分子生物学大实验——目的基因的克隆及表达
分子生物学大实验——目的基因的克隆及表达
第一节基因操作概述 (2)
一、聚合酶链式反应(PCR) (2)
二、质粒概述 (4)
三、凝胶电泳 (5)
四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 (6)
五、重组质粒的连接 (6)
六、限制性内切酶消化 (7)
七、SDS-PAGE蛋白质电泳 (7)
第二节材料、设备及试剂 (7)
一、材料 (7)
二、设备 (8)
三、试剂： (8)
第三节操作步骤 (9)
一、目的基因的获得： (9)
二、pET-21bT（pET-21bR、pET-21b）载体的获得： (11)
三、pET-21b等与目的片段的连接作用 (12)
四、转化大肠杆菌DH5α进行阳性克隆子筛选与鉴定 (12)
五、转化转化大肠杆菌BL21plyst，摇菌进行SDS-PAGE电泳。 (13)
六、融合蛋白的毒力测定 (15)
第四节本实验的实验报告 (15)
第一节基因操作概述
一、聚合酶链式反应(PCR)
PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA 的方法。它包括三个基本步骤：(1)变性(Denature)：目的双链DNA片段在94℃下解链；(2)退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对；(3)延伸(Extension)：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA扩增达106倍。
（一）、PCR反应中的主要成份
1、引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR 成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1)引物长度约为16～30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。(2)引物中G+C含量通常为40%～60%，可按下式粗略估计引物的解链温度Tm ＝4(G+C)+2(A+T)。(4)引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对。(6)两引物之间尤其在3'端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量。(7)引物5'端对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。通常应在5'端限制酶位点外再加1～2个保护碱基。(8)引物不与模板结合位点以外的序列互补。一般PCR反应中的引物终浓度为0.2～1.0μmo L /L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低则降低产量。
2、4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)：dNTP应用NaOH将pH调至7.0，并用分光光度计测定其准确浓度。dNTP原液可配成5～10mmol/L并分装，-20℃贮存。一般反应中每种dNTP 的终浓度为20～200μmol/L。
3、Mg2+：Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+浓度范围为0.5～2mmol/L。对于一种新的PCR反应，可以用0.1～5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。
4、模板：PCR反应必须以DNA为模板进行扩增，模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好)。就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。一般反应中的模板数量为102～105个拷贝，对于单拷贝基因，这需要0.1μg的人基因组DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA。扩增多拷贝序列时，用量更少。灵敏的PCR可从一个细胞，一根头发，一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列。模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。
5、Taq DNA聚合酶：一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃130min，95℃40min，97℃5min。现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶，这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间。Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下，30min，掺入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量。Taq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一般PCR中出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环。在100μlPCR反应中，1.5～2单位的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环。所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减。酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。
6、反应缓冲液：反应缓冲液一般含10～50mmol/LTris·Cl(20℃下pH8.3～8.8)，50mmol/LKCl和适当浓度的Mg2+。Tris·Cl在20℃时pH为8.3～8.8，但在实际PCR反应中，pH为6.8～7.8。50mmol/L的KCl有利于引物的退火。另外，反应液可加入5mmol/L 的二硫苏糖醇(DDT)或100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA)，它们可稳定酶活性。
（二）、PCR反应参数
1、变性：在第一轮循环前，在94℃下变性5～10min非常重要，它可使模板DNA完全解链，然后加入Taq DNA聚合酶(hot start)，这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全，往往使PCR失败，因为未变性完全的DNA双链会很快复性，减少DNA产量。一般变性温度与时间为94℃1min。在变性温度下，双链DNA解链只需几秒钟即可完全，所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。
2、退火：引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度。实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5℃。一般当引物中GC含量高，长度长并与模板完全配对时，应提高退火温度。退火温度越高，所得产物的特异性越高。通常退火温度和时间为37℃～55℃，1～2min。
3、延伸：延伸反应通常为72℃，接近于Taq DNA聚合酶的最适反应温度75℃。实际
上，引物延伸在退火时即已开始，因为Taq DNA聚合酶的作用温度范围可从20℃～85℃。延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度。
4、循环次数：当其它参数确定之后，循环次数主要取决于DNA浓度。一般而言25～30轮循环已经足够。循环次数过多，会使PCR产物中非特异性产物大量增加。通常经25～30轮循环扩增后，反应中Taq DNA聚合酶已经不足，如果此时产物量仍不够，需要进一步扩增。
二、质粒概述
把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1～200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等。
质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。
在细菌细胞内，共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA 外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松驰型的环状分子，称开环DNA(Open circular DNA，简称ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA(Linear DNA)。当
提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。
三、凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide，EB)染色，在紫外光下至少可以检出1～10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外，还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA 条带，用于以后的克隆操作。
