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高效液相色谱仪使用说明

高效液相色谱仪使用说明
高效液相色谱仪使用说明

高效液相色谱仪使用说明

1. 型号:LC-10AT 产地日本岛津。

2. 用途:

高效液相色谱法只要求样品能制成溶液, 不受样品挥发性的限制,流动相可选择的范围宽,固定相的种类繁多,因而可以分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。

与试样预处理技术相配合,HPL C 所达到的高分辨率和高灵敏度,使分离和同时测定性质上十分相近的物质成为可能,能够分离复杂相体中的微量成分。随着固定相的发展, 有可能在充分保持生化物质活性的条件下完成其分离。由于HPL C具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用, 流出组分易收集等优点,因而被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域。高效液相色谱仪与结构仪器的联用是一个重要的发展方向。

3. 测定原理

高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相) 内, 由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数, 在两相中作相对运动时, 经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程, 各组分在移动速度上产生较大的差别, 被分离成单个组分依次从柱内流出, 通过检测器时, 样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来。

4. 使用方法

4.1 系统组成:本系统由1个LC-10ATvp溶剂输送泵、Rheodyne 7725i手动进样阀、SPD-10Avp紫外-可见检测器、色谱数据工作站和电脑等组成,另外还包括打印机、不间断电源等辅助设备。

4.2 准备

4.2.1 准备所需的流动相,用合适的0.45μm滤膜过滤,超声波脱气20min。

4.2.2 根据待检样品的需要更换合适的洗脱柱(注意方向)和定量环。

4.2.3 配制样品和标准溶液(也可在平衡系统时配制),用合适的0.45μm滤膜过滤。

3.2.4 检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常,特别注意输液管道内是否有气泡。

4.3 开机:接通电源,依次开启不间断电源、溶剂输送泵、先将机器预热半小时,这时的流动相用85%甲醇溶液(已脱气),而且要时刻注意输液管道内是否有气泡,如有气泡要进行排气。预热半小时后,开启检测器,待检测器自检结束后,打开打印机、电脑显示器、主机,最后打开色谱工作站。

4.4 各种参数设定

4.4.1 波长设定:在检测器显示初始屏幕时,按[func]键,用数字键输入所需波长值,按[Enter]键确认。按[CE]键退出到初始屏幕。

4.4.2 流速设定:在输送泵显示初始屏幕时,按[func]键,用数字键输入所需的流速(柱在线时流速一般不超过1ml/min),按[Enter]键确认。按[CE]键退出。

4.5 更换流动相并排气泡

4.5.1 将输送管道的吸滤器放入装有准备好的流动相的储液瓶(已排气)中;

4.5.2 逆时针转动泵的排液阀180度,打开排液阀;

4.5.3 按泵的[purge]键,pump指示灯亮,泵大约以2ml/min的流速冲洗,3min(可设定)后自动停止;

4.5.4 将排液阀顺时针旋转到底,关闭排液阀。

4.5.5 如管路中仍有气泡,则重复以上操作直至气泡排尽。

4.5.6 如按以上方法不能排尽气泡,从柱入口处拆下连接管,放入废液瓶中,设流速为5ml/min,按[pump]键,冲洗3min后再按[pump]键停泵,重新接上柱并将流速重设为规定值。

4.6 平衡系统

4.6.1 按《大连江申色谱数据工作站操作规程》打开“在线色谱工作站”软件,输入实验信息并设定各项方法参数后,按下“数据收集”页的[查看基线] 按钮。

4.6.2 等度洗脱方式

4.6.2.1 按输送泵的[pump]键,泵启动,pump指示灯亮。用检验方法规定的流动相冲洗系统,一般最少需6倍柱体积的流动相。

4.6.2.2 检查各管路连接处是否漏液,如漏液应予以排除。

4.6.2.3 观察泵控制屏幕上的压力值,压力波动应不超过1MPa。如超过则可初步判断为柱前管路仍有气泡,按3.5操作。

4.6.2.4 观察基线变化。如果冲洗至基线漂移<0.01mV/min,噪声为<0.001mV时,可认为系统已达到平衡状态,可以进样。

4.7 测定步骤

4.7.1计算校正因子

4.7.1.1用编辑∈实验参数编辑实验参数在编辑实验参数时,纪录图谱名要按照校正文件名的格式输入xxxx0101.

4.7.1.2用编辑∈积分定量参数对话框,选择单点外标法

4.7.1.3用编辑∈报告参数对话框编辑好相应的参数,选择校正实验检查框

4.7.1.4用编辑∈校正∈校正实验参数对话框编辑相应的校正参数及方式,校正文件名前缀必须与编辑∈实验参数的文件名前4位一致

4.7.1.5用编辑∈校正编辑定量峰表对话框编辑需要的校正的色谱峰的保留时间、样品名、每点的含量、峰标志及误差,编辑完成后确认,以后∈校正∈计算校正因子命令利用定量峰表进行峰的匹配及计算。

4.7.1.6用∈操作∈数据采集功能进行求校正因子的实验,将标准样品进样,进样前按检测器[zero]键调零,按软件中[零点校正] 按钮校正基线零点,再按一下[查看基线] 按钮使其弹起。

4.7.1.7用∈操作∈峰检测功能对图谱进行峰检测,完成后用∈操作∈校正∈计算校正因子及绘制标准曲线。

4.7.2进样

4.7.2.1 进样前按检测器[zero]键调零,按软件中[零点校正] 按钮校正基线零点,再按一下[查看基线] 按钮使其弹起。用试样溶液清洗注射器,并排除气泡后抽取适量

4.7.2.2进行样品分析,用∈操作∈数据采集对样品进行数据采集,并把编辑∈报告参数把校正文件名填入校正文件名编辑框,然后进测定样。

4.7.2.3用∈操作∈峰检测,对采集的色谱峰进行检测,之后工作站自动装入外标因子文件,计算出含量。

4.7.2.4打印报告

用∈打印∈打印分析报告,打印机输出分析报告。

4.8关机

样品测定结束后,将检测器关机,将输送管道的吸滤器放入装有85%甲醇溶液(已脱气)的储液瓶,进行测定系统清洗,半小时后关机。

5. 注意事项

5.1流动相内有气泡, 关闭泵, 打开泄压阀, 打开purge键, 清洗脱气, 气泡不断从过滤器冒出, 进入流动相, 无论打开purge 键几次,都无法清除不断产生的气泡。

原因过滤器长期沉浸于乙酸铵等缓冲液内, 过滤器内部由于霉菌的生长繁殖,形成菌团,阻塞了过滤器,缓冲液难以流畅地通过过滤器,空气在泵的压力作用下经过滤器进入流动相。

