第五章聚合酶链式反应
第五章聚合酶链反应及其相关技术
PCR技术从Mullis最初建立到现在共约20多年时间，因为此技术具有高特异性、高敏感性和简便快捷等特点而备受人们广泛应用，许多新型的PCR技术或由PCR衍生的新技术正不断出现，使PCR技术由最初的单一技术体系逐步发展成为一系列的技术综合。PCR技术在体外快速特异地复制目的DNA序列，理论上能将极其微量的（pg DNA）目的基因在较短的时间内（通常1-3h）扩增达到纳克、微克甚至毫克级水平，使产物极易被检测。因此PCR技术目前已经成为人们获取目标基因的最常用的方法之一，Mullis因其杰出的贡献，于1993年获得了诺贝尔化学奖。
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR) 是体外酶促扩增DNA或RNA序列的一种方法，它是一种不需要借助于分子克隆而可以在体外快速繁殖、扩增DNA的技术,它与分子克隆（molecular cloning）、DNA测序（DNA sequencing）一起构成了分子生物学的三大主流技术。在这三项技术中，PCR技术自1983年由美国Cetus公司Kary.Mullis提出并于两年后建立以来，得到了快速的发展，成为最常用的分子生物学技术之一。这项技术使人们能够在数小时内通过试管中的酶促反应将特定的DNA片断扩增数百万倍，给生命科学领域的研究手段带来了革命性的变化。由于PCR技术的实用性和极强的生命力，PCR技术成为生物科学研究的一种重要方法，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。目前，一系列的PCR方法被设计开发出来，并广泛应用于基因扩增与分离、医疗诊断、基因突变与检测、分子进化研究、环境检测、法医鉴定等诸多领域。
5.1 PCR技术原理
聚合酶链式反应（PCR）是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。它应用热稳定的聚合酶，通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，DNA片段以指数方式增加了百万倍。从非常微量的DNA甚至单个细胞所含有的DNA起始，可产生ug量的PCR产物（见图5-1）。
在PCR反应中，欲扩增的目的DNA片段由两条单链组成。首先合成出与两条链两端互补的寡聚核苷酸引物(约含20个核苷酸)，然后将起始反应液中的模板DNA加热而变性解链。在降低温度复性时，引物分别与A，B链两端的互补序列配对结合。最后，在DNA聚合酶的催化下，以目的DNA片段为模板进行聚合反应。第一轮反应结束后，目的DNA增加了一倍。新合成的DNA片段本身又能作为下一轮反应的模板。如此反复进行，DNA片段的数目可以呈
2的指数增加。由于在PCR操作过程中，需要反复加热解链，一般的DNA聚合酶容易变性失活。后来从耐热菌中纯化得到一种TaqDNA聚合酶，能在较高的温度下(70～75℃)进行催化聚合。这样就不需要在每次循环时加入新酶，而且可以获得质量更好的DNA片段，从而使PCR技术达到更成熟的阶段。
5.1.1聚合酶链式反应操作过程
Mullis最初建立的PCR方法使用三种温度的水浴进行实验，并以大肠杆菌DNA聚合酶 I 的Klenow片段催化复性引物的延伸。由于该酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，所以每一轮反应都需添加新的酶，使得操作繁复且产量不高，而且对实验操作要求较高。1988年Saiki等将从温泉中分离的一株嗜热杆菌（Thermus aquaticus）中提取到的耐热DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）引入了PCR技术。由于该Taq酶能够耐高温，在DNA热变性时不会被钝化，所以整个反应只需添加一次酶即可，此酶的发现为如今通过PCR 仪实现DNA的自动化扩增奠定了坚实的基础。
PCR扩增靶DNA序列扩增操作过程一般包括3个步骤，即变性、退火、延伸。
⑴变性（denaturation）是将反应体系混合物加热94℃并维持一定时间，使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链分子作为反应的模板。
⑵退火（annealing）是将反应体系温度降低至特定的温度（寡核苷酸引物的融点温度Tm值左右或以下），使引物能与模板的互补区域结合，形成模板－引物复合物。由于模板链分子较引物复杂得多，加之引物量大大超过模板DNA的数量，DNA模板单链之间互补结合的机会很少。另外，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短。
⑶延伸（elongation）是将反应体系的温度升至72℃并维持一定时间，使反应体系中已结合到模板DNA链上的引物在聚合酶的作用下，以引物为固定起点，以四种单核苷酸（dNTP）作为底物，按照模板链的序列以互补的方式依次把dNTP加至引物的3'端，合成新的DNA链。
上述三个步骤作为PCR的一个循环，由于每个循环所产生的DNA片段作为下一个循环的模板，所以每循环一次，底物DNA的拷贝数增加一倍。因此，反应产物量以指数形式增长，一个分子的模板经过n个循环可得到2n拷贝产物，如经过25次循环后，则可产生225个拷贝数的特异性DNA片断，即3.4×107倍待扩增的DNA片断。但是，由于每次PCR的效率并非100％，并且扩增产物中还有部分PCR的中间产物，所以25次循环后的实际扩增倍数为1×106到3×106数。另外从图中可以看出，PCR反应经过3个循环，扩增产物中就出现待扩增的特异性DNA片断。
5.1.2 参与PCR反应体系的成分及其作用
参与PCR反应的成分主要包括：模板核酸、一对寡核苷酸引物、催化依赖模板的DNA 合成的耐热DNA聚合酶、缓冲液、Mg2+，4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、反应温度与循环次数、PCR促进剂等。现对它们的作用介绍如下：
1、模板用于PCR的模板核酸可以是DNA，也可以是RNA。核酸模板来源广泛，可以从动植物细胞、培养的细胞、细菌、病毒、组织，病理样品，考古样品等中提取。当用RNA 作模板时，首先要进行反转录生成cDNA，然后再进行正常的PCR循环。包括基因组DNA、RNA、质粒DNA和线粒体DNA等。模板DNA都需要通过纯化以除去DNA聚合酶抑制剂（如SDS、氯仿、乙醇等）和其它杂质(如RNA)，以保证有较高的纯度。DNA模板中过多的RNA污染会造成RNA与DNA的杂交或RNA与引物的杂交，导致特异性扩增效率的下降。在用RNA作为扩增模板时，须先将RNA逆转录为cDNA，再以cDNA作为PCR反应的模板进行扩增反
图5-1 聚合酶链式反应示意图
应。除了上述的DNA 或RNA 可用作模板外，PCR 还可以直接以细胞为模板。 一般来说PCR 对模板纯度的要求不是很高，模板不需要达到超纯。对于来源于组织细胞的模板DNA ，只要先溶细胞，经蛋白酶消化去除蛋白质，再用酚、氯仿抽提，经乙醇沉淀的模板即可应用。某些扩增实验中甚至可以直接将溶细胞液煮沸加热，用蛋白质变性后的DNA 溶液作模板。但在DNA 溶液中，不能有影响扩增反应的物质存在，例如蛋白酶、核酸酶、结合DNA 的蛋白质等；另一类是尿素、十二烷基硫酸钠、卟啉类物质等；还有一类是二价金属离子的络合剂(如EDTA)等，会与Mg2+络合，影响TaqDNA 聚合酶的活性。上述物质的存在会
3` 5`
3`
3` 5`
含靶序列的DNA 模板
5`
5` 3`
5`
第一次退火
引物1 引物2
3`
5`
3` 3`
5` 第二次变性、退火
53`
5`
（其它不同长度的链未标出）
影响扩增效果，甚至使扩增失败。
一般对于单拷贝的哺乳动物基因组模板来说，100ul的反应体系中有100ng的模板已足够。有时加的模板太多，会令扩增失败。这时如果对模板稀释后再加入反应体系中，往往能获得成功。
2、引物引物是与靶DNA的3'端和5'端特异性结合的寡核苷酸，是决定PCR扩增产物的特异性和长度的关键。只有当每条引物都能特异地与模板DNA中的靶序列复性形成稳定的结构，才能保证其特异性。一般情况下，设计的引物长度介于15～30个核苷酸之间，3'端必须带有游离的－OH基团，反应体系中各引物浓度一般介于0.1~0.5 μmol/L之间，过高或过低均不利于反应的正常进行。
引物设计是决定PCR反应成败的关键。引物具有定位和定向作用：一对引物分别与一条单链模板结合，并且与靶序列3’端侧翼碱基互补，从而限定了引物只能结合在所识别的链上的靶序列3’端。另外由于DAN聚合酶的5’一3’合成特点，引物的3’端得以延伸，两引物延伸方向相对并指靶序列的中央；决定片段大小：引物之间的距离决定了扩增靶序列的大小及特定范围。
PCR反应中，对引物也有一些特殊的要求，引物过短会影响PCR的特异性，要求有16～30bp。，引物过长使延伸温度超过TaqDNA聚合酶的最适温度，亦会影响产物的特异性。)G+C 的含量一般为40％～60％。引物的四种碱基应随机分布，不要有连续3个以上的相同嘌呤或嘧啶存在。尤其是引物3’不应有连续3个G或c，否则会使引物与核酸的G或c富集区错误互补，而影响PCR的特异性。引物自身不应存在互补序列而引起自身折叠，起码引物自身连续互补碱基不能大于3bp。两引物之间不应互补，尤其是它们的3’端不应互补。一对引物之间不应多于4个连续碱基有互补性，以免产生引物二聚体。引物与非特异靶区之间的同源性不要超过70％或有连续8个互补碱基同源，否则导致非特异性扩增。引物3’端是引发延伸的点，因此不应错配。由于ATCG引起错配有一定规律，以引物3’端A影响最大，因此，尽量避免在引物3’端第一位碱基是A。引物3’末端也不应是编码密码子的第三个碱基，以免因为密码子第3位简并性而影响扩增特异。引物5’端可以修饰，包括加酶切位点，用生物素、荧光物质、地高辛等标记，引入突变位点，启动子序列，蛋白质结合DNA 序列等。引物浓度一般要求在0．1～0．5pmol之间。浓度太高，容易生成引物二聚体，或非特异性产物。引物Tm值最好在55～70℃范围。
简并引物实际上是一类由多种寡核苷酸组成的混合物，彼此之间仅有一个或数个核苷酸的差异。若PCR扩增引物的核苷酸组成顺序是根据氨基酸顺序推测而来，就需合成简并引物。简并引物同样也可以用来检测一个已知的基因家族中的新成员，或是用来检测种间的同源基因。
使用简并引物的PCR反应，其最适条件往往是凭经验确定的，尤其是要注意所选定的变性温度，以避免引物与模板之间发生错配。有的学者建议，使用热起始法(hotstart method)能够有效地克服错配现象。热起始法要求将反应混合物先加热到72℃，然后才加入Taq DNA 聚合酶。经过这样的处理，增加了PCR扩增产物的特异性，所得到的靶DNA片段在EB琼脂糖凝胶电泳中可以容易地观察到，而且背景中的非靶序列的条带全消失了。
