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彗星实验

彗星实验
彗星实验

彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis,SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1~3],并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。本实验对Singh 等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet,UV),属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7~9],诱导K562细胞DNA损伤,用改良彗星实验检测损伤程度,验证改良的实验系统是否可靠,同时筛选并评价DNA损伤的分析指标。

1 材料与方法

1.1 细胞K562细胞,来源于第四军医大学免疫学教研室,37 ℃、5% CO2培养箱中培养,取对数期细胞进行实验。

1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型,20 W,天津市紫晶特种光源有限公司)。

1.3 主要试剂和仪器培养基:10%新生牛血清(杭州四季青公司),90%RPMI-1640培养液(Hyclone公司);双抗(青、链霉素,100 UI/ml);Triton

X-100(Genview分装);二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装);低熔点琼脂糖(FMC 分装);常熔点琼脂糖(Spanish分装)。其余生化试剂均为分析纯。电泳仪:由西北大学物理系提供;电泳槽:DYC33A型(北京市六一仪器厂);显微镜:Leica DM LB 2 (Leica 公司);彗星图象分析软件:CASP软件(casp-1.2.2,

https://www.wendangku.net/doc/756805556.html,/index.php下载);CO2培养箱:BB16HF型(上海力申科学仪器有限公司);环地牌紫外辐照计(北京师范大学光电仪器厂)。

1.4 实验分组及UV处理

收集对数生长的K562细胞,台盼蓝染色计数,细胞活力大于95%,用Hank's(pH7.4)调整细胞密度至1×105/ml,接种于塑料培养皿中(ф=35 mm,2 ml/plate),然后进行紫外线照射(0.3 mW/cm2)。实验分为对照组和8个照射组,各照射组分别照射3、5、10、40,60、120、180、240 s,对照组不进行紫外线照射,之后进行彗星实验。

1.5 细胞活性检测台盼蓝拒染法[10]即时检测经UV处理后K562细胞的活性。

1.6 彗星实验1988年Singh等[5]建立了碱性彗星实验,我们对该实验流程进行改良,首先改变了制胶方法,并在裂解后加入水洗的操作步骤,中和完

成后再用梯度酒精脱水。具体流程如下:①镀膜法制备底胶,将洁净的载玻片在0.2%的常熔点琼脂糖中浸没1 min后,置37 ℃孵箱烘烤过夜;实验时将细胞悬液与低熔点琼脂糖(42 ℃)以1∶1的比例在离心管中混匀,立即灌胶(先用盖玻片在已包被的载片上搭一个22 mm×10 mm×0.17 mm的小槽再灌胶),4 ℃静置15 min后取下盖片,制得含细胞胶层。②裂解,4 ℃,1 h。③水洗,三蒸水4 ℃水洗3 次,5 min/次。④解旋,4 ℃,20 min。⑤电泳,4 ℃,20 min,0.8 V/cm。⑥中和,3 次,每次5 min。⑦梯度酒精脱水,(50%、70%、80%、90%、100%、100%,常温下各一次,每次5 min)。⑧染色(EB,20 μg/ml,20 μl),之后镜检,每组随机取50 个细胞,用CASP分析软件进行分析[11~14]。

1.7 统计学方法实验数据进行t 检验。

2 结果

2.1 改良实验方法的结果通过对制胶方法的改进,基本解决了实验中常见的脱胶现象。同时经梯度酒精脱水后的彗星图象基本位于一个焦平面上(图

1),采图更为方便、可靠。

2.2 台盼蓝染色结果显示紫外线照射没有产生致死性损伤。

2.3 彗星实验结果

由表1可知,UV照射K562细胞从最短的照射时间(3 s,0.9 mJ/cm2)开始,实验组尾长、彗星长、尾矩、Olive尾矩均大于对照组,且差异具有统计学意义(P<0.01)。当UV照射时间延长到240 s时,各参数不再增加。从3 s到180 s,这些检测参数均表现出时间依赖效应。

表2的数据显示,实验组彗星头部半径、头部的面积、头部的DNA含量、头部平均荧光强度、头部DNA百分比随照射时间的增加,表现出振荡模式。

表3的实验结果显示,UV处理后,实验组细胞核DNA尾部的面积、尾部DNA、尾部DNA百分比均大于对照组,t检验有统计学意义(P<0.01),且随UV照射时间的延长,除尾部平均荧光强度外,其它各参数下实验组表现出增加的趋势,显示出时间依赖效应。

3 讨论

DNA分子中的共轭键可吸收较短波长的紫外线,从而导致自身发生损伤[15]。彗星实验可以检测DNA链断裂损伤。

我们采用改良的彗星实验进行检测,用尾长、彗星长、尾矩,Olive尾矩作为分析指标,结果显示,0.3mW/cm2 UV照射3 s即可造成细胞DNA损伤,且随UV照射时间的增加,DNA损伤也增加,表现出良好的时间效应关系,说明改良的彗星实验方法和上述四种分析指标比较可靠。当照射时间增加到240 s时,各分析指标有下降的趋势,表明彗星实验有检测的阈值,当细胞损伤程度超过此值后,该方法就不能够进行准确的检测。

当以尾部的面积、尾部的DNA和尾部的DNA百分比作为分析指标时,结果表现出时间依赖性,提示可以将这些参数用作DNA损伤的分析指标。Durand等[16]分析了彗星图象的几种指标(尾长,彗星尾部DNA百分比,彗星尾矩),发现尾矩这一指标具有分析范围广的特点。我们的实验结果与他们的研究有较好的一致性。

由于尾矩、Olive尾矩等分析参数可以反映尾部的面积、尾部的DNA含量以及尾部的DNA百分比,因此选择尾长、彗星长、尾矩、Olive尾矩作为彗星实验的分析指标,均能较好反映细胞DNA的损伤程度。而采用彗星头部半径、头部面积、头部DNA含量、头部DNA百分比和头、尾部的平均荧光强度作为分析指标时,损伤程度随UV光强的增加表现出振荡模式,提示这6种分析指标不适合用作彗星实验DNA损伤的评价指标。综上,我们建立的改良彗星实验系统具有较好的可靠性,CASP分析软件可用于彗星实验的分析,彗星长、尾长、尾矩和Olive尾矩,均能较好地反映细胞DNA的损伤程度。

由Osting 和Johanson 于1984 年首先提出的微电泳技术,1988 年经Singn 等进一步完善为单细胞凝胶电泳( single cell gel elect rophoresis , SCGE) 。SCGE 是一种在单细胞水平上检测DNA 链损伤的方法,其原理是:包埋在琼脂糖凝胶中的细胞在中性或碱性条件下经裂解与解旋后,带负电荷的DNA 游离断片,在电场作用下向阳极迁移。在荧光显微下观察,受损DNA 形成的影像形似夜空中的彗星,故又称“彗星试验”(Comet Assay) 。彗星试验检测单细胞

水平DNA 损伤,无需放射性示踪,适用于各种有核细胞,样品用量少,试验周期短,故而灵敏、快速、简便(1 ,2) 。目前国内外对彗星试验研究的热点主要集中在两个方面:彗星试验的应用与方法学研究。

1 彗星试验的应用

111 检测化学物质引起的DNA 损伤目前,对化学物质的DNA 损伤作用检测依然是彗星试验的主要应用范围。自彗星试验建立以来,已有多种物质的DNA 损伤作用经过检测,对金属化合物、氧化剂、烷化剂、交联剂的研究都有报道。近年来的研究不仅仅局限在物质是否造成DNA 损伤,在损伤机制、损伤与修复问题上已有了新的探索。M.Tafazoli 等用彗星试验检测了五种氯化烷、烯类物质,结果证明:氯基数目的多少与双键是否存在使物质致DNA 损伤作用存在质和量的差别,含氯数目越多,DNA 损伤作用越强,带双键的烯类比无双键的烷类