处理过滤器浸泡于5 %硝酸溶液中,超声清洗几分钟即可;亦可将过滤器浸泡于5 %硝酸溶液中12~36 小时, 轻轻震荡几次, 再将过滤器用纯水清洗几次, 打开泄压阀, 打开p urge 键,清洗脱气, 如仍有气泡不断从过滤器冒出, 继续将过滤器浸泡于5 %硝酸溶液中,如没有气泡不断从过滤器中冒出,说明过滤器内部的霉菌菌团已被硝酸破坏, 流动相可以流畅地通过过滤器。打开泄压阀,打开泵,流速调至1. 0~3. 0ml/ min ,纯水冲洗过滤器1 小时左右。即可将过滤器清洗干净。关闭泄压阀,纯甲醇冲洗半小时即可。

5.2 柱压高原因(1) 缓冲液盐分如(乙酸铵等) 沉积于柱内; (2) 样品污染沉积。

处理对于第一种情况先用40~50 ℃的纯水,低速正向冲洗柱子, 待柱压逐渐下降后, 相应提高流速冲洗, 柱压大幅度下降后, 用常温纯水冲洗, 之后用纯甲醇冲洗柱子30 分钟; 对于第二种情况,由样品的沉积引起污染的C18柱,和纯水反向冲洗柱子, 然后换成甲醇冲洗, 接着用甲醇+ 异丙醇(4 + 6) 冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定) , 再用换成甲醇冲洗, 然后用纯水冲洗, 最后甲醇冲洗正向冲洗柱子30 分钟以上。

5.3既无压力指示,又无液体流过

原因(1) 泵密封垫圈磨损; (2) 大量气泡进入泵体。

处理对于第一种情况,更换密封垫圈;对于第二种情况,在泵作用的同时, 用一个50ml 的玻璃针筒在泵的出口处帮助抽出空气。

5.4 压力波动大,流量不稳定.

原因系统中有空气或者单向阀的宝石球和阀座之间夹有异物,使得两者不能密封。

处理工作中注意观察流动相的量, 保证不锈钢滤器沉入储液器瓶底,避免吸入空气,流动相要充分脱气[2 >。如为单向阀和阀座之间夹有异物, 拆下单向阀, 放入盛有丙酮的烧杯用超声波清洗.

5.5 出峰不佳,峰分叉。

原因(1) 色谱柱被污染; (2) 柱头填料塌陷。

处理对于第一种情况, 先用纯水反向冲洗柱子, 然后换成甲醇冲洗, 接着用甲醇+ 异丙醇(4 + 6) 冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定) , 再换成甲醇冲洗, 然后用纯水冲洗,最后甲醇冲洗正向冲洗柱子30 分钟以上。如冲洗后依然出峰不佳,则考虑第二种情况。对于第二种情况,拧开柱头,检查柱填料是否硬结或塌陷。去除硬结部分(污染的填料) ,装入新填料, 滴一滴甲醇, 填料下陷, 再填, 用与柱内径相同的顶端平滑的不锈钢杆压紧, 再填平, 滴甲醇, 再压紧反复几次, 直至装满填平[2 >。柱头用甲醇冲洗干净, 擦净柱外壁的填料, 拧紧柱头,用纯甲醇冲洗30 分钟以上。

5.6峰面积重复性不佳。

原因(1) 进样阀漏液; (2) 加样针不到位。

处理对于第一种情况更换进样阀垫圈; 对于第二种情况保证加样针插到底,注射样品溶液后须快速、平稳地从LOAD 状态转换到INJ EC T 状态,以保证进样量的准确。日常工作中, 液相色谱仪的保养非常重要, 如要注意不要让空气进入输液系统和高压泵中, 储液器内的溶液如长时间未用应清洗储液器并更换溶液, 每次用完色谱仪后缓冲液要用纯水冲洗干净,防止无机盐析出或沉积; 样品的前处理也很重要,任何样品都要尽可能地去除杂质, 完全溶解, 尽量减少对色谱柱的污染, 以延长色谱柱的使用寿命, 同时避免注射过浓的样

品溶液, 以免残留液在进样阀内析出固体引起堵塞; 色谱柱作好标记,用于不同分析目的的色谱柱不要混用等。

安捷伦高效液相色谱仪的规范操作

安捷伦高效液相色谱仪的规范操作 1. 目的:明确安捷伦高效液相色谱仪的规范操作,确保数据的准确性。 2. 范围:适用于安捷伦高效液相色谱仪。 3. 职责:检验人员对此负责。 4.操作规程: 系统组成 本系统由1个溶剂二元输送泵(分主/A泵和副/B泵)、手动进样阀、柱温箱、检测器、化学工作站和电脑等组成。 准备 4.2.1使用前应根据待检样品的检验方法准备所需的流动相,用合适的μm滤膜过滤,超声脱气20min。 4.2.2 根据待检样品的需要更换合适的色谱柱(柱进出口位置应与流动相流向一致)和定量环。 4.2.3 配制样品和标准溶液(也可在平衡系统时配制),用合适的μm滤膜过滤。 4.2.4 检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常 将待测样品按要求前处理,准备HPLC 所需流动相,检查线路是否连接完好,废液瓶是否够用等。 开机: 4.3.1 打开计算机,进入中文Windows XP画面,并运行CAG Bootp Server程序。4.3.2 打开1200 LC 各模块电源。 4.3.3 待各模块自检完成后,双击[Instrument 1 Online]图标,化学工作站自动与1200LC 通讯,进入的工作站画面如下所示。 4.3.4 从[视图]菜单中选择[方法和运行控制]画面, 点击[视图]菜单中的[显示顶部工具栏],[ 显示状态工具栏],[系统视图],[样品视图],使其命令前有[√]标志,来调用所需的界面。 4.3.5 把流动相放入溶剂瓶中。

4.3.6 打开冲洗阀。 4.3.7 点击[泵]图标,点击[设置泵…]选项,进入泵编辑画面。 4.3.8 设流速:5ml/min,点击[确定]。 4.3.9 点击[泵] 图标,点击[控制…]选项,选中[启动],点击[确定] ,则系统开始冲洗,直到管线内(由溶剂瓶到泵入口)无气泡为止,切换通道继续冲洗,直到所有要用通道无气泡为止。 4.3.10 点击[泵] 图标,点击[控制…]选项,选中[关闭],点击[确定]关泵,关闭冲洗阀。 4.3.11 点击[泵]图标,点击[设置泵…选项],设流速:min。 4.3.12 点击泵下面的瓶图标,如下图所示(以单元泵为例),输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积,点击[确定]。 数据采集方法编辑 4.4.1开始编辑完整方法:从[方法]菜单中选择[编辑完整方法…] 项,如下图所示选中除[数据分析]外的三项,点击[确定],进入下一画面。 4.4.2方法信息 4.4.2.1在[方法注释]中加入方法的信息(如:测试方法)。 4.4.2.2 点击[确定],进入下一画面。 4.4.3 泵参数设定 4.4.3.1 在[流速]处输入流量,如1ml/min,在[溶剂B]处输入,(A=100-B) ,也可[插入]一行[时间表] ,编辑梯度。在[压力限]处输入柱子的最大耐高压,以保护柱子。 4.4.3.2 点击[确定],进入下一画面。 4.4.4 柱温箱参数设定 4.4.4.1 在[温度]下面的空白方框内输入所需温度,如:40度。并选中它,点击[更多>>] 键,如图所示,选中[与左侧相同],使柱温箱的温度左右一致。 4.4.4.2 点击[确定],进入下一画面。 4.4.5 检测器参数设定:检测波长:一般选择最大吸收处的波长。样品带宽:一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长:一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区 域。参比带宽:至少要与样品信号的带宽相等,许多情况下用100nm作为缺省

