及支架植入术; 9、自体造血干细胞移植; 10、口腔颌面部软组织缺损游离瓣移植修复术; 11、口腔颌面部骨缺损游离骨瓣移植修复术; 12、纤维支气管镜诊疗技术; 13、全身麻醉技术; 14、神经阻滞治疗技术; 15、经食道超声心动图监视技术; 16、体外循环技术。 第二批: 1、内镜逆行胰胆管造影诊疗技术; 2、冠心病介入诊疗技术; 3、先天性心脏病介入诊疗技术; 4、心脏导管消融技术; - 4 -

胶体金的制备及应用11

免疫胶体金的制备及应用 蓝巧玉 08材料科学与工程，海南大学，570228 摘要： 关键词： 1 前言 胶体金（Colloidal gold）是一种疏水胶溶液，也称金溶胶（Coldsol）,因其纳米尺寸所具有的独特性质常作为免疫胶体金标记。自1971年，Faulk首次用免疫金标记技术研究沙门菌壁细胞抗原成分，将胶体金与抗体结合，应用于电镜水平的免疫细胞化学研究。1974年，Romano等用胶体金标记抗球蛋白抗体,建立间接免疫金染色法。1983年，Holgate等建立了免疫金银染色法（LGSS），极大地提高了检测的灵敏度。1989年, Spielberg等通过检测抗 HIV的斑点免疫金渗滤试验,首次建立了斑点金免疫渗滤法 (DIGFA)。1990年，Beggs等在免疫渗滤技术的基础上，建立了一种更加坚毅快速的免疫学检测技术，即胶体金免疫层析法（GLCA），用于检测人尿和血清中的HCG。此后，免疫胶体金标记技术不断成熟，成为继荧光素、放射性同位素和酶之后，又一大免疫标记技术。胶体金作为一种新型免疫标记技术，被广泛应用于电镜水平研究、光显微细胞化学、免疫沉淀以及蛋白质染色技术上，并被引入免疫诊断领域中，尤其在快速诊断方面显示了巨大的前景。 胶体金在弱碱环境下，由于带负电，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、聚羟基脂肪酸酯（PHA）、伴刀豆球蛋白（ConA）等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，可以应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。胶体金标记物具有较好的稳定性、敏感性、精确性并可人工制备，其操作简单、快速和无污染等，另外胶体金标记复合物在干燥状态下室温贮存相当稳定。

胶体金标记技术

胶体金标记技术 胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。由于它不存在内源酶干扰及放射性同位素污染等问题，且利用不同颗粒大小的胶体金还可以作双重甚至多重标记，使定位更加精确。因此已成为继荧光素、酶、同位素及乳胶标记技术之后的一种新型标记技术。现已广泛应用于电镜、流式细胞仪、免疫印迹、蛋白染色、体外诊断试剂的制造等领域。 用胶体金作为特殊标记物的研究始于60年代初，1962年Feldberr等报道了用胶体金标记细胞进行电子显微镜的研究。1971年，Taylor又将胶体金引入电镜免疫标记技术中。近年来的研究表明，胶体金也可作为体外免疫加层试验的指示物。由于胶体金作为标记物具有很多优点，因此自其问世以来，在国内外的许多研究领域中得到了迅速的发展。 近年来，它更多的被应用于免疫学和细胞学相关分子水平的检测中。尤其随着人们物质生活的改善，有关人类健康的问题在现实生活中已显得非常突出。从90年代至今的多篇报道都是关于动物体或人体相关抗体和病原体检测的。 制备方法 在溶液中金颗粒呈圆形，边缘平整，界线十分清楚。金颗粒表面带有大量负电荷，由于静电的排斥力，使其在水中保持稳定状态，形成稳定的胶体，所以称其为胶体金。胶体金的制作方法有白磷还原法，抗坏血酸还原法，柠檬酸三钠还原法和鞣酸—柠檬酸三钠还原法。通过改变反应体系中氯金酸与还原剂的比例（即增加或减少还原剂的量）可得到所需不同直径的金颗粒。 但前两种方法制备得到的金颗粒直径大小不均一，所以目前常用后两种方法，以柠檬酸三钠还原法为例，有两种方法。 1．Frens标准方法： 1)取0.01%HAuCl4溶液50mL,加热煮沸，随即快速加入1%柠檬酸三钠溶液0.5mL。 2)约过25s沸腾的溶液变为淡蓝色，大约再过70s，蓝色突然转变为亮红色， 3)继续煮沸约5分钟后结束反应。 4)冷却后用0.1M K2CO3溶液调至所需PH值。 5)此后再延长反应时间或另加入额外的柠檬酸三钠都不影响实验结果。 该法制备得到的金颗粒直径约为41nm，如前所述要想得到更大或更小的金颗粒，该方法依然可行，唯一不同的是需要改变加入还原剂的量。另外，采用此标准方法所需反应时间最短。2．Slot标准方法： 1)取1mL1%HAuCl4溶液溶于100mL水中，2)再加入2mL1%二水柠檬酸钠溶液。 3)将该混合溶液加热煮沸约15~30min，直至溶液颜色变为亮红色， 4)冷却后，用0.1M K2CO3溶液调整PH值，该法制备的金颗粒直径约为15nm。 胶体金标记蛋白的原理是：在碱性条件下，胶体金颗粒表面带负电荷，可与蛋白质所带正电荷基团之间产生静电吸引而牢固结合，这种结合对所标记蛋白的生物学活性无明显影响。 胶体金免疫技术可大致分为液相胶体金标记技术和固相胶体金标记技术，其分类依据同酶免疫技术。最早的液相胶体金标记技术叫免疫金染色法（IGS），它仅以胶体金作为标记物和显色剂。最初的免疫金染色都采用单标记。即采用大小均一的金颗粒进行标记。后来发展到可利用不同颗粒大小的胶体金作双重标记甚至多重标记。但该方法均仅以胶体金显色，需要较高浓度的标记物，耗费抗体或抗原的量较多，而且需要较大直径的金颗粒（40-50nm），才能获得较高的灵敏度，而且当金颗粒过大时，标记物不稳定，长期贮存容易发生自动聚集。 为克服以上缺点，免疫金银染色法（IGSS）应运而生。该方法的原理是，先用胶体金标记物作免疫金染色，再加入含银的物理显影液，则银离子靠电荷吸引，大量吸附于金颗粒周围，使显色结果呈现金属银的蓝灰色，同时将显色信号进一步放大。应用时，由于本法最终显色是靠金属银的吸附沉积，因此不需要高浓度的胶体金标记物，将胶体金标记物稀释几十倍，仍可获得同免疫金染色一样的最佳效果。这样不仅可以节省大量的抗体或抗原标记物，而且可以节省大量的胶体金。本方法灵敏度的关键在于胶体金吸附银颗粒的数量。小直径的