新生大鼠脑组织中线粒体的分离_刘彤
线粒体的分离
线粒体的分离
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实验三线粒体的分离、超活染色与观察 一、实验目的 1、学习差速离心法分离动、植物线粒体技术。 2、观察动、植物活细胞内线粒体的形态、数量与分布。 3、学习细胞器的超活染色技术。 二、实验原理 利用沉降系数不同的颗粒，在一定介质中沉降速度的差异，采取分级差速离心的方法，将线粒体从细胞悬液中逐级分离出来。离心用的悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。 活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡，可用来研究生活状态下的细胞形态、结构和生理、病理状态。体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以活体染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。詹纳斯绿B（Janus green B）和中性红（neutral red）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体的染色各有专一性。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B（Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。 三、实验材料与方法 1、材料：人口腔上皮细胞、大鼠肝脏、玉米黄化幼苗（水稻、高粱等幼苗均可）、洋葱鳞茎内表皮细胞。 2、主要试剂和仪器：Ringer 溶液，10%、1/3000中性红溶液，1%、1/5000詹纳斯绿B 溶液；分离介质：0.25mol/L蔗糖、50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH7.4），3mmol/L EDTA，0.75mg/ml牛血清白蛋白（BSA），50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，0.3mol/L 甘露醇（pH7.4）、20%次氯酸钠（NaClO）溶液、1%詹纳斯绿B染液，生理盐水，0.25mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，0.34mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，固定液，姬姆萨染液，1/15mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）。温箱，冰箱，冷冻控温高速离心机（或普通高速离心机），高速离心机，显微镜，恒温水浴锅，解剖盘，玻璃匀浆器，剪刀、镊子，双面刀片，载玻片，凹面载玻片，盖玻片，漏斗，小烧杯，表面皿，吸管，牙签，吸水纸，纱布，瓷研钵，尼龙织物。 四、实验方法 （一）大鼠肝线粒体的分离 1、制备大鼠肝细胞匀浆。实验前大鼠空腹12h，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织2g，剪碎，用预冷到0－4℃的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在0－4℃条件下，按每克肝加9ml冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组
正渗透膜分离技术
正渗透膜分离技术 研究背景 随着世界人口数量的迅速增长和矿物燃料的急剧消耗，水资源和能源已成为地球上两种至关重要的资源。水资源匮乏和能源危机困扰着全球许多不同的团体。据报导，世界上至少十二亿的人缺乏洁净安全的饮用水，有二十六亿的人缺少足够多的环境卫生设备。 膜技术是近几十年迅速发展起来的高效分离技术，因其节能、高效、经济、简单方便、无二次污染等一系列优点，在水处理中已被广泛地用于苦咸水淡化、海水淡化、工业给水处理、纯水及超纯水制备、废水处理、污水回用等。作为一种低能耗、低污染的绿色技术，新型的膜分离技术，正渗透（Forward osmosis，FO），在供水和产能方面拥有着巨大的潜能，甚至在食品加工行业、医药行业也有很好的应用前景，正逐渐成为人们关注和研究的热点。 膜分离技术 作为一种广泛应用的分离技术，膜处理的分离原理主要是在常温下使溶质和溶剂通过半渗透膜，达到分离、浓缩和纯化的目的，在这个过程中，驱动力一般为压力驱动或电位驱动。该技术的特点有以下几个方面： （1）膜分离过程在常温下进行分离。 （2）膜分离过程无相变化。 （3）膜分离技术的适用范围较广。 （4）膜分离效率高，分离效果好。 （5）膜分离技术采用装置简单，操作方便。 通常来说，膜分离技术，能够对不同的微粒、分子、离子进行有效的分离，膜材料亦丰富为醋酸纤维素(CA)、聚丙烯腈(PAN)、聚酰胺(PA)、聚砜(PS)、聚丙烯(PP)、聚偏氟乙烯(PVDF)、陶瓷膜等。 常见水处理膜分离技术主要有以下几类： （1）微滤(MF)：由0.01～0.2 MPa的外加压力作为驱动力。膜的微孔直径处于微米范围，可截留粒径为0.1～10μm的悬浮物颗粒、纤维等。 （2）超滤(UF)：超滤以0.1～1.0 MPa左右的压力差为推动力。分离膜的孔径在 0.0015～0.02μm之间。 （3）反渗透(RO)：以1～70MPa左右的压力差为推动力。 （4）纳滤(NF)：由0.5～1.5MPa的外加压力作为驱动力。 正渗透 在正渗透中，用于分离的驱动力主要为FO膜两侧的汲取液和原料液之间的渗透压差，使水从原料液（较低渗透压）一侧自发传递到汲取液（较高渗透压）。不同于传统的靠压力驱动的膜分离技术，比如微滤、超滤、纳滤与反渗透等，正渗透由于运行的原理不同，因此有着独有的优势，例如施加较低或不施加压力，导致更低的能耗，降低运行成本；正渗透的分离能力强，对污染物有着较高的截留率；正渗透污染几乎为可逆污染，因而清洗效率高；正渗透的膜装置组成简单，操作容易等。在众多领域内，正渗透近几十年来均有着广泛的应用，特别的，在一些重要领域如海