高效液相色谱仪使用注意事项[1]全解

岛津液相色谱仪使用注意事项 1.流动相必须用HPLC级的试剂,使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。 2.流动相过滤后要用超声波脱气,脱气后应该恢复到室温后使用。 3.不能用纯乙腈作为流动相,这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。 4.使用缓冲溶液时,做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时,然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上,以充分洗去离子。对于柱塞杆外部,做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。 5.长时间不用仪器,应该将柱子取下用堵头封好保存,注意不能用纯水保存柱子,而应该用有机相(如甲醇等),因为纯水易长霉。 6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。 7.C18柱绝对不能进蛋白样品,血样、生物样品。 8.堵塞导致压力太大,按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。清洗方法;①以异丙醇作溶剂冲洗:②放在异丙醇中间用超声波清洗;⑧用10%稀硝酸清洗。 9.气泡会致使压力不稳,重现性差,所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。 10.如果进液管内不进液体时,要使用注射器吸液:通常在输液前要进行流动相的清洗。 11.要注意柱子的pH值范围,不得注射强酸强碱的样品,特别是碱性样品。 12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗,然后插入新的流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。 液相色谱柱使用经验谈 色谱柱在使用前,最好进行柱的性能测试,并将结果保存起来,作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意:柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同;另外,在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件),只有这样,测得的结果才有可比性。 1、样品的前处理: a、最好使用流动相溶解样品。 b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。 c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。 流动相的配制 液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的,因此要求流动相具备以下的特点: a、流动相对样品具有一定的溶解能力,保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。 b、流动相具有一定惰性,与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。

高效液相色谱仪操作步骤

高效液相色谱仪操作步骤: 1).过滤流动相,根据需要选择不同的滤膜(0.45um)。 2).对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。 3).打开HPLC工作站(包括计算机软件和色谱仪),连接好流动相管道,连接检测系统。 4).进入HPLC控制界面主菜单,点击manual,进入手动菜单。 5).有一段时间没用,或者换了新的流动相,需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵,直接在泵的出水口,用针头抽取。冲洗进样阀,需要在manual菜单下,先点击purge,再点击start,冲洗时速度不要超过10 ml/min。 6).调节流量,初次使用新的流动相,可以先试一下压力,流速越大,压力越大,一般不要超过2000。点击injure,选用合适的流速,点击on,走基线,观察基线的情况。 7).设计走样方法。点击file,选取select users and methods,可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法,点击new method。选取需要的配件,包括进样阀,泵,检测器等,根据需要而不同。选完后,点击protocol。一个完整的走样方法需要包括:a.进样前的稳流,一般2-5分钟;b.基线归零;c.进样阀的loading-inject转换;d.走样时间,随不同的样品而不同。 8).进样和进样后操作。选定走样方法,点击start。进样,所有的样品均需过滤。方法走完后,点击postrun,可记录数据和做标记等。全部样品走完后,再用上面的方法走一段基线,洗掉剩余物。 9).关机时,先关计算机,再关液相色谱。 10).填写登记本,由负责人签字。 注意事项: 1).流动相均需色谱纯度,水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。 2).柱子是非常脆弱的,第一次做的方法,先不要让液体过柱子。 3).所有过柱子的液体均需严格的过滤。

Waters_2695_型高效液相色谱仪操作方法

Waters 2695 型高效液相色谱仪操作方法 1 仪器组成及开机 1.1 仪器组成本仪器由Waters 2695 分离单元、2996型二极管阵列检测器、2420蒸发光散射检测器、色谱管理工作站和打印机组成。 2695 分离单元包括四元梯度洗脱的溶剂输送系统,四通道在线真空脱气机(或氦气脱气机),可容纳120 个样品瓶的自动进样系统,柱温箱,内置的柱塞杆密封垫清洗系统,溶剂瓶托盘,液晶显示器,键盘用户界面及软盘驱动器。 1.2 开机依次接通2695 分离单元、检测器、计算机和打印机的电源。接通2695 分离单元后,约20s 仪器开始自检,约1min 后,显示主屏幕,此时继续各部件的初始化,待主屏幕上方标题区出现“Idle ”时,仪器进入待命状态。 2 溶剂管理系统的准备 2.1 流动相脱气确认所有溶剂管路都充满溶剂,按【Menu/Status 】,进入“Status (1 )”屏幕,光标选“Degasser ”,按【Enter 】,显示选项屏幕,光标下移选“Continuous ”,按【Enter 】。 2.2 启动溶剂管理系统 2.2.1 干启动,当溶剂的管路是干的或是需要更换溶剂时,在“Status (1 )”屏幕下,按【Direct Function 】,光标选“Dry Prime ”,按【Enter 】,显示“Dry Prime ”屏幕,按欲启动的溶剂管路的屏幕键,如【OpenA 】,光标选“Duration ”,按数字键输入5min ,按【Continue 】,待限定时间结束后,重复操作,使实验所需的各溶剂管路均启动、排气并充满流动相。 2.2.2 湿启动在“Status (1 )”屏幕下,光标选“Compomtion ”中欲使用的流动相,输入10 0%,按【Direct Function 】,光标选“Wet Prime ”,按【Enter 】,显示“Wet Prime ”屏幕,输入7.5Ml/min 和6min ,按【OK 】,待限定时间结束后,对每种流动相重复操作。 2.2.3 平衡真空脱气机在“Status (1 )”屏幕下,光标选“Composition ”,输入流动相的组成,按【Enter 】再用光标选“Degasser ”中的“Normal ”,按【Enter 】,按【Direct Function 】,光标选“Wet Prime ”,输入0.000mL/min 和10min. ,按【OK 】。待限定时间结束后,按【Abort Prime 】。 3 样品管理系统的准备 3.1 冲洗自动进样器在“Status (1 )”屏幕下,光标选“Composition ”,输入流动相的组成。按【Direct Function 】,光标选“PurgeInjector ”,按【Enter 】,显示“Purge Injector ”屏幕,输入“Sample Loop Volumes 6.0 ”,光标下移“Compression Check ”,按任意数字键,按【OK 】。 3.2 冲洗进样针在主屏幕下,按【Diag 】,显示“Diagnositcs ”屏幕,按【Prime Ndl Wash 】,显示“Prime Needle Wash ”屏幕,按【Start 】,30s 内应见溶剂从废液排放口流出。按【Close】、【Exit 】。 3.3 冲洗柱塞杆密封垫在主屏幕下,按【Diag 】,显示“Diagnosities ”屏幕,按Prime Seal Wash ,显示“Prime Seal Wash ”屏幕,按【Start 】,待排放口有水流出,按【Halt 】、【Close】、【Exit 】。 3.4 装入样品与转盘将样品瓶插到样品盘合适的位置,打开样品仓门,显示“Door is Open ”屏幕,装入样品盘,按【Next 】,直至所有样品盘装毕,关仓门。 4 编辑分析方法及执行样品分析表 在主屏幕下,按【Develop Methods 】,显示“Methods ”屏幕。 4.1 编辑分析方法 4.1.1 建立新的分离方法在“Method ”屏幕下,按【New 】、【Separation Methods 】,输入方法名,按【Enter 】,显示分离方法屏幕,该屏幕共有6 页,通过按【Next 】或【Prev 】切换。如需设定梯度,在第( 1 )页按【Gradient 】,输入后按【Exit 】;如需设定色谱柱的温度,在第( 4 )页输入后按【Exit 】;在第(6 )页设定检测器的种类,光标选“Absorbance Detector ”,按【Enter 】,光标选“48 6﹨2487 ”,按Abs (1 )图标,设定检测波长,按【OK 】、【Exit 】、【Save 】。 4.1.2 编辑已建立的分离方法在“Methods ”屏幕下,光标选欲编辑﹨修改的分离方法的图标,按【Edit 】,编辑\ 改各种分析参数,按【Exit 】、【Save 】。 4.2 编辑执行样品分析表 4.2.1 建立新的样品组在“Methods ”屏幕下,按【New 】、【Sample Set 】,输入样品组名,按【Enter 】,显示方法组屏幕,在样品组表中输入待分析样品的信息。在“Vial ”中输入样品放置的位

