姜黄素对缺氧缺血性大鼠脑组织中丙二醛和cfos的影响
?６?ＪｏｕｍａｌｏｆＦｏｒｅｎｓｉｃＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ２００９，Ｖ０１－２５，Ｎｏ．１姜黄素对缺氧缺血性大鼠脑组织中丙二醛和ｃ—ｆｏｓ的影响
郑园园，喻林升。张益鹄，叶光华。伊吉普
（温州医学院法医学系，浙江温州３２５０３５）
摘要：目的探讨姜黄素对大鼠缺氧缺血性脑损伤（ｈｙｐｏｘｉａ—ｉｓｃｈｅｍｉｃｂｒａｉｎｄａｍａｇｅ，ＨＩＢＤ）后丙二醛（ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ，ＭＤＡ）含量和ｃ—ｆｏｓ蛋白表达的影响。方法将ＳＤ雄性大鼠随机分为假手术对照组、脑缺氧缺血组、姜黄素组和溶剂对照组。用比色法测定脑组织中ＭＤＡ含量，免疫组织化学方法检测脑皮质区ｃ—ｆｏｓ蛋白的表达．电镜观察脑皮质神经元的形态学变化。结果姜黄素干预组与其他组的相应时间段相比，ＭＤＡ含量下降，脑皮质区ｃ－ｆｏｓ蛋白表达显著增高（Ｐ＜Ｏ．０５），电镜观察脑皮质神经元损伤减轻。结论姜黄素可降低ＨＩＢＤ大鼠脑组织的ＭＤＡ含量，上调ｃ—ｆｏｓ蛋白的表达，减轻神经元的损伤。
关键词：法医病理学；缺氧缺血，脑；姜黄素；丙二醛；ｃ—ｆｏｓ蛋白；大鼠
中图分类号：ＤＦ７９５．１文献标志码：Ａｄｏｉ：ｌＯ．３９６９／ｉ．ｉｓｓｎ．１００４—５６１９．２００９．０１．００３
文章编号：１００４—５６１９（２００９）０ｌ一０００６—０３
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缺氧缺血性脑损伤（ｈｙｐｏｘｉａ—ｉｓｃｈｅｍｉｃｂｒａｉｎｄａｍａｇｅ，ＨＩＢＤ）在临床医学和法医学实践中常见，是一种致残率及死亡率较高的脑损伤。预防和治疗此类脑损伤已成为当前研究热点。本实验采用姜黄素干
基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０４７２２６９）；浙江省教育厅基金资助项目（２００３０７９８）
作者简介：郑咽园（１９８２一），女，湖北宜城人。硕士研究生。主要从事病理学和法医学研究。Ｔｂｌ：１３１１５８１２１９６，Ｅ—ｍａｉｌ：ｙｙｚｄｘｎｏ＠１６３．ｃｏｍ。
通信作者：喻林升（１９６４＿），男，浙江黄岩人。教授，硕士生导师，主要从事病理学和法医学教学与研究。Ｔｅｌ：１３０５７８４２８１５，Ｅ—ｍａｉｌ：ｖｌｓ＠ｈｚｍｃ．ｎｅｔ。预，在以往研究的基础上【ｌ】，通过生化检测、免疫组织化学检测及电镜观察的方法动态观察其对ＨＩＢＤ及神经元凋亡的影响，旨在为防治ＨＩＢＤ提供进一步的理论依据。
１材料与方法
１．１试剂与仪器
丙二醛（ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ，ＭＤＡ）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。一抗（兔抗ｃ—ｆｏｓＩｇＧ多克隆抗体）购自美国ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司，二抗、ＤＡＢ、苏木素均购于福建迈新公司。ＬＫＢ—Ｖ２０８８型超薄切片机（瑞典ＬＫＢ公司）。Ｈ一６００型透射电镜（日本日立公司）。