为了尽可能减少非靶序列的扩增，最近已经发展出一种嵌套引物(nested primers)的策略。其具体的操作程序是，利用第一轮PCR扩增产物作为第二轮PCR扩增的起始材料，同时除使用第一轮的一对特异引物之外，另加一至两个同模板DNA结合位点是处在头两个引物之间的新引物。在第二轮扩增产物中，含有能够同这一组多引物杂交的错误扩增的可能性是极低的，所以应用嵌套引物技术能够使靶DNA序列得到有效的选择性扩增。
3、脱氧核苷三磷酸(dNTP) dNTP为PCR反应的合成原料。每种核苷酸浓度应相同，dNTP 是dATP，dCTP，dGTP，dTTP的总称。反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致，即使在被扩增片段的碱基组成比较特别时。四种核苷酸间浓度的不平衡会增加反应时DNA聚合酶错配的机率。dNTP的浓度一般为20-200μmol/L，浓度过高虽能加快反应速度，但非特异性扩增也随之增加，DNA聚合酶复制DNA时也越容易出错。降低dNTP的浓度可相应提高反应特异性。dNTP储存液必须为pH7.0左右，其浓度一般为2mmol／L，分装后置一20℃环境下保存。
4、耐热DNA聚合酶耐热DNA聚合酶是PCR技术实现自动化的关键。由于此酶在靶DNA 变性的高温下仍保持活性，所以在PCR扩增DNA的全过程中，只需一次性加入反应体系，不必在每次高温变性后再另添加酶。同时它催化的聚合反应的最适温度为70～80℃，此时引物与模板的结合的特异性好，故产物的纯度高。现在已发现多种耐热DNA聚合酶，均具有在高温下仍保持一定酶活性的通性，但不同耐热DNA聚合酶的性能也存在一定的差别。常见的耐热DNA聚合酶有TaqDNA聚合酶、PwoDNA聚合酶、TthDNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、 PfuDNA 聚合酶等, 但在PCR反应中应用最多的是Taq DNA聚合酶。
（1）TaqDNA聚合酶
天然的TaqDNA聚合酶是从美国黄石国家公园的温泉嗜热水生菌Thermus aquaticus YT-1菌株中分离获得的，现已克隆出该酶的基因，全长2499个碱基，编码长度为832个氨基酸、分子量为94kDa的蛋白质。现在市场销售的TaqDNA聚合酶是E.coli细胞中表达的产物。该酶有很高的耐热稳定性,在95℃时,它的半衰期为30 min，即使100℃处理5min，还具有一半活性。TaqDNA聚合酶具有5'→3'DNA聚合酶活性和5'→3'外切酶活性，缺3'→5'外切酶活性，不具有klenow酶的校对功能，在其催化的PCR扩增过程中发生碱基错配的几率大大增加，碱基错配的几率为1/300~1/18000。碱基错配的数量受温度、Mg2+浓度和循环次数的影响。
TaqDNA聚合酶作为PCR的耐热性DNA聚合酶，以带引物的单链DNA为模板，以dNTP为原料，催化互补链的聚合反应，在引物3'-OH末端加上脱氧单核苷酸，形成3',5'磷酸二酯键，使DNA链按5'→3'方向延伸，扩增的DNA片断可长达几个kb。
（2）PwoDNA聚合酶
PwoDNA聚合酶是从喜温性古细菌（archaebacterium）Pyrococcus woesei中发现的，现在已经克隆出此酶基因并转入E.coli细胞中用于表达、提取此酶并在市场销售。该酶具有强的5'→3' DNA聚合酶活性，兼有3'→5'外切酶活性，没有检测到5'→3'外切酶活性。这种酶具有更高的耐热性，100℃下处理2h仍具有一半活性。由于此酶具有3'→5'外切酶活性，所以用这种酶扩增DNA的准确度远高于Taq DNA聚合酶，扩增能力可以达到5kb，并且扩出的DNA片断是平末端的，可直接用于平末端连接。
（3）TthDNA 聚合酶
这种酶是从喜温性真菌Thermus thermophilus HB8中分离的，具有强的5'→3' DNA 聚合酶活性，无3'→5'外切酶活性。当反应体系中存在Mn2+的条件下，该酶具有很强的反转录酶活性，能有效地将RNA反转录成cDNA。当鳌合了Mn2+后再加入Mg2+，则可以使该酶的聚合活性增加，反转录产生的cDNA在此酶的作用下还可以进行PCR扩增。由于Tth DNA聚合酶既具有反转录活性又具有DNA扩增的功能，使得cDNA的合成与扩增可以用同一种酶催化，所以被用于反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR），对于从RNA水平检测和分析基因表达十分有用。
（4）Vent DNA聚合酶
此酶由海底火山口98℃水中生长的Litoralis栖热球菌中分离得到，酶基因已经得到克隆，并在大肠杆菌中成功表达了该酶。Vent DNA聚合酶热稳定性极好，97.5℃下半衰期
长达130min，而且该酶具有3'→5'外切酶活性，因此在催化DNA合成时具有校正功能，从而有效降低碱基错误掺入率，提高扩增结果的忠实性。
（5）PfuDNA聚合酶
PfuDNA聚合酶是从Pyrococcus furisus菌体中分离提纯的，该酶具有5'→3' DNA聚合酶活性，同时与Pwo DNA聚合酶相似具有3'→5'外切酶活性，因此Pfu DNA聚合酶也具有校正功能，催化DNA合成的忠实性要比Taq DNA聚合酶高12倍。该酶耐热性极好，97.5℃下半衰期大于3h。但此酶在反应体系中无dNTP存在时会降解模板DNA，故在配置PCR反应液时须在最后添加于反应体系。
除了上述的几种DNA聚合酶外，现在很多公司开发出了具有不同特性的聚合酶类型，如Takala公司推出的LA Taq DNA聚合酶和EX Taq DNA聚合酶,不仅聚合能力大大提高，如前者可以扩出约30kb的超长片断，后者可以顺利扩出5kb的片断，而且均具有3'→5'外切酶活性，保证扩出产物的保真性，产物还可以直接用于TA克隆。
5、镁离子(Mg2+)浓度一般来讲，耐热的DNA聚合酶的活性都需要二价阳离子。PCR反应体系中使用Mn2+虽然可以使一些聚合酶具有催化活性，但催化活性要比Mg2+低得多，而Ca2+不能活化DNA聚合酶。因此，PCR反应中耐热DNA聚合酶的活性与反应体系中游离Mg2+浓度直接相关：Mg2+浓度过低酶活力显著降低，使产物减少；浓度过高又会使酶催化非特异性扩增。Mg2+浓度还影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、PCR产物的特异性、引物二聚体的生成等。值得注意的是，PCR反应体系中dNTP、引物和模板DNA等中的磷酸基团均可与Mg2+结合而降低游离Mg2+的实际浓度，从而影响酶的活性。另外,反应体系中整合剂的存在(如EDTA),也会结合一部分游离的Mg2+。因此，在优化PCR反应条件时应考虑上述诸多因素，以寻找体系中Mg2+的最适反应浓度。
6、反应缓冲液反应缓冲液为PCR反应提供必需的、合适的酸碱度和某些离子，一般在购买公司耐热DNA聚合酶时配套提供。常用的缓冲液含10～50mmol/L的 Tris-HCl，室温条件下其pH介于8.3～8.8，在72℃时其pH为7.2左右。反应缓冲液还含有KCl，50mmol/L 以内有利于引物的退火，而50mmol/L以上则抑制DNA聚合酶活性。此外，为了保护DNA聚合酶的活性，一般还需在反应缓冲液中添加DNA聚合酶保护剂，如小牛血清白蛋白（BSA，100μg/ml）、明胶（0.01％）、Tween-20（0.05％～0. 1％）或二硫苏糖醇（DTT，5mmol/L）等。
7、PCR促进剂 PCR促进剂主要包括向反应体系中加入助溶剂和添加剂，起到降低PCR 反应过程中碱基错配水平，提高富含GC模板的扩增效率。助溶剂主要包括甲酰胺
（formamide）、二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）和甘油（glycerol）；添加剂包括氯化四甲基铵（tetramethylammonium chloride，TMAC）、谷氨酸钾（potassium glutamate）、硫酸铵（ammonium sulfate）、离子化及非离子化的除垢剂等。这些有关促进剂的添加可能有利于消除引物和模板的二级结构，降低DNA的解链温度使DNA变性完全，同时增进DNA 复性时的特异性配对，增加或改变DNA聚合酶的稳定性等，提高PCR扩增效率。如在反应体系中，添加5％~10%的DMSO利于DNA的变性，但对Taq DNA聚合酶具有抑制作用。而添加5％~20%的甘油有利于DNA的复性，10~100μmol/L的TMAC则有助于扩增产物的特异性。
5.1.3聚合酶链式反应的条件
聚合酶链式反应的条件主要考虑如下几个方面：PCR反应体系的配制，变性的温度与时间，退火的温度与时间，延伸的温度与时间，循环次数等。
1、PCR反应体系的设制
如前所述，PCR是一种在体外条件下模拟生物体内DNA复制达到在很短时间内大量扩增特异DNA片断的技术，因此反应体系中需加入一定量的需要扩增的DNA模板，能与模板中靶DNA序列特异结合的一对寡核苷酸引物，DNA链合成所需的适量底物dNTP，催化DNA链合成的一定量的耐热DNA聚合酶，以及包含Mg2＋在内的维系DNA聚合酶活性发挥作用的反应缓冲液系统，在有些情况下还可考虑在反应体系中添加适量的某种PCR促进剂以提高反应效率。
2.变性温度与时间
在PCR反应中，能否成功的使模板DNA和PCR产物充分变性是反应成败的关键。只有当模板DNA和PCR产物完全变性成为单链后，引物才能在退火过程中与模板结合。变性通过加热来实现。变性所需的温度取决于模板DNA和PCR产物双链DNA中的G+C含量，G+C含量越高，则双链DNA分离变性的温度越高。一般情况下，93℃～95℃足以使模板DNA变性，但温度不能过高，否则高温环境对酶的活性有影响。变性所需的时间与DNA分子的长度相关，DNA 分子越长，在特定解链温度下双链DNA分子完全分离所需的时间越长。若变性温度太低或变性时间过短，则只能使DNA模板中富含AT的区域产生变性，当PCR循环中的温度降低时，部分变性的DNA模板又重新结合成双链，导致引物无法结合而使扩增失败。所以变性阶段DNA解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。
3、退火的温度与时间
退火温度是影响PCR反应特异性的重要因素。引物与模板复性所需的退火温度与时间，
取决于引物的长度、碱基组成及其浓度。引物长度越短，引物中G+C含量越低，所需的退火温度就越低。虽然降低退火温度可能提高扩增产量，但引物与模板间的错配现象会增多，导致非特异性扩增上升。相反，提高退火温度虽可提高反应的特异性，但会引起扩增效率下降甚至无扩增产物出现。引物的退火温度可通过Tm=4(G+C)＋2(A+T)公式粗略估算，一般在算出的Tm值上减去5℃即为较合适的反应设计退火温度。