琼脂糖可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。目前，一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。
琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中，在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移，其迁移速率由下列多种因素决定：
1、DNA的分子大小：
线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。
2、琼脂糖浓度
一个给定大小的线状DNA分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2～1.5%，分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3～0.7%，DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8～1.0%。
3、DNA分子的构象
当DNA分子处于不同构象时，它在电场中移动距离不仅和分子量有关，还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的，超螺旋DNA移动最快，开环DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA 带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。
4、电源电压
在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。
5、嵌入染料的存在
荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强，还会使线状DNA迁移率降低15％。
6、离子强度影响
电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶)，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液)，则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。
四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ，Mˉ)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaCl2，RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于～70℃保存(半年)，因此CaCl2法为使用更广泛。
为了提高转化效率，实验中要考虑以下几个重要因素：
1、细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时，密度过高或不足均会影响转化效率。
2、质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。
3、试剂的质量：所用的试剂，如CaCl2等均需是最高纯度的(GR或AR)，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。
4、防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。
五、重组质粒的连接
外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：
1、带有非互补突出端的片段用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端，这也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下，常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时，在DNA 片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。
2、带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物，而且正反两种连接方向都可能有。
3、带有平末端是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补平所致。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG8000)以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。
六、限制性内切酶消化
限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。绝大多数限制性内切酶识别长度为4、5或6个核苷酸且呈二重对称的特异序列，切割位点相对于二重对称轴的位置因酶而异。一些酶恰在对称轴处同时切割DNA双链而产生带平端的DNA片段，另一些酶则在对称轴两侧相对的位置上分别切断两条链，产生带有单链突出端（即粘端）的DNA片段。1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在50μl体积1小时内完全切开1μgλ噬菌体DNA所需的酶量。不同的限制性内切酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此。但是，几乎所有的生产厂家都对其生产的酶制剂优化过反应条件，因此购买的内切酶说明书上均有其识别序列和切割位点，同时提供有酶切缓冲液（buffer，10×、5×）和最适条件，使得酶切反应变得日益简单。
七、SDS-PAGE蛋白质电泳
细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。
第二节材料、设备及试剂
一、材料
不同来源的模板DNA；
E.coli DH5α菌株：Rˉ，Mˉ，Ampˉ；
E.coli BL21Plyst（DE3）FˉompT hsdSB(rBˉmBˉ) gal dcm(DE3)；
琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒：购自Beijing Tianwei Corporation。
本实验所用的特异引物：
表2-1 设计Cry1Ac结构域基因特异引物
引物序号引物序列
15'-CGCGGATCCGGGTGGAGAAAGAATA-3'
25'-CGCGTCGACATGTCGATGGGAAGTG-3'
3 5'-CGCGGATCCGGATTGGGTAAGGTAT-3'
4
5 5'-CGCGGATCCGGTTCGTGTACGGTATG-3'
6 5'-CGCGTCGACTTAGCCCTAGTTGGT-3'
7
8
9 5'-CGCGTCGACTATACCTTACCCAATCTC-3'
表2-2 Cry1Ac结构域菌体阳性克隆子的引物
引物名称引物序列
T7 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'
SP6 5'-GATTTAGGTGACACTATAG -3'
注：Tm=4（C+G）+2（A+T）
二、设备
PCR小管；离心管；DNA扩增仪(PE公司或eppendorf)；琼脂糖凝胶电泳所需设备(电泳槽及电泳仪)；台式高速离心机；恒温振荡摇床；高压蒸汽消毒器(灭菌锅)；涡旋振荡器；恒温水浴锅；台式高速离心机；微波炉或电炉；紫外透射仪；数码相机及其附件；电热恒温培养箱；无菌工作台；低温冰箱；制冰机；分光光度计；微量移液枪(20μl，200μl，1000μl)及吸头；电热恒温鼓风干燥箱；蛋白电泳系统ProteawIIBio-Rad；超声波破碎仪；Millipore 纯水仪；空气浴振荡器；电子天平。
三、试剂：
1、限制性内切酶(BamHI，SalI，NdeI)
2、10×PCR反应缓冲液
3、MgCl2：25mmol/L
4、4种dNTP混合物
5、Taq DNA聚合酶
6、异丙醇
7、LB液体培养基(Luria-Bertani)：称取蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，NaCl 10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5，加去离子水至总体积1升，高压下蒸气灭菌20分钟。
8、LB固体培养基：液体培养基中每升加13g琼脂粉，高压灭菌。
9、氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)母液：配成50mg/ml水溶液，-20℃保存备用。
10、溶菌酶溶液：用10mmol/L Tris·Cl(pH8。0)溶液配制成10mg/ml，并分装成小份(如1.5ml)保存于-20℃，每一小份一经使用后便予丢弃。
11、50×TAE（Tris-乙酸）：Tris碱24.2g、冰乙酸5.71mL、5mol/LEDTA(PH8.0)10mL加去离子水定容至100mL，使用时用去离子水作50倍稀释，即为工作液。
12、溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)。溶液Ⅰ可成批配制，每瓶100ml，高压灭菌15分钟，储存于4℃冰箱。