分离线粒体
从细胞、组织中分离线粒体——差速离心法 所需缓冲液： RSB（使细胞膨胀的低渗缓冲液） 10mM NaCl（Mr=58.44） 2.5mM MgCl2（Mr=20 3.3） 10mM Tris-Cl（PH8.0） 调PH值至7.4 配法：0.5844g NaCl，0.5083g MgCl2·6H2O，10ml 1M Tris-Cl（PH8.0），调PH值至7.4，加水定容至1000ml。 2.5×MS缓冲液（MS缓冲液是用来保持细胞器张力的等渗缓冲液） 525mM甘露醇（Mr=182.17） 175mM 蔗糖（Mr=342.3） 12.5mM Tris-Cl（PH8.0） 2.5mM EDTA（PH8.0） 调PH值至7.4 配法：19.13g甘露醇，11.98g蔗糖，加150ml水溶解，加2.5ml 1M Tris-Cl（PH8.0），1ml 0.5M EDTA（PH8.0），用1M HCl调PH值至7.4，加水定容至200ml。 1×MS缓冲液 210mM甘露醇 70mM 蔗糖 5mM Tris-Cl（PH8.0） 1mM EDTA（PH8.0） 调PH值至7.4 配法：38.26g甘露醇，23.96g蔗糖，加800ml水溶解，加5ml 1M Tris-Cl（PH8.0），2ml 0.5M EDTA（PH8.0），用1M HCl调PH值至7.4，加水定容至1000ml。 注意事项： 溶液、离心管应在冰上预冷，所有离心步骤都要在40C进行。 从细胞中分离线粒体： 1．消化贴壁细胞，加5ml培液，转入10ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加5ml PBS，1000rpm离心5min，弃上清；悬浮细胞直接转入10ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加5ml PBS，1000rpm离心5min，弃上清。 2．用3ml冰上预冷的RSB重悬细胞，让细胞膨胀10min，加3×61uL PMSF贮液，在冰上匀浆，转速不宜过快。 3．细胞一破碎，立刻加入2ml 2.5×MS缓冲液至终浓度为1×MS。 4．750g离心10min以去除细胞核、未破碎的细胞和大的膜碎片。 5．将上清转移至另一离心管中，重沉淀细胞核一次。 6．将上清转移至另一离心管中，10000g离心20min沉淀线粒体。 7．弃上清，用1 ml 1×MS缓冲液重悬沉淀，750g离心10min，取上清，10000g离心20min，弃上清，用适当体积的1×MS缓冲液重悬沉淀。
正渗透技术处理水和废水
正渗透技术处理水和废水 1 引言 膜分离技术由于出水水质高、设备简单易操作、能耗相对较低、适应性强等特点，在水处理领域获得越来越多的关注.目前应用于水处理领域的几种膜分离技术.其中微滤(microfiltration，MF)、超滤(ultrafiltration，UF)、纳滤(nanofiltration，NF)和反渗透(reverse osmosis，RO)由机械压力驱动传质过程，是水和废水处理的常规技术.其他膜技术，如温度差驱动的膜蒸馏技术(membrane distillation，MD)，电场驱动的电渗析技术(electro-dialysis，ED)，一些由化学反应驱动的膜吸收技术(membrane absorption，MA)等也成为水处理领域的新型技术.正渗透(forward osmosis，FO)是一种由渗透压(浓度差)驱动的新型膜技术.可用于海水脱盐、废水处理等方面. FO膜是一种渗透膜.名义孔径在1 nm以下，用于截留溶解性离子和盐类等物质，与RO 相当.但与RO相比，FO无需外加机械压力，具有低压操作、低膜污染、高截留的优点，近年来在水处理领域受到较多关注. 2 FO原理(Basic principle of FO) FO膜是一种选择性渗透膜，膜的一侧是低渗透压的待处理水，另一侧是高渗透压的汲取液，水分子透过FO膜从低渗透压侧扩散到高渗透压侧，从而实现水与杂质的分离(图 1).该过程的驱动力是膜两侧溶液的渗透压差，不需外界提供压力. 图 1 FO工艺的原理示意图 2.1 FO应用与运行效果 2.1.1 海水(浓盐水)脱盐 FO已被用于含盐废水、含盐地下水、盐湖水和海水的脱盐.大多数为实验室规模的小试研究，汲取液采用难挥发性(NaCl，Na2SO4，MgSO4等)或挥发性(NH3/CO2和NH4HCO3)盐溶液.其中Zhao等进行的盐湖水脱盐，回收率达到70%.McGinnis等采用中试规模的FO处理高盐水(TDS>70，000 ppm)，回收率达到60%，与蒸发浓缩技术相当，出水水质达标(美国宾州
实验四 线粒体的分离与观察