4、延伸的温度与时间
延伸温度取决于使用的DNA聚合酶的最适温度，延伸温度设定于聚合酶的最适温度附近，以获得较高的扩增效率。PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR反应延伸的时间，视待扩增片段的长度而定。在最适温度条件下，核苷酸的掺入率为每秒35～100个核苷酸，故延伸1min对于2kb的扩增片断已经足够。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。
5、循环次数
循环次数决定PCR扩增程度。通常情况下，PCR循环次数主要取决于反应体系中最初的模板DNA的浓度。PCR反应中扩增出的靶序列随循环次数的增加而呈指数性增长，但这种增长会在一定的循环后便放慢直至停止，很快达到反应平台。循环次数过多会增加非特异性产物量及碱基错配数，循环次数太少则影响正常的PCR产物量，一般的循环次数介于30～40次之间。
5.1.4 聚合酶链式反应引物设计原则
PCR反应中扩增产物的大小和扩增产物特异性的高低，设计并用于反应体系中扩增用的引物起到了非常关键的作用。因此为了提高反应的效率，需要对引物精心设计。
5.1.4.1 引物设计的一般原则
PCR反应中的引物为化学合成的寡核苷酸，不仅具有5'→3'的方向性，而且通常成对存在，包括5'端引物和3'端引物，分别设在被扩增目标片段的二端，并分别与模板正负链序列互补：即5'端引物与位于待扩增片断5'端上游的一小段DNA序列相同，引导正链的合成；3'端引物与位于待扩增片断3'端的一小段正链DNA序列互补，引导负链的合成。PCR反应扩增产物就是包括二条引物在内的这一对引物之间的双链DNA片段。因此为了增加扩增产物的特异性和提高扩增产量，在设计PCR扩增引物时需注意如下各方面：
（1）引物本身的长度及配对扩增用引物之间的扩增跨度;引物设计的目的是要提高PCR 的特异性。因此要求设计的引物与模板DNA中的靶序列根据碱基互补配对原则稳定结合。寡核苷酸引物的长度越长，扩增的产物特异性越高，但引物过长容易产生寡核苷酸的链内互补，
并使延伸温度超过Taq DNA聚合酶的最适温度，影响产物的特异性。而引物过短则会降低PCR的扩增特异性。因此，引物的长度要适宜，一般以18～25个核苷酸为宜，而且一对引物中两个引物的寡核苷酸长度差异应小于3bp。至于配对扩增用引物之间的扩增跨度，即可能的扩增产物的长度，不仅要考虑扩增序列本身的复杂程度如是否含高G+C含量，也要考虑扩增用DNA聚合酶的扩增能力大小。
（2）引物的碱基组成;组成引物的4种碱基应随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积影响扩增特异性。C+G 碱基含量在引物中的比例一般以40%～60%为宜。
（3）引物自身特征;引物除了考虑长度外，自身内部碱基不应有反向重复序列或大于3bp的自身互补序列，否则引物自身会折叠形成发夹结构，影响引物与待扩增DNA中的靶序列结合。
（4）引物之间;二条引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3'端的互补重叠以免形成引物二聚体。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补。在PCR反应体系中，由于含有高浓度的引物，即使引物间存在极为微弱的互补作用，也会使引物相互杂交并在聚合酶的作用下得到引物二聚体的扩增产物。若在PCR早期就形成引物二聚体，在扩增过程中势必造成对聚合酶、反应合成底物dNTP及包括引物本身的竞争，从而抑制待扩增靶序列的扩增。若在操作中采用热启动方式或在PCR扩增程序设计上运用退火温度降落方式（touch down PCR），可以减少引物二聚体的生成。另一方面，PCR扩增退火温度常根据较低的Tm值选定，故3'端引物与5'端引物应有相接近的Tm值，其差别不应大于5℃，否则难以保证扩增的效果。
（5）引物末端修饰;在PCR扩增中，引物的3'端是引发延伸的起点，因此一定要与模板准确配对，不能进行任何修饰。引物的5'端并无严格的限制，在与模板结合的引物长度足够的前提下，其5'端碱基可不与模板DNA互补而成游离状态。通常这些游离序列对引物与模板的结合并无显著影响，因此引物的5'端可以被修饰，如引入突变位点，用生物素、荧光素、地高辛等化学物质标记，引入蛋白质结合DNA序列，添加限制性酶酶切位点序列便于扩增产物的下步克隆等。
5.1.4.2引物3' 端的末位碱基
引物3' 端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其它3个碱基，因此应当避免在引物的3'端使用碱基A。当末位碱基为T时，错配的情况下也能引发链的合成，所以也应
尽量避免在引物的3'端第一位碱基使用T。引物3' 端末位碱基最佳选择是G和C ，因为它们形成的碱基配对比较稳定。
5.1.4.3引物设计软件
引物的设计要考虑多方面的因素，设计出的引物在PCR扩增中具有重要的地位，直接关系到靶DNA片断能否扩出，扩出的效率有多高，是否存在非特异扩增现象等，因此要进行科学的设计。引物的设计通常通过有关设计软件得以完成。目前常用的专门设计软件主要包括“Oligo”和“Primer Premier”，它们均具有引物的自动搜索功能和引物分析评价功能，但两者侧重点不同，“Primer Premier” 自动搜索功能最强且方便使用。除了上述两种设计软件外，“Dna ssist”、“Omiga”和“D NA star”都可以用于引物设计。随着国际互联网的普及与发展，很多大型生物技术公司提供的网络在线引物设计平台，如invitrogen公司、Roche等公司网站（网址分别为https://www.wendangku.net/doc/7c5053488.html,和https://www.wendangku.net/doc/7c5053488.html,）均提供在线引物设计。
5.2 聚合酶链式反应技术类型
PCR技术从1985年建立以来，在过去的20多年来发展极快，从早期的简单扩增发展为一系列的技术体系，不仅可以扩增两段已知序列间的DNA，现在发展到可以扩增已知序列两侧的未知序列，甚至可以扩增序列未知的新基因，发展出的方法达到几十种，并且还在不断发展、完善，功能上不仅可以用于DNA的单纯扩增，还可以用于DNA的定点突变，基因的定量和基因的连接等。
5.2.1已知DNA序列的聚合酶链式反应扩增
对已知DNA序列的体外酶促扩增，是PCR的最初功能。作为PCR的靶DNA一般是一个待扩增的特定双链DNA片断，应知道其全序列或其两端20～30bp的核苷酸序列以供设计3' 端、5' 端引物之用。靶DNA可以是环状DNA分子的一部分，也可以是线型DNA分子的一部分。按照PCR的原理与操作要求，在冰上分别把人工合成的一对特异引物、提取或分离的靶DNA、dNTP、Mg2+、PCR反应缓冲液、耐热DNA聚合酶等各按一定的浓度或量要求添加到反应管中，混合后置于PCR仪中，通过设定变性、退火、延伸三步反应的温度与时间及循环次数编好程序后并运作此PCR反应程序。但在有些情况下，若引物的退火温度和DNA聚合酶的酶催化活性温度相近时，可以把退火与延伸两步过程合二为一，只需使延伸时间稍微延长即可，
使PCR扩增程序更为简单。扩增结束后取适量产物通过凝胶电泳即可鉴定扩增的效果。对于此类已知DNA序列的PCR扩增，经常用于重组子的鉴定、微生物类型鉴定、亲子鉴定等方面。
5.2.2 逆转录聚合酶链式反应
PCR技术不仅可以用于DNA靶序列的扩增，也可以用于RNA靶序列的扩增。RNA水平的PCR通常称为逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)，有时也称为反转录PCR、RNA PCR，它是一种将mRNA反转录与PCR技术相偶联的靶基因分离技术。通过mRNA反转录得到对应的cDNA，然后利用特定的PCR引物直接以反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增反应，获得大量的靶DNA序列。反转录可以用总RNA或分离出的总poly(A)RNA为模板进行，反转录产物无需转变成双链cDNA，即可进行PCR扩增。RT-PCR为经cDNA分离特定表达基因提供一种通用、便捷的手段。
常见的RT-PCR可以分为一步法和两步法两种类型。一步RT-PCR法是RT和PCR过程在同一反应管和单一的反应缓冲液中完成，RT完成后不需打开反应管进行加样以避免污染。两步法是先在一个管中通过反转录酶的作用将mRNA模板反转录出cDNA一链，再在另一个管中添加适量已反转录获得的cDNA一链，加入特异引物及其它反应成分后进行PCR扩增。两步法虽然在操作上比较繁琐，但可将反转录产物分别进行多重不同的PCR反应，可以从一个样品解答多个问题。
逆转录中所用的引物可以是基因特异引物，也可以是Oligo(dT)或随机引物。对于用特异引物即用3' 端引物通过与mRNA模板结合引导反转录只能获得特定基因或基因家族的cDNA序列，而Oligo(dT) 引物则针对真核生物mRNA在3'端均带有poly(A)结构设计出，它能指导体系中所有的3'端带poly(A)尾巴的mRNA反转录为cDNA，不会对总RNA中的rRNA 进行反转录。但是在反转录过程若使用随机引物，如果用总RNA为模板，则反转录得到的产物中除了由mRNA反转录出的cDNA外，大部分产物均为总RNA中的rRNA反转录产物。至于实验中选择何种反转录引物，则视具体需要而定（见图5-2）。
反转录常用的逆转录酶主要有三种类型，第一类包括Moloney鼠白血病病毒来源的MMLV 反转录酶和禽成髓细胞瘤病毒来源的AMV。这两种酶在反转录过程中，均缺乏3'→5'的核酸外切酶活性，因此没有校正功能，而且在反转录体系中需要高浓度的dNTP以确保反转录完全。在反转录酶活性最适温度方面，MMLV反转录酶活性最适反应温度为37℃，比AMV反转录酶的活性最适反应温度低，不利于具有强二级结构的RNA的反转录。对于这俩种酶的RNase H活性方面，AMV的RNase H活性较MMLV的高，故AMV在反转录过程中更易发生消化反转录
产生的RNA-DNA 杂合链中的RNA 部分，也能消化cDNA 链3'端的RNA 模板，限制了cDNA 合成的长度。第二类反转录酶是MMLV 反转录酶的RNase H-突变体，具有反转录效率高、合成的cDNA 更长的特点，而且可在更高的温度（如50℃）下反转录合成cDNA ，更有利于具有强二级结构的RNA 的反转录。第三类是前面提到过的嗜热热稳定的Tth DNA 聚合酶，在Mn 2+存在下表现反转录活性，可以实现RT 与PCR 一步操作，但合成的cDNA 长度低，保真度降低。
图5-2 RT-PCR 原理示意图