13、溶液Ⅱ：0.2 mol/LNaOH(临用前用10mol/LNaOH母液稀释)，1％SDS。
14、溶液Ⅲ：5mol/LKAc 60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml，并高压灭菌。溶液终浓度为：K+3mol/L，Acˉ5mol/L。
15、RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/LTris·Cl(pH7。5)，15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100℃加热15分钟，使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5mleppendorf 管分装成小份保存于-20℃。
16、饱和酚：市售酚
17、按体积/体积＝1：1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1：1)。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。
18、TE缓冲液：10mmo/LTris·Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)。高压灭菌后储存于4℃冰箱中。
19、电泳所用试剂：上样缓冲液(6×)：0.25% 溴酚蓝，40%(w/v)蔗糖水溶液。
20、溴化乙锭(EB)溶液母液：将EB配制成10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。
21、1%琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml0.5×TAE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5μg/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液0.5×TAE），即可上样。
22、含Amp的LB固体培养基：将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入Amp储存液，使终浓度为50ug/ml，摇匀后铺板。
23、连接反应缓冲液(10×)：0.5mol/LTris·Cl(pH7.6)，100mol/LMgCl2，100mol/L二硫苏糖醇(DTT)(过滤灭菌），500μg/ml牛血清清蛋白(组分V.Sigma产品）（可用可不用），10mol/LATP（过滤灭菌）。
24、T4 DNA连接酶(T4 DNA ligase)；购买成品。
25、IPTG储液(200mg/ml)：在800μl蒸馏水中溶解200mgIPTG后，用蒸馏水定容至1ml，用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃。
26、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解，定容至100ml，棕色瓶存于室温。
27、1.5M Tris-HCl(pH8.0)：Tris18.17g加ddH2O溶解，浓盐酸调pH至8.0，定容至100ml。
28、1MTris-HCl(pH6.8)：Tris12.11g加ddH2O溶解，浓盐酸调pH至6.8，定容至100ml。
29、10%SDS：电泳级SDS10.0g加ddH2O68℃助溶，浓盐酸调至pH72，定容至100ml。
30、10?电泳缓冲液(pH8.3)：Tris3.02g，甘氨酸18.8g，10%SDS10ml加ddH2O溶解，定容至100ml。
31、10%过硫酸铵（AP）：1gAP加ddH2O至10ml。
32、2?SDS电泳上样缓冲液：1MTris-HCl(pH6.8)2.5ml，β-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6g，甘油2.0ml，0.1%溴酚兰1.0ml，ddH2O3.5ml。
33、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰0.5g，甲醇200ml，冰醋酸50ml，ddH2O 250ml。
34、脱色液：甲醇50ml，冰醋酸50ml，ddH2O400ml。
35、0.05mol/LCaCl2溶液：称取0.28gCaCl2(无水，分析纯)，溶于50ml重蒸水中，定容至100ml，高压灭菌。
第三节操作步骤
一、目的基因的获得：
（一）、建立PCR操作程序
PCR 反应体系 PCR 反应程序
Cry1Ac 基因模板
2μL 正向引物
2μL 反向引物
2μL 10×Buffer
5μL dNTP
4μL TaqDNA 聚合酶
1μL 去离子水
34μL 总体积 50μL
（二）、进行琼脂糖凝胶电泳并且作柱回收
DNA 回收试剂盒（QIAquick Gel Extraction Kit Protocol ）
1、用干净的刀片将单一的DNA 条带从琼脂糖凝胶上切下，尽量切除多余凝胶。
2、加入溶胶液500μL ，50℃水浴放置10min 。
3、将上一步所的溶液加入一个吸附柱中，12000r/min 离心30s ，倒掉收集管中的废液。
4、加700μL 漂洗液，12000r/min 离心30s ，弃掉废液。
5、加500μL 漂洗液，12000r/min 离心30s ，弃掉废液。
6、将离心吸附柱放回收集管中，12000r/min 离心2min ，尽量除去漂洗液。
7、再将离心柱放在30～40℃温箱中烘干10min 。
8、将吸附柱放入一个干净的离心管中，在吸附膜中间位置加入40μL 洗脱缓冲液，室温放置2min ，12000r/min 离心1min 。
注意事项
紫外灯下切下含待回收DNA 的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA 污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA 的污染。
（三）、进行目的片段的双酶切：
Step1 94℃ 3 min Step 2 94℃ 1 min
Step 3 60℃ 1 min Step4 72℃ 2min Step 5 Go to step2 30cycles Step 6 72℃ 10 min
结构域基因的双酶切反应体系
在此条件下，37℃反应1h 。接下来作柱回收。
二、pET-21bT （pET-21bR 、pET-21b ）载体的获得：
（一）、取菌 37℃过夜摇菌 提取质粒。
1、取1.2mL 培养物倒入离心管中，4℃8000r/min 离心1min ，重复一次。
2、吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
3、加入100uL 预冷的溶液Ⅰ，在涡旋混合器上剧烈振荡直至看不见沉淀。
4、加入200uL 新配制的溶液Ⅱ，快速颠倒离心管5次，以混合内容物，不要振荡，室温3～5min 。
5、加入150uL 预冷的溶液Ⅲ，温和地振荡混匀，可见白色絮状沉淀，然后放冰上5～10min 。
6、加入400uL 饱和酚：氯仿（1：1）进行抽提，以除去蛋白质。12000r/min 离心5min 。
7、上清液加入等体积的异丙醇沉淀，-20℃放置10～30min 。15000r/min 离心3min 。去上清得到质粒DNA 沉淀。
8、沉淀用200uL 预冷70%的乙醇冲洗沉淀。
9、用一小条滤纸小心吸去管壁残留的上清，将离心管放在超净台中通风干燥，直至无乙醇气味。
10、加入适当浓度Rnase 的TE 缓冲液（或去离子水）重溶质粒DNA ，振荡混匀，-20℃备用。
（二）进行高效表达载体的双酶切：
目的片段
模板DNA 10μL
限制性内切酶 BamHI 2μL ；SalI 2μL
缓冲液 T buffer 3μL
去离子水 3μL
总体积
20μL 组分
载体的双酶切反应体系
表达载体10μL
限制性内切酶BamHI 2μL；SalI 2μL
缓冲液T buffer 3μL
去离子水3μL
总体积20μL
在此条件下，37℃反应1h。接下来作柱回收。
三、pET-21b等与目的片段的连接作用
1、在离心管中建立下列连接体系
10×T4DNA Ligase Buffer 2。5μL
目的片段10μL
表达载体2μL
T4DNA Ligase 1μL
dH2 O up to 25μL
2、16℃过夜反应。
四、转化大肠杆菌DH5α进行阳性克隆子筛选与鉴定
（一）大肠杆菌感受态细胞制备（DH5α、BL21plyst）
注：常规CaCl2法，要求无菌操作。
1、从37℃培养的16～20h的新鲜平板中挑取一个DH5 单菌落，接种于5mLLB培养基中，37℃，180r/min震荡过夜。
2、按1%的接种于小三角瓶中，37℃震荡培养3h至OD600为0.5。
3、4000r/min离心5min，收集菌体，倒去上清，加入1/2体积预冷的0.05mol/LCaCl2轻轻悬浮沉淀，置冰上30min。
4、4000r/min离心5min，倒去上清，加入1/10体积预冷的0.05mol/LCaCl2轻轻悬浮沉淀。
5、进行分装，向每一个离心管中加约200uL的感受态细胞。
6、4℃保存备用（一星期用完）。
（二）连接产物转化
1、5uL ～10uL 连接产物和200uL 感受态细胞在无菌条件下混匀
2、冰浴30min
3、42℃热击，1.5min 。
4、冰浴2min
5、加入500uL ～800uLLB 液体培养基（无菌条件下）。
6、37℃扩培，180r/min 进行60min 。