实验八线粒体的分离与观察 实验目的 用差速离心法分离动、植物细胞线粒体。 实验原理 线粒体(mitochondria)是真核细胞特有的，使能量转换的重要细胞器。细胞中的能源物质——脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过耦联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。 制备线粒体采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。在一给定的离心场中(对于所使用的离心机，就是选用一定的转速)，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。 悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B(Janus green B)是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。 I．鸡肝线粒体的分离 实验用品 一、材料 鸡肝脏 二、试剂 1. 生理盐水 2．1％詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。 3. 0. 25 mol／L蔗糖+0.01mol／L Tris-盐酸缓冲液（ph7.4）：
核与线粒体分离提取方案
线虫细胞核和线粒体提取 N2同步化后，转移至培养皿，每皿大约4000条，2 day后到了mid-late L4，day5，day10，day15收集线虫（也有文献选择1、6、12、17day）。初步计划收集10个皿线虫。 1.细胞核分离 细胞核蛋白提取查阅的文献上都没提及是用哪个厂家的试剂盒，只简单说了自己采用的方法，也不是很具体。查到一份Protocol采用蔗糖分离法提取细胞核，此方法开始是用于肝组织(Widnell and Tata 1964)，后来被用于动物软组织(Rickwood et al. 1997)，后来成功用于肌细胞和培养的细胞。 方法如下： 1.在10cm细胞培养皿中培养的细胞系，直到它们达到90％汇合 2.分离当天，吸出培养基，然后用冰冷的PBS清洗细胞。吸出PBS。 3.将培养皿放在冰上，用1 mL PBS将细胞从板上刮掉。转移将细胞加入到冰上的1.5mL离心管中。 4.以10000rpm短暂离心5-10秒。 5.吸掉上清液，并将沉淀物重悬在9个填充细胞体积均质培养基中 6.用Potter-Elvehjem匀浆器将悬浮液均质化，冰上匀6次 7.用棉布过滤匀浆 8.在4℃下以600g离心滤液10分钟。丢弃上清液。用步骤5中一半体积的均匀培养基重悬沉淀。4℃ 600g 离心10分钟。丢弃上清液。 10.将9体积的高渗蔗糖缓冲液加入沉淀。在Potter-Elvehjem匀浆器（5或6冲程）或Dounce均化器在冰上。 11.在4℃下以60,000g-80,000g离心匀浆80分钟。 12.翻转管子去除蔗糖。从管壁擦去剩余的蔗糖，注意不要擦掉细胞核。 核在这个阶段保留其膜。要卸下膜，请执行步骤13。 13.为了除去核膜，将来自步骤12的沉淀重悬含有0.5％Triton X-100的匀浆介质。在4℃下以600g离心10分钟。重复该过程。最后，如果需要，用均质介质洗涤沉淀以除去剩余的TritonX-100。 14.将沉淀物重悬在选择的介质中用于随后的分析。 分离的细胞核可以尝试裂蛋白，再用BCA法检测蛋白浓度。 2.线粒体提取 查阅了文献，线粒体蛋白提取采用的是Qproteome Mitochondria Isolation Kit (Qiagen 37612)，流程如下： 1.将新鲜切除的组织放在冰上，取出适当的大小样品。用1ml 0.9％（w / v）氯化钠溶液洗涤样品。 2.将样品切成约2毫米3片，放入2毫升反应液中管，并加入500μl含蛋白酶抑制剂的裂解液。 3.使用TissueRuptor转子定子使样品均质化，均质器设最低速度转10s。 4.吸取1.5ml含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液加入管中并孵育在4℃摇床上10分钟。 5.在4℃下以1000xg离心匀浆10分钟。 6.小心地清除上清液 7.将细胞沉淀重悬于1.5ml冰冷的破碎缓冲液中使用1毫升枪头吹打。细胞使用钝头针头和注射器进行破
水处理中正渗透膜分离技术的应用
水处理中正渗透膜分离技术的应用 摘要：渗透（osmosis）是一种仅依靠渗透压驱动的分离过程,基于渗透现象发展起来的正渗透膜分离技术,目前该技术在国际都得到了广泛的应用。本文章综述了水处理中正渗透膜分离技术应用过程的基本原理、应用现状以及水处理正渗透膜分离技术的应用领域,并对未来水处理中正渗透膜分离技术的应用方向提出了展望。希望在未来其技术能得到更加广泛的应用与发展。 关键词：正渗透应用水处理膜分离技术 一、前言 20世纪60年代起，对膜分离技术从实验室研究已经进入到了工业行业的实际应用，直至现在，它已应用到水处理，食品加工，制药工程，医学以及能源等不同的领域。正渗透(Forward osmosis，FO)是一种不需外加压力做驱动力，而仅依靠渗透压驱动的膜分离过程。正渗透膜分离技术与外加压力驱动的膜分离技术最大的区别就是正渗透膜分离技术不需要外加压力或在较低的外加压力下运行，并且膜污染情况相对较轻，在持续长时间运行后无需清洗。水处理中正渗透膜分离技术目前在国际上诸如美国、新加坡、欧洲等国家和地区已得到大量研究和应用。 二、水处理中正渗透膜分离技术的基本原理 正渗透是浓度驱动型的膜过程,它依靠选择性渗透膜两侧的渗透压差为驱动力来自发的实现水在膜中的传递。也就是指水从较高水化学势(或较低渗透压)一侧区域通过选择透过性膜流向较低水化学势(或较高渗透压)—侧区域的过程。