5.2.3 已知cDNA 一段序列获得全长cDNA 的聚合酶链式反应
cDNA 是基因转录产物mRNA 通过反转录而来。除了上述的反转录途径获得cDNA 外，cDNA 序列还可以通过构建cDNA 文库后筛选获得，也可以通过对分离纯化后的目的蛋白进行氨基酸序列测定后获得，但通常情况下获得的cDNA 只是基因全长cDNA 的部分序列而并非全长。cDNA 末端的快速扩增（rapid amplification of cDNA ends ，RACE ）为克隆获得基因全长提供了解决途径。RACE 是一种基于mRNA 反转录和PCR 技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点、扩增基因转录本未知区域、从而获得cDNA 完整序列的方法。根据待扩增序列与已知序列的位置关系，可分为3' RACE 和5' RACE ，分别用于获得已知序列位点下游的mRNA 未知序列和已知序列位点上游的mRNA 未知序列。
1、3' RACE
3' RACE 扩增获得已知序列下游的mRNA 未知序列，主要分为两步，第一步是通过反总RNA 或mRNA 的分离
AAA(A)n 3`
引物退火 oligo-(dT)n 引导
随机6寡聚核苷酸 引基因特异序 AAA(A)n 3`
AAA(A)n 3`
AAA(A)n 3`
TTT(T)n3` n 3`
n 3`
AAA(A)n 3`
TTT(T)反转录酶
cDNA 第一链的合成 DNA 聚合酶
进行PCR
基因特异引物组合
转录获得3'末端第一链cDNA序列，然后以第一链cDNA产物为模板以套式引物扩增出3'末端序列。根据大多数真核mRNA的3'端本身带有poly(A)尾巴，为mRNA 3'序列反转录提供天然的引物互补退火位点。因此与一般的mRNA反转录相似，可以设计能与poly(A)互补的oligo(dT)序列作为反转录引物，经退火后引导cDNA链的合成。但为了方便后续的cDNA 3'序列的扩增及提高实验结果的可靠性，需对3' RACE反转录引物两端做特殊设计。反转录引物5'端添加一特定序列，这特定序列由外侧引物区OP（outer primer）和内侧引物区IP （inner primer）两部分组成，OP和IP将为以后的两轮PCR扩增提供引物序列。为了让反转录在紧接poly(A)尾巴交界处开始，降低扩增物中的同聚尾长度，在反转录引物的3'端加入一个非T碱基的锚定核苷酸，构成3'锚定引物（anchoring primer，AP），它实为三种引物的混合体。
为了扩出未知序列，可根据目的基因的已知序列设计两条基因特异性引物GSP1（外侧基因特异性引物）和GSP2（内侧基因特异性引物）。在用反转录产物扩增目的序列时，先用GSP1和OP引物组合进行第一轮PCR扩增，然后用第一轮PCR扩增产物为模板，以内部套式引物即GSP2和IP引物组合进行二次PCR扩增，以提高扩增产物的特异性（见图5-3）。
2、5' RACE
5' RACE用于扩增目的mRNA已知序列上游（即5'端）的未知序列。由于mRNA的5'端没有类似于3'端的寡聚核苷酸尾巴，为此需要设计一种能够将锚定引物AP序列引入其cDNA的方法，然后通过类似3' RACE同样的巢式扩增获得5'端未知序列。经典的5' RACE 是先通过序列已知的GSP1作为反转录引物产生cDNA第一链，去除杂合链中的RNA后利用DNA末端转移酶的活力对cDNA第一链进行同聚核苷酸加尾，在生成第二链cDNA时引入锚定引物序列，再按3' RACE的方法扩增出目的序列。
此经典的5' RACE遇到的问题是常因包括序列本身的结构特征和反转录酶的持续能力等原因，反转录反应并不能使所有得到的第一链cDNA 到达末端，形成一些假全长cDNA片断，但末端转移酶不能区分这些假全长片断与真全长片断，可同时对它们有效地加尾。为了克服上述问题，发展出的新5' RACE技术采用在反转录前对5'端完整mRNA脱帽子结构，后在RNA 连接酶的作用下把锚定RNA寡核苷酸引物序列连接到mRNA的5'端。反转录时，只有那些进行到mRNA 5'末端的反应（即反转录反应通过了被连入的mRNA锚定序列的反应），互补序列才会整合进第一链cDNA的3'端，在以后的PCR扩增中，由于以锚定序列作为引物，只有那些全长的cDNA才能被有效扩增（见图5-4）。
研究中发现，某些反转录酶在反转录到达RNA末端时，会表现出末端转移酶的活性而将
3～5个脱氧核苷酸残基（主要是dC ）添加到第一链cDNA 的末端，而且只有到达末端时才显示这种活性，因此可以设计出3'端带3～5个dG 的锚定引物加入到反转录体系中，该含poly(dG)的锚定引物可结合RNA 反转录到末端时已添加poly(dC)的第一链cDNA 3'端序列上。通过此技术同样可以扩出mRNA 的5'端全长序列，目前clontech 公司已开发出相关的试剂盒。
图5-3 3’RACE 示意图 图5- 4 5’RACE 示意图
5.2.4 已知序列侧翼聚合酶链式反应扩增
常规的PCR 技术是用于扩增两段已知序列之间的DNA 片断，而对于已知序列侧翼的未知DNA 序列的扩增，常规的PCR 则显得无能为力。后来，科学家在常规PCR 的基础上发明了获得已知序列基因两侧未知DNA 序列的PCR 方法，包括反向PCR 、锚定PCR 、TAIL-PCR 等，大大方便了对已知序列的侧翼未知DNA 的扩增。
1、反向PCR
反向PCR （inverse polymerase chain reaction ）简称IPCR ，非常适合于已知序列侧翼DNA 序列的扩增，虽然在设计扩增用的一对引物时与常规PCR 引物设计的规则一致，设计出的引物必须与已知序列互补，但与常规PCR 引物的方向是相对的不同，用于反向PCR X(A)n3` mRNA
X(dT)m -IP-OP 5` 反转录 cDNA 合成 降解RNA
5` X(A)n3` mRNA X(dT)m -IP-OP 5` 5` X(dT)m -IP-OP 5` 5`GSP1 OP5`
第一轮扩增 OP 5` 5`GSP1 5`GSP2 IP5` 第二轮扩增 5`GSP2 IP5` mRNA X(A)n3` 反转录 GSP1 X(A)n3` GSP1
降解RNA GSP1
加尾 GSP1 OP-IP-(G)n (C)n GSP2 扩增 OP-IP-(G)n
GSP2 5`
的一对引物方向是相反的。用这样的一对引物做常规的PCR 扩增，每个引物只能对各自的模板线性扩增，不能进行指数级增长，无法得到足够的产物。故用IPCR 扩增的DNA 模板必须先经过某种限制性内切酶酶切后，然后通过连接使含有已知序列的DNA 环化，使设计的引物由原来的相反转变为相对，就按常规PCR 操作扩出未知的侧翼序列。所以综合来讲，IPCR 主要包括酶切、切出片断自身连接环化、PCR 扩增等步骤（见图5-5）：
首先，用限制性内切酶消化待测线性DNA 模板。其次，用连接酶将酶切后的线性DNA 模板自身连接成为环状分子，从而使引物处于一个相对的位置。第三，可以通过两种方式进行未知序列的扩增：其一为用设计的引物直接进行常规PCR 扩增，其二为先把已环化的DNA 用另一种限制性内切酶消化，将环状DNA 从已知区域中间切开。这样线性化的DNA 两侧为已知序列，未知序列夹在中间，再按常规PCR 进行扩增。
通过上述的技术处理，就能获得已知序列的侧翼未知序列。为了提高扩增产物的特异性，往往设计巢式引物（nested primer ）即包括内侧引物、外侧引物共两对引物，先用外侧引物对样品进行一次扩增，然后用内侧引物对一次扩增产物进行二次扩增。扩出的特异序列通过序列测序与分析，就可获得侧翼序列。
图5-5 反向PCR 的基本过程（引自吴乃虎，1998）
左侧序列
右侧序列
连结后重新环化
引物1 引物2
根据靶DNA 序列设计一对
外向引物进行P CR 扩增
2、锚定PCR(anchored PCR)
锚定PCR又称单侧特异引物PCR(single- specific primer PCR，SSP-PCR)，是指通过添加锚定引物接头的方式来扩增合成未知序列或未全知序列的方法。在锚定PCR中，一条引物为根据已知序列设计的序列特异性引物，另一条则是根据序列的共同特征设计的非特异性引物。这种非特异性的通用引物起到在其中一端附着的作用，故称为锚定引物，与锚定引物结合的序列则称为锚定序列。一种常用的锚定PCR技术是以DNA文库中载体上的一小段序列作为锚定序列。还可把通过人工合成的特定序列连接到DNA片断上作为锚定序列，因此可称为连接锚定PCR（ligation anchored PCR）。在前述的RACE技术扩增基因中，均属锚定PCR范畴，用到的同聚物即为锚定引物，包括根据成熟mRNA的poly(A)序列特征设计出的一段oligo(dT)引物，以及由mRNA通过反转录获得的一链cDNA通过DNA末端转移酶在其 3'末端进行同聚物加尾后，如poly(dG)尾，再据此尾特点而设计出的对应poly(dC)引物，它们均属锚定引物的范畴。关于RACE技术这里不再重复。
3、TAIL-PCR
TAIL-PCR也叫交错式热不对称PCR（thermal asymmetric interlaced PCR），它是利用一系列序列特异性的巢式引物和一个短的任意引物（arbitrary primer）引导扩增已知序列的侧翼序列的技术。它是一种半特异性的PCR反应，由于两类引物的退火温度不同从而可以通过控制反应过程中的退火温度，有效地控制特异性和非特异性产物的扩增。在TAIL-PCR 中序列特异性的巢式引物较长，退火温度较高，因此在PCR反应中退火温度的高低对它与目的序列的退火没有太大的影响，在高、低两种退火温度下都可以与已知序列发生特异性的退火，而序列短的任意引物则仅可以在退火温度较低时与未知序列（已知序列的侧翼序列）发生退火，通过高低温退火温度的交替进行，使目的基因得到有效的扩增（见图5-6）。该PCR 技术由我国科学家刘耀光教授发明，对于分析已知序列的侧翼序列非常有效，尤其适用于对转基因突变体T-DNA插入位点侧翼序列的分析。为了提高扩增的效率和扩出更长的DNA片断以提供更多的侧翼序列信息，发明者对该技术进行了进一步的完善，在原来TAIL-cycling 技术的基础上，引入了抑制PCR技术，发展出了hiTAIL-PCR方法。此新方法对已知序列位点的侧翼未知序列的分离显示了更强大的生命力。
5.2.5未知序列聚合酶链式反应扩增
利用PCR技术扩增已知基因序列并不困难，只要根据基因的3'和5'两端序列合成一对引物就可实现，但对于用PCR扩增未知序列，因为不能设计所需要的引物而难以实现。随
着PCR技术的发展，近年来先后发展了几种针对未知序列的PCR扩增技术包括差异显示PCR、限制性显示PCR、消减PCR、简并PCR和Alu-PCR等，非常适于用来扩增差异表达的基因或新基因，下面重点对前三者作详细介绍。
1、差异显示PCR
