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Nisin的防腐特性及其在食品工业中的应用_刘晓雪

布洛芬颗粒用于缓解轻至中度疼痛如头痛、关节痛、偏头痛、牙痛、肌肉痛、神经痛、痛经,也用于普通感冒或流行性感冒引起的发热,疗效确切,原质量标准中收载的检查项中无有关物质的检查,我们采用高效液相色谱法对布洛芬的有关物质测定进行了研究,并确认了其中的单个主杂质为2-[4-(2-甲基丙烯基)苯基]丙酸。

参考文献

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[2]刘芳、柳小秦等.HPLC法测定布洛芬原料及制剂的有关物质[J].药物分析杂志,2011,31(3):552页~553页.

收稿日期:2016-03-14

(内文见下页)

·科研园地·

Nisin的防腐特性及其在食品工业中的应用

刘晓雪,葛菁萍,宋刚,平文祥

黑龙江大学生命科学学院/微生物省高校重点实验室(哈尔滨150080)

摘要:食品保藏过程中腐败菌和致病菌的产生一直是人们研究的主要问题。工业防腐剂对人的身体以及环境都或多或少存在伤害,因而寻求广谱、高效、低毒的天然防腐剂成为了一种最新的趋势。乳酸链球菌素(Nisin)是某些乳链球菌产生的一种活性多肽物质,它通常被用来作为食品的生物防腐剂,并且在一些药物、兽医和保健品的制作过程中发挥着潜在的作用。本论文主要讲述Nisin的抑菌机理及其在食品工业中的应用研究进展。

关键词:细菌,乳酸菌,Nisin,食品储藏

中图分类号:TS201.3文献标识码:A文章编号:1006-2882(2016)02-195-004

DOI:10.14035/http://www.wendangku.net/doc/745cc3d1bcd126fff6050bc3.htmlki.hljyy.2016.02.002

Antiseptic Speciality of Nisin and the Application in Food Industry

Liu Xiaoxue,et al

Key laboratory of microbiology of Heilongjiang Province,College of Science,Heilongjiang

Univerisity(Harbin150080)

Abstract:The production of spoilage organisms and pathogenic bacterium is always a major problem to study for people in food preservation process.There have more or less damage for human bady or environment about the Industrial preservative,thus in search of a natural preservatives that spectrum,efficient,low toxicity has been a new tendency for the food preservation.Nisin is a natural an-timicrobial peptide produced by some strains of Lactococus lactis http://www.wendangku.net/doc/745cc3d1bcd126fff6050bc3.htmlctis that not only as a biological preservative of food,but also have some potential effect to the making process of drugs,veterinarian and health product.The present paper mainly describled that the antibacterial mechanism of Nisin and the research progress of it in the food industry.

Key words:bacteriocins;Lactococus lactis;Nisin;food preservation

Nisin是一种由乳酸链球菌乳酸亚种(Lactococus lac?tis http://www.wendangku.net/doc/745cc3d1bcd126fff6050bc3.htmlctis)某些菌株产生的一种小肽,它可以有效的抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长,同时也是一些杆菌以及梭状芽胞杆菌孢子的副产物。乳酸菌是一种非孢子微需氧菌,它们在生牛奶中作为一种自然菌群,其碳水化合物的主要发酵产物是乳酸。由乳酸菌产生的细菌素(LAB)作为抗菌多肽的一种异质群体,LAB在活性谱、作用方式、分子质量、遗传起源和生化特性上都与其他抗菌肽存在着

差异。各物种间,抗菌肽是产生的第一道防线,同时先天性免疫也是其中一部分。人们通常将细菌素与抗生素相混淆,然而其主要的区别在于抗生素不是核糖体合成的,此外抗生素的基本作用方式、抗菌谱、毒性和耐药机制也与细菌素存在着诸多不同[1]。

Nisin是由乳酸乳球菌乳酸亚种产生的一种小分子量的抗菌多肽或细菌素。它作为一种生物防腐剂已经长达40年,其最早发现于20世纪末30世纪初,而它在当时被认为是牛奶中的一种有毒物质,并且对奶酪的起始发酵剂有着不利的影响。在1947年国家研究所对乳制品业进行的研究中,Nisin可作为一种食品防腐剂的理论才刚刚崭露头角。1951年,Hirsch等人对其作为一种防腐剂进行了第一次深入的研究,1952年Nisin被用于用于奶酪的加工中。1957年,Nisin的第一种商业化的产品Nisaplin在英国面世。1962年Nisin被证明是无毒的,并由多名研究员在1971年阐明了其分子构造。1969年JECFA对商业Nisin浓缩液的纯度和特性进行了定义,WTO于1970年创造出了Nisin的国际参照物[2-3]。目前Nisin已被多个国家广泛应用于牛奶、奶酪、罐装食品、鱼肉制品、啤酒、饮料、日用甜食和沙拉等的防腐保鲜,其中包括EEC(Nisin作为食品添加剂特定的编号是E234)和USA等国家。