在具有选择透过性膜的两侧分别放置两种具有不同渗透压的溶液，一种为具有较低渗透压的原料液(Feed solution)，另一种为具有较高渗透压的驱动液(Draw solution)，正渗透正是应用了膜两侧溶液的渗透压差作为驱动力，才使得水能自发地从原料液一侧透过选择透过性膜到达驱动液—侧。当对渗透压高的一侧溶液施加一个小于渗透压差的外加压力的时候，水仍然会从原料液压一侧流向驱动液—侧，这种过程叫做压力阻尼渗透(Pressure-retarded osmosis，PRO)。压力阻尼渗透的驱动力仍然是渗透压，因此它也是一种正渗透过程。水处理中正渗透膜分离技术应用正是基于这种原理。 三、水处理正渗透膜分离技术应用现状 正渗透膜过程，具有三低优势，即低压操作，低能耗和低污染，在水处理领域已得到了一定的应用。但是国内并不多见其应用报道，所以说应用不是很多，尽管如此，这一技术仍然具有很大的应用价值和光明的应用前景。如果要大范围普及正渗透膜分离技术，仍需做很多努力。包括了我国对正渗透膜分离技术研究不多，特别是在水处理应用上缺乏经验参数，这需要进行大量的实验，从而积累经验；目前所拥有的正渗透膜性能太低，品种不全、不优；缺少既经济又高效的汲取液体系和汲取液再浓缩途径。 鉴于水处理正渗透膜分离技术仍存在比较多的问题，在今后的研究和应用方面应该从这些方面的着手突破，极大推动正渗透技术在水处理中的广泛应用，以促进新一代水处理工艺的高效发展。总之，对水处理正渗透膜分离技术的研究，都应该围绕如何提高正渗透过程的水回收率、如何提高正渗透过程中的分离效率、以及如何降低正渗透过程的运行成本等方面进行。 四、水处理中正渗透膜分离技术应用领域
组织线粒体提取
从动物组织中粗提线粒体 一、实验目的： 从动物组织中分离线粒体，以便线粒体功能分析实验。 二、实验准备 Lysis buffer、匀浆器、离心管、解剖器具 三、实验步骤： 1．实验前一天小鼠禁食过夜。线粒体提取前所有溶液要冰上预冷。 2．解剖小鼠（~30g），快速取出肝脏，去除胆囊，放入50ml预冷的IBc烧杯中； 3．预冷的IBc洗去多余的血液。洗4-5次至IBc澄清。 4．冰上将肝脏剪碎 5．倒掉清洗的IBc，加入新的5mlIBc，将上清转移至玻璃匀浆器 6．以1,600 rpm冰上匀浆3-4次，组织与缓冲液比例1：5-1：10间 7．匀浆液转移至50ml离心管，600g，离心10min 4 ℃ 8．小心将上清转移至新的离心管600g，离心10min 4 ℃ 9．小心将上清转移至新的离心管7000g，离心10min 4 ℃ 10．倒掉上清，加入5ml预冷的IBc，洗一次，不要用枪头重悬 11．7000g，离心10min 4 ℃ 12．去除上清，重悬底部的含有线粒体的颗粒。用玻璃棒搅松底部的沉淀，不加IBc，用弃去上清的少量缓冲液重悬。用1ml移液管重悬避免出现气泡。 13．转移至14ml离心管，置于冰上。线粒体在1-3小时内用于实验，得到比较好的活性。 14．Bradford法测定线粒体浓度。 四、试剂配方 Buffer for cell and mouse liver mitochondria isolation (IBc)：100 ml 10 ml 0.1M Tris–MOPS 1 ml 0.1M EGTA/Tris 20 ml 1M sucrose 100 ml ddH2O，pH 7.4 储液： 1 M sucrose： 342.3 g sucrose 1L ddH2O Mix, 20 ml分装-20 C保存. 0.1MTris/MOPS： 12.1 g Tris； 500ml ddH2O，MOPS 调pH 7.4，ddH2O 体积至1L保存于4 C. 0.1 M EGTA/Tris： 38.1 g EGTA； 500 ml ddH2O，Tris调pH 7.4 总体积至1L ，保存于4 C. 五、注意事项 1. 开始前将离心管预冷5min，所有步骤包括匀浆在4度冰上进行，降低磷脂酶和蛋白酶活性； 2．最后重悬时，用玻璃棒搅松底部的沉淀。不加IBc，用弃去上清的少量缓冲液重悬，线
线粒体分离及功能测定
组织和线粒体裂解液（Tissue and Mitochondrial lysis buffer）： Components Final concentration Tris-HCl 50mM pH7.4 NaCl 150mM EDTA 2mM EGTA 2mM Triton X-100 0.2% NP-40 0.3% PMSF 100uM NaVO3 1mM NaF 250mM Leupeptin 10ug/ml Aprotinin 2ug/ml DTT 1mM 组织线粒体的分离 1) 小鼠脱臼处死，迅速取出组织，放入用冰预冷的线粒体提取缓 冲液中， 2) 充分洗去血水，尽量去除非组织成分， 3) 在小烧杯中加入新鲜的提取缓冲液，用小剪刀将组织剪碎， 4) 4℃，电动匀浆机，600rpm 上下3 次， 5) 1000g 4℃离心10min，将上清小心倒入新离心管中， 6) 重复上面步骤一次， 7) 10,00Og 4℃离心10min,沉淀即为线粒体， 8) 倒掉上清，加入新鲜的提取缓冲液重悬沉淀，10,000g 洗一次， 9) 最后用适量的提取缓冲液小心悬起沉淀，冰上保存备用（不要超过6hours）， 10) 定量线粒体蛋白浓度，用于后续分析。 分离或培养细胞线粒体的提取(Dounce 匀浆法) 低渗线粒体缓冲液（Hypotonic mitochondrial buffer）:100 ml Components Final concentration Hepes(KOH) 20mM pH7.2 Sucrose 210mM Mannitol 70mM EDTA 1mM EGTA 1mM