万方数据
法医学杂志２００９年２月第２５卷第１期
１．２实验动物及分组
７２只健康清洁级ＳＤ雄性大鼠，体质量１８肌２２０９，购自温州医学院实验动物中心。随机等分为假手术对照组（Ｉ）．、脑缺氧缺血组（Ⅱ）、姜黄素组（Ⅲ）和溶剂对照组（Ⅳ）。每组再按２、４、６ｈ时间段分为３个亚组。１．３模型制备
假手术对照组仅游离左侧颈总动脉但不结扎，余者参照Ｒｉｃｅ等【：】的方法制备ＨＩＢＤ动物模型，结扎左侧颈总动脉后，置于８％０２、９２％Ｎ２环境中２ｈ，环境温度恒定为２２℃～２５℃。姜黄素组在术前１ｈ腹腔注射姜黄素（４０ｍ∥ｋｇ），溶剂对照组在同时间点注射等量二甲基亚砜。每组分别在缺氧后２、４和６ｈ断颈处死。将大鼠断头后，在冰盘内迅速除去大鼠颅骨，剥离硬脑膜及软脑膜，取出完整的脑组织，用预冷的生理盐水冲洗。取结扎侧适量大脑皮质经液氮速冻后置一７０ｃＣ冰箱保存，备测ＭＤＡ；取适当大小的脑组织块置４℃的４％多聚甲醛中固定，备免疫组织化学检测：另少量备用做透射电镜，取左脑皮质Ｏ．１ｃｍ×Ｏ．１ｃｍ×０．１ｃｍ大小的组织２～３块，预冷２．５％戊二醛前固定。
１．４脑组织ＭＤＡ含量的测定
将低温保存的脑组织制成匀浆，用冷冻离心机以离心半径６ｃｍ。３０００ｒ／ｍｉｎ，离心２０ｍｉｎ。取上清液用硫代巴比妥酸比色法测定ＭＤＡ含量。
１．５免疫组化（ＳＰ法）测定ｃ—ｆｏｓ蛋白
将置于多聚甲醛中固定２４ｈ的脑组织常规石蜡包埋，连续切片，片厚４仙ｍ，备免疫组织化学检测。操作严格按照说明书，ＤＡＢ显色，苏木精复染。以ＰＢＳ代替一抗设阴性对照。
１．６电镜观察
２．５％戊二醛处理过的脑组织再经过ｌ％锇酸后固定，Ｅｐｏｎ８１２包埋，切片，常规染色，醋酸硝酸铅双重染色，电镜观察脑组织超微结构变化。
１．７图像分析及数据处理
ｃ—ｆｏｓ蛋白免疫组织化学染色的切片采用计算机图像处理系统（Ｂ×５１）对切片进行图像分析及处理。应用ＳＰｓＳｌｌ．０统计软件，数据以石蜘形式表示。组间用单因素方差分析（ｏｎｅ—ｗａｙＡＮＯＶＡ）进行统计学分析，两两比较用口检验。Ｐ＜０．０５为差异具有统计学意义。
２结果
２．１脑组织ＭＤＡ含量
实验各组随着时间的变化，ＭＤＡ含量均增加。Ｉ组与其他组相比ＭＤＡ含量最少（Ｐ＜０．０５）。与Ⅱ组
?７?
和Ⅳ组相比，Ⅲ组同时间点ＭＤＡ含量明显减少（Ｐ＜０．０５）（表１），Ｉ组各时间段比较差异无统计学意义。
表ｌ各组大鼠脑组织ＭＤＡ含量
！里三鱼：至兰：竺竺竺型翌墨２组别２ｈ４ｈ６ｈ
注：１）与Ｉ组比较，Ｐ＜０．０５；２）与Ⅱ组比较，Ｐ＜Ｏ．０５；３）与同组上一时间段比较．Ｐ＜０．０５
２．２免疫组织化学检测ｃ—ｆｏｓ蛋白结果
ｃ—ｆｏｓ蛋白在Ｉ组各时间段表达量均低于其他各组水平。缺氧缺血２ｈ后结扎侧皮质区的ｃ—ｆｏｓ蛋白阳性表达率与Ｉ组相比均明显升高（Ｐ＜Ｏ．０５）。Ⅲ组２ｈ的蛋白阳性率最高（Ｐ＜０．０１），以后表达减弱，但仍然高于其他各组水平（表２）。图１、２分别显示Ⅱ、Ⅲ２ｈ组ｃ—ｆｏｓ阳性产物呈棕黄色，位于神经元细胞核内。
表２缺氧后不同时间点皮质区ｃ—ｆｏｓ蛋白阳性率
（ｎ＝６，孑虹，％）
注：１）与Ｉ组比较，Ｐ＜０．０５；２）与Ⅱ组比较，尸＜０．０５；３）与Ⅱ组比较．Ｐ＜Ｏ．Ｏｌ
图１缺氧缺血２ｈ组大脑皮质组织ｃ—ｆｏｓ蛋白的表达
ＤＡＢ×４００
图２姜黄素２ｈ组大脑皮质组织ｃ—ｆｏｓ蛋白的表达
ＤＡＢ×４００
万方数据
?８?