损伤作用强,说明物质的DNA 损伤作用与其结构密切相关(3) 。Toshio Kasamatsu 将彗星试验改良,使细胞裂解后再染毒,并与传统彗星试验比较,结果发现:所检测的直接致突变物,在改良法和传统法中均得到阳性结果;需要经过代谢或膜作用才能对DNA 造成损伤的间接致突变物则只在传统法中得到阳性结果,在改良法中为阴性,这一研究成果对我们分析遗传毒物的化学与生物特性颇有参考价值(4) 。112 化学物质的靶组织遗传毒性评价B. L. Pool2Zobel 等将从人体组织直肠获得的细胞克隆后,暴露于有致癌危险性的化学物中,观察形成直肠肿瘤的情况,该研究证明彗星试验能有效评估不同化学物质对靶组织的遗传毒性(5) 。体外试验检测出的致突变物质,在机体内经代谢后,对整个机体的作用如何,对哪些组织具有遗传毒性,是否具有特异性靶组织,彗星试验体内试验研究将对其做出客观评价。

1. 3 辐射生物学研究

过去的研究已证实彗星试验检测低剂量辐射引起的DNA 损伤快速、灵敏。它可以监测接触放射线的人群DNA 损伤状况,监测肿瘤放疗前后DNA 损伤变化,总之,彗星试验已被广泛应用于辐射损伤的监测。1996 年Takajj Ikushima 提出假说:辐射诱发DNA 损伤的有效修复机制的激发与放射适应性有关。他们首先让细胞在37 ℃接受非损伤性低剂量辐射4h ,再以损伤剂量处理适应细胞和未适应细胞,发现适应细胞损伤修复率高。这一发现使我们对辐射生物效应的研究打开了新思路(6) 。

1. 4 肿瘤细胞生物学研究

1. 4. 1 凋亡与肿瘤:细胞凋亡与肿瘤的关系,是目前毒理学研究的一个崭新方

向。肿瘤的产生缘于机体内调节细胞增殖和死亡平衡的机制被破坏。在肿瘤发生发展及灭亡过程中,细胞凋亡起着重要作用,对凋亡的进一步研究将对认识肿瘤的发生机制、预防及治疗肿瘤产生深远的影响(7) 。凋亡发生时将产生180 —200bp 或其整数倍大小的DNA 片段,在彗星试验中呈现独特的小头大尾的形态学特征, (8) 因此,以DNA 损伤为检测终点的彗星试验可用于凋亡的检测。

1. 4. 2 肿瘤细胞药物抗性: Peggy Olive 等研究发现:肿瘤细胞亚群对DNA 损伤具有抗性(9) 。由于彗星试验检测单细胞水平DNA 损伤,对细胞亚群的损—208 —伤情况,各细胞亚群对物质作用的反应是否均一都能得到明确的结果。因此,彗星试验用于检测药物抗性细胞,能够为治疗方案的及时调整提供依据。

1. 5 生态毒理学

1996 年G. Koppen 等首次将彗星试验应用于植物细胞- 蚕豆根尖细胞,他们将蚕豆根尖细胞以浸泡方式暴露在不同化合物的溶液中,观察DNA 损伤情况,发现甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、丝裂霉素C、氯化镉、重铬酸钾、氯化铬都能诱导蚕豆根尖细胞DNA损伤。彗星试验用于植物系DNA 损伤监测,对于环境质量的评估非常有意义(10) 。

1. 6 工业废水监测

研究工业废水的遗传毒性最常用的方法是微生物测试系统(Ames 试验) 和植物测试系统(紫母草花粉母细胞和蚕豆根尖细胞微核试验) ,这些试验需对样品进行预处理,操作繁杂。张遵真等将彗星试验改良,直接将细胞浸泡于不同浓度的各种工业废水中检测其DNA 损伤效应,提供了一种敏感性高、可直接测定各种污水遗传毒性的方法(11) 。

1. 7 人群流调

近年来彗星试验用于流行病学调查增多。Ric2cardo Crebelli 等检测苯职业暴露人群外周血淋巴细胞DNA 损伤情况,发现暴露人群与匹配的对照人群相比较,DNA 损伤有显著差异,暴露组尾长远远大于对照组(12) 。E. Rojas 等调查吸烟人群颊粘膜细胞DNA 损伤情况,与不吸烟人群相对比,吸烟者DNA损伤明显高于不吸烟者,其尾长89. 30 ±16. 18μm ,而不吸烟者为52. 01 ±10. 43μm(13) 。Roberto Barale则对戒烟人群进行随访追踪调查,发现成烟一年后,外周血淋巴细胞DNA 损伤明显减少(14) 。彗星试验所需样品用量少、灵敏、快速,必将成为分子流行

病学调查的有力手段。

1. 8 临床应用

1. 8. 1 病因与发病机理分析:未被正确修复的DNA氧化性损伤可以导致疾病甚至癌变, Kleiman NJ 等研究发现:白内障病人的晶体上皮细胞DNA 损伤水平升高,可能是氧化性损伤未被修复所致,故推测白内障发病机理可能与损伤的DNA 未被切除修复有关(15) 。

1. 8. 2 疾病诊断; 遗传性疾病如着色性干皮病(XP) ,因缺乏对DNA 损伤的修复能力,对紫外线诱发皮肤癌高度敏感。彗星试验可作为着色性干皮病及其他以切除修复缺陷为特征的综合征的诊断工具,有利于早期发现患者、控制疾病(16) 。

1. 813 药效评估:N - acetylcysteine (NAC) 曾被公认具有抗X 一放射作用,而BjornHellman 等用彗星试验研究却发现:无论NAC 存在与否,遭受X - 射线的淋巴细胞DNA 损伤都非常明显并有剂量—效应关系,未发现NAC 有抗放射作用,说明NAC 应用范围有限(17) 。依托泊苷etoposide 是一种有效的抗肿瘤药,但研究发现:在损伤肿瘤细胞DNA 的同时,该药对正常的外周血淋巴细胞DNA 也造成损伤,且呈剂量一效应关系。说明彗星试验能帮助我们全面客观地评估药效(18) 。

1. 8. 4 临床用药短期和长期遗传毒性评估: P.Gauduchon 等利用彗星试验评价两种抗真菌药对人淋巴细胞DNA 损伤作用,发现暴露于Chlirithalonil中1h ,有明显DNA 损伤而未见细胞死亡,暴露24h则细胞存活率急剧降低,在Carbendazim 中暴露1h和24h 均未见细胞毒性效应和DNA 损伤效应,为人们临床用药提供了参考(18) 。

2 彗星试验方法学研究

1997 年D. Slamenova 等人选用彗星试验、碱洗脱法和染色体畸变试验同时检测MNN G 诱导哺乳细胞DNA 损伤,发现彗星试验最敏感,低浓度(约0. 1μg/ml) 即可检测到DNA 损伤,而另两种试验需浓度≥1μg/ ml 才能检测,彗星试验灵敏性可见一斑(19) 。但影响试验敏感性的因素很多,如何控制这些因素的干扰,使试验灵敏度达到最佳,尚需进一步研究和摸索。

211 细胞

理论上彗星试验可用于任何有核细胞,实际上并非每种细胞对任何物质的DNA

损伤作用都敏感。马爱国等用彗星试验分析不同种类细胞的DNA 氧化损伤效应及自身修复能力的差异,结果显示淋巴细胞对氧化损伤有较强的抵抗力且损伤修复率低,修复慢(20) 。

2. 2 细胞暴露方式

细胞暴露于化合物的方式不同,试验敏感性也不同。张遵真等对彗星试验的悬浮染毒与传统染毒方式进行对比研究,发现:采用悬浮染毒检测化合物的DNA 损伤作用比传统染毒更敏感,并具有节省细胞和时间、均匀性好、操作方便等优点(21) 。

2. 3 裂解条件

包括盐浓度、pH 及裂解时间。对于盐浓度和pH ,结论比较一致,而裂解时间观点却不一。以往的研究认为裂解时间对试验结果影响很大,应在1h 与3h 之间,裂解过长将导致阴性组背景值增加;而1997年Ashbv 等将裂解时间延至18h 亦未见阴性组拖尾形成,他们认为裂解时间对结果无大的影响(22) 。

2. 4 解旋及电泳条件

包括解旋时间、pH 及NaCl 浓度、电压、电流及电泳时间。我们认为解旋30 分钟、电压20~25 伏、电流200~300 毫安、电泳30 分钟为宜。其中,解旋时间、pH、电压、电泳时间对试验结果影响最大,其余则较小。Ashbv 等观察到MNN G 处理过的细胞解旋0. 3h 与阴性对照组解旋8h 尾长相似,随解旋时间的增加,彗星尾部各参数的值亦增加(22) 。Maria Klaude等研究了电泳pH 的影响,发现:中性条件下,彗星尾主要由环状DNA 组成,附着于核,向四周伸展而不会迁移,碱性条件下游离DNA 断片则向尾部迁移,可见pH 大小对结果有很大的影响(23) 。