1Nisin的特性与抑菌作用

1.1Nisin的抑菌圈

Nisin对革兰氏阳性菌有较强的抑菌活性,但是对革兰氏阴性菌、酵母菌以及霉菌的抑菌性能极弱。革兰氏阳性菌芽孢如梭状芽胞杆菌对Nisin尤其敏感,其芽孢对Nisin的敏感度强于营养细胞。Nisin对乳酸菌也有抗菌性,乳酸菌可在低pH值的条件下生长,因而Nisin可以用作为经过热处理的低pH值食物的防腐剂,例如色拉调味料和酒精饮料[4]。实际上,酵母对Nisin的敏感度意味着酵母可以与Nisin共同发酵来控制乳酸菌的生长。此外Nisin也对病原体李斯特菌有显著的抑菌活性,李斯特菌可以在低温下生长,并且可以在老、幼、病、孕和免疫功能不全的人群中导致重病并且死亡率很高。研究得到,现在已经实施了在很多食物中利用Nisin的方法来消除李斯特菌。

Nisin对于营养细胞和芽孢的敏感度在不同的属之间甚至是相同物种的不同菌株之间是存在差异的[5]。

1.2Nisin对营养细胞的抑制作用

Nisin以一种浓度依赖性的方式发挥作用,即大量的施加Nisin和大量的抑制或杀死营养细胞以及孢子。抑制营养细胞的主要作用位点是细胞质膜,Nisin以一种电压依赖方式来充当膜消除剂。Henning和他的同事通过研究充分证实了,Nisin的抑菌效果是通过Nisin和细胞质膜的磷脂成分相互作用产生的。他们也证明了分离的细胞质膜碎片可以抵消Nisin的抑制作用,而Nisin与磷脂结合形成了Nisin-磷脂复合物[6]。对Nisin的最新进展表明,其作用于细胞质膜并依靠质子动力和膜脂质成分形成瞬态空隙,此作用方式已经对在膜质体体外的研究中被证实。

Nisin对营养细胞的抑制作用又被称为杀菌或抑菌,这取决于Nisin的浓度和细菌的浓度,生理状态以及主导条件。当试验条件为细菌生长最适宜的时候,例如最适温度,最适pH值,水分活度,氧化还原电位和养分的有效性以及细菌在精力充沛的条件下,Nisin将会呈现一个更明显的杀菌效果。相反,细菌的抑菌或杀菌作实现于Nisin多样的保存系统中,这些非最佳的因素或者存在其他的防腐剂,亦或存在热损伤作用。很多微生物学家将这种食品的多因素保存方法作为一项栅栏技术进行了研究。实际上,需要提供不同的条件来确保对食物中的细菌是采取破坏还是抑制的方法,对此食品微生物学家应该将其纳入考虑的范围之内。

1.3对孢子的抑制作用

在大多数情况下,对细菌孢子的抑制作用会比杀死孢子的过程更缓慢。Nisin应用于热处理食品中作为一种食品防腐剂具有重要的意义,这也意味着在整个货架期内必须保持含有充分的残余Nisin,以提供一个对任何孢子都有持续作用的条件。另一个重要的发现是,孢子进行越强的热处理其对Nisin的敏感程度越高。例如,梭状厌氧菌PA3679的孢子在121.1℃的条件下热处理存活3min时,此时其对Nisin的敏感度是未经过热处理时的10倍。因此人们对很多物种经过热处理后芽孢对Nisin的敏感效果进行了研究,这已经成为Nisin在热加工食品中作为防腐剂时的一个重要因素。

Gould和Hurst发现机械断裂后的孢子比裂解后的孢子对Nisin更敏感。一些嗜热菌的孢子,例如嗜热芽孢杆菌和热解糖梭菌都对Nisin尤为的敏感[7]。这导致考虑将Nisin 加入在到蔬菜罐头中,以满足在异常高温的条件下长期储存食品的要求,例如,军用口粮的储存。1984年,Morris等人已经研究了在分子水平上Nisin对孢子的抑制作用方式。他们发现Nisin对孢子的抑制作用是通过Nisin和残余蛋白质的巯基结合产生的。磷脂不是牵连的,马里兰大学的Hansen展开了更进一步的工作,即利用遗传的方法表明Nisin的变体是由具有抗菌活性的孢子而不是营养细胞产生的,反之亦然。这清楚的表明,Nisin对孢子的抑制作用方式与其对营养细胞的抑制作用方式是具有很大差异的。