在高等生物中，体内基因的表达图谱不仅随着发育时间与空间的变化而呈规律变化，也会在环境诱导或是转基因等条件下，基因的表达图谱也会随之变化，因此分离、分析这些差异表达的基因非常利于认识生物的基因功能及其表达规律。但传统的PCR方法难以分离这些差异显示的基因。1992年Liang和Pardee建立了一种全新的显示mRNA表达差异的方法，即mRNA差异显示PCR（mRNA differential display PCR，DD-PCR）技术，又称差异显示反转录PCR（differential display reverse transcription PCR，DDRT-PCR）。由于该技术
图5-6 TAIL-PCR原理示意图（引自刘耀光，1995）
注：TR1，TR2，TR3为长的特异引物，AD为短的随机兼并引物
具有与PCR技术相似的简单、快捷和高效等特点，已用于越来越多的差别表达基因的分离与鉴定，在分子生物学和基因工程领域发挥了极大的作用。
该技术的原理主要是基于真核生物成熟mRNA具有poly(A)的尾巴结构特点，根据在poly(A)上游的2个碱基只能有12种可能的排列组合：前面第一个碱基（B）有G、C、T三
MN样mRNA 3'端反种可能，第二位碱基（N）有A、T、G、C四种可能，设计出oligo-(dT)
12
转录锚定引物，它是由约12个连续的脱氧核苷酸加上两个3'端锚定脱氧核苷酸组成，其中M为除T以外的任何一种核苷酸（即A、G或C），而N则为任何一种核苷酸（即A、T、G或
MN表示,共有12种引物。当用任何一C），故MN共有12种不同的排列组合方式，并用5'-T
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MN对mRNA进行反转录，能够把总mRNA群体的1/12分子反转录成mRNA-cDNA 种oligo-(dT)
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杂合分子。然后以一种由10个核苷酸组成的5'端随机引物（arbitrary primer，AP）和3'端锚定引物进行PCR，以获得足够的cDNA进行差别显示分析。若使用12种3'端锚定引物和20种5'端随机引物组成的全部240组引物对作PCR扩增，理论上能得到20000条左右的DNA 条带，其中每一条都代表一种特定的mRNA种类。这个数字大体上涵盖了在一定发育阶段某种类型细胞中所表达的全部的mRNA种类。
为了便于显示不同样品按同一种引物对扩增后的差异表达带，常在PCR反应体系中加入放射性核素32P或35S以标记反应产物。PCR反应结束后各取适量产物通过变性聚丙稀酰胺凝胶电泳，经放射自显影和对胶板上的不同样品间进行比较，找出差异显示条带（见图5-7）。将差异条带从凝胶上切割并回收cDNA，即可进行克隆测序分析或用作制备探针从基因文库中调取有关基因。该技术用样少、操作简易、快速高效和可同时对多样品比较等优点，但在实际操作中还发现，该技术也存在一些不足：如若要检测全部mRNA种类则每样品要进行至少240次PCR并进行后续分析，样品越多工作量越大；受聚丙稀酰胺凝胶分辨能力的影响，有存在差异条带漏检的可能；有时条带集中使目的带难以准确切出导致假阳性结果等。
2、限制性显示PCR
DDRT-PCR技术的发展为差异表达基因或新基因的发现提供了有效的途径。由于使用了兼并性引物和特异性不高的锚定引物，扩增结果往往产生较高的假阳性现象，阻碍了该技术的发展应用。马文丽发展的限制性显示PCR（restrict display PCR，RD-PCR）技术很好的解决了上述问题。
聚合酶链式反应
聚合酶链式反应 聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。 PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 PCR原理 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶 耐热DNA聚合酶--Taq酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 反应准备 其中dNTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及Mg2+的加量（或浓度）可根据实验调整。 PCR反应五要素： 引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。 PCR所用的酶主要有两种来源：Taq和Pfu，分别来自两种不同的噬热菌。其中Taq扩增效率高但易发生错配。Pfu扩增效率弱但有纠错功能。 模板即扩增用的DNA，可以是任何来源，但有两个原则，第一纯度必须较高，第二浓度不能太高以免抑制
RNA的聚合酶链式反应
RNA的聚合酶链式反应：目前常用的RNA检测方法有原位杂交，点杂交，Northern印记杂交以及核酸酶保护试验等。这些方法的普遍缺点是难以检测低丰度的信使RNA，并且操作繁琐，将RNA反转录和PCR结合起来建立RNA聚合酶链式反应（RT-PCR）则可以克服上述缺点。 RT-PCR先在反转录酶的作用下以信使RNA为模板合成cDNA，再以CDNA为模板进行PCR反应。此法快速，简便，并且灵敏度高。此法可以检测单个细胞中少于10个拷贝的特异RNA。 RT-PCR 应用：分析基因的转录产物 克隆cDNA及合成cDNA探针， 改造cDNA序列等 RT-PCR中的关键步骤是RNA的反转录，要求RNA模板必须是完整。并且不含DNA，蛋白质等杂质。若RNA模板中污染了微量DNA，扩增后会出现特异DNA的PCR产物。而cDNA扩增产物却很少，必要时可用无ＲＮａｓｅ的ＤＮａｓｅ处理反转录产物，消除ＤＮＡ后在进行ＰＣＲ。如果蛋白质未除尽可与ＲＮＡ结合，从而影响反转录和ＰＣＲ反应。 常用的反转录酶有二种，也就是ＡＭＶ，和ＭｏＭＬＶ的反转录酶 ＡＭＶ反转录酶由二个不同亚基组成，具有较强的ＲＮａｓｅＨ活性。可水解ＲＮＡ模板，以ＲＮＡ模板合成单链ＤＮＡ的酶活性最适作用温度为４２摄氏度。ＭｏＭＬＶ反转录酶由一条多肽链组成，最适作用温度为３７摄氏度。ＲＮａｓｅＨ活性较低，适于合成大片段
全长ｃＤＮＡ 但是当模板ＲＮＡ的二级结构影响反转录反应时，用ＡＭＶ反转录酶更合适，因为较高的反应温度会消除ＲＮＡ二级结构的影响。此外ｉａ这二种反转录酶的缓冲液有所不同。 最近，从嗜热栖热菌ＨＢ８中分离得到Ｔｔｈ耐热ＤＮＡ聚合酶，此酶还具有反转录酶活性，９５摄氏度时该酶的半衰期为２０分钟具有５—３外切酶活性，无３—５外切酶活性，利用Ｔｔｈ耐热ＤＮＡ聚合酶同时具有反转录酶的特点，可以简化ＲＴ－ＰＣＲ，并且比Ｔａｑ聚合酶反应敏感度高１００倍。所以更优越。Ｔｔｈ聚合酶作用温度高，可消除ＲＮＡ的二级结构对反转录反应的影响，增加ＴｔｈＤＮＡ聚合酶的反转录的活性，可增加ＲＴ－ＰＣＲ反应灵敏性。 ＴｔｈＤＮＡ聚合酶的缺点：反转录酶活性需要二价锰离子，而二价锰离子会降低ＤＮＡ聚合酶的忠实性， ＴｔｈＤＮＡ聚合酶催化聚合反应的错误掺入率为１／５００
聚合酶链式反应
实验9 聚合酶链式反应（PCR）技术 【实验目的】 掌握PCR反应的原理及操作技术。 【实验原理】 PCR 技术实际上是在模板DNA、引物和4 种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于耐高温DNA 聚合酶的体外酶促合成反应。PCR 技术的特异性取决于引物和模板DNA 结合的特异性。反应分为三步：1 热变性：在高温条件下，DNA 双链解离形成单链DNA；2 退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链；3 延伸：在DNA 聚合酶、dNTPs 和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA 链延伸反应。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA 片段得到了大量复制，数量可达到10 6~7个拷贝。 【器材与试剂】 1．器材 DNA 扩增仪（PCR 仪）、台式离心机、微量取液器、硅烷化的PCR 小管、琼脂糖凝胶电泳系统 2．材料 模板DNA，单、双链DNA均可作为PCR的样品。 3．试剂 (1) 10×PCR 缓冲液 (2) MgCl2 15mmol/L (3) dNTP 混合物：每种2.5mmol/L (4) Taq DNA 聚合酶：5U/μl (5) 引物1和引物2：2 μmol/L (6) 琼脂糖凝胶电泳试剂 【操作步骤】 1. 在0.2ml Eppendorf 管内依次混匀下列试剂，配制20μl 反应体系。
ddH2O 7.8 μl 10×PCR 缓冲液 2 μl MgCl2（15mmol/L） 2 μl dNTP（2.5mmol/L） 2 μl 引物1 (2μmol/L) 2 μl 引物2 (2μmol/L) 2 μl 模板DNA 2 μl Taq DNA 聚合酶（5U/μL）0.2 μl 总体积20 μl 2．按下述循环程序进行扩增 程序阶段程序名称温度时间循环数 1 预变性94℃ 3 min 1 变性94℃30 sec 2 退火52℃30 sec 30 延伸72℃30 sec 3 保温4℃∞ 1 3．扩增结束后，取10μl 扩增产物进行电泳检测。 【要点提示】 1．在90~95℃下可使整个基因组的DNA变性为单链。一般94~95℃下30~60sec。时间过长使TaqDNA聚合酶失活。 2．退火温度一般在45~55℃。退火温度低，PCR特异性差；退火温度高，PCR特异性高，但扩增产量低。。 3．延伸温度一般在70~75℃。此温度下TaqDNA聚合酶活性最高。一般扩增产物长度小于1 kb，延伸时间30 sec即可。当扩增产物长度大于1 kb时，可适当延长延伸时间。
PCR(聚合酶链式反应)原理