2. 5 检测指标

彗星试验的检测指标主要有拖尾细胞率、尾长、尾矩、DNA 含量。有时仅用尾长就能说明问题,有时用单一的指标并不能详尽地反映试验的真实情况,需要综合考虑。在试验中选择合适的指标,能使试验敏感性增高。

3 彗星试验应用前景展望

311 致突变物初筛:目前应用最广泛的体外哺乳动物细胞短期致突变试验是姊妹染色单体交换试验(SCE) 和外周血微核试验(peripheral blood micronu2cleus ,pbMN) ,若彗星试验的敏感性能够与上述二者一致或接近,因其简

便、快速等特点,决定了其在致突变物初筛中广阔的应用前景。但致突变物质种类繁多,结构不同,功能基团不同,作用方式亦不同,彗星试验是否对各种类型的物质都敏感,还需进行系统的研究。

312 生态毒理:将彗星试验应用于植物细胞或者鱼类、贝类,对来自土壤、水体、大气的常见动植物进行监测,对环境污染物的遗传毒性评估、环境质量的监测与评估提供了新的手段。

313 分子流行病学监测手段:彗星试验可监测职业暴露人群的DNA 损伤情况,也可监测暴露于某种环境因素中的个体DNA 损伤情况,评价环境因素的潜在危害。

单细胞凝胶电泳步骤:

1. 分离制备单细胞悬液:

(1)体外培养的细胞株:用胰酶消化,最后用PBS悬浮吹打成单细胞悬液,细胞要计数,具体的量我前边已经说过。

2. 胶板制备:

(1)取100μl于45℃水浴中保温的0.5%NMA,铺于磨沙载玻片上,形成底胶。盖玻片推匀,不能有气泡,4度凝固5至8分钟。

(2)水平取下盖片,取100μl于37℃水浴中保温的0.5%LMA与20μl细胞悬液(约400个细胞)混匀,立即铺片,加上盖玻片,4度凝固5至8分钟。

3. 细胞裂解与电泳:

(1)将制备好的胶板去掉盖玻片后,浸于4℃预冷的细胞裂解液中,在4℃下裂解2.5到3小时。

(2)取出胶板,用双蒸水浸没漂洗后放入电泳槽中,浸泡在4℃预冷的电泳液中解旋20分钟。

(3)玻片水平放置阳极端附近,4℃电泳20到25分钟(25V,300mA)。可在电泳槽周围加冰块以保持低温。

4. 中和与染色:

(1)电泳结束,将胶板浸泡于中和液中,每次10分钟,共中和3次,每次要更换中和液。最后晾干。

(2)取出胶板,置于染色缸中,在2μg/ml的EB染色液中,暗处染色5到10分钟。

(3)蒸馏水漂洗2次,每次5分钟。

稍晾干,滤纸吸去多余水分,尽快在荧光显微镜下观察。

从胶板制备开始到最后都应该在暗光下操作。

具体的你可以查写文章,好好看看下面连接的那些讨论内容

试剂及材料:

1)PBS

2)0.8%正常熔点凝胶(PBS配制)

3)0.6%低熔点凝胶(PBS配制)

4)毛玻璃片

5)盖玻片

6)碱性裂解液(2.5mol/L NaCl;100mmol/L Na2EDTA;10mmol/L Tris;1%肌氨酸钠),临用前加10%DNMSO,1%Triton X-100

7)电泳缓冲液(1mmol/L Na2EDTA;300mmol/L NaOH;Tris.Cl,pH7.5)

8)EB(2ug/ml)

步骤:

1.制备第一层胶:100ml 0.8%正常熔点胶,加盖盖玻片,4℃固化10min;

2.制备第二层胶:轻轻地去除盖玻片,在第一层胶上滴加75ul含1×10000个细胞的0.6%低熔点胶(cell与凝胶比例为1:5),加盖盖玻片,4℃固化10min;

3.裂解:去掉盖玻片,将凝胶浸入冰冷的碱性裂解液内(临用前加10%DMAO,1%Triton X-100),4℃裂解1h;

4.取出玻片,用PBS缓冲液漂洗3次后置于水平电泳槽内,加入pH13的电泳缓冲液(没过玻片2-3min),放置20min(黑闭)。

5.电泳:电压20V,300mA,30min

6.取出玻片,用PBS或Tris.Cl,pH

7.5漂洗3次,每次3min;

7.染色:胶上滴加3ulEB,加盖盖玻片,24h检测。或者4℃,潮湿,闭光的条件下保有胶片,观察时再染色,镜检。

八种常用生化实验步骤

实验一基因的PCR扩增技术 一、实验目的与原理简介 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)是体外克隆基因的重要方法,它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。因此能用于从微量样品中获得目的基因,同时完成了基因在体外的克隆,是分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。 常规PCR反用于已知DNA序列的扩增,具体可分为三个主要过程:一、变性。通过升高温度使DNA双链模板分子中氢断裂,形成单链DNA分子,温度为94℃,时间1min。二、复性。降低温度使DNA单链分子同引物结合。温度为55℃,时间1min。三、延深。升高温度,在DNA聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加入dNTP,实现模板的扩增,温度为72℃,时间2min。同时第一步变性前要在94℃下预变性5分钟,使DNA双链完全解开。经过 25-35个循环之后,在72℃下继续延伸10分钟。 PCR反应包含的七种基本成分: 1)热稳定性DNA聚合酶:Taq DNA聚合酶是最常适用的酶,商品化Taq DNA酶的特异性活性约为80000单位/mg. 2)寡核苷酸引物:寡核苷酸引物的设计是影响PCR扩增反应的效率与特异性的关键因素。 3)脱氧核苷三磷酸(dNTP):标准的PCR反应体系应包括4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸,即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。每种dNTP的浓度一般在200-250μl之间,高浓度的dNTP对扩增反应会起抑制作用,可能是dNTP与Mg2+螯合有关。 4)二价阳离子:一般需要Mg2+来激活热稳定的DNA聚合酶,由于dNTP与寡聚核酸结Mg2+合,因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L。 5)维持PH值的缓冲液:用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的PH值调至8.3-8.8之间,标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L。在72℃温育时,反应体系的温度将下降1个多单位,致使缓冲液的PH值接近7.2。 6)一价阳离子:标准PCR缓冲液内含有50mmol/L的KCl,它对扩增大于500bp长度的DNA是有益的。 7)模板DNA:含有靶序列的模板DNA可以以单链或双链形式加入到PCR混合液中,闭环DNA的及增效率略低于线性DNA。 学习PCR反应的基本原理和基本技术。 了解引物设计的一般要求。 二、材料和试剂 10Х扩增缓冲液 4种dNTP贮存液(20mmol/L,PH 8.0) Tap DNA 聚合酶 5端引物(20μmol/L)及3端引物(20μmol/L) 模板DNA 琼脂糖凝胶 PCR仪(Bio-Rad公司)移液枪(0.5-10μL 5-50μL)枪头微量移液管 一、实验操作 1)按照以下次序,将各成分加到微量离子管内混合: 10Х扩增缓冲液2.5μl M g2+1.5μl 5端引物1μl