组织线粒体分离试剂盒
组织线粒体分离试剂盒 简介： 线粒体是细胞呼吸的主要场所，细胞活动所需的能量主要由在线粒体内进行的氧化所产生的能量来供应。制备线粒体的关键是保持线粒体的完整性和纯度，可通过分级分离法获得，即先低俗出去细胞核以及细胞碎片，再进行高速梯度离心分离线粒体。 Leagene 组织线粒体分离试剂盒(Tissue Mitochondria Isolation Kit)是快速便捷分离动物组织中的线粒体的试剂盒，分离线粒体的同时可以获得去除线粒体的细胞浆蛋白，可用于分析细胞色素C 等线粒体蛋白向胞浆的释放，大部分获得的线粒体都含有完整的内膜和外膜，并具有线粒体的生理功能(如检测线粒体膜电位)，获得的蛋白可用于SDS-PAGE 、Western 、双向电泳等蛋白分析。该试剂盒可用于从动物软组织(如脑、肝脏)和硬组织(心肌、骨骼肌)中提取线粒体，对于采用该试剂盒提取硬组织线粒体效果不佳者，建议采用Leagene 硬组织线粒体分离试剂盒。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、 低温离心机、匀浆器 2、 PBS 操作步骤(仅供参考)： 1、清洗：取新鲜组织(不宜采用冻存的组织)，迅速称重，用预冷的PBS 清洗1次，冰上剪成3mm 2大小的组织碎片。 2、匀浆裂解：加入Mitochondria Lysis buffer(如需获得细胞浆蛋白，应提前加入PMSF ，至PMSF 浓度为1×)，置于冰浴上Dounce 匀浆器中，匀浆10～20次。 不同组织或不同匀浆器所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。 3、离心以去除细胞核、未破碎的细胞和大的膜碎片。注：如需获得纯度更高的线粒体，可 编号 名称 CS0010 50T Storage 试剂(A): Mitochondria Lysis buffer 100ml -20℃ 试剂(B): Mitochondria Stock buffer 10ml -20℃ 试剂(C): Protein Stock buffer (5×) 10ml RT 试剂(D): PMSF(100×) 1.5ml -20℃ 使用说明书 1份
组织线粒体分离试剂盒
组织线粒体分离试剂盒 简介： 组织线粒体分离试剂盒(Tissue Mitochondria Isolation Kit)是快速便捷分离动物组织中的线粒体的试剂盒，分离线粒体的同时可以获得去除线粒体的细胞浆蛋白，可用于分析细胞色素C 等线粒体蛋白向胞浆的释放，大部分获得的线粒体都含有完整的内膜和外膜，并具有线粒体的生理功能(如检测线粒体膜电位)，获得的蛋白可用于SDS-PAGE 、Western 、双向电泳等蛋白分析。该试剂盒可用于从动物软组织(如脑、肝脏)和硬组织(心肌、骨骼肌)中提取线粒体，对于采用该试剂盒提取硬组织线粒体效果不佳者，建议采用Leagene 硬组织线粒体分离试剂盒。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 操作步骤(仅供参考)： 1、清洗：取新鲜组织(不宜采用冻存的组织)，迅速称重50～100mg ，用预冷的PBS 清洗1次，冰上剪成3mm 2大小的组织碎片。 2、匀浆裂解：加入预冷的Mitochondria Lysis buffer(如需获得细胞浆蛋白，应提前加入PMSF ，至PMSF 浓度为1×)，置于冰浴上Dounce 匀浆器中匀浆。 不同组织或不同匀浆器所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。 3、离心以去除细胞核、未破碎的细胞和大的膜碎片。 4、上清液转移至一干净离心管离心。 5、弃上清，沉淀为线粒体，如果希望获得去除线粒体的细胞浆蛋白，应在本步骤中收集上清，并且在收集上清时注意勿触及沉淀。 6、保存：弃上清，用适当缓冲液悬浮沉淀。如果用于线粒体酶活性或功能的分析，线粒体沉淀应重悬于Mitochondria Stock buffer ；如果用于线粒体蛋白的分析，获得的细胞浆蛋白应保存于1×Protein Stock buffer ，即按细胞浆蛋白：Protein Stock buffer (5×)=1:4比例混合；如果用于双向电泳，应使用恰当的保存液。 编号 名称 CS0203 50T Storage 试剂(A): Mitochondria Lysis buffer 100ml -20℃ 试剂(B): Mitochondria Stock buffer 10ml -20℃ 试剂(C): Protein Stock buffer (5×) 10ml RT 试剂(D): PMSF(100×) 1.5ml -20℃ 使用说明书 1份
细胞器线粒体的分离与观察
细胞器线粒体的分离与观察 高熹1120152430（李安一） （北京理工大学生命学院16121501班） 摘要：差速离心法是交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法。此法适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离。离心分离出细胞核与线粒体，进行染色，对细胞核和线粒体的形态进行观察并记录。 关键词：差速离心法；细胞核；线粒体；实验。 1 引言 差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。 线粒体是真核细胞特有的，司能量转换的重要细胞器。细胞种的能源物质——糖、脂肪、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸华生成ATP，供给细胞生理活动之需。