高效液相色谱仪HPCL使用中常见故障及解决方法

高效液相色谱仪HPCL使用中常见故障及解决方法 1 高效液相色谱仪系统 液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统组成。对于整个系统而言,柱子、泵和检测器是核心部件同时也是易出问题的主要部位。 2 常见问题及解决方法 高效液相作为一种高精密仪器,如果在使用过程中不按照正确操作的话,就容易导致一些问题。其中最常见的就是柱压问题、漂移问题、峰型异常问题。 2.1 柱压问题柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方,柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在50PSI( 3.3 Bar)之间(在使用梯度洗脱时,柱压平稳缓慢的变化是允许的)。压力过高、过低都属于柱压问题。 2.1.1 压力过高这是高效液相在使用中最常见的问题,指的是压力突然升高,一般都是由于流路中有堵塞的原因。此时,我们应该分段进行检查。 (1).首先断开真空泵的入口处,此时PEEK管里充满液体,使PEEK管低于溶剂瓶,看液体是否自由滴下,如果液体不滴或缓慢滴下,则是溶剂过滤头堵塞。处理方法:用30%的硝酸浸泡半个小时,在用超纯水冲洗干净。如果液体自由滴下,溶剂过滤头正常,在检查;

(2).打开Purge阀,使流动相不经过柱子,如果压力没有明显下降,则是过滤白头堵塞。处理方法:将过滤白头取出,用10%的异丙醇超声半个小时。如果压力降至100PSI (6.7 Bar)以下,过滤白头正常,在检查; (3).把色谱柱出口端取下,如果压力不下降,则是柱子堵塞。处理方法:如果是缓冲盐堵塞,则用95%的水冲至压力正常。如果是一些强保留的物质导致堵塞,则要用比现在流动相更强的流动相冲至压力正常。假如按上面的方法长时间冲洗压力都不下降,则可考虑将柱子的进出口反过来接在仪器上,用流动相冲洗柱子。这时,如果柱压仍不下降,只有换柱子入口筛板,但一旦操作不甚,很容易造成柱效下降,所以尽量少用。 2.1.1 压力过低压力过低的现象一般是由于系统泄漏,处理方法:寻找各个接口处,特别是色谱柱两端的接口,把泄漏的地方旋紧即可。当然还有一个原因就是泵里进了空气,但此时表现的往往是压力不稳,忽高忽低,更严重一点会导致泵无法吸上液体。处理方法:打开Purge阀,用3~5ml/min的流速冲洗,如果不行,则要用专用针筒在排空阀处借住外力将气泡吸出。 2.2.漂移问题主要包括基线漂移和保留时间漂移。 2.2.1基线漂移一般说来,机器刚起动时,基线容易漂移,大概要半个小时的平衡时间,如果你用了缓冲溶液或缓冲盐,还有就是在低波长下(220nm)平衡时间相对会比较长,但如果你在实验过程中发现基线漂移,则你要考虑下面的原因:

高效液相色谱仪操作三要点

高效液相色谱仪操作三要点 高效液相色谱仪(HPLC)现已成为有机化学分析的重要手段之一。同样,在食品分析中,无论是残留分析还是成分分析,HPLC 也已成为不可或缺的分析仪器。和其它分析仪器一样,你若想让HPLC 很好地为你工作、得到可靠的数据,首先你要保养好它,使它处于一个良好的待机状态,这样你操作它进行分析时就可以比较顺利地获得理想的结果。而且良好规范的操作习惯可以延长仪器使用寿命。大家在学校或接受仪器公司培训的时候,老师或工程师会提出很多的操作注意事项。但要是总结归纳一下,最重要的有三点:脱气、过滤和冲洗。本文围绕这三点进行讨论,给新从事HPLC 分析的工作者一点操作建议,希望能对正确的操作仪器有一点帮助。更欢迎有经验的专家介绍使用经验,提出好建议。 一、脱气 流动相脱气对于避免HPLC 系统出问题,顺利得到一个理想的数据是一个很有效的措施。HPLC 系统内是不希望有气泡存在的。HPLC 泵在输送液体时要产生很大的力量,由于气体的压缩比与液体相比大的多,因而当气泡存在时,你将观察到瞬间的流速降低和系统压力下降。如果这个气泡足够大,液相泵将不能输送任何溶剂,而且如果压力低于预先设定的压力低限,泵将停止工作。有些泵设计可以很好地排除气泡,而也有一些泵设计当气泡存在时将停止运转。当一个气泡通过输液泵时,由于系统压力大,气泡通常会溶解在流动相溶液中,随流动相通过柱子。但是到达检测器流通池时系统压力又恢复到了大气压,因而气泡可能在检测器流通池中又显现,在色谱图上会出现不规律的毛刺。为解决这个问题,有些仪器公司设计一个反压控制器,这样可以在检测器出口提供足够的压力保持气泡始终溶解在流动相中直到它们流出检测器。当然,这个压力不能超过流通池所能承受的压力极限,否则可能损坏检测器。紫外/可见光(UV/VIS)检测器的液相色谱图中的噪音毛刺通常是气泡进入并通过流通池的征兆。有些检测器对空气的存在也非常敏感,但表现出的征兆与UV/VIS 不同,例如有报导说,当使用荧光(FL)检测器时,流动相中溶解氧的存在可能会使一些化合物失去荧光性。此外,对于利用待测物质在电极表面发生氧化还原反应引起电流变化而进行检测的电化学(EC)检测器,对流动相中的溶解氧的存在也非常灵敏。此外,气泡的存在有时还会导致保留时间不重现。所以,必须注意消除流动相中的空气,并且还应避免空气由管路(如PTFE 管)渗透进 流动相中。如果适当地关注在使用之前脱去流动相中溶解进的空气,上述这些问题均能避免,或把影响降至最低。常用的脱气方法有如下几种: 1. 吹氦脱气法。 利用氦气在液体中溶解度比空气低的特性,在0.1MPa 压力下,以约60 mL/min 流速通入流动相储液容器中10~15min,可以很有效地从流动相中排除溶解的空气,能排除接近80%的氧气。采用一个高效分布式喷射流装置,一体积的氦气可从流动相中将等体积的几乎全部气体排除。这意味着1L 氦气通过1L 流动相就可完成排气这个工作。这种脱气方法虽然好,但我们国内氦气价格较高,很少有实验室采用此方法。 2. 加热回流法。 此法的脱气效果较好。在操作时要注意冷凝塔的冷却效率,否则溶剂会丢失,混合流动相的比例会有变化。 3. 抽真空脱气法。 此法可使用真空泵,降压至0.05~0.07MPa 即可除去溶解的气体。但是由于真空脱气会使混合溶剂组成发生变化,从而影响到实验的重现性,因此多用于单溶剂体系的简单分析。4. 超声波脱气法。

waters 2695 高效液相色谱仪操作规程

Waters Alliance 高效液相色谱仪操作规程 一、概述 1.设备使用范围:主要用于样品中食品添加剂、农药残留、兽药残留、毒素、污染物、非法添加物测定。 2.设备主要技术/性能指标: 四元溶剂混合支持等度和梯度应用,具有11个独特的梯度曲线。自动混合持术能够以任何比例混合四种溶剂。先进的溶剂分配功能。串联流路具有无脉冲溶剂分配,无需使用湿润器。在线溶剂脱气和溶剂自动压缩实现准确的流路。集成的密封清洗实现稳定操作,并且所有溶剂类型均符合规格。 检测器包括光电二极管阵列、示差折光检测器。 二、使用要求 1.存放环境温度10~30℃,湿度≤80%,电压220V。 2.流动相和纯水应用微孔滤膜过滤(纯有机相或含一定比例有机相的用有机系的滤膜,水相或缓冲盐的用水系滤膜)。一次制得的纯水或缓冲盐流动相应在连续24小时内使用完,如未使用完也应弃去不用,并重新配制新鲜的流动相。如需使用,应重新过滤。流动相的pH值应在色谱柱填料允许的范围内。该泵带有真空脱气机,可不超声,但要在泵电源开启后,等脱气机停止工作后(约需5分钟)再进行泵的其它操作。 3.流动相禁止使用氯仿、三氯(代)苯、亚甲基氯、四氢呋喃、甲苯等;慎重使用四氯化碳、乙醚、异丙醚、酮、甲基环己胺等,以免造成对柱塞密封圈的腐蚀。 三、操作程序 A:开机步骤 1.打开计算机,进入Windows界面。 2.打开仪器电源,待仪器各部分自检完成。 3.将2695泵密封垫清洗管路、洗针管路以及ABCD管路分别放入适当的溶剂。

4.Prime seal wash:按2695面板Diag键,选择Prime SealWash,清洗泵头,直至 出口管有液滴流出,按Halt,停止Prime,再按close关闭界面。。 5.Prime needle wash:再选择Prime NdlWash,清洗进样针1-2次,直至黄管有液体喷出。Close并Exit,退出Diag界面。 6.Dry Prime:按2695面板Menu/Status键,再按Direct Function键做Dry Prime (注: 此操作仅在管路中没有液体时执行,否则直接进入步骤6)。 7.Wet Prime:按2695面板Menu/Status键,再按Direct Function键做Wet Prime,5mL/min分别冲洗当天实验需要使用的管路各2分钟。 8.Purge Injector:按2695面板Menu/Status键,再按Direct Function键做Purge Injector,灌注注射器一次。 B:新建方法 1.运行Empower3软件,用户名:system,密码:manager。 2.点击“Run Samples”选择存放数据文件的项目“project”和仪器系统,进入样 品采集界面,确认仪器通讯正常。 3.按“edit method set ”按钮,建立方法组,设置仪器方法。 4.在右下方仪器方法下拉菜单中,选取设置好的仪器方法,按“monitor”按钮,观 察基线,待基线平稳,按停止按钮,可准备进样。 C:样品分析 1.将样品放入2695样品盘中,记录每一个样品对应的位置号。 2.Empower软件中,先单进样一次,若条件合适,确定运行时间。 3.在“samples”状态编辑样品表,开始自动进样。 D:数据处理及打印 1.在Empower3软件中运行“Browse Project ”,在“Channel”表中打开数据,建 立处理方法。 2.用建立好的处理方法处理数据。 3.在“Results”表中选择要打印的结果,选择“Report method ”,打印数据。

高效液相色谱法的标准操作规程

高效液相色谱法的标准操作规程 1 定义及概述: 1.1 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法,其基本方法是将具不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相,用高压输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱,注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后,各成分先后进入检测器,用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理,得到测定结果。由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相,本法具有分离性能高、分析速度快的特点。 1.2 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定,特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反应,方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有:硅胶,用于正相色谱;化学键合固定相,根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱,其中最常用的是十八烷基硅烷(又称ODS)键合硅胶,可用于反相色谱或离子交换色谱;凝胶或玻璃微球等填充剂是有一定孔径的大孔填料,用于排阻色谱。 1.3 高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理组成。检测器最常用的为可变波长紫外检测器或紫外—可见检测器。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱,可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2 高效液相色谱仪的使用要求: 2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程”的规定作定期检定,应符合规定。 2.2 仪器各部件应能正常工作,管路为无渗漏连结,流路中无堵塞或漏液,在设定的检测器灵敏度条件下,色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。