CHIP技术

染色质免疫沉淀分析ChIP技术介绍 染色质免疫沉淀分析ChIP 技术介绍 (Chromatin Immunoprecipitation Assay, ChiP) (Abcam 公司与Upstate 公司都提供ChIP 抗体产品) 染色质免疫沉淀法(Chromatin immunoprecitation,ChIP)就是研究体内DNA 与蛋白质相互作用的重要工具。它可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA 片段的结合情况,还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。核小体组蛋白可以发生多种翻译后的共价修饰,如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等,这些共价修饰与真核基因的表达密切相关。根据“组蛋白密码”假说,组蛋白的各种共价修饰的组合会以协同或拮抗的方式诱导特异的下游生物学功能,因此,ChIP 也为研究组蛋白修饰在基因表达中的作用,全面阐明真核基因的表达调控机制提供了强有力的研究工具。 真核生物细胞状态就是由内源与外源因素共同影响的,所有信号传递途径的终点都就是DNA。DNA 通过核蛋白复合物组成染色质,染色质就是基因调控的一个重要作用位点。转录激活因子与辅助抑制因子的研究显示存在一种新的调节机制--“组蛋白密码”,其信息存在于组蛋白的转录后修饰等过程中。该类修饰包括组蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化等过程。随着越来越多组蛋白核心结构区域与羧端修饰的确定,组蛋白密码在控制与调节基因功能过程中的作用越来越明确。参与修饰的酶根据其作用的不同而分类:如组氨酸乙酰转移酶(HATs)可以将乙酰基团转到组蛋白上;组蛋白去乙酰酶(HDACs)可以去除氨基酸上的乙酰基团;组蛋白甲基转移酶(HMTs)可以将甲基基团转移到组蛋白上等不同组氨酸修饰标记对应于不同的生物学过程,它可以作为调节因子的作用位点,也可以用来改变染色质结构。 染色质免疫沉淀分析(ChiP)就是基于体内分析发展起来的方法,它的基本原理就是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA 复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA 片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA 相互作用的信息。它能真实、完整地反映结合在DNA 序列上的调控蛋白,就是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的一种很好的方法。CHIP 不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且,CHIP 与其她方法的结合,扩大了其应用范围:CHIP 与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip 方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;CHIP 与体内足迹法相结合,用于寻找反式因子的体内结合位点;RNA-CHIP 用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见,随着CHIP 的进一步完善,它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。 凝胶电泳迁移率改变分析(EMSA)就是目前研究转录调控蛋白与相应核苷酸序列

彗星实验

应用慧星试验研究细胞D NA损伤的原理与方法 山西大学生命科学系环境生物毒理学研究室(太原030006) 孟紫强 中国辐射防护研究院二所 张连珍 提 要 对应用慧星试验(即单细胞微凝胶电泳(SCGE技术)研究细胞DNA损伤的操作过程、技术原理以及实验操作过程中应注意的事项,进行了详细介绍和讨论。 关键词 慧星试验 单细胞微凝脉电泳 DNA损伤 哺乳类细胞 淋巴细胞 诱变剂往往是通过引起DNA损伤而诱发细胞突变和癌变。近年来由Singh等改进和建立的慧星试验(Com et assay)即单细胞微凝胶电泳(SCGE)技术,是一项测定和研究细胞DNA损伤的新技术,该技术在国外有关研究领域内已得到广泛的应用〔1,2〕。但在我国有关研究报道甚少。为此,本文对我们研究室建立和改进的SCGE技术作了详细报道,以期与国内同行交流和进一步改进。 1 SCGE测定原理 哺乳类细胞和人血淋巴细胞,其DNA的分子量很高且具有严密的超螺旋结构。在理想的实验条件下,对淋巴细胞的分离、处埋、裂解、碱处理等过程均保持在避光条件下小心谨慎地操作,使细胞DNA不受损伤,其DNA结构仍象在活细胞中那样完整,外加电泳电场就不会使DNA在凝胶中泳动。因此,在理想条件下,正常对照组细胞DNA在电泳之后仍应保持在原来位置。在SCGE实验中,细胞DNA之所以从原位向电泳电场的阳极迁移,形成慧星状图象,其原因是:当细胞DNA受损伤产生链断裂时,DNA的超螺旋结构受到破坏;在细胞裂解液作用下,细胞膜、核膜及其它膜结构受到破坏,细胞内的蛋白质、RNA及其它成分均可进入凝胶而扩散到裂解液中,而核DNA分子量很高不能进入凝胶,只能留在原位。在碱处理和碱性电泳液的作用下DNA解螺旋,使DNA的断链和碱易变性DNA片断从严密的超螺旋结构中释放出来;由于这些DNA断链分子量较小且碱变性为单链,所以在电泳电场中就可以离开核DNA在凝胶分子筛中向阳极移动,形成慧星状图象。DNA受损伤愈严重,产生的断链和碱易变性片断就愈多,断链也愈小;在相同电泳条件下迁移的DNA量就愈多,迁移的距离就愈长。因此,通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可定量测定DNA损伤程度,确定电离辐射或其它因素作用剂量与DNA损伤效应之间的关系。 我们的实验也表明,未处理的对照组淋巴细胞DNA在SCGE实验中也表现有微弱的迁移现象。我们认为这主要是由于人血淋巴细胞从静脉血分离出来之后,体外条件必竟是一种非生理条件,离开活体的细胞不可避免地会受到某些非生理条件的不利影响,使细胞中的DNA受到不同程度的损伤,导致微量DNA在电泳中迁移。我们在用碱洗脱法和DNA碱解旋速率法测定DNA单链断裂时,也发现未处理对照组的人血淋巴细胞和其它哺乳类细胞的DNA单链断裂占总DNA的5~30%〔3—5〕,也表明非生理条件能诱发DNA 损伤,与本实验结果一致。 2 SCGE实验方法 211 细胞分离和处理 (1)人血淋巴细胞分离:从健康人静脉采血015~1mL,沿离心管管壁滴加在等体积淋巴细胞分离液液面上,3500r m in离心2m in,吸取中间层淋巴细胞於10m l离心管中,加磷酸盐缓冲液(PBS)至5m l,1500r m in离心8m in,如此重复洗涤细胞两次,再将细胞悬于PBS,置4℃待用。(2)其它细胞的分离制备:对于体外培养的细胞株,若为贴壁生长的细胞,当细胞处于对数生长期时,可弃去培养液,加适量011%胰蛋白酶H ank’s溶液,在37℃下3-5m in,使细胞脱离瓶壁,用PBS洗涤细胞2—3次,调节至适当的细胞密度即可;若为悬浮培养的细胞,只需用PBS 洗涤细胞两次即可。对于实体肿瘤、胸腺、脾及其它组织,可用不锈钢剪去除结缔组织,剪碎,压研通过60目不锈钢网,再用PBS洗涤细胞2—3次,调节适当细胞密度即可。对于肝细胞的分离制备比较复杂,需经过含胶原酶和透明质酸酶的缓冲液进行器官灌注,再分离肝细胞。(3)紫外线或Χ-线照射:取新鲜分离的淋巴细胞或其它细胞悬液,用PBS调细胞浓度为1×105个细胞 m l,于冰水浴中经紫加线或60Co-Χ线照射,照后细胞置于冰水浴中,并立即用于SCGE测定。(4)化学处理:新鲜分离的淋巴细胞或其它细胞,在SCGE测定前用待测化学物在37℃下处理2-4h,细胞密度均为1×105个 m l。随后将细胞保存在4℃下或冰水浴中,立即进行测定。 212 制片 (1)磨砂载玻片:用水砂纸(粒度,N o. 380)将普通光学显微镜用的载玻片(厚度较薄为宜)单面加水轻磨,使形成的磨砂面均匀细密。磨时谨防加压过大、用力过猛,以免在载玻片面上形成粗纹痕迹。实验发现如磨砂面有粗纹划痕,细胞裂解液处理后,载玻