7、取100uL ～200uL 涂含有氨苄抗性的LB 平板。
8、放在恒温培养箱中37℃培养过夜。
（三）从平板中调取30个菌落编号1～30，经T7、SP6特异引物进行PCR 扩增，来筛选阳性克隆子，最后只需选择一个阳性重组质粒，分别进行单酶切、双酶切及及原始目的片段PCR 扩增以确保目的片段真正地连接到表达载体上。
Cry1Ac 结构域菌体阳性克隆子的PCR 扩增
建立以下体系每PCR 管分装500μL/30=16μL 。
PCR 反应体系 PCR 反应程序
当载体上T7、SP6特异引物P 调后，应在原目的片段基础上加约200bp 长度，再经过琼脂糖凝胶电泳应得到得到我们所要的重组DNA 。筛选出阳性克隆子进行质粒提取及单、双酶切
五、转化转化大肠杆菌BL21plyst ，摇菌进行SDS-PAGE 电泳。
（一）Cry1Ac 结构域基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达
1、将阳性克隆子分别进行质粒提取，再分别转化大肠杆菌（Escherichia coli )BL21Plyst 表Cry1Ac 菌体模板
少量 SP6引物
20μL T7引物
20μL 10×Buffer 50μL dNTP （10mmol/L ） 10uL TaqDNA 聚合酶 5μL 去离子水 400μL 总体积 500μL
Step1 94℃ 5min Step 2 94℃ 1 min Step 3 52℃ 1 min Step4 72℃ 2min Step 5 Go to step2 30cycles Step 6 72℃ 10 min
达菌株，涂平板，37℃培养过夜。
2、菌种活化：5mL培养基的试管中各加入氨苄，摇匀。用10uL无菌枪头挑取单菌落，接
种。放入到摇床中，180r/min，37℃，振荡培养12h。取出活化好的菌种。先在100mL 的培养基中滴入氨苄，摇匀。按1%的量接种，放到摇床中，230r/min，37℃，振荡培养2h~3h。
3、融合蛋白的诱导表达：向菌液中分别加入终浓度0.8mmoL/L的IPTG作诱导剂。28℃，
180r/min，振荡培养8h。取以上诱导培养液，倒入离心管中，5000r/min，4℃离心10min。
弃去上清，加入5mL10mmoL/L的Tris-HCl（pH8.0），悬浮沉淀，加入适当浓度的溶菌酶进行破壁处理，4℃12000r/min离心10min，收集沉淀，再用5mL50mmol/L的Na2CO3（pH9.5）溶解，于4℃冰箱保存备用，按常规溶解SDS-PAGE方法检测表达产物。
（二）Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
1、根据厂家说明书安装玻璃板。
2、确定所需凝胶溶液体积配制15mL的分离胶溶液。一旦加入TEMED，马上开始聚合，
故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。
3、迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液，留出灌注浓缩胶所需空间。再在胶液面上
小心注入一层水（约2~3mm高），以防止氧气进入凝胶溶液。
4、分离胶聚合完全后（约30min），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。
5、配制5mL的浓缩胶溶液。一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物
并进入下步操作。
6、聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入
气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。
7、在样品中按1：1体积比加入2×样品缓冲液，在100℃加热3min以使蛋白质变性。
8、浓缩胶聚合完全后（30min），小心移出梳子。把凝胶固定在电泳装置上，上下槽各加
入Tris-甘氨酸电级缓冲液。
9、按预定顺序加样，加样量通常为10~25uL。
10、将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电
压提高到15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm，然后关闭电源。
11、从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部
切去一角以标注凝胶的方位。
12、用考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行1~2小时或过夜染色。
13、换脱色液脱色，需3~10小时，其间更换多次脱色液至背景清楚。
14、对凝胶进行拍照，或将凝胶干燥成胶片。
注意事项：
1、实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。
2、为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确，10%AP在一周内使用。室温较低时，TEMED的量可加倍。
3、未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。
六、融合蛋白的毒力测定
生物测定采用叶片浸渍饲喂法：先将供试药剂Bt制剂和Cry1Ac毒蛋白按等比级数稀释法，顺次配制成系列浓度，药液中加入0.2‰的Triton X-100，以清水为对照进行预备试验，根据预备试验的结果，以校正死亡率在10%～90%的浓度范围作为正式试验的浓度范围，然后按上述原则和方法配制出5～6个系列浓度，供正式试验用。取新鲜甘蓝苗嫩叶片，用打孔器打下直径6㎝的圆片，分别在各种供试药液中浸渍约10s，取出自然凉干后，放入12cm 直径培养皿中(垫有滤纸保湿)，并接入供试小菜蛾幼虫，每处理4次重复，每重复接虫10头。饲养温度为26士1℃，光周期L：D=16：8，相对湿度：70%。于96h检查虫口死亡情况，算出96h的校正死亡率和毒力值(LC5O)。
第四节本实验的实验报告
1、简述Bt cry1Ac结构域基因是如何连接到表达载体上以及该基因在基因克隆上的意义。
2、简述蛋白转导结构域（Tat、Rev）在基因操作上的作用。
3、记录本实验你所观察到的电泳图片包括
1）目的片段PCR
2）通过双酶切得到高效表达载体
3）T7、SP640进行筛选阳性克隆子
4）阳性克隆子CAPS鉴定
5）SDS-PAGE蛋白质电泳检测
软琼脂克隆形成实验步骤完整版
软琼脂克隆形成实验步 骤完整版 集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]
注意：软琼脂克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。 1、配制100ml的1.2%Argrose和0.7%Argrose，Argrose用DNA电泳用BIOWESTREGULARArgroseG10 （4℃），溶剂用双蒸水（DDW），高压灭菌后，维持在42℃中不会凝固；配制500ml的2×1640和 0.005%的结晶紫。 2、实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度42℃。提前融化血清和双抗。 3、如已制好上下胶，则在微波炉中溶解1.2%Argrose下胶和0.7%Argrose上胶，降温后放入42℃水浴锅 中保持。 4、根据实验需要的量配制20%FBS+2×1640+2×PS（5种细胞配40ml），每种细胞设3个复孔。 5、铺下胶：按1:1比例使1.2%Argrose下胶和20%FBS+2×1640+2×PS混合，6孔盘每孔迅速加入1.5ml 混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不能产生气泡）。对于一个6孔盘，配5ml上述培养液+5ml1.2%Argrose下胶于50ml离心管中（离心管要一直置于水浴锅中）。 6、细胞计数：取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数， 用正常培养液调整细胞密度至40×104／ml以上，这样加的体积小于100ul，不会影响其他成分的稀释程度。每孔铺1万个细胞，准备4个孔的细胞数，即4×104。 7、铺上胶：按1:1比例混合0.7%Argrose上胶和20%FBS+2×1640+2×PS，每种细胞需先配2ml（20%FBS+2 ×1640+2×PS）+2ml0.7%Argrose上胶于离心管中混匀，放入42℃水浴锅中保持。再将细胞悬液加入上述混合液中，混匀后迅速加入6孔盘中，每孔1ml。待上层琼脂凝固后，置于5%CO ，37℃，培养2－3 2周。 8、间隔2天补加200ul10%FBS+1640+1×PS，以防过于干燥。 9、计数克隆：把平皿放置在倒置显微镜下（100×），在镜下随机选择10个视野，计数视野中大于50个 克隆数(﹥0.05mm的克隆)和所有克隆数，克隆形成率=大于50个克隆数\所有克隆数×100%。每孔加入1ml的0.005%结晶紫染色1h以上，镜下拍照。 10、数据处理：每个视野的面积是1mm2,6孔盘每孔的面积是9.6cm2,则一个孔中总的克隆数=平均克隆数× 960，如果要比较﹥0.05mm的克隆的绝对值，则可以利用“每孔﹥0.05mm的克隆数/每孔总细胞克隆数”，将分母取一组作为标准，做出此组与其他组的比值系数，再分别用此系数乘以各组﹥0.05mm的克隆的绝对值，就得到总细胞克隆数相同条件下的﹥0.05mm的克隆的绝对值，可进行比较。
