cDNA文库的构建
以生物细胞的总 mRNA 为模板，用逆转录酶合成互补的双链 cDNA ，然后接 到载体上，转入到宿主后建立的基因文库就是 cDNA 文库。
构建 cDNA 文库通常包括：
① mRNA 的提取及其完整性的确定；
② cDNA 的合成和克隆；
③ 目的 cDNA 的鉴定等步骤。
一、 mRNA 的提取及其完整性的确定
1. 总 RNA 的提取
RNA 提取程序一般包括：①沉淀细胞；②裂解细胞；③离心除去细胞残渣。
2.mRNA 的分离
高等真核生物 mRNA 分子的 3' 端均有 poly(A) 尾，尾的长度一般足以吸附于寡聚脱氧胸腺核苷酸（ oligo dT ） - 纤维素上，因此，可以用亲和层析法从总 RNA 样品中分离 mRNA 分子，得到的 mRNA 分子实际上编码细胞内所有的多肽。
3. mRNA 的纯化
对高丰度的 mRNA 来讲，其所对应的 cDNA 克隆很容易通过核酸杂交加以鉴定，从 cDNA 文库中分离出来，因此，在合成和克隆双链 cDNA 之前不需要进一步纯化和富集。分离低丰度 mRNA 通常有如下两种方法：①按照大小对总 mRNA 进行分级，主要用琼脂糖凝胶电泳和蔗糖密度梯度离心法进行分级；②多聚核糖体的免疫学纯化法，这是利用抗体来纯化合成目的多肽的方法。
4. mRNA 完整性的确定
确定 mRNA 完整性的方法有三种：
① 直接检测 mRNA 分子的大小；
② 测定 mRNA 的转译能力；
③ 检测总 mRNA 指导合成 cDNA 第一链长分子的能力。
二、 cDNA 的合成和克隆
1. cDNA 第一链的合成
用亲和层析法得到 mRNA 后，根据 mRNA 分子的 3' 端有 poly (A) 尾结构的原理，用 12~20 个核苷酸长的 oligo （ dT ）与纯化的 mRNA 混合， oligo （ dT ）会与 poly (A) 结合作为反转录酶的引物，反转录反应的产物是一条 RNA-DNA 的杂交链。 oligo （ dT ）结合在 mRNA 的 3' 端，因此合成全长的 cDNA 需要反转录酶从 mRNA 分子的一端移动到另一端，有时这种全合成难以达到，尤其是 mRNA 链很长时，为此建立了一种随机引物法合成 cDNA 。随机引物是一种长度为 6~10 个核苷酸，由 4 种碱基随机组成的 DNA 片段。与 oligo （ dT ）仅与 mRNA 3' 端结合不同，它们可以在 mRNA 的不同位点结合。随机引物法合成的产物也是 RNA-DNA 的杂交体。把 cDNA 克隆到载体中之前，必须把这种杂交体中的 RNA 转变成 DNA 链，即形成双链 DNA 分子。
2. 双链 cDNA 的合成
合成 cDNA 第二条链有两种方法。一种方法是利用 cDNA 第一链的 3' 末端常常出现发夹环的特征，这种发夹结构是反转录酶在第一链末端“返折”并且进行复制第一链的结果，它为合成 cDNA 第二链提供了有用的引物。用这种方法合成的双链 cDNA 在一端有一个发夹环，可以用单链特异的 S1 核酸酶切去。但是 S1 核酸酶的处理，常
常会“修剪 ” 过多的 cDNA 顺序，使 cDNA 丢失了 mRNA 5' 端的部分顺序。如 图 8 所示。
图 8
另一种方法是用大肠杆菌的 RNase H 进行修饰。 RNase H 能识别 RNA-DNA 杂交分子并把其中的 RNA 切割成短的片段，这些 RNA 短片段仍与 cDNA 第一链结合，可被新合成的 DNA 所取代。新合成的 DNA 存在切口，用 DNA 连接酶把这些切口连接在一起形成一条完整的 DNA 链。 RNase H 法优于 S1 核酸酶法，它能获得包括 mRNA 5' 端全部或绝大部分的更长顺序 cDNA 分子。
3. 将 cDNA 重组到载体上
合成的 cDNA 与载体 DNA 进行连接一般有 3 种方法：
① 借助于末端转移酶的 3' -OH 端合成均聚物的能力，双链 cDNA 和线性化载体 DNA 的 3' -OH 端分别加上 均聚核苷酸链；
② 双链 cDNA 和线性化载体 DNA 分别用 Klenow 片段进行末端补平，然后用 T4 DNA 连接酶进行齐头连接， 形成重组体；
③ 通过粘性末端连接。
4. 转化
重组的载体 DNA 分子在一定条件下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。 当不同重组的 DNA 含有不同的 cDNA 基因时，整个转化子含有来自 mRNA 群体的各种 cDNA 基因，这样的转 化子群体构成该 mRNA 全部遗传信息的 cDNA 基因文库。
5. 目的 cDNA 克隆的鉴定
用于从 cDNA 文库中筛选和鉴定目的 cDNA 的方法主要有 3 种：
① 核酸杂交：核酸杂交是从 cDNA 文库中筛选目的克隆最常用、最可靠的方法。它可以同时迅速地分析数目 极大的克隆，而不要求目的克隆包含全长的 cDNA 片段或 cDNA 克隆在宿主中表达。
② 免疫学杂交检测：在无法获得合适的探针进行核酸杂交反应的情况下，免疫学检测方法是筛选重组体的重 要途径，通过检测重组克隆所表达的基因产物筛选目的克隆。
③ cDNA 同胞选择：将 cDNA 文库先分成若干个各含 10~100 个克隆的易于处理的亚 cDNA 文库，由于每个亚 库的复杂度较低，故可使用对整个 cDNA 文库相对不太灵敏的方法。当鉴定出阳性库后，再将其分成越来越小 的库，进一步进行检查，如此重复直至分离到目的 cDNA 克隆。