毒性试验整理

实验一发光细菌的急性毒性评价试验 一、实验器材 1.菌株 明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum) 2.培养基 酵母膏0.5%,胰蛋白胨或多聚蛋白胨(Polypetone)0.5%,甘油0.3%,NaCl 3%,Na2HPO4 0.5%, KH2PO4 0.1%,pH6.5。固体培养基再加琼脂2%。 3.溶液、试剂及待测物质 酵母粉,蛋白胨,NaCl(AR),Na2HPO4(AR),KH2PO4(AR),甘油(AR),二甲基亚砜(AR),乙酸乙酯(AR),HCl(1M),去离子水。 4.仪器及其他用品 生物毒性测试仪;电热恒温鼓风干燥箱;振荡培养箱;DELTA 320pH计;氮吹仪;镊子,移液枪,三角锥形瓶等。 二、目的要求 1.学习了解发光细菌的急性毒性评价试验的基本原理。 2.掌握发光细菌的急性毒性评价试验的操作要领和评价方法。 三、基本原理 发光细菌是指在正常的生理条件下能够发射肉眼可见的蓝绿色荧光的细菌,这种可见荧光波长在450-490 nm之间,在黑暗处肉眼可见。不同种类发光细菌的发光机理是相同的,都是由特异性的荧光酶(LE),还原性的黄素(FMNH2),八碳以上长链脂肪醛(RCHO),氧分子(O2)所参与的复杂反应,大致历程如下: FMNH2+LE→FMNH2·LE+O2→LE·FMNH2·O2+RCH→LE·FMNH2·O2·RCHO→LE+FMN+ H2O+RCOOH+光 具体来说,生物发光反应由分子氧作用,胞内荧光酶催化,将还原态的黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛氧化为FMN及长链脂肪酸,同时释放出最大发光强度在波长为 407-409 nm处的蓝绿光。 发光细菌法是利用灵敏的光电测量系统测定毒物对发光细菌发光强度的影响。发光细菌含有荧光素、荧光酶、ATP等发光要素,在有氧条件下通过细胞内生化反应而产生微弱荧光。当细胞活性升高,处于积极分裂状态时,其ATP含量高,发光强度增强。发光细菌在毒物作用下,细胞活性下降,ATP含量水平下降,导致发光细菌发光强度的降低。实验显示,毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系,因而,可以根据发光细菌发光强度判断毒物毒性大小,用发光度表征毒物所在环境的急性毒性。

彗星试验步骤

彗星试验步骤 1.5.4 彗星试验(单细胞凝胶电泳试验):参照文献[i],略加改动,进行碱性单细胞凝胶电泳,具体如下。 1.5.4.1 制片 将0.6%的NMPA(用PBS配制)于微波炉中加热融化后,浸泡磨砂玻片,用吸水纸将玻片滑面及四周吸干,自然晾干备用。 1.5.4.2 铺胶 取1.5.3中所备细胞悬液10μl,向其中加入70μl 37℃0.7%LMPA(用PBS配制),混匀后迅速滴于37℃预热的玻片上,立即盖上盖玻片,4℃固化10min。 1.5.4.3 裂解 轻轻取下盖玻片,将玻片浸于新鲜配制并预冷的细胞裂解液中,4℃避光裂解1h。 1.5.4.4 解旋 从裂解液中取出载玻片,用PBS浸泡玻片3×3min。用纸巾吸去玻片上残留的液体,置于水平电泳槽中,加新鲜配制的碱性电泳缓冲液至高于玻片表面3mm 以上,避光解旋30min。 1.5.4.5 电泳 电压25V,调整液面高度使电流达到300mA,电泳25min。 1.5.4.6 漂洗及染色 电泳完毕,取出玻片,用PBS浸泡2×15min,以中和强碱。用纸巾吸去玻片上残留的液体,然后滴加20μg/ml的EB20μl,盖上盖玻片,立即置荧光显微镜下观察。 以上步骤尽量在黄光下或暗处进行,避免其他原因所致的DNA损伤。每一剂量水平制片2张。 1.5.4.7 结果观察 荧光显微镜下200倍观察,激发波长515~560nm,发射波长590nm。每一剂量水平随机观察100个细胞,记录拖尾细胞数。计算拖尾细胞率(以下简称拖尾率),拖尾率=(拖尾细胞数/100)×100%。每一剂量水平用目镜测微尺测量30个拖尾细胞的全长和头长,拖尾细胞尾长(以下简称尾长,tail length,TL)=全

生化实验报告模版

生物化学实验报告 姓名:郭玥 学号: 3120100021 专业年级: 2012级护理本科 组别:第8实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心

【实验报告第一部分(预习报告内容):①实验原理、②实验材料(包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材)、③实验步骤(包括实验流程、操作步骤和注意事项);评分(满分30分):XX】 实验目的:1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 5、了解柱层析技术 实验原理:1、蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。 2、不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别, 可分离纯化各种蛋白质。 3、盐析法:盐析法是在蛋白质溶液中,加入无机盐至一定浓度或达饱和状态,可 使蛋白质在水中溶解度降低,从而分离出来。蛋白质溶液中加入中性盐后,由 于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质,致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃 至消失。中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变,蛋白质表面的电荷 大量被中和,更加导致蛋白质溶解度降低,蛋白质分子之间聚集而沉淀。

4、离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆 的交换,利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。 5、醋酸纤维素薄膜电泳原理:血清中各种蛋白质的等电点不同,一般都低于pH7.4。 它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷,在电场中向正极移动。由于血清中 各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同,因而在醋酸纤维素薄膜上电 泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白(Albumin)、α1-球蛋白、α 2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。 实验材料:人混合血清葡聚糖凝胶(G-25)层析柱 DEAE纤维离子交换层析柱饱和硫酸铵溶液 醋酸铵缓冲溶液 20%磺基水杨酸 1%BaCl 溶液氨基黑染色液 2 漂洗液 pH8.6巴比妥缓冲溶液 电泳仪、电泳槽 实验流程:盐析(粗分离)→葡聚糖凝胶层析(脱盐)→DEAE纤维素离子交换层析(纯化)→醋酸纤维素薄膜电泳(纯度鉴定) 实验步骤: (一)盐析+凝胶柱层析除盐:

CHIP实验操作

ChIP实验操作指南 国家瓜果改良中心荔枝分中心 采用Bowler等(2005)的方法,具体如下: 1收获2.0g花生根、茎、也、种子于一个50ml离心管中。 2加40 ml超纯水于离心管中,轻柔颠倒离心管洗材料2次。 3去掉尽可能多的水,再加入37ml 1% 甲醛,与15-25 ℃,真空放置15 min。 4 加入2. 5 ml 2 M甘氨酸是离心管中的甘氨酸的终浓度为0.125 M,再真空放置5 min。 5 加40ml超纯水与离心管中,轻柔颠倒离心管洗材料2-3次。 6去掉尽可能多的水,液氮速冻后-80℃保存或直接利用。 第一天 1 准备核酸提取液Extraction buffer 1、2、3,并4 ℃预冷。 2 液氮淹没样品,样品尽量磨碎,注意不用潮解样品。 3 预冷的50 ml离心管中加入预冷的30 ml核酸提取液1 ,再将样品粉末加入离心管中,轻柔颠倒混匀后放在冰上5 min. 4 再拿一个50 ml离心管于冰上预冷,用两层滤膜将样品过滤入该离心管,如果滤液中仍有残渣,重复步骤4。 5 4 ℃, 3000g 离心10min。 6 小心弃上清,加入1 ml 4 ℃预冷核酸提取液2重悬浮沉淀,移入进口(或严格灭菌)的1.5ml 离心管,4 ℃,12000g离心溶液10Min. 7 小心弃上清,加入300μl 4 ℃预冷核酸提取液3重悬浮沉淀,可以轻柔颠倒助匀,但要避免起泡。(核酸提取液3很粘稠,但还是要尽量重悬浮好沉淀)。 8 在一新4 ℃预冷离心管中加300μl 4 ℃预冷核酸提取液3,再将步骤7的溶液小心加入上层,4 ℃,16000g离心溶液1h(准备步骤9,制一块1%琼脂糖凝胶,用80μl CHIP 洗液洗磁珠)。 9 准备核酸裂解液 Nuclei lysis Buffer。 10 小心弃上清,加入300μl预冷核酸裂解液,于冰上用(剪过尖端)枪头吹打溶液混匀或轻柔颠倒助匀,但要注意避免起泡。并取出1-2μl混匀也来作为对照看超声波破碎后的对照。 11 超声波破损染色质5次,每次15s,中间间隔1 min 避免溶液过热,避免损失过多及起泡。跑电泳(1%琼脂糖凝胶)检测超生效果(应该在200-1000bp之间)。可以把破碎后的染色质-80 ℃保存或直接进入下一步。 12 超声波破碎后溶液4 ℃,12000g离心5 min,上清液移至1个5ml离心管中,并移出10μl来,于-20℃保存作为“Input DNA对照”。 13 先验证这时候的超声波破碎后溶液体积少于300μl,再补加CHIP洗液至总体积3 ml。