高效液相色谱仪的综述

题目:高效液相色谱仪的综述 院 部 生命科学院 学科门类 生物仪器分析 专 业 生物技术一班 学 号 1111431017 姓 名 王伟康 指导教师 陈金武 2014年6月15日 装 订 线

摘要 目前,高效液相色谱(HPLC)法由于对复杂样品中的分析物具有极高的分离效率而成为最有效的分离方法。将具有高灵敏度的化学发光分析法和具有高分离效率的高效液相色谱分离法相结合已引起了国内外分析化学家的极大兴趣。本文简单概述了高效液相色谱化学发光的特点、发展史、检测原理、化学发光反应体系以及发展前景。 关键词:高效液相色谱仪发展历史原理应用 ABSTRACT At present, high performance liquid chromatography (HPLC) and become the most effective method for separating the separation efficiency of the analysis method of complex samples with high. Luminescence analysis method and high performance liquid with high separation efficiency of chemical with high sensitivity of chromatographic separation method has aroused great interest of chemists at home and abroad. This paper briefly introduces the characteristics, chemiluminescence HPLC detection principle, development history, chemiluminescence reaction system and the development prospects. Key words:High performance liquid chromatography;Development history;Principle;Application

U3000高效液相色谱仪操纵制度及封面

安徽省产品质量监督检验检验研究院仪器设备 操作规程 (cg———2016) 设备编号() 仪器名称U3000 液相色谱仪操作规程 编制 审核 批准 2016 年月日

U3000高效液相色谱仪操作规程 一基本原理 U3000高效液相色谱系统由:①输液泵②自动进样器、③色谱柱温箱、④检测器、⑤数据处理系统组成。 使用高效液相色谱时,液体待检测物由流动相带入色谱柱,通过压力在色谱柱中移动,由于试样中各组分在色谱柱内固定相与流动相间分配或吸附特性的差异,不同的物质组分顺序离开色谱柱,经检测器检测得到不同的色谱峰信号,依据组分的保留时间和响应值(峰面积或峰高)进行定性和定量分析。

二操作前准备 1.1流动相的配制: 1.1.1根据所供试品的性质、相关的文献资料、工作经验等按比例配制流动相。 1.1.2根据流动相的性质确定采用有机膜(0.45um)还是水相膜(0.45um)对流动相进行过滤。 1.1.3将过滤后的流动相进行超声脱气10~15分钟。1.2对照品供试品处理: 1.2.1称取或量取适量的对照品或供试品,用适当的溶剂(最好采用流动相或流动相的主成分)进行充分溶解(也可借助超声波进行超声溶解),使其浓度为 0.1~1mg/mL(根据检测结果再适当调节溶液的浓度)。 1.2.2根据对照品或供试品的性质确定采用有机针头滤膜(0.45um)还是水相针头滤膜(0.45um)进行过滤。 1.3色谱柱的选择:根据样品的性质选择适当的色谱柱。 三操作顺序 1.开机

2.1打开UPS(不间断电源)电源,打开仪器接线板电源开关; 2.2打开电脑显示器电源,打开电脑主机电源(POWER),启动电脑; 2.3依次打开泵、自动进样器、柱温箱、检测器的电源; 2.4双击屏幕右下角“服务管理器”快捷图标,出现对话界面后点击“启动仪器控制器”启动,等显示“本地仪器控制器运行空闲”,可以关闭界面。 2.5双击在桌面上的Chromeleon 7图标(工作站主程序)。 2.6在左下方点击仪器,则在右边会自动显示该仪器控制面板。 2.7旋开泵上的排液阀(两圈以上);设置A通道为100%,点击“冲洗”,然后再出现的对话框中点击“忽略并执行”;(默认冲洗5分钟);然后分别“冲洗”流路中其他通道气泡;排完气泡后关闭排液阀; 2.8设置流动相的比例及流速后,点击“马达”。此时泵自动会以设置的流速进行运行。

高效液相色谱仪检定规程

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LC-10AD型高效液相色谱仪检定规程 1.适用范围 适用于岛津LC-10AD型高效液相色谱仪的检定。 2.职责 检验员:严格按照检定规程进行周期检定。 QC主管:监督检查检定规程执行情况。 3.检定项目和技术要求 3.1.输液系统 3.1.1.泵流量设定值误差:Ss<±2%;流量稳定性误差:<±2% 3.1.2.定性测量重复性误差(5次定量管进样):RSD≤1.5% 3.1.3.定量测量重复性误差(5次定量管进样):RSD≤1.5% 3.2.紫外检测器性能 3.2.1.可调波长紫外—可见光检测器波长示值误差:<±2nm;重复性误差:<±1nm 3.2.2.基线漂移:≤5×10-3(AU/h);基线噪声:≤5×10-4(AU) 3.2.3.最小检定浓度(静态):4×10-8g/ml(萘的甲醇溶液) 4.检定条件 4.1.环境温度为10~30℃,8小时内温度波动不超过±3℃,相对湿度低于65%。 4.2.电源电压:220±22V,电源频率:50±0.5Hz。 4.3.检定设备 4.3.1.秒表:分度值小于0.1s。 4.3.2.分析天平:最大称量200g,最小分度值0.1mg。 4.3.3.容量瓶 4.3.4.微量注射器 4.3. 5.标准物质和试剂 5.检定方法

5.1.泵流量设定值误差Ss、流量稳定性误差S R的检定。 将仪器的输液系统、进样器、色谱柱和检测器联接好,以甲醇为液动相,按表1设定流量,待流速稳定后,在流动相排出口用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相,同时用秒表计时,准确地收集10~25分钟,称重,按下式计算Ss和S R。 Ss=(Fm—Fs)/Fs×100% S R=(Fmax—Fmin)/F×100% 式中Ss为流量设定值误差(%); Fm=(W2—W1)ρt·t为流量实测值; W2:容量瓶+流动相的重量(g); W1:容量瓶的重量(g); Fs:流量设定值(ml/min); ρt:实验温度下流动相的密度(g/cm3); t:收集流动相的时间(min); S R:流量稳定性误差(%); Fmax:同一组测量中流量最大值(ml/min); Fmin:同一组测量中流量最小值(ml/min); F:同一组测量中的算术平均值(ml/min)。 5.2.定性、定量测量重复性的检定 将仪器联接好,使之处于正常工作状态,用进样阀的定量管注入适当的标准溶液(萘或联苯)或稳定的待分析样品溶液,记录保留时间和峰面积,连续测量5次,按下式计算相对标准偏差RSD。 RSD= [Σ(Xi—X)2]/(n—1)×1/X×100% 式中,RSD为定性、定量重复性的相对标准偏差; Xi为第i次测得的保留时间或峰面积;

