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动物超数排卵技术研究进展_王新蕾

动物超数排卵技术研究进展

王新蕾1, 邵义祥1, 王 鹏2

(1. 南通大学实验动物中心,南通226001; 2.苏州大学基础医学院,苏州215123)

[摘要] 基于哺乳动物超数排卵技术在畜牧生产、濒危动物物种保存和生物工程研究中的重要作

用以及其对人类辅助生殖技术的特殊贡献,本文概述了国内外超数排卵技术中各种超排激素的用途和特点,介绍了超排技术在不同种属哺乳动物中的应用,以及此项技术最新的研究进展。[关键词] 哺乳动物; 超数排卵; 激素; 辅助生殖技术

[中图分类号] Q95-33 [文献标识码] A [文章编号] 1004-8448(2007)04-0280-05

[收稿日期] 2007-03-16[作者简介] 王新蕾(1980-), 女, 硕士研究生, 主要从事临床医 学检验与实验动物模型的研究。

E-mail:wxl_wp@163.com[通讯作者] 邵义祥, 男, 博士, 副教授, 主要从事实验动物学

 研究 E-mail: shaoyx@ntu.edu.cn

超数排卵是在雌性哺乳动物发情周期的一定阶段,应用外源性促性腺激素诱导卵巢多个卵泡发育,并排出具有受精能力的卵子的方法,简称“超排”。通过外源性激素的注入,提高血液中促性腺激素浓度,降低发育卵泡的闭锁,增加早期卵泡发育到成熟卵泡的数量,从而使雌性动物每次排卵数目增加[1]。通过超数排卵技术,可以充分挖掘母畜的繁殖潜力,为胚胎移植提供充足的胚胎。因此,超数排卵技术是胚胎移植过程中必不可少的一环,同时也是进行转基因动物生产和动物克隆等研究中应用的一种重要的技术手段。

超数排卵技术的研究始于20世纪20年代,Smith和Engle首先发现了超数排卵现象[2], 他们在性成熟的雌性小鼠身上做了垂体前叶组织肌肉埋植试验, 结果从输卵管内回收了60多个卵子, 大约是正常的4~5倍。此后不久, Cole和Hart发现了孕马血清可使未成熟大鼠超排, 奠定了超排技术的基础[2]。基于超数排卵技术在畜牧生产、濒危动物物种保存和生物工程研究中的重要作用以及其对人类辅助生殖技术的贡献,本文就其研究进展作一综述。

1 超数排卵中常用的激素

用于动物超数排卵的激素种类较多,但目前较常用的超排激素大体分为两大类:一类是促进卵泡生长发育,主要有孕马血清促性腺激素(PMSG)和卵泡刺激素(FSH); 另一类是促进排卵,主要有人绒毛膜促性腺激素(hCG)和黄体生成素(LH)。

1.1 PMSG

是动物中广泛应用的超排激素,是一种糖蛋白激素,具有FSH和LH双重作用,但由于其分子中N-乙酰-神经氨酸含量较高,导致PMSG在动物体内半衰期较长,远远高于LH[3]。因此,使用后会引发多种不良效应,如卵巢囊肿,卵巢易出现大量不排卵卵泡,黄体早期退化,胚胎发育不正常,超数排卵的季节性变异范围大等等[4]。这些都会影响超数排卵的效果。

1.2 FSH

也是一种较常用的超排激素,由于其在动物体内的半衰期短,因此需要多次注射,处理程序烦琐。但最近有人报道将FSH溶于30%的聚乙烯吡咯酮(PVP) 中,由于PVP对FSH具有包被和缓释的作用,可延长FSH在动物体内的半衰期,从而减少FSH的注射次数,简化超排的操作程序[5]。1.3 LH

常与FSH配合使用,LH可和FSH协同作用促进卵泡成熟、触发排卵、促进黄体形成并分泌雌

激素和孕激素,在动物的生殖过程中发挥着重要作用[6]。LH峰是控制排卵发生的关键因素,注射外源性LH,增加卵巢血液供应,诱发排卵。

1.4 hCG

与LH的生物学作用与免疫特性基本相似,常与PMSG和FSH配合使用,具有促黄体激素的作用,于卵泡发育近成熟时给药可促进排卵,并可有力阻止PMSG超排引起的动物黄体早期退化。