PCR(聚合酶链式反应)原理 PCR 是体外酶促合成特异DNA片段的方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即在高温（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在T aq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。 1971年Kleppe等人在Journal of molecular biology上发表文章首次准确、精炼、客观的阐述了PCR方法，1976年一种从嗜热水生菌(Thermus aquaticus)分离得到的热稳定的DNA依赖的DNA聚合酶的应用大大增加了PCR的效率。而现今所发展出来的PCR则是源于由Saiki和Mullis等人于1988年发表在Science上的一篇论文，Mullis当时服务于Perkin Elmer（PE）公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。后来PE被Applied Biosystems Inc.（ABI）公司收购、分拆、再转卖，而PCR的专利和倍受信赖的PCR仪器生产和销售就留在ABI名下。到如今，PCR方法愈发趋向自动化，并从中衍生出更多的新技术方法，可以说，PCR技术是支撑现代分子生物学发展的一块重要基石。这种技术的广泛应用催生了一个庞大的市场，多个公司均有各种类型的商品化PCR仪出售。PCR 的专利目前依然掌握在ABI和Roche（罗氏）两大公司手中，去年业界颇为引人瞩目ABI 诉MJ公司侵犯侵犯PCR仪知识产权案最终以MJ败诉并宣布破产、最终被Bio-rad收购暂告一段落。其后还会不会有后继的故事还需拭目以待。 PCR原理 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶的作用下，以单链为模版，根据碱基互补配对原则复制成新的单链，与模版配对成为双链分子挎贝。在体外实验中发现，DNA 在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计与模板DNA的5’端结合的两条引物，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制，多次重复“变性解链—退火—合成延伸”的循环就可以以几何级数大量扩增特定的基因。 发现耐热DNA聚合酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该类酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。 从PCR原理可以看出，PCR仪的关键是升降温的步骤。现在偶尔还能听到一些前辈们笑谈早年的PCR实验如何在3个水浴锅中完成的趣闻。经过不断改进，今天的PCR 已经越来越完善和智能化。出于市场推广的战略需要，各厂家的PCR仪型号不同，着力宣传的技术指标和参数也不尽统一，编者在这里简单列出选购时我们认为应该考虑的常用指标，希望有助于大家选购PCR仪的选购技巧。 PCR仪介绍及其选购 P CR仪的种类总体来说可以分为两大类：PCR扩增仪和实时荧光定量PCR仪，普通的PCR扩增仪又衍生出带梯度PCR功能的梯度PCR仪、和带原位扩增功能的原位PCR仪等等。1996年由ABI公司首先推出将扩增和检测融为一体的实时荧光定量
7、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR,rtpcr)
逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR，rtpcr） 逆转录-聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）可以：（1）分析基因的转录产物；（2）获取目的基因；（3）合成cDNA探针；（4）构建RNA高效转录系统。 逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA 高效转录系统。 实验材料：组织、细胞 试剂、试剂盒：RNA提取试剂、dNTP混合物、Taq DNA聚合酶、第一链cDNA合成试剂盒仪器、耗材：离心管、离心机、水浴锅、PCR管、电泳仪、凝胶图像分析系统、移液管、移液枪、离心管盒 一、反转录酶的选择 1．Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。 二、合成cDNA引物的选择 1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 2．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。3．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。 三、试剂准备 1．RMA提取试剂 2．第一链cDNA合成试剂盒 3．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 4．Taq DNA聚合酶
1聚合酶链式反应PCR技术
实验1 聚合酶链式反应（PCR）技术 【实验目的】 掌握PCR反应的原理及操作技术。 【实验原理】 PCR 技术实际上是在模板DNA、引物和4 种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于耐高温DNA 聚合酶的体外酶促合成反应。PCR 技术的特异性取决于引物和模板DNA 结合的特异性。反应分为三步：1 热变性：在高温条件下，DNA 双链解离形成单链DNA；2 退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链；3 延伸：在DNA 聚合酶、dNTPs 和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA 链延伸反应。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA 片段得到了大量复制，数量可达到10 6~7个拷贝。 【器材与试剂】 1．器材 DNA 扩增仪（PCR 仪）、台式离心机、微量取液器、硅烷化的PCR 小管、琼脂糖凝胶电泳系统 2．材料 模板DNA，单、双链DNA均可作为PCR的样品。 3．试剂 (1) 10×PCR 缓冲液 (2) MgCl2 15mmol/L (3) dNTP 混合物：每种2.5mmol/L (4) Taq DNA 聚合酶：5U/μl (5) 引物1和引物2：2 μmol/L (6) 琼脂糖凝胶电泳试剂 【操作步骤】 1. 在0.2ml Eppendorf 管内依次混匀下列试剂，配制20μl 反应体系。
ddH2O 7.8 μl 10×PCR 缓冲液 2 μl MgCl2（15mmol/L） 2 μl dNTP（2.5mmol/L） 2 μl 引物1 (2μmol/L) 2 μl 引物2 (2μmol/L) 2 μl 模板DNA 2 μl Taq DNA 聚合酶（5U/μL）0.2 μl 总体积20 μl 2．按下述循环程序进行扩增 程序阶段程序名称温度时间循环数 1 预变性94℃ 3 min 1 变性94℃30 sec 2 退火52℃30 sec 30 延伸72℃30 sec 3 保温4℃∞ 1 3．扩增结束后，取10μl 扩增产物进行电泳检测。 【要点提示】 1．在90~95℃下可使整个基因组的DNA变性为单链。一般94~95℃下30~60sec。时间过长使TaqDNA聚合酶失活。 2．退火温度一般在45~55℃。退火温度低，PCR特异性差；退火温度高，PCR特异性高，但扩增产量低。。 3．延伸温度一般在70~75℃。此温度下TaqDNA聚合酶活性最高。一般扩增产物长度小于1 kb，延伸时间30 sec即可。当扩增产物长度大于1 kb时，可适当延长延伸时间。
逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 详细 实验方法 ?逆转录-聚合酶链反应实验方法 实验材料 ?组织或细胞样品 试剂、试剂盒 ?RNA提取试剂 ?dNTP 混合物 ?Taq DNA聚合酶 ?第一链cDNA合成试剂盒 仪器、耗材 ?离心管 ?离心机 ?水浴锅 ?PCR管 ?电泳仪 ?凝胶图像分析系统 逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，R T-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
一、反转录酶的选择 1．Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H 活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScript Ⅱ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。 二、合成cDNA引物的选择 1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 2．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA 仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。 3．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。 三、试剂准备 1．RMA提取试剂 2．第一链cDNA合成试剂盒 3．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 4．Taq DNA聚合酶 四、操作步骤 1. 总RNA的提取：见相关内容。
第五章聚合酶链式反应
第五章聚合酶链反应及其相关技术 PCR技术从Mullis最初建立到现在共约20多年时间，因为此技术具有高特异性、高敏感性和简便快捷等特点而备受人们广泛应用，许多新型的PCR技术或由PCR衍生的新技术正不断出现，使PCR技术由最初的单一技术体系逐步发展成为一系列的技术综合。PCR技术在体外快速特异地复制目的DNA序列，理论上能将极其微量的（pg DNA）目的基因在较短的时间内（通常1-3h）扩增达到纳克、微克甚至毫克级水平，使产物极易被检测。因此PCR技术目前已经成为人们获取目标基因的最常用的方法之一，Mullis因其杰出的贡献，于1993年获得了诺贝尔化学奖。 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR) 是体外酶促扩增DNA或RNA序列的一种方法，它是一种不需要借助于分子克隆而可以在体外快速繁殖、扩增DNA的技术,它与分子克隆（molecular cloning）、DNA测序（DNA sequencing）一起构成了分子生物学的三大主流技术。在这三项技术中，PCR技术自1983年由美国Cetus公司Kary.Mullis提出并于两年后建立以来，得到了快速的发展，成为最常用的分子生物学技术之一。这项技术使人们能够在数小时内通过试管中的酶促反应将特定的DNA片断扩增数百万倍，给生命科学领域的研究手段带来了革命性的变化。由于PCR技术的实用性和极强的生命力，PCR技术成为生物科学研究的一种重要方法，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。目前，一系列的PCR方法被设计开发出来，并广泛应用于基因扩增与分离、医疗诊断、基因突变与检测、分子进化研究、环境检测、法医鉴定等诸多领域。 5.1 PCR技术原理 聚合酶链式反应（PCR）是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。它应用热稳定的聚合酶，通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，DNA片段以指数方式增加了百万倍。从非常微量的DNA甚至单个细胞所含有的DNA起始，可产生ug量的PCR产物（见图5-1）。 在PCR反应中，欲扩增的目的DNA片段由两条单链组成。首先合成出与两条链两端互补的寡聚核苷酸引物(约含20个核苷酸)，然后将起始反应液中的模板DNA加热而变性解链。在降低温度复性时，引物分别与A，B链两端的互补序列配对结合。最后，在DNA聚合酶的催化下，以目的DNA片段为模板进行聚合反应。第一轮反应结束后，目的DNA增加了一倍。新合成的DNA片段本身又能作为下一轮反应的模板。如此反复进行，DNA片段的数目可以呈