高效液相色谱仪的操作步骤及注意事项

高效液相色谱仪的操作步骤及注意事项 一、操作步骤: 1.开机前先将流动相过滤和超声:水流动相用混合滤膜(0.2μm)过滤,有机流动相用有机滤膜过滤,之后超声脱气15-20分钟。(过滤的目的是除去流动相里的杂质,以免杂质进入色谱柱堵塞色谱柱;超声的目的是排除流动相里面的气体,以防气体进入色谱柱损害色谱柱,影响柱效能) 注:试验过程中由于只有0.45μm的混合滤膜,第一次使用时感觉效果不好,于是过滤水时同时使用两张混合滤膜过滤水流动相。 2.超声结束后,将流动相放置到规定位置(1号泵接水流动相,2号泵接有机流动相),开机逐个排气(先启动泵,排气结束后再打开检测器)。 3.排气结束后,关闭所有排气阀。先用纯有机流动相冲洗色谱柱20-30分钟,基线走稳之后,再打开水流动相(注意:水流动相和有机流动相流速之和为1ml/min),继续走基线,直到基线平稳。 注意:实验结束后,再用纯有机流动相冲洗色谱柱20-30分钟,冲出色谱柱内残留的样品物质,预防长时间不使用仪器样品的残留物质沉积在色谱柱内,导致下次使用难以冲出,色谱柱柱压偏高,基线不稳,出现大量鬼峰。(不同规格的色谱柱其所允许的最大流速之和不同) 4.走基线时,应将进样阀处于Load状态,用注射器进样时应快速进样,进样后将进样阀立即扳回到Inject状态,此时液相系统开始进入采样状态。采样结束后,可在数据分析里面查看分析结果并可进行编辑,也可以在脱机状态下查看样品的分析结果并编辑。 二、使用中常见的问题及注意事项 1.过滤时有时会出现流动相漏液。可能的原因是滤膜放置不正确(有点偏)和接头有点错位,导致流动相从缝隙中漏出。 注意:操作时,应先向滤瓶内倒入少量流动相,观察是否漏液并开始过滤,若未漏液,再向滤瓶中添加流动相。 2.超声时,瓶外液体的液面应高于瓶内流动相的液面,否则流动相内的气体可能无法排出液体,气体仍然残留在流动相内,以致开机排气时无气泡排出。

(完整word版)高效液相色谱仪使用说明

高效液相色谱仪使用说明 1. 型号:LC-10AT 产地日本岛津。 2. 用途: 高效液相色谱法只要求样品能制成溶液, 不受样品挥发性的限制,流动相可选择的范围宽,固定相的种类繁多,因而可以分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。 与试样预处理技术相配合,HPL C 所达到的高分辨率和高灵敏度,使分离和同时测定性质上十分相近的物质成为可能,能够分离复杂相体中的微量成分。随着固定相的发展, 有可能在充分保持生化物质活性的条件下完成其分离。由于HPL C具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用, 流出组分易收集等优点,因而被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域。高效液相色谱仪与结构仪器的联用是一个重要的发展方向。 3. 测定原理 高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相) 内, 由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数, 在两相中作相对运动时, 经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程, 各组分在移动速度上产生较大的差别, 被分离成单个组分依次从柱内流出, 通过检测器时, 样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来。 4. 使用方法 4.1 系统组成:本系统由1个LC-10ATvp溶剂输送泵、Rheodyne 7725i手动进样阀、SPD-10Avp紫外-可见检测器、色谱数据工作站和电脑等组成,另外还包括打印机、不间断电源等辅助设备。 4.2 准备 4.2.1 准备所需的流动相,用合适的0.45μm滤膜过滤,超声波脱气20min。 4.2.2 根据待检样品的需要更换合适的洗脱柱(注意方向)和定量环。 4.2.3 配制样品和标准溶液(也可在平衡系统时配制),用合适的0.45μm滤膜过滤。 3.2.4 检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常,特别注意输液管道内是否有气泡。 4.3 开机:接通电源,依次开启不间断电源、溶剂输送泵、先将机器预热半小时,这时的流动相用85%甲醇溶液(已脱气),而且要时刻注意输液管道内是否有气泡,如有气泡要进行排气。预热半小时后,开启检测器,待检测器自检结束后,打开打印机、电脑显示器、主机,最后打开色谱工作站。 4.4 各种参数设定 4.4.1 波长设定:在检测器显示初始屏幕时,按[func]键,用数字键输入所需波长值,按[Enter]键确认。按[CE]键退出到初始屏幕。 4.4.2 流速设定:在输送泵显示初始屏幕时,按[func]键,用数字键输入所需的流速(柱在线时流速一般不超过1ml/min),按[Enter]键确认。按[CE]键退出。 4.5 更换流动相并排气泡 4.5.1 将输送管道的吸滤器放入装有准备好的流动相的储液瓶(已排气)中; 4.5.2 逆时针转动泵的排液阀180度,打开排液阀; 4.5.3 按泵的[purge]键,pump指示灯亮,泵大约以2ml/min的流速冲洗,3min(可设定)后自动停止;

高效液相色谱使用方法

面。 8、设Flow:5ml/min,单击OK。 9、单击Pump图标,出现参数设定菜单,单击Pumpcontrol选项,选中On,单击OK,则系统开始Purge,直到管线内(由溶剂瓶到泵入口)无气泡为止,切换通道继续Purge,直到所有要用通道无气泡为止。 10、单击Pump图标,出现参数设定菜单,单击PumpControl选项,选中Off,单击Ok关泵,关闭 Purgevalve。 11、单击Pump图标,出现参数设定菜单,单击Setuppump选项,进入Pump编辑画面,设Flow:1.0ml/min。 12、单击泵下面的瓶图标,如图所示(以二元泵为例),输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积。单击Ok。 (二)数据采集方法编辑: 1、开始编辑完整方法: 从“Method”菜单中选择“Editentiremethod”项,如上图所示选中 除“Dataanalysis”外的三项,单击Ok,进入下一画面。 2、方法信息: 在“MethodComments”中加入方法的信息(如:方法的用途等)。 单击Ok进入下一画面。