另外,促性腺激素释放激素(GnRH)也可用于动物超排。排卵前由于成熟卵泡分泌的雌激素高峰对下丘脑产生正反馈作用,下丘脑大量释放GnRH,刺激垂体合成与释放促性腺激素,LH和FSH分泌增加,刺激排卵。应当注意的是,应用于超排的激素用量应适当,不应过高或过低,剂量过低,不足以引起较多卵泡的成熟,剂量过高又会引起“过刺激”(Overstimulation), 从而减少胚胎和卵母细胞的收集率。

2 超数排卵技术在不同哺乳动物中的 应用及研究进展

2.1 大﹑小鼠

大﹑小鼠具有繁殖力强,易饲养,给药方便等特点,在实验研究中应用广泛,特别是小鼠,由于其体形小,生长快,因此是生物医学研究领域应用最广泛的实验动物,因此对其进行超数排卵的研究对动物胚胎工程等工作的开展具有重要意义。有关大、小鼠超排的文献国外报道较多[7,8],方法是通过注射不同的外源激素,如Kon等用PMSG和hCG在成年Wistar大鼠动情周期诱导其超排[9],Nariai等用黄体生成素释放激素类似物诱导小鼠超排[10],Kanter等用GnRH激动剂来增加小鼠的排卵数量[11],均取得良好成效。国内李秦等曾报道用PMSG和hCG对SD大鼠进行超数排卵,注射间隔时间为72 h, 腹腔注射激素40IU/只,达到最佳超排效果[12]。梁成光报道间隔72 h, 肌肉注射激素60 IU/只,收集Wistar大鼠囊胚[13]。左琴等则证实大鼠的超排与小鼠超排相似,间隔48 h 腹腔注射激素50 IU/只,Wistar 大鼠的超排效果最好[14]。戴丽军等对各品系小鼠超排的激素剂量和注射间隔时间进行比较,得出最佳激素剂量为5 IU PMSG+5IU hCG,最适合的注射间隔时间为48 h[15]。高善颂等采用四种不同剂量PMSG(2.5~10.0 IU)和hCG(2.5~10.0 IU)对小鼠超排,也得出同样结论[16]。Kagabu等通过实验证明对小鼠进行超排时,选择12周龄的小鼠,可以得到较多的卵子[17]。各种动物的排卵都依赖于LH,在发情周期中,当内源性LH达到高峰时,即触发排卵。在超排反应中,内源性LH不足以满足大量卵泡成熟的需要,若不立即给予大量外源性LH或其类似物(如hCG等)将导致部分卵泡闭锁,从而引起排卵数的减少[16]。2.2 羊

到目前为止,有关羊超数排卵方面的资料很多。在绵、山羊超排的外源激素主要有FSH和PMSG。Armstrong 等在安哥拉山羊超排处理中,对PMSG和FSH-P作了比较,结果FSH-P的效果(平均获卵数16.1±8.0),明显优于一次性注射PMSG组(平均获卵数10.8±1.2)[18]。Pintado等采取PMSG和FSH相结合的方法,用PMSG代替了部分FSH进行超排处理,获得了单纯使用FSH一样数量的可用胚胎, 大大降低了超排成本[19]。岳奎忠等于第一次注射FSH的同时,加注PMSG200 IU,超排母羊的平均红体数为13.94±1.11个,平均获卵数10.5±0.97显著超过了单纯使用FSH处理[20]。芮荣等用4种方法对30只山羊进行超数排卵。结果发现:PMSG(1000~1350 IU)肌注+hCG (750~1 000 IU)静注得到的平均排卵数最高(7.4个/只); 其次为FSH(总剂量为300 IU,连续3日,每日2次肌注)+LH(100~150 IU)静脉注射(6.5个/只)。这两种方法较为有效[21]。山羊处理方法:一般是在山羊发情周期的第13~15天开始使用PMSG一次性注射或FSH连续处理3~4 d,剂量递减,每天两次,每次间隔12 h[4]。注射PMSG后,适当时间注射APMSG(PMSG抗体)可中和PMSG在动物体内的残留,并能够控制发育卵泡不会过多,排卵时间比较集中。李秦等通过不同给药方法导致的PMSG(1500 IU)和APMSG(1000 IU)对海门山羊的超排效果比较,认为在羊采用一次性投给比小剂量多次投药效果好[12]。

2.3 兔

Hashimoto等用纯化的猪卵泡刺激素对兔超排,取得较好效果[22]。李秦等用400 IU和200 IUPMSG和hCG两种剂量对兔超排,结果表明400 IU排卵数明显高于200 IU组, 但两者受精率基本相同。