克隆构建目的基因的简便方法
克隆构建 一、 PCR 1、PCR 20ul体系，4个Mix，3个回收，1个对照 H2O 10.8ul 94℃3min KOD Buffer 2ul 94℃30s DNTPs 2ul 5X℃30s MgSO4 2ul 68℃Xs Primer F 2ul 68℃10min Primer R 2ul cycle 34 KOD 0.2ul Plasmid 1ul 试剂确保融化完全，枪头触到表面打净，最后用白枪头反复打几次混合溶液，离心3-4s，分装20ul至PCR管。 2、加尾 0.1ul Taq 酶，加入到20ul，微弹，离心，PCR仪上放置15min。 3、回收 配中孔胶，电泳并回收试剂盒回收：熔胶后室温冷却再上柱，PW缓冲液离心过后于超净台上吹干7-9min，电泳检测回收产物。 二、连接 Solution 1 5ul 目的片段 4.5ul 16℃过夜 T-vector 0.5ul 三、转化 1、感受态细胞制备 取5ml无抗LB培养液，加入到灭菌试管中，取60-80ul新鲜菌液，37℃恒温摇床2h；取其中2.4ml倒入2.5ml EP管中，尽量保持4℃低温下12000g离心30s， 沿壁缓缓加入CaCl2溶液，冰上滑动EP管管底使菌体悬浮； 2、转化涂板 加入连接产物时边加边搅，热激时温度略微低于42℃，时间严格控制1min30s 之后冰上静置3min左右，加入300ul LB 无抗培养基，于37℃恒温箱复苏50min，涂板并37℃恒温箱过夜培养。 四、鉴定 1、质粒提取 挑去单克隆菌落，37℃过夜培养，次日提取质粒。 2、酶切鉴定 根据设计引物选择双切酶，20ul体系37℃酶切2h，电泳检测并送去测序。 3、PCR鉴定 将切出片段所属的菌液进行菌液PCR鉴定。
实验绿色荧光蛋白
生物技术实验报告 姓名：张龙龙 学号：2011506066 班级：11级生技02班
前言：绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水 母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。GFP 由3 个外显子组成，长2.6kb；GFP 是由238 个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27. 0kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由 3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成. 一.实验目的 1、了解表达用基因克隆引物设计的原理和方法。 2、了解利用原核表达系统表达外源基因的原理、流程及方法。 3、掌握PCR、DNA片段的酶切与连接、细菌转化、阳性克隆筛选、质粒提取、DNA样品的纯化、核酸电泳等分子生物学基本技术。 二．实验原理 基因工程一般包括四个步骤：一是取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；三是把重组DNA引入某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。 本实验根据绿色荧光蛋白（GFP）的基因序列设计一对引物，用该引物将GFP基因从含GFP基因的质粒中扩增出来。再利用双酶切切开表达载体pET23b 和目的基因的两端接头，通过T4连接酶GFP基因与表达载体重组。将含GFP 基因的重组表达载体导入宿主菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下，使GFP基因表达 三.实验材料及仪器 1、实验材料：含有GFP的质粒；DNA Marker；DH5α；BL21； 2、仪器：恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、制冰机、台式离心机、涡旋振荡器、冰箱、电泳仪、透射仪、PCR仪、PCR管、刀片、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、吸水纸、微型离心管、台式冷冻离心机、塑料手套、1.5ml离心管。 四.实验内容 4.1 质粒的提取、酶切及电泳鉴定： 1)实验试剂：LB培养基；溶液Ⅰ；Tris-HCl（pH=8）；溶液Ⅱ；溶液Ⅲ； 酚/氯仿抽提液；无水乙醇；电泳缓冲液；加样缓冲液；GoldView核酸 DNA 染色剂；1%的琼脂糖凝胶；XhoⅠ(10U/μl)；NdeⅠ（10U/μl）；T 4 lisase。 2)实验步骤： 质粒的提取与鉴定
软琼脂克隆形成实验步骤(完整版)
注意：软琼脂克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。 1、配制100ml的1.2% Argrose和0.7%Argrose，Argrose用DNA电泳用BIOWEST REGULAR Argrose G10（4℃），溶剂用双蒸水（DDW），高压灭菌后，维持在42℃中不会凝固；配制500ml的2×1640和0.005%的结晶紫。 2、实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度42℃。提前融化血清和双抗。 3、如已制好上下胶，则在微波炉中溶解1.2%Argrose下胶和0.7% Argrose上胶，降温后 放入42℃水浴锅中保持。 4、根据实验需要的量配制20%FBS+2×1640+2×PS（5种细胞配40ml），每种细胞设3 个复孔。 5、铺下胶：按1:1比例使1.2%Argrose下胶和20%FBS+2×1640+2×PS混合，6孔盘每 孔迅速加入1.5ml混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不能产生气泡）。对于一个6孔盘，配5ml上述培养液+5ml 1.2%Argrose下胶于50ml离心管中（离心管要一直置于水浴锅中）。 6、细胞计数：取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞， 作活细胞计数，用正常培养液调整细胞密度至40×104／ml以上，这样加的体积小于100ul，不会影响其他成分的稀释程度。每孔铺1万个细胞，准备4个孔的细胞数，即4×104。 7、铺上胶：按1:1比例混合0.7% Argrose上胶和20%FBS+2×1640+2×PS，每种细胞需 先配2ml（20%FBS+2×1640+2×PS）+2ml0.7% Argrose上胶于离心管中混匀，放入42℃水浴锅中保持。再将细胞悬液加入上述混合液中，混匀后迅速加入6孔盘中，每孔1ml。待上层琼脂凝固后，置于5%CO2，37℃，培养2－3 周。 8、间隔2天补加200ul 10%FBS+1640+1×PS，以防过于干燥。 9、计数克隆：把平皿放置在倒置显微镜下（100×），在镜下随机选择10个视野，计数 视野中大于50个克隆数(﹥0.05mm的克隆)和所有克隆数，克隆形成率=大于50个克隆数\所有克隆数×100%。每孔加入1ml的0.005%结晶紫染色1h以上，镜下拍照。
基因克隆、假病毒操作步骤
实验名称：基因克隆 实验器材:荧光定量PCR仪、摇床、离心机、生工PCR产物纯化试剂盒、恒温加热器、 NEB连接体系、灭菌纯水、JM109感受态、冰、LB培养基、酒精灯、涂棒、氨苄、氨苄抗性平板、甘油等； 操作步骤： 1、可通过PCR进行拼接获得目的基因的，过柱纯化（生工试剂盒根据说明书进行纯化， 在最后一步的洗脱可以用预热的灭菌纯水洗脱，在加灭菌纯水洗脱的时候一定要加在纯化柱子的膜中间）； 2、选择合适的载体（EZ-T）用连接酶进行连接，NEB体系，16℃过夜连接 T4lages 1.0 10×T4buffer 2.0 EZ-T 1.0 目的基因8.0 DdH2O 8.0 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 20ul 3、取100μl摇匀后的JM109感受态细胞悬浮液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下 面的操作），加入10μl连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42度水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却2min； 4、加入500μl LB液体培养基，混匀于37℃振荡培养45min使受体菌恢复正常生长状态并 使转化体产生抗药性； 5、将恢复培养的菌体5000rpm离心3min，移去上层LB培养基，用余下的200μl重悬菌体， 并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却)，均匀涂布于琼脂凝胶表面（氨苄抗性），37℃倒置培养12~16小时； 6、挑取多个单克隆菌落分别接种到1ml含有抗生素（氨苄）的LB液体培养基中，37℃振 荡培养3h； 7、培养1-2小时即可以利用PCR（定量或定性）进行鉴定； 8、选取初步鉴定阳性的菌液送测序，测序正确后甘油保存（甘油的浓度为30%-50%），充 分混匀，-80℃保存；
质粒DNA的提取和纯化实验报告
质粒DNA的提取和纯化实验报告