对线粒体的结构和功能的研究通常是在离体线粒体上进行的。 制备线粒体用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。在一给定的离心场中（对于所使用的离心机，就是选用一定的转速），球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在一均匀悬浮介质中离心某一时间内，组织匀降中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉降的是细胞核，其次是线粒体，其他更轻的细胞器和大分子可依次再分离。 悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意样品保持4，避免酶失活。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B（janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引而堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。 Giemsa染液为天青色素、伊红、次甲蓝的混合物，本染色液最适于血液涂抹标本、血球、疟原虫、立克次体以及骨髓细胞、脊髓细胞等的染色。染前用蛋白酶等进行处理，然后再用姬姆萨染液染色，在染色体上，可以出现不同浓淡的横纹样着色。姬姆萨染液可将细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞浆染成粉红色，在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。 2 实验器材及材料 2.1 实验材料 大鼠肝脏。
正渗透膜分离的研究进展
CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS 2011年第30卷第1期·66· 化工进 展 正渗透膜分离的研究进展 施人莉，杨庆峰 （上海交通大学环境科学与工程学院，上海 200240） 摘要：正渗透是浓度驱动的膜技术，是指水通过选择性渗透膜从高水化学势区域向低水化学势区域的传递过程。本文介绍了正渗透的基本构成（驱动力、汲取液和正渗透膜材料），指出膜两侧的浓差极化是水通量性能的最大障碍，采用通量模型说明了膜在两种放置方向下存在的内浓差极化和外浓差极化，内浓差极化对驱动力的减小起着重要的作用；论述了膜材料、原料液浓度、汲取液浓度对正渗透和压力延迟渗透水通量的影响；此外，评述了正渗透过程的膜污染和能耗。 关键词：正渗透；浓差极化；膜污染；能耗 中图分类号：TQ 021.8 文献标志码：A 文章编号：1000–6613（2011）01–0066–08 Research advances in forward osmosis membrane separation SHI Renli，YANG Qingfeng （School of Environmental Science and Engineering，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240，China）Abstract：Forward osmosis（FO）is a concentration-driven membrane process，in which water transports across a semi-permeable membrane from a dilute feed solution into a concentrated draw solution. The basic factors of FO（driving force，draw solution and membrane materials）are introduced. The major hindrance to permeate water flux performance is the prevalence of concentration polarization on both sides of the membrane. Flux models that account for the presence of both internal and external concentration polarization for the two possible membrane orientations are presented. Internal concentration polarization is found to play a significant role in the reduction of driving force. This article comments the effect of membrane material，feed solution concentration，and draw solution concentration on FO and pressure-retarded osmosis（PRO）water flux performance. In addition，membrane fouling as well as energy consumption of FO is evaluated. Key words：forward osmosis；concentration polarization；membrane fouling；energy consumption 正渗透（forward osmosis，FO）技术近年来受到越来越多的关注。