彗星实验要点

1、凋亡细胞的观察:看过国外此法作出的凋亡细胞彗星图像,很漂亮, 用CASP软件分析后,其曲线呈典型的双峰,而正常细胞为单峰。我的一些教训:观察凋亡细胞最好把电压、电流、和电泳时间均调低,否则,凋亡细胞中的DNA片断跑的太块,荧光下根本看不到凋亡细胞的尾巴。注:我用的是中性条件,20V,200mA,20min, 凋亡细胞观察宜选用10V,100mA,10min。朋友们如果有异议,请不吝赐教,也对我有所帮助。 2、 解旋20分钟应该没问题,但是我认为您的电泳时间过长,当然我不知道 您的电泳条件(电压、电流、),我认为20分钟足够了,时间长了一是浪费时间,二是彗星图像不好,不利于分析。您的裂解时间有点短了,文献报道,最好不要少于1.5小时 3、一般100ul0.5%低熔点胶中含400个细胞就足够了 4、本版【图片仓库】子版有我做的彗星图像,感兴趣可以看看 https://www.wendangku.net/doc/756805556.html,/bbs/post/view?bid=66&id=2729243&sty=1&tpg=1&ag e=0 5、注意,CASP只读.tif扩展名的图像,如果你的相机拍摄的图像可以有.tif 格式,就更好了,如果是.jpg格式,那还要在计算机中转换一下,不过很简单 6、首先,荧光染色的东西最好马上看,否则影响结果。 其次,您的染色液量我觉得多了点,我用2ug/ml,1ml注射器1滴就可以。第三,要忠于实验结果,图象内容不能更改,可以用ACDSEE或PHOTOSHOP 转换图象格式或大小,所以,作出来的实验图象质量要好 7、。背景的选择问题,如果图片质量好的话,背景大小不同,对结果影 响不是很大,如果图片背景乱七八糟,那背景框的选择肯定对结果产生很大影响。我的建议:背景框不要太大,参考我贴的那个图。注意,背景框可以在细胞的上面或下面,如果背景框在上面时,分析后的图像(分析后出现一个头、尾分明的图像,是基本重合在细胞上的)质量很差,很不规则,那再把背景框调到下面试试,如果还是不好,那只能说你的结果质量不好了。背景框的选择关键在于分析同一批细胞,背景框要相同,才能保持资料的可比性。 结果的保存,记得好像使用说明里提到了,如果没有提到,那就是我原创的!!!呵呵,先卖个关子。FILE菜单下有一个EXPORT RESULTS(输出结果)的按钮,点击以后,默认是.TXT文本文件,好了,给你的输出文件起个名字,选择保存位置,点击确定就OK了,回到你保存的输出结果文件,发现它是一个不可识别的文件,那就直接把它的扩展名改成.TXT,打开它,看看你的结果,包括13个指标,很好,这个.TXT的结果文件可以被SPSS统计软件直接识别,不是很方便吗??(如果你愿意把数据一个一个地输入统计软件,我也没意见,呵呵)。这里还有一个小窍门,在用SPSS读取之前,最好把你的结果文件调整一下,这也是我发现的。把所有的指标都排列到第一行,下面的结果要和指标一一对应,每个数据之间留空格(默认的),行与行之间不要用回车,就是不要有空行,其实调整起来很简单,主要是调节.TXT文本文件阅读框的宽度。调好后,SPSS软件直接识别,很方便,为你节省很大工作量,不信就试试。 8、我用双层铺胶法,自制微电泳槽,第一层:0.75%正常熔点胶,100μl,

彗星电泳方法整理

Comet assay简介 单细胞凝胶电泳技术(Single cell gel electrophoresis, SCGE),又称彗星试验(Comet assay),是在核酸沉淀法(Nucleoid sedimentation)和晕圈分析(Holo assay)等检测技术基础上逐步发展起来的一种在单细胞水平检测有核细胞DNA断裂的新技术。它主要包括Olive等建立的测定DNA双链断裂的中性单细胞凝胶电泳技术和Singh等建立的测定DNA单链断裂的碱性单细胞凝胶电泳技术。此技术已经被广泛应用于放射生物学、DNA断裂与修复、毒理学、肿瘤治疗评价、细胞凋亡等领域的研究。 是碱性单细胞凝胶电泳可以检测DNA链的断裂和碱不稳定点,请问碱不稳定点是不是DNA上的脱嘌呤/嘧啶位点呀?还有个问题就是彗星试验检测到的DNA断裂其实是DNA损伤与修复的共同作用的结果,而且DNA修复的一个重要方式就是核苷酸切除修复,因此DNA修复过程也会造成DNA链的断裂,所以彗星试验所反映的时间-效应关系,可能并非与真实的DNA损伤有偏差,因为它无法鉴别修复过程中的DNA断裂。 SCGE技术的原理: 细胞核中的DNA为负超螺旋结构,而且很致密,通常DNA双链以组蛋白为核心,盘旋而形成核小体。一般情况下,偶然的DNA单链断裂对核酸分子双股结构的连续性影响不大,而且不易释放出来,但是,如果用去污剂破坏细胞膜和核膜,用高浓度盐提取组蛋白,DNA 残留而形成类核。如果类核中的DNA有断裂,断裂点将引起DNA致密的超螺旋结构松散,在类核外形成一个DNA晕圈。将类核置于电场中电泳,DNA断片可从类核部位向阳极迁移,经荧光染色后,在阳极方向可见形似彗星的特征性图像,故称“彗星试验”。彗星尾部即为迁移出类核的DNA片段。此时彗星尾部有可能还与头部以单链或双链的形式相连。DNA损伤越严重,导致DNA超螺旋结构越松散,产生的断裂点越多,DNA片段越小,从而在彗星尾部出现的DNA断片越多,则慧尾的长度、面积和荧光强度越大。通过测量彗星尾部的长度、面积或荧光强度等指标,可以对DNA的损伤程度进行定量分析。 随着SCGE技术的发展,可测量的指标也越来越多,而且更准确。目前,用于SCGE分析的指标主要分为四类,包括形状指标、距离指标、强度指标和矩类指标。其中形状指标有彗星细胞率;距离指标包括彗星尾长、彗星全长、彗星头部半径、尾部半径;强度指标包括头部DNA百分含量、尾部DNA百分含量、头部面积、尾部面积等;矩类指标包括尾矩、Olive尾矩等。 依靠目镜测微尺人工测量彗星距离指标,主观性较强,人为误差较大,而且矩类指标更需要人工通过公式计算得出,使研究人员的工作量加大。因此,研究人员渴望开发出一种专

生化实验报告资料

生物化学实验报告 姓名:吴瑞 学号: 3120016004 专业年级: 2012级临床医学(妇幼保健) 组别:第四实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心

一、实验室规则 1.实验前应认真预习实验指导,明确实验目的和要求,写出预实验报告。 2.进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律,不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。 3.严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题,切勿盲目处理,应及时请教指导老师。 4.严格按操作规程使用仪器,凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用,对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法,才能开始使用;仪器发生故障,应立即关闭电源并报告老师,不得擅自拆修。 5.取用试剂时必须“随开随盖”,“盖随瓶走”,即用毕立即盖好放回原处,切忌“张冠李戴”,避免污染。 6.爱护公物,节约水、电、试剂,遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 7.注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时,管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。 8.废纸及其它固体废物严禁倒入水槽,应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱,必须事先用水稀释,方可倒入水槽内,并放水冲走。 9.以实事求是的科学态度如实记录实验结果,仔细分析,做出客观结论。实验失败,须认真查找原因,而不能任意涂改实验结果。实验完毕,认真书写实验报告,按时上交。 10.实验完毕,个人应将试剂、仪器器材摆放整齐,用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好,方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理,保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等,并严格执行值日生登记制度。

ChIP 原理及实验方法

染色质免疫沉淀技术(ChIP)实验方法 实验原理 染色质免疫沉淀技术(ChIP)通过与染色质片段共沉淀和PCR技术,在体内检测与特异蛋白质结合的DNA片段。ChIP技术最大的优点就是在活体细胞状态下研究了蛋白质和目的基因结合状况,减少了体外实验的误差。在活体细胞中,先对与调节蛋白结合的染色质进行分离,然后通过一定的方法(例如:超声波)随机剪切染色质,用调节蛋白的抗体沉淀目的染色质,再通过一定手段把目的染色质上的蛋白质去除掉,最后用PCR等方法检测鉴定共沉淀的DNA片段的特性。 仪器和试剂