聚合酶链式反应PCR实验报告
实验二聚合酶链式反应（PCR） 一、实验原理 聚合酶链式反应（PCR）是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。它应用热稳定的聚合酶，通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，DNA片段以指数方式增加了百万倍。从非常微量的DNA甚至单个细胞所含有的DNA起始，可产生ug量的PCR产物。 二、器材与试剂 1.器材：移液器，EP管，热盖PCR仪，电泳仪，量筒，锥形瓶，微波炉，电子天平，紫外照色仪 2.试剂：引物，模板，Taq DNA聚合酶，原料（dNTPs），缓冲液与Mg2+，H2O, 2*PCRmix溶液，DNA染料 三、实验步骤 PCR反应体系的建立 取离心管，依次加入试剂混匀 1．H2O 12μl 2．模板1μl 3．引物T7 1μl 4．引物sp6 1μl 5．2*PCRmix 15μl PCR仪的热循环反应 把离心管放入PCR仪中，由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成
1.模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 2.模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至 56℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 3.引物的延伸：经加热至72℃左右DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶 的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复该循环30次，每次需要2-3分钟。 电泳检测结果 扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中，电泳结束后，放到紫外照射仪中进行透射，电泳明胶显示清晰的条带，如下图所示加入的为1号样，出现在500bp左右条带，而预算结果为扩增出492bp条带，故实验成功。
聚合酶链式反应(PCR)实验方法
聚合酶链式反应（PCR） 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA 得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。 PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途： (1) 生成双链DNA中的特异序列作为探针； (2) 由少量mRNA生成cDNA文库； (3) 从cDNA中克隆某些基因； (4) 生成大量DNA以进行序列测定； (5) 突变的分析； (6) 染色体步移； (7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。 一、试剂准备 1. DNA模版 2．对应目的基因的特异引物 3．10×PCR Buffer 4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
聚合酶链式反应及其在基因诊断中的应用
聚合酶链式反应及其在基因诊断中的应用 聚合酶链式反应于1983年由美国Cetus公司的发明，并和定点突变的发明者一起荣获1993年度诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。 一、PCR反应原理和反应过程 DNA的体外复制包括3个步骤： 变性（denaturation）:94 ?C ~95 ?C 退火（annealing）:40 ?C ~70 ?C 延伸（extension）:72 ?C 3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。 二、PCR的反应体系和反应条件 （一）PCR反应体系 参与PCR反应的主要成份: 模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和缓冲液等。 1 模板 包括基因组DNA、RNA、质粒DNA、线粒体DNA等。RNA作为模板时，须先将RNA 逆转录为cDNA，再以 cDNA作为扩增的模板。模板量：1000ng、500ng、100ng、50ng? 2、引物（Primers） 引物决定PCR扩增产物的特异性和长度，是化学合成的寡核苷酸片段。引物的 合成可以采用化学方法。引物设计时必须遵循一些原则。 设计引物的原则： 1）二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补 2）长度为18 ~ 25个核苷酸 3）二条引物之间避免形成引物二聚体 4）引物的碱基组成应平衡 5）引物退火温度计算：Tm=2（A+T）+（C+G）
6）引物的5`端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记） 3、脱氧核苷三磷酸（dNTP） 是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧核苷三磷酸的混合物。反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致，浓度过高虽能加快反应速度，但非特异性扩增也随之增加 dNTP浓度：20 ~ 200umol/L,浓度升高增加非特异性扩增。 4、DNA聚合酶 从一种生活在热泉（80℃~90℃）中的水栖噬热菌（Thermus aquaticus, Taq）中提取，有很高的耐热稳定性。 Taq 酶的作用:模板指导下，以dNTP为原料，在引物3’-OH末端加上脱氧单核苷酸，形成3’, 5’ -磷酸二酯键，使DNA链沿5’→3’方向延伸，催化DNA合成。 最适酶量：（酶量过多，导致非特异性扩增） Taq DNA聚合酶复制的保真性，Taq DNA聚合酶无3’→5’外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配。Taq DNA聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基替换率为1/8000，故扩增的片段越长，错配的机率越高。 耐热的 DNA多聚酶有Pwo DNA polymerase、Tth DNA polymerase、Pfu DNA polymerase具有较高的热稳定性，较高的保真性，降低碱基错配率2 ~ 10倍。 5、镁离子浓度 镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应系统本身、稳定核苷酸和提高Taq 酶的活性有直接影响。虽然Taq 酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关，但PCR反应体系中dNTP、引物、模板DNA及鳌合剂的存在均可与Mg2+结合而降低游离Mg2+的浓度从而影响酶的活性。 当dNTP浓度为200umol/L时，MgCl2的浓度为L较宜。 6、其它反应因素 pH：调节至酶反应所需的最适pH（ pH =左右） 盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物与模板杂交 基质：BSA、gelatin 、Tween20、DTT等（牛血清白蛋白或明胶等基质可以保护Taq 酶的活性） （二）PCR的反应条件 反应温度（变性、退火、延伸） 反应时间（变性、退火、延伸）
聚合酶链式反应
定义 （英文全称：Polymerase Chain Reaction），
性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。 编辑本段技术原理 复制成同样的两分子挎贝。在
简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。 对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。 编辑本段反应五要素
4种dNTP混合物各200umol/L 引物各10～100pmol 模板DNA0.1～2ug TaqDNA聚合酶2.5u Mg2+1.5mmol/L 加双或三蒸水至100ul PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+) 编辑本段PCR反应条件的选择
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 70℃ 60核苷酸/S/酶分子 55℃ 24核苷酸/S/酶分子 高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。 PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 编辑本段酶及其浓度
第二篇第八章 多聚酶链式反应