可以认为PMSG和hCG对兔的超排效果甚佳[12]。刘亚等采用PMSG(75 IU)+hCG(100 IU)和FSH(100 IU)+hCG(75 IU)两种方法对青年和经产日本大耳白兔进行超排处理,结果表明后者方案优于前者,经产兔比青年兔超排效果好[23]。廉颖等用FSH衡量法(兔颈部皮下注射FSH,每次0.15 mg/只,每次间隔14 h共注6次。末次注射FSH后12 h经耳缘静脉注射hCG 75 IU/只)和递减法(兔颈部皮下注射FSH 6次,每次间隔10~14 h,注射剂量递减,第1、2次剂量为0.15 mg/只, 第3、4次0.1 mg/只, 第5、6次0.05 mg/只, 末次注射FSH后12 h,耳缘静脉注射hCG 75 IU/只),发现两种方法无明显差异。但不同品种兔对超排影响较大,品种不同对激素的敏感性差异较大[24]。毛冠平等用两种剂量(50 和100 IU)PMSG处理后的母兔卵巢平均排卵点数分别为10.83个和13.80个,差异不显著。平均获卵数分别为7.05个和7.96个,差异不显著。但平均充血卵泡数分别为7.30个和15.36个,差异极显著[25]。

2.4 猪

由于猪属于多排卵动物,其超数排卵的意义不如单胎动物大,所以对猪的超排报道相对较少。但近年来,关于猪胚胎移植、核移植、转基因等技术的研究日趋增多,为了获得充足的卵母细胞和胚胎,超数排卵技术的研究被提上了日程。国内外猪的超排处理方法多用PMSG(或FSH)+hCG(或LH)。Ziecik等采用PMSG+hCG法对猪一次或两次给药,得到可用胚胎数与未用激素组比较均有显著差异[26]。陈乃清等采用PMSG(250 ~1000 IU)配合hCG(250~1000 IU)肌肉注射对猪进行超排,获得了良好的超排效果,平均每头排卵数23.9~27.9枚。结果表明此方法是既简便又有效的母猪超排程序[27]。李文化等对湖北白猪用PMSG和hCG进行超排处理,发现10 IU/kg体重的PMSG能促进母猪发情,并且显著提高青年母猪的排卵数。处理方法: 在距上一个发情周期开始的第16天一次性肌注PMSG 10 IU/kg,72 h后注射相同剂量hCG[28]。芮荣等分别用PMSG(1000 IU)+hCG(500 IU)法和PMSG+PG(0.1 mg)+hCG法对小型猪进行超排,结果表明后者的头均排卵数(12.2±4.9)明显高于前者(2.0±5.3)[29]。岳奎忠等在对长白猪和哈白猪超排的研究中,也使用前列烯醇先溶解黄体,再用PMSG(1000 IU)和hCG(1000 IU)进行处理,也取得了较好效果[30]。另外,陈乃清[27]和岳奎忠[30]均认为猪的品种是影响超排效果的一个主要因素。2.5 猫

家猫是唯一一种没有被列为珍稀或濒危物种的猫科动物, 通过对家猫超数排卵的研究, 可促进家猫的胚胎移植, 因此, 对其他濒危猫科动物物种的延续有重要的意义。对家猫的超排方案主要有PMSG/hCG、FSH/hCG、eCG/hCG等三种方法。其中以eCG/hCG的超排效果最好。猫是典型的刺激性排卵动物,eCG(马绒毛膜促性腺激素)是目前用来刺激家猫卵泡发育较好的激素。用eCG/hCG对家猫超排获得比正常排卵多4倍的卵子(23.3±2.3)[31]。文端成等则比较了PMSG/hCG和FSH/hCG两种方案以及不同剂量和注射方式对家猫超排效果的影响,结果表明,PMSG的注射方式不影响家猫超排效果,用200 IU的PMSG超排家猫是较合适的剂量,FSH和PMSG都可用于家猫超排,但PMSG方案更合适[32]。

2.6 犬

Yamada等在研究排卵前犬卵母细胞体外成熟和受精时应用了eCG/hCG对犬进行了超排,取出卵母细胞培养72 h后,经超排处理的排卵前犬卵母细胞到达细胞分裂中期百分率(31.9%)高于对照组即未用激素组(12.1%)[33]。目前看来,关于犬科动物超数排卵的资料十分有限,因为犬科动物属季节性单发情动物,其生殖生理特点与其他哺乳动物有所不同,对发情周期中激素的变化还不是很了解,用激素诱导发情相对其他动物较困难。况且,这种动物发情结束后长时间处于间情期与下一次发情周期的开始受激素调控的机理也不清楚,给诱导发情试验带来了许多困难[34]。而且,犬对外源性激素处理的反应差异较大。因此,犬科动物超排的研究还处于起步阶段。