3、泵参数设定:(以二元泵为例) 在“Flow”处输入流量,如1ml/min,在“SolventB”处输入70.0,(A=100-B),也可Insert一行”Timetable”,编辑梯度。在“PressureLimitsMax”处输入柱子的最大耐高压,以保护柱子。 单击Ok进入下一画面。 4、自动进样器参数设定: 选择合适的进样方式,如图所示,进样体积1.0ul,洗瓶位置为6 号。“StandardInjection”----只能输入进样体积,此方式无洗针功 能。“InjectionwithNeedleWash”----可以输入进样体积和洗瓶位置,此方式针从样品瓶抽完样品后,会在洗瓶中洗针。“Useinjectorprogram”---可以点击Edit键进行进样程序编辑。 点击Ok进入下一画面。 5、柱温箱参数设定: ●在”Temperature”下面的方框内输入所需温度,并选中它,点击”more>>”键,如图所示,选中”Sameasleft”---使柱温箱的温度左右一致。 ●点击ok进入下一画面。 6、VWD检测器参数设定: ●在”Wavelength”下方的空白处输入所需的检测波长,如254nm, 在”Peakwidth(Responsetime)”下方点击下拉式三角框,选择合适的响应时间,如 >0.1min(2s)。

(完整)高效液相色谱仪的结构

四、高效液相色谱仪的结构 高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统等五大部分组成(图3-1-2)。分析前,选择适当的色谱柱和流动相,开泵,冲洗柱子,待柱子达到平衡而且基线平直后,用微量注射器把样品注入进样口,流动相把试样带入色谱柱进行分离,分离后的组分依次流入检测器的流通池,最后和洗脱液一起排入流出物收集器。当有样品组分流过流通池时,检测器把组分浓度转变成电信号,经过放大,用记录器记录下来就得到色谱图。色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。 图3-1-2 高效液相色谱仪的结构示意图 1.高压输液系统 高压输液系统由溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置和压力表等组成。 (1) 溶剂贮存器。溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成,容量为1~2L,用来贮存足够数量、符合要求的流动相。 (2) 高压输液泵。高压输液泵(图3-1-3)是高效液相色谱仪中关键部件之一,其功能是将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统,使样品在色谱柱中完成分离过程。 由于液相色谱仪所用色谱柱径较细,所填固定相粒度很小,因此,对流动相的阻力较大,为了使流动相能较快地流过色谱柱,就需要高压泵注入流动相。对泵的要求:输出压力高、流量范围大、流量恒定、无脉动,流量精度和重复性为0.5%左右。此外,还应耐腐蚀,密封性好。高压输液泵,按其性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。恒流泵是能给出恒定流量的泵,其流量与流动相粘度和柱渗透无关。恒压泵是保持输出压力恒定,而流量随外界阻力变化而变化,如果系统阻力不发生变化,恒压泵就能提供恒定的流量。

图3-1-3 恒流柱塞泵 (3) 梯度洗脱装置。梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例,从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化,达到提高分离效果,缩短分析时间的目的。梯度洗脱装置分为两类: 一类是外梯度装置(又称低压梯度),流动相在常温常压下混合,用高压泵压至柱系统,仅需一台泵即可。 另一类是内梯度装置(又称高压梯度),将两种溶剂分别用泵增压后,按电器部件设置的程序,注入梯度混合室混合,再输至柱系统。 梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度,来调整混合样品中各组分的k值,使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温,所不同的是,在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的,而不是借改变温度(温度程序)来达到。 2.进样系统 进样系统包括进样口、注射器和进样阀等,它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。六通进样阀是最理想的进样器,其结构如图3-1-4。 图3-1-4 六通进样阀装置 3.分离系统 分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成,如图3-1-5。其内径为2 ~ 6mm,柱长为10 ~50cm,柱形多为直形,内部充满微粒固定相,柱温一般为室温或接近室温。 图3-1-5 常见色谱柱外形

最新高效液相色谱使用方法

最新高效液相色谱使用方法 一、流动相准备 将流动相按比例混合,注意混合的流动相必须相互溶解,最好能将流动相混合在一起,若相互溶解性不好,可分成两种。流动相配好后,将管路放入,注意不要将瓶口密封。 二、开机 首先将真空泵打开,待泵的指示灯由黄变绿打; 打开600泵开关,按Direct键,进入操作菜单。 三、抽气 抽取管路A液体:先将注射器旋转插入,将旋钮由Run转至 Draw,抽液,完成后将旋钮由Draw至Run,再将注射器旋转取下,反复1-2次,抽至管路内无气泡。 抽取管路B液体:在泵操作菜单上将B设为100%,给0.2ml/min的流速,听到泵转换的声音后,将流速设为0,以抽取管路A的步骤进行抽气。 四、调节流动相比例与流速 在泵操作菜单上设定流动相比例,并以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml/min的速度逐步升高流速,每次间隔3-5分钟。 五、2410示差检测器的使用 1、打开2410示差检测器开关 2、调整检测器内、外温度 3、实验前一天晚上,使用“purge”状态平衡过夜,若第二天还要做实验,结束工作后不关机,节省第二天的平衡时间,保持0.2ml/min的流速。 六、2487紫外检测器的使用 1、打开2487示差检测器开关,机器自动进入自检过程,约需7分钟。 2、设置检测波长 3、预热30分钟左右,即可注样测定。

试验四、番茄内源激素高效液相色谱法测定 一、样品准备 取新鲜番茄根、茎、叶5克左右,液氮冷冻,放入冰箱储存。配80%甲醇,冰箱冷冻。 二、提取 样品放入预冷研钵,加l0ml 80%的冰冻甲醇研磨至匀浆,转入小烧杯中,再用甲醇清洗研钵2次,每次l0ml,转入小烧杯中。小烧杯放入冰箱(0~4℃)冷藏14小时以上。 三、过滤 取出用漏斗滤纸过滤,并用10m180%甲醇清洗残渣,合并滤液;如果提取液中沉淀物或色素多,则用10000g离心l0~12min,上清液转入冻干瓶中。 四、浓缩 将冻干瓶中的液体用减压蒸干机蒸干(至瓶中液体结冰),然后用2m1 80%的甲醇冲洗,如果有浑浊物,再次用离心机12000g离心l0min,倒入带有刻度的试管中,为保证试管中的液体有5ml左右,将不足5ml的试管中再加入一些甲醇。 五、萃取 提取液中加入等量石油醚萃取,用力振荡,待静止分层后,用胶头滴管吸取上层液体弃去,此过程反复进行,直至醚层不再有颜色。 六、过柱纯化 萃取脱色后液体吸入针管,通过C18小柱滤除色素,用1~2m1甲醇清洗小柱一次,若滤出色素,将液体吸回,用新小柱重新滤一次(小柱使用前要用甲醇浸泡,用后再用甲醇反复冲洗,再浸泡)。 七、二次浓缩 液体转入蒸发皿中,60℃蒸干,用lml甲醇洗脱。 八、过滤 0.45um滤膜过滤,滤液收集到小瓶中,冷冻待测定。 九、测定与计算 用标样做标准曲线,分别为10,50,100,200,500mg/ml。进样量为20ul。 测定条件:流速为lml/min,柱温设定为35℃,测定波长为260nm,流动相甲醇:3%乙醇=45:55 计算:通过曲线计算样品中激素浓度。

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