第二篇技术篇 第八章多聚酶链式反应 1、基本原理 PCR技术是在模板DNA、引物（人工合成）、Mg2+和4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）存在的条件下，利用DNA聚合酶（Taq酶）催化作用，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸的循环过程，体外大量扩增特异DNA片段。 （1）引物设计与合成 设计合成一对与目的DNA片段两侧翼序列分别互补的寡核苷酸引物。其中一引物与目的区段上游一条模板链的序列相互补，而另一引物与目的区段下游另一条模板链的序列相互补。 （2）DNA模板的变性 加热或强酸、碱性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为DNA 的变性。 （3）模板与引物的结合（退火或复性） 解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火。 （4）引物延伸 将反应体系温度升到72℃左右，在Mg2+存在的条件下，Taq聚合酶催化dNTP按碱基互补原则连接在DNA引物3ˊ端（5’→3’方向延伸），使引物延伸，形成两条与模板互补的新链。 以上为一次PCR循环（变性、复性和延伸），新合成的链可作为下一轮循环的模板 PCR原理Flash 演示 2、PCR反应体系与反应条件 （1）PCR反应体系 ◆模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 DNA模板一般100ng /100μL。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 ◆引物浓度 0.1-0.5 μmol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降 ◆Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 μl 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。 ◆dNTP 1
聚合酶链式反应技术
聚合酶链式反应技术 引言：聚合酶链式反应（PCR）是20世纪80年代后期由K.Mullis 等建立的一种体外酶促扩增特异DNA片段的技术。PCR是利用针对目的基因所设计的一对特异寡核苷酸引物，以目的基因为模板进行的DNA体外合成反应。由于反应循环可进行一定次数，所以在短时间内即可扩增获得大量目的基因。PCR技术具有灵敏度高、特异性性强、操作简便等特点。虽然PCR技术也存在出错倾向高、产物大小受到限制和必须预先有目标DNA序列等缺点，但仍被誉为20世纪分子生物学研究领域最重大的发明之一。Mullis也因贡献卓著而获得1993年度诺贝尔奖。目前，PCR技术已广泛应用于分子生物学的各个领域，在分子克隆、法医学鉴定、DNA序列分析、致病基因的检测及考古学等方面都发挥着重要作用。 操作过程： 聚合酶链式反应用于扩增一小段已知的DNA片断，可能是单个基因，或者仅仅是某个基因的一部分。与活体生物不同的是，PCR 只能复制很短的DNA片断，通常不超过10kbp。DNA是双链分子，因此用互补DNA双链的构造单位（核苷酸）来度量其大小，单位为碱基对（base pair, bp）。某些特定的方法可以扩增40kbp左右的片断，但是这种大小与真核细胞的染色体DNA相比仍然是很少的。例如，人的体细胞DNA含有大约30亿个碱基对。目前应用的聚合酶链式反应需要几个基本组成： 1、DNA模板（template），含有需要扩增的DNA片断。
2、2个引物（primer），决定了需要扩增的起始和终止位置。（见下面引物一节） 3、DNA聚合酶（polymerase），复制需要扩增的区域。 4、脱氧核苷三磷酸（dNTP），用于构造新的互补链。 5、缓冲体系，提供适合聚合酶行使功能的化学环境。 聚合酶链式反应在热循环设备中进行。PCR仪可以将反应管加热或冷却到每步反应所需的精确的温度。为防止反应体系中液体产生蒸气，通常在反应管上加盖加热的盖子（比加热板温度来的高），或者在反应体系表面加入一层石蜡油。 引物 特定的引物决定了所扩增的DNA片断。引物是人工合成的短DNA片断，一般不超过50个碱基（通常18－25个），它们与所要扩增的DNA片断的起始和终止区域完全互补。在“黏合”时引物结合于DNA模板的起始和终止点，DNA聚合酶结合到这两个位置，开始合成新的DNA链。 选择引物的长度和熔点（Tm）要考虑许多条件。引物的熔点与聚合酶链式反应第一步中DNA的熔点不同，是指50％的引物与模板结合的温度，高于这个温度引物与模板就不能有效结合。这个温度随着引物长度的增加而升高。如果引物长度太短，就有可能与DNA模板的几个位置结合，造成非特异性复制。另一方面，引物长度也受限于Tm。如果Tm太高，即高于80℃，也会导致问题，因为DNA聚合酶在此温度下活性较低。引物最优长度通常为20到40个碱基，熔
逆转录PCR原理及步骤
逆转录PCR RT-PCR和逆转录PCR是同义词，已合并。 RT-PCR 为反转录PCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。 目录 1mode逆转录PCR 2实时PCR 3RT-PCR技术相关试剂 4PCR各步骤的目的 1 4.1 预变性 1 4. 2 三种循环 1 4.3 延伸时间原因 1 4.4 PCR引物的选择 1 4.5 注意事项 1mode逆转录PCR 由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互补DNA。 RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。（检测基因表达的方法，参见Northern Blot法。 RT-PCR的关键步骤是在RNA的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒（avian myeloblastosis virus,AMV）反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒（moloney murine leukemia vrius,MMLV）反转录酶。 RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。 2实时PCR 实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅
高中生物聚合酶链式反应技术
高中生物聚合酶链式反应技术2019年3月21日 （考试总分：100 分考试时长： 120 分钟） 一、单选题（本题共计 20 小题，共计 100 分） 1、（5分）下列对于相关实验共性的叙述，错误的是 A．“分离绿叶中的色素”和“胡萝卜素粗品的鉴定”都要用到纸层析法 B．“分离土壤中分解尿素的细菌”和“菊花的组织培养”都要使用琼脂 C．“果酒制作”和“探究酵母菌细胞呼吸方式”都用重铬酸钾检测酒精 D．“分离纯化大肠杆菌”和“分离纯化血红蛋白”都要使用差速离心法 2、（5分）下列关于生物技术应用的叙述，正确的是 A．从酶的固定方式看，物理吸附法比化学结合法对酶活性影响小 B．作为消化酶使用时，蛋白酶制剂只能以注射的方式给药 C．加酶洗衣粉中酶制剂可以被重复利用，提高了酶的利用率 D．将海藻酸钠凝胶珠用自来水冲洗，可洗去多余的CaCl2和杂菌 3、（5分）下列关于PCR技术的叙述，错误 ．．的是 A．PCR技术的基本原理是DNA双链复制 B．每次循环可分为变性、复性和延伸三步 C．参与PCR的物质有引物、酶、脱氧核糖、模板等 D．一个模板DNA分子第n次循环需要2n-1对引物 4、（5分）平板划线法和稀释涂布平板法是接种微生物的两种常用方法，下列描述正确的是 A．采用平板计数法获得的菌落数往往多于实际的活菌数 B．平板划线法是将不同稀释度的菌液通过接种环连续划在固体培养基表面 C．稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液倒入液体培养基中进行培养 D．与平板划线法相比，稀释涂布平板法形成单菌落的效果更好 5、（5分）关于电泳的说法不．正确的是 A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 B．带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动 C．蛋白质在醋酸纤维薄膜上的移动速度取决于它所带净电荷的多少 D．电泳后需经染色、漂洗和脱色，才可长期保存 6、（5分）下列关于“DNA粗提取和鉴定”实验的叙述，正确的是 A．酵母菌、菜花和猪的成熟红细胞都可作为提取DNA的材料 B．在酒精溶液中，某些蛋白质的溶解度比DNA大 C．在研磨植物细胞时加入洗涤剂是为了溶解DNA D．在50～60 ℃的水浴中，DNA遇二苯胺试剂后即呈蓝色 7、（5分）PCR(多聚酶链式反应)技术是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，如图表示合成过程。下列说法错误的是 A．甲过程高温使DNA变性解旋，该过程不需要解旋酶的作用 B．丙过程用到的酶在高温下失活，因此在PCR扩增时需要再添加 C．如果把模板DNA的两条链用15N标记，游离的脱氧核苷酸不做标记，循环3次后，在形成的子代DNA 中含有15N标记的DNA占25% D．PCR中由碱基错配引起的变异属于基因突变 8、（5分）下列哪些是进行PCR扩增所必需的条件 A．限制酶 B．DNA连接酶 C．Taq酶 D．解旋酶 9、（5分）下列关于生物工程中常见的几种酶的叙述，正确的是 A．DNA连接酶可把目的基因与载体的黏性末端的碱基黏合，形成重组DNA B．纤维素酶是细胞工程中常用的工具酶，可获得单个动物细胞 C．Taq酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA聚合酶 D．纤维素酶和果胶酶处理植物细胞获得原生质体，便于植物杂交育种 10、（5分）“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在P CR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如图2所示，其中第⑤种DNA分子有几个： A．2 B．4 C．6 D．8 11、（5分）生物产品的分离、纯化是现代生物技术中一种常见的技术。下列关于物质提取、纯化原理的叙述中，不正确的是 A．采用凝胶色谱法分离果胶酶的原理是蛋白质分子的相对分子质量不同，在色谱柱中的移动速度不同B．使用透析法可以去除样品中相对分子质量较大的杂质 C．电泳法是利用样品中各种分子带电性质和数量以及样品分子大小不同，产生的迁移速度不同而实现样品中各种分子的分离 D．离心法分离蛋白质的依据是不同大小的分子离心时沉降速度不同 12、（5分）要将菊花茎段细胞培养成完整的植株，无需 A．选用生长旺盛的嫩枝 B．离体状态并且具有完整细胞核的细胞 C．导入外源基因