实验一、质粒DNA的提取和纯化 一、实验目的： 1、学习并掌握碱裂解法小量制备质粒DNA的方法。 2、初步了解DNA纯化的原理。 二、实验原理 1、细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 2、质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。 3、碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 4、纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 三、实验步骤 1、挑取单菌落接种到含Amp的LB液体培养基试管内（3.5ml/管） 2、将试管放入恒温震荡培养箱中，37℃，200r/min培养12-16h。 3、将菌落转入1.5ml离心管中（尽量倒满）1200r/min，离心30s（沉淀菌体） 4、重复一次第三步的过程 5、弃掉上清液并扣干，加入预冷的Solution1 100微升，剧烈震荡打散菌体
植物基因的克隆｜植物基因克隆的基本步骤
植物基因的克隆 08医用二班姚桂鹏0807508245 简介 克隆（clone）是指一个细胞或一个生物个体无性繁殖所产生的后代群体。通常所说的基因克隆是指基于大肠埃希菌的DNA片段（或基因）的扩增，主要过程包括目标DNA的获取、重组载体的构建、受体细胞的转化以及重组细胞的筛选和繁殖等。本文主要介绍植物基因的特点、基因克隆的载体、基因克隆的工具酶、基因克隆的策略以及植物目的基因的分离克隆方法等内容。 关键词 植物基因基因克隆载体工具酶克隆策略分离克隆方法 Plant gene cloning Introduction Cloning (clone) refers to a cell or an individual organisms asexual reproduction produced offspring. Usually said cloning genes means
based on escherichia coli segment of DNA (or genes), including the main course target DNA, restructuring of the carrier, transformation of receptor cells and reorganization of screening and reproductive cells. This paper mainly introduces the characteristics of plant gene and gene cloning and carrier, gene clone tool enzyme, gene cloning and plant gene strategy of separation cloning method, etc. Keywords Plant gene cloning tool enzyme gene cloning vector method of separation of cloning strategy 一、植物基因的结构和功能 基因（gene）是核酸分子中包含了遗传信息的遗传单位。一般来说，植物基因都可分为转录区和非转录的调控区两部分。 （一）植物基因的启动子 启动子（promoter）是指在位于结构基因上游决定基因转录起始的区域，植物积阴德启动子包括三个较重要的区域，一时转录起始位点，而是转录起始位点上游25~40bp的区域，三是转录起始位点上游-75bp处或更远些的区域。 （二）植物基因的增强子序列
细胞克隆形成实验
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整个基因克隆实验流程(完整)
一、组织总RNA的提取 相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水 相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。 相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。 实验步骤 1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入 液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。 2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解； 3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min； 4.4℃，,12000g 离心15min； 此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中； 5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管， 加入等体积的异丙醇，轻轻混匀； 6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min； 7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min； 8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀； 9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min 晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解） 10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。 RNA质量检测 相关试剂：溴酚蓝，TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB） 相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机） 相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒） （1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。 （2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错，可以用于下游逆转录实验。
人教版八年级下册生物实验指导
八年级下册（人教版）实验教学 目录 第七单元生物圈中生命的延续和发展 第一章生物的生殖和发育 第一节植物的生殖 探究实验十四扦插材料的处理 (89) 第四节昆虫的生殖和发育 课外探究家蚕的生殖与发育 (91) 第四节鸟的生殖 探究实验十五探究鸟卵的结构 (92) 第二章生物的遗传和变异 第五节生物的变异 探究实验十六花生果实大小的变异 (94) 第三章生物的进化 第三节生物进化的原因 模拟探究模拟保护色的形成过程 (97) 第八单元健康地生活 第三章动物在生物圈中的作用 第二节动物与人类生活的关系 探究实验十七酒精或烟草浸出液对水蚤心率的影响 (100)
探究实验十四扦插材料的处理 ■实验预习 1．下列不属于无性生殖方式的是（） A.试管婴儿 B.克隆 C. 组织培养 D.出芽生殖 2．下列不属于无性生殖的优点的是（） A.保持亲本的优良性状 B.繁殖速度快 C.培育新品种 D.以上都是3．有性生殖有生物个体生命起点是（） A.生殖细胞 B.受精卵 C.卵细胞 D.幼体出生 4．某同学在橙树枝上做了多次嫁接柑桔枝条，就是没有成功。可能的原因是（） A.形成层对齐 B.温度不适宜 C.水分适宜 D.接穗和砧木属同科植物5．下列哪项为无性生殖和有性生殖的最大区别? （） A．是否产生生殖细胞B．是否需要两性生殖细胞结合 C．后代是否有性别之分D．亲代是否有性别之分 6．克隆羊“多莉”，是将白面绵羊的乳腺细胞核移植到黑面绵羊的去核卵细胞中后，经一系列培育而成。试根据遗传学原理，分析“多莉”的面部毛色应是 （） A．黑色B．白色C．黑白相间D．不能确定 ■实验指导 1．材料选取：用茎繁殖成活率高的植物，如柳枝、玫瑰枝、葡萄枝、枳壳枝等一年生新枝。 2．对枝条的处理： （1）上下两端至少各有一个芽。上芽利于长茎叶；下芽利于长根。 （2）上端切口角度是45度，而下端切口是斜向的 3．扦插的要求： 茎插入角度为45度，保证上端切口与地面呈90度角。 ■实验报告 目的要求： 1．进一步掌握对照实验的设计 2．运用生物知识解决实际问题 材料用具：
细胞克隆形成实验
细胞克隆形成实验 当单个细胞在体外增殖6 代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50 以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。 细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大： 一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。 实验方法： 平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验 (a) 平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞 (b) 软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。 平板克隆形成实验基本步骤： 1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DME培养液中备用。 2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL37°C预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37C 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2?3周。 3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用 PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10?30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。 4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。 克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)X100% 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。