２．３脑组织超微结构改变
假手术组：神经元核大而圆，核仁清晰，双层结构的核膜包在核外，胶质细胞胞核正常，无水肿。脑缺氧缺血组：皮质神经元粗面内质网扩张、线粒体轻微肿胀．同时见有神经元、胶质细胞的核膜内陷皱缩．核体积缩小的核固缩表现（图３）。姜黄素组：神经元、胶质细胞和毛细血管周围水肿程度减轻，核固缩的细胞数量明显减少（图４）。溶剂对照组同脑缺氧缺血组。
图３缺氧缺血组早期凋亡神经元ｘ６０００
图４姜黄素组神经元形态基本正常×６０００
３讨论
ＨｌＢＤ是一种临床医学和法医实践都常见、死亡率高的脑损伤。它既可由某些中枢神经系统和全身性疾病引起，又见于机械性损伤、机械性搴息和某些毒物中毒等暴力性损伤案件。本课题在以往研究的基础上。成功复制大鼠脑缺氧缺血性损伤模型，应用生物化学、免疫组织化学和电镜观察技术，以ＭＤＡ含量、ｃ—ｆｏｓ蛋白表达和细胞凋亡为主要指标。并对比研究了姜黄素对实验大鼠ＨＩＢＤ的保护作用，探讨其保护作用的机制。
在脑缺血缺氧条件下，神经元产生大量自由基、活性氧（ＲＯＳ），使ＡＴＰ产生迅速减少，钙离子大量积聚触发线粒体损伤而诱导神经元凋亡。姜黄素是姜黄发挥药理作用的主要活性成分。具有广泛的药理性质，如抗氧化、清除自由基、抗炎等作用。姜黄素抗ＨＩＢＤ的作用。首先表现在其可抑制缺氧缺血大鼠脑
ＪｏｕｍａｌｏｆＦｏｒｅｎｓｉｃＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ２００９，Ｖ０１．２５，Ｎｏ．１
组织ＭＤＡ和亚硝酸盐的产生，有效清除超氧化物【３】。有研究表明姜黄素对脑梗死患者氧化损害具有保护作用１４】。本实验中姜黄素组ＭＤＡ含量比缺氧缺血组相比明显减少（Ｐ＜０．０５），这与姜黄素的抗氧化能力相符。
ｃ—ｆｏｓ基因是外界刺激引发细胞迅速作出反应的一种即早基因（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ—ｅａｒｌｙｇｅｎｅ，ＩＥＧ）。正常情况下在神经元表达极低，ＨＩＢＤ可诱导ｃ—ｆｏｓ基因及相关产物的短暂快速表达。目前认为缺氧缺血后ｃ—ｆｏｓ的表达对神经元具有保护作用【５Ｉ．也有研究证明在脑缺血时，ｃ—ｆｏｓ的表达可延迟及抑制凋亡【唰。本实验免疫组化结果显示姜黄素组较其他组的ｃ－ｆｏｓ蛋白含量高（尸＜Ｏ．０５），且电镜显示姜黄素组神经元损伤较轻，缺氧缺ｆｆＩＬ组的神经元出现凋亡特征。该结果进一步说明姜黄素可能是通过抑制神经元的凋亡机制来减少缺氧缺ｆｌＩＬ引起的神经元损伤。
根据本研究结果结合文献．我们认为ｃ—ｆｏｓ的表达可能在ＨＩＢＤ中起重要作用，姜黄素可通过上调ｃ—ｆｏｓ的表达抑制脑组织细胞凋亡，从而拮抗ＨＩＢＤ。参考文献：
［１］喻林升，王良兴，徐正褂，等．慢性低０２高ＣＯ：大鼠脑组织的损伤作用及川芎嗪对其影响的研究［Ｊ】．中国应用生理学杂志，２００２，１８（２）：１１４—１１６．
［２］ＲｉｃｅＪＥ３ｒｄ，ＶａｎｎｕｃｃｉＲＣ，ＢｒｉｅｒｌｅｙＪＢ．Ｔｈｅｉｎｎｕｅｎｃｅ０ｆｉｍｍａｔｕｒｉｔｙｏｎｈｙｐｏｘｉｃ—ｉｓｃｈｅｍｉｃｂｒａｉｎｄａｍａｇｅｉｎｔｈｅｒａｔ［Ｊ］．ＡｎｎＮｅｕｒｏｌ，１９８ｌ，９（２）：１３ｌ一１４１．
【３】ＧｈｏｎｅｉｍＡＩ，Ａｂｄｅｌ—ＮａｉｍＡＢ，ＫｈａｌｉｆａＡＥ，以以．Ｐｍ－ｔｅｃｔｉＶｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃｕｒｃｕｍｉｎａｇａｉｎｓｔｉｓｃｈａｅｍｉａ／ｒｅｐｅｄ’ｕｓｉｏｎｉｎｓｕｌｔｉｎｒａｔｆｏｒｅｂｒａｉｎ【Ｊ】．ＰｈａｍａｃｏｌＲｅｓ，２００２，４６（３）：２７３—２７９．