FO采用高浓度的汲取液来产生高的渗透压，以汲取低浓度原料液侧的水透过半渗透膜，然后再将被稀释的汲取液中的水进行分离，最终可获得纯净的水。 相对于反渗透（RO）技术[1–3]，这种利用溶液渗透压差来进行分离的FO技术，由于其回收率高、浓水排放少、膜污染低、无需外压等，正有越来越多的研究报道出现。当前，人们利用FO膜分离技术开展工业废水处理[4]、垃圾渗滤液处理、液态食品加工、海水淡化[5–6]、压力延迟渗透（pressure- retarded osmosis，PRO）进行发电等研究；另外，在紧急救援时的生命支持系统方面已利用FO膜分离技术制取淡水[7–8]。然而，由于FO中存在的浓差极化现象，其实际水通量明显小于预期水通量。因此，对FO过程进行深入研究具有重要的意义。 收稿日期：2010-05-19；修改稿日期：2010-07-04。 基金项目：上海教委科研创新重点项目（09ZZ18）及国家自然基金项 目（20306015，20676077）。 第一作者：施人莉（1987—），女，硕士研究生。联系人：杨庆峰。 E-mail yangqf@https://www.wendangku.net/doc/746684647.html,。
细胞线粒体分离试剂盒
细胞线粒体分离试剂盒 简介： 线粒体是细胞呼吸的主要场所，细胞活动所需的能量主要由在线粒体内进行的氧化所产生的能量来供应。制备线粒体的关键是保持线粒体的完整性和纯度，可通过分级分离法获得，即先低俗出去细胞核以及细胞碎片，再进行高速梯度离心分离线粒体。 Leagene 细胞线粒体分离试剂盒(Cell Mitochondria Isolation Kit)是快速便捷分离培养细胞中的线粒体的试剂盒，分离线粒体的同时可以获得去除线粒体的细胞浆蛋白，可用于分析细胞色素C 等线粒体蛋白向胞浆的释放，大部分获得的线粒体都含有完整的内膜和外膜，并具有线粒体的生理功能(如检测线粒体膜电位)，获得的蛋白可用于SDS-PAGE 、Western 、双向电泳等蛋白分析。本试剂盒提供台盼蓝染色液和PMSF ，可以分别判断线粒体质量和提取细胞浆蛋白。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、 胰蛋白酶 2、 低温离心机、匀浆器 3、 PBS 操作步骤(仅供参考)： 1、清洗：用预冷的PBS 清洗细胞，离心，其上清。 2、裂解：沉淀用预冷的Mitochondria Lysis buffer 重悬细胞，冰浴放置，可用相差显微镜检测膨胀的程度。 3、匀浆：把细胞悬液转移至Dounce 匀浆器中，匀浆。不同细胞或不同匀浆器所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。 编号 名称 CS0201 50T Storage 试剂(A): Mitochondria Lysis buffer 100ml -20℃ 试剂(B): Trypan Blue Stain 10ml 4℃ 避光 试剂(C): Wash buffer 100ml -20℃ 试剂(D): Mitochondria Stock buffer 10ml -20℃ 试剂(E): Protein Stock buffer(5×) 20ml RT 试剂(F): PMSF(100×) 1.5ml -20℃ 使用说明书 1份
线粒体提取
线粒体提取 缓冲液A（100 mM Tricine-KOH (pH 7.4), 300 mM sucrose, 10 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM potassium-EDTA, 0.1% BSA, 5 mM DTT and protease inhibitors: 1 mM PMSF, 10 g/ml pepstatin A）。 缓冲液B（pH 7.4, 无DTT ，余下同分离缓冲液A）。 1、将拟南芥叶片10g,置于研钵中，剪碎。 2、加25ml分离缓冲液A，冰上充分研磨。 3、匀浆液经4层纱布过滤。滤液取20ul用于细胞色素c活性测定，记为（1）。 4、于2,600g 离心15 min（Beckman J2-HS），弃沉淀。上清取20ul用于细胞色素c活性 测定，记为（2）。 5、上清液进一步在12,000g 离心15 min，此时得到线粒体粗提样。 6、弃上清，将沉淀轻柔地悬浮于2 ml分离缓冲液B中。从中取20ul用于细胞色素c活性测定，记为（3）。 7、铺制蔗糖密度梯度于38ml超离管中，介质由上到下依次包括6 ml / 0.6 M sucrose, 6 ml / 0.9 M sucrose, 8 ml/ 1.2 M sucrose, 8 ml /1.45 M sucrose 和8 ml/ 1.8 M sucrose。介质均用缓冲液B配制。 8、然后将2 ml悬浮液铺于蔗糖密度梯度介质上。 9、然后以24000rpm离心90 min（SW28 Beckman rotor）。 10、超离结束后，收集1.45M/1.2M层组分于50ml离心管中，缓冲液B稀释5倍。 11、12000g离心15min，沉淀即为纯化的线粒体。 13、将沉淀重悬于500ul缓冲液B中，从中取20ul用于细胞色素c活性测定，记为（4）。 14、纯化的线粒体液氮速冻，存于-80℃。
实验二 细胞核与线粒体的分离与观察