目的基因PCR扩增产物的克隆
目的基因PCR扩增产物的克隆 [实验原理] 1.PCR产物回收 在高离子盐存在的情况下，DNA片断选择性的吸附于离心柱内的硅基质膜上，再通过一系列快速的漂洗、离心的步骤去蛋白液和漂选液，将引物、核苷酸、蛋白酶等杂质去除，最后用低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净DNA从硅基质膜上洗脱。 2.T载体与PCR产物的连接 源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA 分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。因为DNA片断有两个端点，所以切割时出现两种可能，一种是单酶切，另一种是双酶切，这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。对于单酶切来说，载体与供体的末端都相同，连接可以在任何末端之间进行，这样就导致了大量的自连接产物。为了减少自环的高本底，可对载体进行5’除磷酸处理，原理是连接酶只能连接DNA 片断的3’OH末端与5’端，所以除磷后载体不会自环。一旦有外源片断插入时，由外源片断提供5’端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自身成环造成的高本底。对于双
RNA提取,RT-PCR实验报告
RNA制备及其鉴定 实验目的初步掌握组织总RNA制备的原理及其基本方法，掌握RNA纯度鉴 定的基本方法。 实验原理 细胞内的RNA通常与蛋白质结合，以核蛋白（RNP）的形式存在。分离制备RNA时，首先必须破碎细胞，使RNP释放到溶液中并与蛋白质分离，然后将RNA同其他的细胞成分分离开并保证RNA的完整性。本次实验我们选用了Trizol法分离提取小鼠肝组织的总RNA，Trizol法分离提取的RNA产率高、纯度好且不易降解。 评价RNA质量的标准是RNA的均一性和完整性。均一的RNA取决于有效的去除RNA提取物中的DNA、蛋白质和其他杂质；完整的RNA取决于最大限度地避免纯化过程中内源性及外源性RNA酶对RNA的降解。通常采用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度，纯RNA的A260/A280=2.0，但由于所用的标本不同，此比值有一定的变化，一般在1.8~2.0之间，低于改值表明有蛋白污染，需进一步用酚/氯仿抽提。RNA的完整性可通过琼脂糖电泳法进行鉴定。完整的RNA电泳时，28S和18SrRNA经EB染色后，两条电泳条带的显色强度近似为2比1。 本实验中几个重要试剂的作用： Trizol试剂：Trizol的主要成分是苯酚、异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸钠、β-巯基乙醇、醋酸钠、柠檬酸钠。它的主要作用是1、裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。2、使蛋白质变性，有利于DNA和RNA与蛋白质的分离。3、抑制内源和外源RNase。 氯仿：氯仿的作用有多个方面，一、作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去。二、通过变性作用抑制RNase活性；三、通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；四、作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除杂作用。 异丙醇：异丙醇是沉淀核酸用的，作用和乙醇一样。只不过用量要比乙醇少。异丙醇是等体积，而乙醇一般需要2.5倍体积。在水相很多，离心管容积有限，加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀。 75%乙醇：应用无水乙醇+DEPC水制备。用乙醇洗涤沉淀，可去除所有残留的蛋白质和无机盐.RNA样品中如果含有无机盐,有可能对后续实验操作中的一些酶促反应产生抑制作用。 实验步骤按规定的操作步骤进行操作，特别注意创造一个无RNA酶的环境。实验结果 经RNA琼脂糖电泳后，紫外灯下观察RNA分离情况如下图：
最新soft agar assay protocol软琼脂克隆形成实验教学内容
1.软琼脂克隆形成实验 1)配制1.2%和0.7%的琼脂糖，高压灭菌后置于55℃水浴中，使其保持融化状 态。 2)配含20%FBS、2×抗生素的2×RPMI 1640培养基，37℃预热。 3)灌下层胶：1.2%的琼脂糖胶与2×培养基1:1混合，加入到6孔板中，每孔3ml， 室温放置待其凝固。 4)等待下层胶凝固过程中消化B16 con shRNA与B16 Myo7a shRNA稳转细胞， 计数，用无血清培养基调整浓度为5×104/ml，每孔用100μl细胞，设3个平行孔。 5)下层胶凝固后灌上层胶：0.7%的琼脂糖胶与2×培养基1:1混合(温度约40℃ 左右)，加入100μl细胞悬液，即5000个细胞，混匀，加入孔板中，每孔3ml。 6)37℃5% CO2培养，约2-3周收细胞，0.1%结晶紫染色，计数并比较两组克 隆形成情况。 1、人生最重要的不是努力，不是奋斗，而是抉择。 2、老板只能给一个位置，不能给一个未来。舞台再大，人走茶凉。 3、意外和明天不知道哪个先来。没有危机是最大的危机，满足现状是最大的陷阱。 4、所见所闻改变一生，不知不觉断送一生。 5、生意，可以掌控努力与投资，却无法掌控结果。人生得意时找出路，失意时才有退路，宝马都有备胎，您的人生呢？ 6、世界上有多少有才华的失败者，世界上有很多高学历的无业游民—是因为选择错误。 7、下对注，赢一次；跟对人，赢一世。 8、学识不如知识，知识不如做事，做事不如做人。 9、不识货，半世苦；不识人，一世苦。 10、生命不在于活得长与短，而在于顿悟的早与晚。
11、做人处事，待人接物：重师者王，重友者霸，重己者亡。 12、没有目标的人永远为有目标的人去努力。 13、人生三阶段：比才华；比财力；比境界。 14、人若把自己框在一定的范围内，就容易限制了自己的思维和格局。 15、今天的优势会被明天的趋势代替，把握趋势，把握未来。 16、读万卷书不如行千里路，行千里路不如阅人无数，阅人无数不如名师指路。经师易得，人师难求。 17、学历代表过去，财力代表现在，学习力代表将来。 18、人生能走多远，看与谁同行；有多大成就，看有谁指点。 19、聪明的人看得懂，精明的人看得准，高明的人看得远。 20、做人不成功，成功是暂时的；做人成功，不成功也是暂时的。 记住这些话他会帮你变得更完美 记住： 再烦，也别忘微笑；再急，也要注意语气； 再苦，也别忘坚持；再累，也要爱自己。 低调做人，你会一次比一次稳健；高调做事，你会一次比一次优秀。成功的时候不要忘记过去；失败的时候不要忘记还有未来。 有望得到的要努力，无望得到的不介意，则无论输赢姿态都会好看。生活不是单行线，一条路走不通，你可以转弯。 泪水和汗水的化学成分相似，但前者只能为你换来同情，后者却可以为你赢的成功。 变老是人生的必修课，变成熟是选修课。 以锻炼为本，学会健康；以修进为本，学会求知；
目的基因的克隆转化及重组子筛选
实验报告 题目:单元二:目的基因的克隆、转化及重组子筛选 指导老师:丛佩清 日期:2013/10/24-2013/10/26 一．实验目的： (1)学习和掌握DNA片段胶回收的方法。 (2)学习DNA连接的有关技术。 (3)掌握用CaCl2 法制备感受态细胞的原理和方法。 (4)学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。 (5)掌握质粒提取的基本方法。