真空设备、涡旋器、液氮、冷冻离心管、离心机、超声波粉碎仪、miracloth 37%甲醛,2M甘氨酸,ddH O,剪切的鲑精DNA/protein A琼脂糖珠(Sant cruz), 2 蛋白酶K(14mg/ml),RNaseA,酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),氯仿,无水乙醇, 提取缓冲液1(EB1):0.4M蔗糖;10mM Tris-HCl,pH8.0;5mM β-ME; 0.1mM PMSF;蛋白酶抑制剂混合物(aprotinin、pepstain A、Leupeptin、 Antipain、TPCK、Benzamidine) 提取缓冲液2(EB2):0.25M 蔗糖;10mM Tris-HCl,pH8.0;10mM MgCl2; 1%Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) ;5mM β-ME;0.1mM PMSF;蛋白酶抑制剂混合物(同上) 提取缓冲液3(EB3):1.7M蔗糖;10mM Tris-HCl,pH8.0;0.15%Triton X-100;2mM MgCl ;5mMβ-ME;0.1mM PMSF;蛋白酶抑制剂混合物(同上) 2 核裂解缓冲液(NLB):50mM Tris-HCl,pH8.0;10mM EDTA;1%SDS;PMSF和蛋白酶抑制剂混合物(同上) ChIP稀释缓冲液(ChIP DB):1.1%Triton X-100;1.2mM EDTA;16.7 mM Tris-HCl,pH8.0;167mM NaCl;PMSF和蛋白酶抑制剂混合物(同上) 洗脱缓冲液(EB):1%SDS;0.1M NaHCO3(现配) 低盐洗脱液:150mM NaCl;0.1%SDS;1%Triton X-100;2mM EDTA;20mM Tris-HCl,pH8.0

药物毒理学考试要点

名词解释 1.血脑屏障:是指血液-脑组织间液和血液-脑脊液间的屏障,由血液-脑屏障、脑脊液-脑屏 障和血液-脑脊液屏障三个屏障构成。 2.内分泌系统:是一种整合性的调节机制,通过分泌特殊的化学物质来实现对有机体的控 制与调节。 3.药物依赖性:也称药物成瘾性,是精神活性物质与机体长期相互作用下造成的一种精神 状态(有时也包括身体状态),表现为强制性地连续不断地使用该药物的行为和其他反应,目的是去感受该药物所产生欣快性精神效应,或是为了避免由于停用该药物引发的戒断症状所带来的严重不适感。 4.直接致癌物:指进入机体后不需经代谢活化,直接与细胞生物大分子(DNA、RNA、蛋 白质)作用而诱发细胞癌变的化学物质。 5.间接致癌物:指进入机体后需经细胞内微粒体混合功能氧化酶系统等代谢活化后才具有 致癌性的化学物质。 6.促癌物:此类物质本身并无致癌性,严格的说不属于致癌物,但它可以与致癌物协同作 用,诱发突变细胞克隆扩增,促进癌的发生;或在致癌物作用之后,反复作用与细胞,加速癌细胞发展成为癌瘤。 7.促癌剂:具有促癌作用的物质,通过促进突变细胞的克隆扩增而发挥致癌作用。 8.前致癌物:未经代谢活化的间接致癌物称为前致癌物或原致癌物。 9.辅致癌物:有些化学物质既非引发剂,也非促长剂,本身并不致癌,但能增强引发剂和 促长剂的作用,即能加速致癌作用的过程。 10.药物的暴露:通过对暴露、时间依赖性的靶器官剂量与毒性作用关系研究解释毒性作用

机制。 11.急性毒性试验:又称单次给药毒性试验,系研究实验动物一次或24小时内多次给予受 试物后一定时间内所产生的毒性反应,观察期至少为14天。 最大耐受剂量(浓度):(MTD)指动物能够耐受的而不引起动物死亡的最高剂量。 最小致死剂量(浓度):(MLD)引起个别受试动物出现死亡的剂量 LD50:(半数致死量)预期引起50%动物死亡的剂量,该值是经统计学处理所推算出的结果。 12.长期毒性实验:又称重复给药毒性试验,是研究实验动物重复给予较大剂量的受试物后 产生的毒性反应特征,药物非临床安全性评价的重要内容。 13.一般生殖毒性实验:在雌雄动物交配前的交配期直至胚胎着床给药,评价受试药物对动 物生殖的毒性干扰作用,即生殖过程的第一阶段试验。 14.致畸敏感期毒性试验:妊娠动物自胚胎着床至硬腭闭合阶段给药,评价受试药物对妊娠 动物、胚胎及胎仔发育的影响。致畸敏感期毒性试验即生殖过程的第二阶段试验。15.围生期毒性试验:从胚胎着床到幼仔断奶这段时期给药,检测受试药物对妊娠及哺乳动 物、胚胎发育以及子代出生后生长发育的不良影响。围生期毒性试验即生殖过程的第三阶段试验 16.光敏反应:指皮肤对光线敏感产生的不良反应,是由某些药物(化学药物)与皮肤接触、 经特定波长的光照后引起的皮肤损伤。 17.靶点:医学上进行某些放射治疗时,放射线从不同方位照射,汇集病变部位,这个病变 部位叫做靶点。 18.靶部位:药物吸收进入机体分布于全身,通常仅对其中某些部位造成损害,被药物造成 损害的部位叫靶部位。

生化实验整理

生化实验整理

1. 氨基酸的分离鉴定——纸层析法 一、实验目的 ? 了解层析技术的一般原理 ? 掌握纸层析的方法和原理,学会分析未知样品的氨基酸成分 二、实验原理 ? 层析法亦称色谱法,是利用混合物中各组分的物理、化学及生物学特性的差异,使各组分以不同程度分布在两个相中,即固定相和流动相,当流动相流过加有样品的固定相时,各组分所受固定相的阻滞作用和受流动相的推动作用的影响各不相同,从而使各组分以不同速度移动而达到分离的目的 ? 固定相:是由层析基质组成的,可以是固体物质(如吸附剂、凝胶、离子交换剂等),也可以是液体物质(如固定在纤维素或硅胶上的溶液),这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用 ? 流动相:是在层析过程中,推动固定相上待分离的物质向一定方向移动的液体、气体或超临界体。柱层析中一般称为洗脱液,薄层层析时称为展层剂 ? 分配系数:是指在一定的条件下,某一组分在固定相和流动相中含量(浓度)的比例,常用K 来表示,它是层析中分离纯化物质的重要依据 ? 迁移率:是指在一定条件下,某一组分在相同的时间内,在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值,常用R f 来表示 分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离 的先决条件,差异越大,分离效果越理想 ? 层析根据不同的标准可以分为多种类型:如按固定相基质的形式不同可分为纸层析、薄层层析和柱层析;按流动相的形式不同可分为液相层析、气相层析和超临界层析;按分离的原理不同可分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等 ? 纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析,滤纸纤维上的羟基具有亲水性,吸附一层水作为固定相,有机溶剂为流动相。有机相流经固定相支持物时,与固定相之间连续抽提,使物质在两相间不断分配而得到分离。溶质在滤纸上的移动速度用R f 值表示: 在一定条件下,某种物质的R f 值是常数。R f 值的大小与物质的 结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关 ? 氨基酸显色反应——茚三酮反应原理: 所有的α-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质, 除了脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质 该反应分为两步:第一步是氨基酸被氧化形成CO 2、NH 3和醛,水合 茚三酮被还原成还原型茚三酮;第二步是所形成的还原型茚三酮结合另一分子水合茚三酮和氨缩合生成有色物质 三、实验器材 大试管及塞子,大头针,三角薄层喷瓶,毛细管,吹风机,层析滤纸(新 f R