实验二细胞核与线粒体的分离与观察 一、实验目的 1．了解差速离心法分离细胞核与线粒体的原理。 2．掌握差速离心法分离动物与植物细胞的细胞核与线粒体的方法。 二、实验原理 细胞核（nucleus）是细胞中重要的细胞器，细胞的控制中心，在细胞的代谢、生长、分化中起着重要作用，是遗传物质的主要存在部位。线粒体（mitochondria）是真核细胞特有的能量转换的重要细胞器，是细胞进行有氧呼吸的主要场所。细胞中的能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动需要。对细胞核和线粒体结构与功能的研究通常是在离体进行的，因而分离细胞核和线粒体是必须的。 差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心分离细胞核和线粒体。在确定的离心场中，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。 缓冲的蔗糖溶液是常用的悬浮介质，它属于等渗溶液，比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。线粒体的鉴定用詹纳斯绿B（Janus green B）活染法，对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中染料被还原成无色。 从植物细胞分离线粒体除了作线粒体功能测定外，在植物细胞遗传工程中，常用于分离核外基因——线粒体DNA等目的。 分离线粒体的方法仍采用均匀介质中的差速离心。介质中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L甘露醇代替。EDTA螯合二价阳离子，Ca2+除去后细胞间粘着解体，促使组织分散成单个细胞。牛血清白蛋白（BSA）能包在细胞外面，并作为
正渗透
正渗透膜分离关键技术及其应用进展 摘要：正渗透是一种新型的膜分离技术，具有能耗低、膜污染小及回收率高等优点，近年来在国际上得到了广泛的关注．本文介绍正渗透膜分离技术的基本原理；综述正渗透膜分离关键技术驱动液与膜材料的最新进展；简述正渗透膜分离技术的最新应用；展望正渗透膜分离技术的重点研究方向． 关键词：正渗透；渗透压；膜材料；驱动液;醋酸纤维素（ＣＡ）膜材料 1.引言 随着现代经济的快速发展、世界人口的迅猛递增，全球淡水资源日渐短缺．目前，全球至少有１２亿人喝不到安全洁净的水，大约有２６亿人生活在淡水资源匮乏的地区，水资源短缺已经成为２１世纪困扰人类最大的问题．在众多水处理方法中，反渗透（ＲＯ）是目前应用最成熟、最广泛的技术．然而，ＲＯ需要较高的水压抵消渗透压差，是能量密集型技术，同时，ＲＯ过程还存在回收率低、浓水排放、浓差极化和膜污染严重等问题．正渗透（ｆｏｒｗａｒｄｏｓｍｏｓｉｓ，ＦＯ）是近年来发展起来的一种用于污水处理和咸水淡化的新型膜分离技术．与压力驱动膜分离过程相比较，ＦＯ过程无需外加压力，而仅仅依靠渗透压驱动．因此ＦＯ运行过程中的能耗小，膜污染情况也会相对较少，可以长时间的运行而不需要频繁清洗．另外，ＦＯ技术在脱盐过程中回收率高，浓缩的盐水可通过结晶分离，没有浓盐水的排放，是环境友好型技术．因此，人们对发展ＦＯ技术的兴趣极大，对其应用研究的领域不仅仅停留在水处理、发电等方面，甚至拓展到了生命科学，如药物蛋白浓缩、药物释放和食品工程等领域． 2原理与特点 2.1基本原理 Lee 等(1981)较早地概况总结了反渗透(RO)、正渗透(FO)和减压渗透((Pressure Retarded Osmosis,PRO)过程的工作原理，如图 1 所示。
线粒体的提取与观察
线粒体的提取与观察 线粒体是细胞中重要的细胞器，存在于绝大多数生活细胞中，它的主要功能是提供细胞内各种物质代谢所需要的能量。正由于这样，对线粒体膜，呼吸链酶及线粒体DNA等成分的结构，功能以及物理化学性质的研究已经成为细胞生物学研究中的重要课题，所以提取线粒体的技术已经成为线粒体研究中必不可少的手段，线粒体大量存在于代谢旺盛的细胞中，如动物的心肌，肝，肾等器官和组织的细胞中，大量置备线粒体就是从这些器官组织中提取，当所用样品较少时（如电镜和光镜的观察）可采用从组织培养细胞中提取，本实验就是介绍两种材料制备用于光镜观察的线粒体。 一、目的与要求 了解提取线粒体的基本原理及其过程，通过光学显微镜的观察了解体外分离的线粒体的一般形态 二、基本原理 线粒体具有完整的结构，一定的大小和质量，低温条件下在等渗液中破碎细胞，差速离心后，获得线粒体。经活性染料Janus green B染色，线粒体呈浅蓝色。 三、实验内容 1．线粒体的分离提取 2. 鼠肝的匀浆制备 3. 线粒体的活体染色 四、实验步骤 （一）动物组织线粒体的分离，提取与观察 显微镜检查：将1％Janus green B溶液按1:1比例加入线粒体悬液中,在室温或水浴中染15~20分钟,用吸管吸取一滴线粒体悬液，滴于载玻片上，加盖玻片后，放显微镜下进行观察，线粒体为蓝绿色圆形颗粒。 2．组织培养细胞的线粒体的提取与观察
（三）操作中应该注意的问题 1．整个操作过程为保证线粒体的完整，应尽量使操作时的环境如温度（0—4℃），pH (7.0左右)保持恒定，同时尽可能短操作时间。 2．组培细胞消化时要特别小心，防止损失或反复。（损失指细胞脱落到消化液中）。 3．匀浆时，所用的介质一定是等渗缓冲液，常用的有0.25 mol/L蔗糖溶液或生理盐水代替Hank’s液 4．匀浆次数依照匀浆器的松紧而定，次数过少，细胞破损不完全，就会影响线粒体产量。 5．所以取2/3上清夜用来制备线粒体是为防止细胞碎片过多影响观察。 6．整个分离过程，一般最好在30—60分钟内完成，不宜过长。