(6)学习和掌握限制性内切酶的使用方法。 二．实验原理： (1)cDNA的TA克隆:Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有 3’T突出端的载体，在连接酶作用下，通过粘性末端连接，把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，称为 T-A克隆。可用于PCR产物的克隆和测序。 (2)感受态细胞制备原理：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态,细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，细胞膨胀，细胞壁通透性增强,在冷热变化刺激下细胞膜表面产生裂隙，使外源DNA进入。 (3)蓝白斑筛选:载体带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽；宿主细胞编码C端部分序列。诱导物IPTG 和乳糖的结构相似，可以与乳糖操纵元的阻遏蛋白结合，从而解除阻遏蛋白的作用，使载体得以合成α-互补肽，与宿主细胞编码的C端部分结合形成β-半乳糖苷酶，而X-Gal是β-半乳糖苷酶的显色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。可用于重组克隆的筛选，重组克隆无法产生α-互补肽，因而无法使X-Gal显色，培养基上表现为白色菌落。 三．实验材料： 大肠杆菌DH5a、LB培养基、0.1mol/L CaCl2溶液、Binding Buffer、spin-column、SPW 溶液、1μl pMD19-T Vector、5μlSolution Ⅰ、250μlSolution Ⅰ、250μlSolution Ⅱ、350μlSolution Ⅲ、HiBind ? Mini Columns (I)、500 μlBuffer HB、1400 μlDNA Wash Buffer等 四．实验步骤、现象、结果及分析： Ⅰ10月24号 (1)cDNA电泳及胶回收 1. 取上周制备的置于-20℃冰箱保存的目的基因产物1、2、3组DNA样品，选取其中2号组及3号组进行琼脂糖电泳，因1号组RT-PCR琼脂糖凝胶电泳有杂带故弃而不用，1、3号组DNA样品（已加入loading buffer）分别加入SYBR Gold2μl，1%琼脂糖电泳，紫外灯下切胶。 2.把所割胶放入1.5 ml EP管，称重如下表一。 表一：cDNA琼脂糖凝胶重量 空管2管3管 重量（g）0.9045 1.2280 1.2961 净重（g）0.3235 0.3916 3.按1g/1ml 的量，大致各加入400μl Binding Buffer，65℃水浴7min；（每隔2－3 min，摇一下）； 4.把溶液转移至spin-column，10000g 离心1 min ，倒出套管内残液； 5.在柱子中加入300μl Binding buffer，10000g 离心1min，倒出套管内残液； 6.在柱子中加入700ul 的SPW 溶液，放置3min，10000g 离心1min ，去残液； 7.10000g 离心1min（去乙醇）； 8.把柱子放入干净的1.5ml EP 管。加Elution Buffer 20μl。室温放置1min，10000g 离心1min。 9.检测DNA的纯度和浓度，如下表二所示。选取质量好的2号组进行接下来的连接转化。 表二：cDNA吸光度测定 2组3组
目的基因克隆之欧阳光明创编
一、目的基因克隆的策略有哪些？其理论依据什么？如何根据具体条件，如目的性状的特点，已知控制目的性状的基因的信息合理选择基因克隆的方法？ 欧阳光明（2021.03.07） 1、主要有以下几个克隆的策略： （1）PCR法分离目的基因：从蛋白质的一级序列分析得到核酸序列的相关信息，设计简并引物，通过对mRNA进行反转录得到cDNA，以cDNA为模板，然后将目的基因通过PCR方法扩增，或者直接从基因组DNA扩增的方法。 （2）核酸杂交的方法：通过对蛋白质的氨基酸序列分析，设计简并引物，通过核酸杂交的方法从基因文库中筛选得到目的基因。（3）免疫学筛选法分离目的基因：利用免疫学原理，通过目的蛋白的特异抗体与目的蛋白的专一结合，从表达文库中分离目的蛋白基因。 2、若控制该性状的目的蛋白质不容易分离纯化，这PCR方法比较适宜，若蛋白质分离纯化容易，且有现成的基因文库，则后两种方法较为简单。 二、蛋白组学方法克隆目的基因的理论依据是什么？有哪些技术环节？要用到哪些技术？ 1、理论依据：以分离纯化的目的蛋白为研究起点，通过对目的蛋白的一级结构分析，获得起码的氨基酸序列信息后，反推可能的
DNA序列，然后设计引物，从cDNA中将目的基因扩增出来，或者设计核酸探针，通过杂交技术将目的基因从基因文库中筛选出来。或通过抗体抗原免疫反应从表达文库中将该基因分离出来。 2、技术环节是确定并制备出高纯度的蛋白质。 3、所需要的实验技术有：蛋白质的双向电泳技术，由第一向的等电聚焦电泳和第二向的SDS-PAGE电泳组成；蛋白质氨基酸序列分析。 三、基因组学方法克隆基因的策略有哪些？各有什么特点？如何选择恰当的基因组学方法克隆目的基因？ 1、基因文库筛选方法 通过对基因文库的筛选将目的基因分离出来，一般有两种方法：核酸杂交法，原理是分子杂交；PCR筛选法，通过ＰＣＲ方法将目的基因分离出来，对于以混合形式保存的文库，先将文库分成几份，每份为一个“反应池”进行PCR反应，待选出阳性池后，将阳性池的混合克隆稀释，然后等量分置96孔板中，进行横向池及纵向池的ＰＣＲ反应，然后将阳性菌落群进行稀释，重复上述工作，直到筛出阳性单克隆。 2、图位克隆目的基因 利用分子标记技术对目的基因进行精细定位，利用分子标记技术对目的基因进行精细定位，用获得的与目的基因紧密连锁的分子标记筛选基因文库的方法。主要有染色体步移法、染色体登陆、跳查和连接法；外显子捕捉和cDNA直选法等。 3、插入突变分离克隆目的基因
植物基因克隆实验指导
植物基因克隆实验规则 一、植物基因克隆实验课的目标 根据基因克隆实验操作的整体性和连贯性特点, 将该实验设计为综合性实验课程，实验内容设计上完全抛弃了原来分散的、孤立的单纯学习某一实验技术的缺陷, 将单个实验综合为系统的、连贯的系列型大实验，注重科研成果在教学中的应用，我们从以往的科研项目中选取了部分研究内容用于学生的综合性实验教学，这是基于教学实验与实际科学研究实验之间的新的实验教学模式。 整套实验围绕洋甘菊倍半萜生物合成途径中关键酶基因HMGR的克隆这一研究课题进 行操作, 设计的实验内容具有极强的连续性和综合性，让学生在独立实践操作中学习基因克隆的基本研究方法和体会科学研究的严密逻辑和培养科研理念。 我们将实验内容设置为8个部分, 实验内容前后衔接紧密, 环环相扣, 不可分割, 前一个实验的结果是下一个实验的材料。该课程使学生获得了整个类似科研实践过程的训练和体验, 学习了从事科研工作的基本功, 对完成自己的毕业论文及将来从事生命科学研究奠定了科 研基础。 二、实验的进行程序和要求 1、预习学生在课前应认真预习实验指导以及教材有关章节，必须对该次实验的目的要求、实验内容、基本原理和操作方法有一定的了解。 2、讲解教师对该实验内容的安排及注意事项进行讲解，让学生有充分的时间按实验指导的要求进行独立操作与观察。 3、独立操作与观察除个别实验分组进行外，一般由学生个人独立进行操作和观察。在实验中要按实验指导认真操作，仔细观察，作好记录。有关基本技能的训练，要按操作程序反复练习，以达到一定的熟练程度。
4、演示每次的实验都备有演示内容，其目的是帮助学生了解某些实验中的难点，扩大在实验课有限时间内获得更多感性知识的机会。 5、作业实验报告参照硕士毕业论文的格式写，必须强调科学性，实事求是地记录、分析、综合。在实验结束时呈交。 6、小结每次实验结束后，由师生共同小结本次实验的主要收获及今后应注意的问题。 三、实验规则和注意事项 1、每次上课前，必须认真阅读实验指导，明确本次实验的目的要求、实验原理和注意事项，熟悉实验内容、方法和步骤。 2、上实验课时必须携带实验指导、记录本及文具等。进入实验室要按规定座位入座。 3、实验时要遵守纪律，听从教师指导，保持肃静。有问题时举手提问，严禁彼此谈笑喧或随意走动，也不得私自进行其他活动。 4、实验时要遵守实验操作规程，严格按照教师的安排和实验指导的要求进行。操作观察要认真仔细，边做、边看、边想，认真做好实验记录。 5、要爱护仪器和器材设备，注意节约实验材料、药品和水电。如有损坏器材应立即报告并主动登记、说明情况。 6、实验结束后，应清理实验台面，认真清理好仪器、药品及其他用品，放回原处，放好凳子，方可离开实验室。值日生要负责清扫地面，收拾实验用品，处理垃圾，关好水、电、门窗后再离开。
基因工程原理讲义：目的基因的克隆
第九讲目的基因的克隆 中国科学院遗传与发育生物学研究所 2017年8月
目录 一、基因克隆的一般概念 1．基因克隆定义 2．“克隆”的不同含义 3．基因克隆的过程 4．DNA片段的产生与分离 5．基因文库 二、基因克隆与分离的实验策略 1．物理策略 2．生物策略 3．克隆样品的选择 4．基因文库库容测算 三、cDNA基因克隆 1．概述 2．cDNA文库的构建 3．低丰度mRNA之cDNA克隆 4．稀少mRNA的cDNA克隆 5．全长cDNA的合成 6．cDNA克隆的优越性 四、基因组DNA克隆
1．cDNA克隆的局限性 2．基因组DNA克隆的优越性 3．构建基因组文库的载体类型五、基因定位定隆 1．基因定位克隆概述 2．RFLP分子标记 3．RFLP作图原理与步骤 4．染色体步移 5．大尺度物理图谱的构建
目的基因的克隆 一、基因克隆的概念 1．基因克隆的定义 基因克隆亦叫做DNA克隆(DNA cloning)，它是指将外源基因或DNA片段插入到克隆载体的分子上，构成重组的DNA群体，并转化到寄主细胞进行复制和繁殖，以便从大分子DNA或DNA片段混合物中分离纯化目的基因或特定DNA片段的实验操作，叫做基因克隆。严格地说，基因克隆应叫做DNA克隆，因为被克隆的是基因组的全部(理论上)的DNA片段，而并不是所有的DNA片段都编码有基因。 *要注意基因克隆与基因分离两者在概念上的差别！完成了基因克隆并不等于完成了基因的分离！尽管两者之间存在密切的相互关系。因此在日常交谈中或是一般文字叙述中，甚至于某些正式有关文件中，常把“基因克隆”与“基因分离”等同使用，不作区分，是不妥当的。 *有时我们所说的基因克隆，即所谓的“分子克隆”(Molecular cloning)，实质上包含着目的基因的分离与鉴定两个主要的内容，基因克隆的全过程包括如下四个步骤：