2.7 灵长类动物

在灵长类动物的超排中,有关猕猴的研究最多。猕猴的组织结构、生理和代谢机能等与人类最为相似,是研究人类疾病最理想的动物模型,但实验用猕猴数量有限,遗传背景不明,按照普通的动物繁殖方法无法满足现代生物医学对其数量和质量的要求,体细胞核移植技术的成熟为猕猴的大量生产提供了途径[35]。在对猕猴超数排卵时,

应考虑到其发育年龄和繁殖季节以及激素种类等的影响[35]。王林嵩等对FSH及大剂量氯菧酚诱发猕猴超数排卵的效果进行观察分析,结果表明FSH每只1 mg/d诱发超数排卵的效果比氯菧酚每只50~100 mg/d效果好,氯菧酚诱发超数排卵的效应与剂量不呈正比,两侧卵巢的卵泡发育存在交替优势现象,同一只动物两次超排实验中间隔一次月经周期后,其卵巢对药物诱发超排效果反应良好,超排不影响猕猴的正常生育能力[36]。在体外授精和胚胎移植过程中,Hayes等对短尾猕猴使用了重组人松弛激素,并用重组人FSH和hCG进行超数排卵,受孕率和移植成功率较高[37]。国内熊成培等则用促性腺激素刺激动物超数排卵后,用hCG促使卵泡进一步发育并接近排卵,手术法采集卵母细胞,在卵母细胞进一步成熟过程中,添加血清和激素会取得更好的效果[38]。

3 超数排卵技术在医学研究中的价值

超数排卵技术不仅在畜牧生产、物种保存和生物工程研究领域有很重要的价值,它在医学研究中的价值也是不容忽视的,特别是在体外受精胚胎移植(IVF-ET)中,促超排卵是其成功的先决条件,对治疗目前令许多夫妇和妇科专家头痛的不孕不育疾病起到至关重要的作用。目前,临床上常采用长效和短效促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-α)用于超促排卵降调节,它可以增加卵泡的募集,抑制内源性黄体生成素峰, 避免卵泡过早黄素化, 从而提高妊娠率[39]。Gleicher等对1494名不孕症妇女使用了促性腺激素, 结果有441人怀孕,其中127人为两胎或多胎[40]。因此动物超数排卵技术在医学研究领域中具有重要的借鉴价值,对人类辅助生殖技术的发展与完善起到促进作用,与人类的繁衍及社会的稳定和发展有着不可或缺的联系。

4 超数排卵技术的前景展望

目前,对于一些动物如羊、牛、兔等的超排处理方法已趋于完善和稳定,但对于猪、猫、犬等动物超排的研究相对较少,而且技术上也不够完善,可能是由于此前对在这几种动物身上应用超排的意义认识不足,困难较多,研究者也相对较少。在对家猫进行超排时,由于猫具有天生神经质的特性,对周围环境变化敏感,操作起来较困难,而在犬科动物,到现在为止,尚未找到一种非常可靠的确定母犬排卵时间的方法,但家猫和犬的超排研究对同种属其他濒危或珍稀物种的保护有重要意义。随着动物胚胎移植、核移植、胚胎冷冻、转基因技术的不断发展和应用,超数排卵技术越来越受到人们的广泛重视。超排技术正在医学生物学研究和畜牧生产中不断地发展和改进,有望在家畜品种改良、珍稀濒危物种保护、人类辅助生殖技术的发展过程中得以应用,具有广阔的发展前景,值得广大学者进一步探讨和研究。

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The Progress of Research on Animals Superovulation Technology

WANG Xin-lei1, SHAO Yi-xiang1, WANG Peng2

(1. Laboratory Animal Centre of Nantong University, Nantong 226001,China;

2. Preclinical Medical College of Soochow University, Suzhou 215123, China)

[Abstract] On account of the significancant role of the superovulation technique to prologue produc-tion and preservation for endangered species and biotechnology research as well as its special contribu-tion to human assisted reproductive technique,this article summarizes the usages and characteristics of hormones used for superovulation technology in domestic and abroad,It also introduces the application of superovulation technology on different genus mammals and the recent development of this technology. [Key words] Mammal; Superovulation; Hormone; Assisted reproductive technology