ChIP实验的原理与实践

一、原理 转录从基因的启动子区开始,由一系列的转录因子结合到基因的启动子区,通用转录因子结合在 基本启动子区起始转录,而这个过程对基因的转录是必需的,但不是充分的,通常需要一些特异的转 录因子结合在上游调节序列,使基因特异表达并维持的合适水平,ChIP主要用于研究转录因子(个人 认为主要是特异转录因子的作用,因为这些因子的表达才有时空特异性)与下游基因的结合,如果 ChIP发现转录因子能与目的基因结合,那么这说明该基因可能是其下游基因,要想进一步证明,还要 做高低表达和荧光素酶等实验。 二、目的基因的筛选 1,如果做ChIP-seq那就不需要在实验前筛选目的基因了,理论上芯片会分析出样本中该转录因 子所有的下游基因,我们根据这个分析结果进行筛选就可以了。 2、如果是做普通的ChIP,那么在实验前要进行初步的筛选,选择自己感兴趣的目的基因,设计 PCR引物,进行验证,所以,这样考虑的话,ChIP实验是对你的早期数据的验证。个人认为,筛选目 的基因的方法有一下几种:a,查文献,看转录因子和哪些基因在表达时间,空间,及功能

相关。b, 你的课题设计中涉及到的基因,比如说你课题中设计到c-myb基因,你就想看一下转录因子和c-myb的 关系(这个纯属碰运气)。c,根据自己早期的实验结果,比如,你做高、低表达后,发现你的转录 因子表大变化后,一些基因的表达也发生了变化,那么这些基因可以作为候选基因。 3、另外筛选完自己感兴趣的基因后,可以用一些分析工具进行初步的预测,这个网上也可以搜 到,就不罗嗦了,如果有战友需要,可以再讨论。 三、实验设计 这里只说说实验各组的作用 1.input:样本经过超声,但是没有进行ChIP,包含样本超声后总DNA,可以进行电泳,检测超声 效果,同时,可以与最后ChIP样本进行比较,看ChIP的效率(如果用同一引物进行PCR,ChIP组和 input组亮度差不多,说明ChIP效率高,基本上,样本中所有的目的基因片段都被ChIP下来了,反之 ,说明效率低,实验条件有待改进) 2、阳性对照:一般用anti-RNA Polymerase II抗体,因为RNA Polymerase II是通用转录

彗星实验

彗星实验 彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验。 实验原理:它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单,双链缺口损伤的程度。当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时,其超螺旋结构受到破坏,在细胞裂解液作用下,细胞膜、核膜等膜结构受到破坏,细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到电解液中,而核DNA由于分子量太大不能进入凝胶而留在原位。在中性条件下,DNA片段可进入凝胶发生迁移,而在碱性电解质的作用下,DNA发生解螺旋,损伤的DNA断链及片段被释放出来。由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链,所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成"彗星"状图像,而未受损伤的DNA部分保持球形。DNA受损越严重,产生的断链和断片越多,长度也越大,在相同的电泳条件下迁移的DNA 量就愈多,迁移的距离就愈长。通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度,从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性,研究的细胞不需处于有丝分裂期。同时,这种技术只需要少量细胞。 实验材料: 玻片、琼脂糖、细胞裂解液、碱性解链溶液(PH>13,200mM NaOH,1Mm EDTA)、电泳槽、超纯水、DAPI、PBS、荧光显微镜。 实验步骤: 1.制片:配制1%的琼脂糖凝胶,于微波炉中加热融化后,浸泡磨砂玻片,用吸水纸将玻 片滑面及四周吸干,自然晾干备用; 2.细胞处理:将细胞消化收集,离心后吸弃上清,用预冷的1*PBS清洗细胞一次,以1*10^5 细胞/ml悬浮细胞;

3.铺胶:将细胞与凝胶以一定的比例(1:10)混匀后迅速滴于玻片上,在显微镜下观察 细胞的数目(注意调整比例及铺板均匀),4℃黑暗环境中固化10min; 4.裂解:轻轻取出玻片,将玻片浸于预冷的细胞裂解液中,4℃避光裂解30-60min; 5.解旋:从裂解液中取出载玻片,用PBS浸泡玻片3次,每次3mim,用纸巾吸去玻片上 的液体,置于水平电泳槽,加入新鲜配制的碱性电泳缓冲液至高于玻片表面3mm以上,避光解旋30min; 6.电泳:电压30V,电流300Ma,电泳30min。 7.漂洗及染色:电泳完毕,取出玻片,用PBS浸泡2次,每次15min,以中和强碱。滴加 DAPI染色,立即置于荧光显微镜下观察。 结果观察: 荧光显微镜下20倍波长,激发波长377nm,发射波长477nm。每一个视野观察50个细胞,记录拖尾细胞数。计算拖尾细胞率=(拖尾细胞数/50)*100%。每个视野用目镜测微尺测量30个细胞的全长和头长,拖尾细胞尾长(TL)=全长-头长,计算各剂量组的平均尾长。

彗星实验

彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis,SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1~3],并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。本实验对Singh 等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet,UV),属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7~9],诱导K562细胞DNA损伤,用改良彗星实验检测损伤程度,验证改良的实验系统是否可靠,同时筛选并评价DNA损伤的分析指标。 1 材料与方法 细胞K562细胞,来源于第四军医大学免疫学教研室,37 ℃、5% CO2培养箱中培养,取对数期细胞进行实验。 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型,20 W,天津市紫晶特种光源有限公司)。 主要试剂和仪器培养基:10%新生牛血清(杭州四季青公司),90%RPMI-1640培养液(Hyclone公司);双抗(青、链霉素,100 UI/ml);Triton X-100(Genview分装);二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装);低熔点琼脂糖(FMC 分装);常熔点琼脂糖(Spanish分装)。其余生化试剂均为分析纯。电泳仪:由西北大学物理系提供;电泳槽:DYC33A型(北京市六一仪器厂);显微镜:Leica DM LB 2 (Leica 公司);彗星图象分析软件:CASP软件(casp-1.2.2,下载);CO2培养箱:BB16HF型(上海力申科学仪器有限公司);环地牌紫外辐照计(北京师范大学光电仪器厂)。 实验分组及UV处理 收集对数生长的K562细胞,台盼蓝染色计数,细胞活力大于95%,用Hank's 调整细胞密度至1×105/ml,接种于塑料培养皿中(ф=35 mm,2 ml/plate),然后进行紫外线照射 mW/cm2)。实验分为对照组和8个照射组,各照射组分别照射3、5、10、40,60、120、180、240 s,对照组不进行紫外线照射,之后进行彗星实验。 细胞活性检测台盼蓝拒染法[10]即时检测经UV处理后K562细胞的活性。 彗星实验1988年Singh等[5]建立了碱性彗星实验,我们对该实验流程进行改良,首先改变了制胶方法,并在裂解后加入水洗的操作步骤,中和完成后

生化实验整理

1.氨基酸的分离鉴定——纸层析法 一、实验目的 ?了解层析技术的一般原理 ?掌握纸层析的方法和原理,学会分析未知样品的氨基酸成分 二、实验原理 层析法亦称色谱法,是利用混合物中各组分的物理、化学及生物学特性的差异,使各组分以不同程度分布在两个相中,即固定相和流动相,当流动相流过加有样品的固定相时,各组分所受固定相的阻滞作用和受流动相的推动作用的影响各不相同,从而使各组分以不同速度移动而达到分离的目的 固定相:是由层析基质组成的,可以是固体物质(如吸附剂、凝胶、离子交换剂等),也可以是液体物质(如固定在纤维素或硅胶上的溶液),这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用 流动相:是在层析过程中,推动固定相上待分离的物质向一定方向移动的液体、气体或超临界体。柱层析中一般称为洗脱液,薄层层析时称为展层剂 分配系数:是指在一定的条件下,某一组分在固定相和流动相中含量(浓度)的比例,常用K来表示,它是层析中分离纯化物质的重要依据 迁移率:是指在一定条件下,某一组分在相同的时间内,在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值,常用R f来表示 分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件,差异越大,分离效果越理想 层析根据不同的标准可以分为多种类型:如按固定相基质的形式不同可分为纸层析、薄层层析和柱层析;按流动相的形式不同可分为液相层析、气相层析和超临界层析;按分离的原理不同可分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等 纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析,滤纸纤维上的羟基具有亲水性,吸附一层水作为固定相,有机溶剂为流动相。有机相流经固定相支持物时,与固定相之间连续抽提,使物质在两相间不断分配而得到分离。溶质在滤纸上的移动速度用R f值表示: 在一定条件下,某种物质的R f值是常数。R f值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关 氨基酸显色反应——茚三酮反应原理: 质,除了脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质 一分子水合茚三酮和氨缩合生成有色物质

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