1.4稳定性和溶解性

在使用Nisin作为食品防腐保鲜剂的时候,要考虑它们的稳定性和溶解性。在一个干燥、避免阳光直射、防潮以及

基金资助:国家自然科学基金(31470537)

作者简介:刘晓雪,女,1991年12月出生,黑龙江省齐齐哈尔市人,硕士。

通讯作者:平文祥,男,1959年出生,黑龙江呼兰人,教授,博士,微生物遗传育种。

在不超过25℃的温度下储存时,Nisin的浓度非常稳定。Ni-sin在水溶液或悬浮液在pH值为2,温度在115℃至121℃的条件下长时间加热依然保持活性;在pH值为5到7之间时,Nisin逐渐变的不稳定并且在高温加热时活性显著降低。巴氏灭菌的温度对Nisin尚有较低程度的损害,并且其活性仍然能够保持在80%左右,例如,在加工奶酪的标准进程中。在加热过程中与在缓冲液中相比,食品的不同成分可以不同程度的保护Nisin分子。

Nisin更易溶于酸性基质中,并且pH越接近中性越逐渐难溶。在pH值为2.2时其的溶解度大约是56mg/mL,pH值为5时溶解度为3mg/mL,并且在pH值为11时溶解度为1mg/mL[8]。实际上,利用Nisin处理过的食品防腐剂的溶解度不可能超过0.25mg/mL,然而溶解度也不会成为一个难题。

1.5拮抗因素

食物中的不同因素会影响或部分影响Nisin,处于非加热或者最低限度热加工状态下,源于微生物,植物或者动物的蛋白水解酶在食品的货架期期间可以使Nisin的含量降低。有研究表明,Nisin的保留情况取决于储存的温度,储存的时间长短和pH值,这也是决定Nisin添加量的一个因素。

Nisin是具有疏水性的物质,食品中的脂类物质可以干扰食品内部的均匀分布,并且作用于细菌的Nisin较难获得[9]。某些食品添加剂已经被证明与Nisin对立,例如,Nisin在含有焦亚硫酸钠(一种抗氧化剂,漂白光谱的抗微生物制剂)以及二氧化钛(增白剂)的食品中的被分解。相比较固体和异构的食品,Nisin更适合在液体和同质商品中作用。早在1993年Richard发现将Nisin加入到牛奶中后进行HTST处理(在72℃加热数秒钟)与牛奶在100℃的条件下热处理10min相比李斯特菌的活力较低。他把这种现象归因于在加热的过程中蛋白质变性:越温和的热处理蛋白质越束缚Nisin,该性能还需要进一步的考察。

2Nisin在食品工业中的应用

2.1奶酪产品的加工

Nisin最早在奶酪产品的加工中作为一种食品防腐剂,如今这仍然是Nisin主要的应用领域之一。这些产品制造商所用的原料主要是原奶酪,黄油和脱脂奶粉,往往也添加各种香料,磷酸盐或柠檬酸乳化盐以及水。其中尤其是奶酪,经常存在厌氧梭菌的孢子,他们通常能够在85-105℃的热处理条件下存活6-10分钟,直至溶解过程结束。加工奶酪的成分在高pH值和高水量的条件下结合低氧化还原电位,可以有利于这些孢子的生长,由于随后产生的气体,异味等因素导致奶酪变质[10]。与奶酪变质相关的梭菌属是丁酸梭菌,酪丁酸梭菌和产孢梭菌,其中英国已经使用鸡尾酒中的上述梭菌属的孢子(以每克200个孢子计)进行了奶酪生产加工的试验。

在加工的奶酪产品中,潜在的肉毒梭菌的生长和产毒

具有重大的研究意义。Nisin的加入量取决于下列因素:孢子存在制剂中的水分含量,pH值,盐含量,使用香料添加剂的量,烹调过程的时间长短以及保质期内所需要的温度。Nisin用于防腐的量大致在5-20μg/g,而用于抗肉毒梭菌的是12.5μg/g以及更高。

2.2其他的巴氏消毒的乳制品

在很多高温和冷藏温度不足或运输设施不齐全的国家中,Nisin的浓度在0.625-1.25μg/mL之间时对巴氏消毒的牛奶作用效果最明显,而在2.5-3.75μg/mL之间对巴氏杀菌调味奶和乳品甜点作用效果最好[11]。