【４】谭华，李作孝，李小红，等．加用姜黄素对脑梗死患者血浆超氧化物歧化酶及丙二醛的影响【Ｊ】．中国中西医结合杂志，２００３，２３（２）：１１０一１１１．
【５】ＷｉⅡｉａｍｓＡＪ，ＬｉｎｇＧ，ＢｅｒｔｉＲ，ｅ￡以．ＴｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅｓｎａｉｌｐｅｐｔｉｄｅＣＧＸ—１００７ｒｅｄｕｃｅｓＤＮＡｄａｍａｇｅａｎｄａｌｔｅｒｓｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃ—ｆｂｓａｎｄｂｃｌ一２ｆ．ｏｌｌｏｗｉｎｇｆｂｃａｌｉｓｃｈｅｍｉｃｂｍｉｎｉｎｊｕｒｙｉｎｒａｔｓ［Ｊ】．ＥｘＰＢｒａｉｎＲｅｓ，２００３，１５３（１）：１６—２６．
【６］ｚｈａｏＬＲ，ｓｐｅｌｌｍａｎＳ，ＫｉｍＪ，以以．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃｆｉ—ｂｍｎｅｃｔｉｎｐｅｐｔｉｄｅｅｘｅｒｔｓｎｅｕｒｏｐｍｔｅｃｔｉｖｅｅｆ亿ｃｔｓ
ｏｎｔｍｎ．ｓｉｅｍｆｏｃａｌｂｒａｉｎｉｓｃｈｅｍｉａｉｎｒａｔｓⅡ】．ＢｒａｉｎＲｅｓ，２００５，１０５４（１）：１—８．
（收稿日期：２００８一１０—２４）
（本文编辑：张建华）万方数据
姜黄素对缺氧缺血性大鼠脑组织中丙二醛和c-fos的影响
作者：郑园园， 喻林升， 张益鹄， 叶光华， 伊吉普， ZHENG Yuan-yuan， YU Lin-sheng，ZHANG Yi-gu， YE Guang-hua， YI Ji-pu
作者单位：温州医学院,法医学系,浙江,温州,325035
刊名：
法医学杂志
英文刊名：JOURNAL OF FORENSIC MEDICINE
年，卷(期)：2009，25(1)
被引用次数：0次
参考文献(6条)
1.喻林升.王良兴.徐正褂慢性低O2高CO2大鼠脑组织的损伤作用及川芎嗪对其影响的研究[期刊论文]-中国应用生理学杂志 2002(02)
2.Rice JE 3rd.Vannucci RC.Brierley JB The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage
in the rat 1981(02)
3.Ghoneim AI.Abdel-Naim AB.Khalifa AE Protective effects of curcumin against ischaemia/reperfusion insult in rat forebrain 2002(03)
4.谭华.李作孝.李小红加用姜黄素对脑梗死患者血浆超氧化物歧化酶及丙二醛的影响[期刊论文]-中国中西医结合杂志 2003(02)
5.Williams AJ.Ling G.Berti R Treatment with the snail peptide CGX-1007 reduces DNA damage and alters gene expression of c-los and bcl-2 following focal ischemic brain injury in rats 2003(01)
6.Zhao LR.Spellman S.Kim J Synthetic fibronectin peptide exerts neuroprotective effects on transient focal brain ischemia in rats 2005(01)
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下载时间：2010年12月13日