2.3蔬菜罐头

低酸罐头食品(pH值大于4.5)在Fo=3的最低限度的热处理过程中(即最小的高压蒸煮),可以使肉毒梭菌孢子受到破坏。当Fo≥3时,常规的消毒方法很难将耐热孢菌,如嗜热脂肪芽孢杆菌和热解糖梭菌的耐热芽孢完全杀死。因此,Nisin在低酸蔬菜罐头是通过控制嗜热腐败微生物的生长,来促使产品在温暖的环境下能够长期储存。使用Nisin 时也可以允许Fo低于3,然而这也不会增加嗜热变质的潜在风险[12]。高酸食物(pH值小于4.5)的细菌性腐败,仅限于非致病性,耐热,耐酸,以及形成孢子的细菌,例如巴氏梭菌,浸麻芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌。Nisin可以对这些细菌的生长变质进行有效的控制。

2.4高分子热板烘焙产品(松饼)

松饼是在英国和澳大利亚尤其受欢迎的高水分面粉产品。他们由面粉糊在一个热的金属板上进行生产,其中含有酵母或疏松剂,以提升它们的外观形态。他们在使用前要进行传统的烘烤,而其具有非酸性(pH6-8),高水分(48-54%),以及高水活性(0.95-0.97)等特点。该产品在室温的条件下出售。

已经发生的一些食物中毒事件中,究其原因是松饼中蜡状芽孢杆菌的生长。制造松饼使用的面粉不可避免的含有少量的蜡状芽孢杆菌的孢子。在烹饪的过程中松饼的底部进行高热处理,但是松饼的其余部分将进行较低的热处理,因而芽孢杆菌孢子容易生存。在产品3-5天的保质期期间,蜡状芽孢杆菌孢子的数量从无法可检测增长到超过105/g,这足以引起食物中毒[13]。在澳大利亚和英国进行的研究表明,保质期的最后未处理的松饼中分离出的蜡状芽孢杆菌对Nisin很敏感。在面粉糊中加入Nisin的量在3.75μg/g时能够有效的防止食品中毒。

2.5巴氏杀菌液蛋制品

液蛋是指禽蛋打蛋去壳后,将液蛋经杀菌处理后包装,代替鲜蛋进行产品销售。巴氏杀菌鸡蛋产品(整体,黄色和白色)接受热处理(通常时62-65℃,2-3min),以确保沙门氏菌的破坏。然而,这样的热处理不足以杀死细菌孢子以及革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。许多这些存活的细菌能够在冷藏的温度下生长,而巴氏杀菌液蛋产品通常具有有限

的货架期。人们采用2.5-5mg/g的Nisin作为一种有效的防腐剂来延长货架期,同时其对嗜冷蜡状芽孢杆菌也有抑制作用。试验表明,Nisin对蛋清比对蛋黄更有效[14]。这可能是由于蛋黄中存在的高磷脂量阻止了Nisin的作用方式,以及蛋清中存在其他的抗菌因素,例如,伴清蛋白和溶菌酶。从蛋清中提取的溶菌酶与Nisin有协同作用,并且这种结合比任何单独使用具有更宽的抗菌谱。

2.6肉类

硝酸盐作为肉制品加工过程中常用的染色剂,能有效地抑制肉毒杆菌的生长繁殖。但含硝酸盐的食物有致癌的危险,故世界各地对其用量都有严格的控制。对腌制肉中高亚硝酸盐含量的关注使很多研究人员考虑其他的储藏系统,其中包括亚硝酸盐含量的减少以及添加Nisin。有研究表明在质量浓度为25mg/L时,明显降低了单核细胞增生李斯特氏菌的水平,且对蟹肉、鲤鱼、龙虾肉组织没有任何损伤[15]。

2.7酒精饮料

Nisin潜在的控制啤酒和葡萄酒的中乳酸腐败菌生长的研究已经在欧洲开展。研究表明,虽然乳酸腐败菌对Nisin 很敏感,但是酵母完全不受影响,这个重要的因素使得允许在发酵的过程中添加Nisin[16]。在酿造工业中通常应用发酵罐来防止或者控制污染现象的发生;用洗涤酵母的方法代替众所周知的酸洗以消除污染菌,影响酵母的存活力,减少巴氏杀菌的过程,并增加未消毒的或瓶装的啤酒的货架期,此应用在葡萄酒行业也相当适用。

除酒精饮料的生产外,Nisin也可以使用在蒸馏酒精的生产中。将Nisin加入到受乳酸菌自然污染的发酵麦芽浆中,后者的活性可控制,酵母的竞争力低于基质,从而导致酒精产量的增加。Rojo等研究发现,Nisin和亚硫酸盐能有效的控制葡萄酒酿造时乳酸产生苹果酸的过程,并且也减少了亚硫酸盐的添加量[17]。

2.8沙拉酱

印第安州纳州立大学研究了使用Nisin来控制沙拉酱中乳酸腐败菌的生长。作为美国沙拉酱生产的一个必要要求是少酸,这改善了沙拉的风味以及增加了风味成分[18]。在室温储藏时,若沙拉酱的pH值从3.8升高至4.2会使其更易发生变质,而解决这种问题的方法是添加2.5-5mg/L的Nisin。

2.9自然奶酪

天然的奶酪产品对很多不同的革兰氏阳性微生物敏感,多个研究小组通过利用Nisin生产发酵剂来制造奶酪。许多软的,表面成熟类型的奶酪非常容易侵染李斯特菌,而且数量极多。由未加热的新鲜牛奶制成的奶酪中,不同的内源性乳酸菌会引起异味和其他气体。奶酪在很多手工条件下进行生产时,通常会感染很多不良的金黄色葡萄球菌,例如在奶厂[19]。豪达奶酪和埃文达芝士存在的主要细菌问题是由于酪丁酸梭菌发生的丁酸发酵引起的。Nisin对奶酪中所有的有害微生物都具有抗菌活性。

目前,尤其是在大的工业生产中,通过将如硝酸钠等的其他试剂加入到干酪乳中来进行奶酪的保护。因为这种方法越来越不受欢迎,并且通常只能作用于特定的微生物(如梭菌),Nisin的使用成为了一个具有吸引力的替代方案。由于在奶酪中直接加入Nisin的成本太高,并且存在不可直接用于天然奶酪以及效率低等限制因素,使得Nisin产生菌成为了首选策略。然而,Nisin产生菌中不含有香料,以及不具备酸活性和噬菌体抗性,故其对于大多数干酪奶的制造就显得极其适用[20]。

3展望

Nisin是一种理想的天然、高效的食品防腐剂,已成为食品科学研究的热点之一,符合未来防腐剂的发展要求以及满足人们对健康的追求。作为一种天然防腐剂,Nisin无毒副作用而且可以通过微生物发酵法大量生产,成本较低。但Nisin也存在着诸多的限制因素,如代谢性能差、代谢时效常、抗菌谱窄等。而且在实际应用中我们对Nisin的作用机理、抗菌谱研究的不够透彻,这一问题会在一定程度上影响Nisin的正常作用及开发,因此需要更进一步的研究。然而尽管如此,Nisin在生物防腐剂方面的应用依旧受到广泛关注,而且其必将具有更广阔的应用前景。

参考文献

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收稿日期:2016-04-10

基于G6PD/6GPD比值法的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶测定试剂盒性能分析

郭锐1,朱丽东1,冯健明2,徐倩2

1.广州医科大学附属第二医院血液内科实验室(广州510260);

2.广州市丰华生物工程有限公司(广州510730)

摘要目的:对基于G6PD/6GPD比值法的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶测定试剂盒进行性能分析。方法:从试剂盒灵敏度、重复性及与对照试剂盒进行临床对比方面评价试剂盒的性能。结果:试剂盒对G6PD和6PGD的分析灵敏度分别为0.03U/gHb 和0.02μg/ml;20次检测质控品C1和C2,变异系数分别为4.18%和6.12%;该试剂盒对1000例临床样本的敏感度、特异性及总符合率均为1.00,误诊率为0.001,漏诊率为0,P=1.000>0.05,差异无统计学意义。Kappa=0.962(P<0.01),广州丰华公司的试剂盒与对照试剂盒的临床检测结果具有高度的一致性。结论:广州丰华公司的试剂盒操作简单,结果可靠,由于该方法能检出G6PD缺乏症杂合子,弥补了荧光法检测G6PD缺乏症的不足,更适合推向市场。

关键词:G6PD/6GPD比值法;葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症;新生儿筛查;试剂盒;出生缺陷

中图分类号:R556.6文献标识码:A文章编号:1006-2882(2016)02-199-004

DOI:10.14035/http://www.wendangku.net/doc/745cc3d1bcd126fff6050bc3.htmlki.hljyy.2016.02.003

Performance Analysis of Determination Kit Using G6PD/6PGD Ratio for

Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase

Guo Rui,et al

1.Blood medical laboratory in the second affiliated hospital of Guangzhou Medical University,

(Guangzhou510260,China)

(内文见下页)