实验四、土壤中放线菌的分离

实验四、土壤中放线菌的分离

一、实验目的

1、从土壤中分离、纯化放线菌;初步掌握药用微生物的分离纯化方法和操作技术。

2、了解不同生境条件中土壤放线菌的种类与数量。

二、实验内容

筛选放线菌永远是新抗生素研究的课题之一。迄今为止，已发现的抗生素约有80%来自于放线菌。土壤中放线菌最丰富，品种齐全。通常情况下，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。随着地理分布、植被及土壤性质的不同，放线菌的种类、数量和拮抗性也各不相同。从堆肥或过热的材料中如干草或蔗渣中可分离到大量的嗜热放线菌，从淡水和海洋环境中可分离到嗜碱性的和嗜酸性的菌种。土壤中含有的放线菌主要是链霉菌，人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌，如小单孢菌、游动放线菌、诺卡氏菌等，它们是生物活性物质重要的产生菌。但往往由于样品中稀有放线菌的数量太少，常规的分离方法很难得到。

对样品进行风干、干热处理、培养基添加重铬酸钾等方法可以减少细菌和真菌的数量，以提高放线菌的获得率。用干热和苯酚处理可减少链霉菌数量和比例的方法，可以分离得到更多种类的放线菌。

土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释法来获得放线菌。

注:从土壤中分出的放线菌要进一步鉴别是否为抗生菌。首先应根据筛选目的确定试验模型，然后利用培养基平板进行拮抗性测定。常用的方法有琼脂块法和滤纸片法。其主要依据是扩散原理，即观察在抗生菌周围是否会出现明显的抑菌圈。抑菌圈的大小和透明度则表明了该菌株抗菌活性的强弱。

三、实验原理、方法和手段

原理一:稀释涂布平板法;如图1。

原理二:对样品进行风干、干热处理以减少细菌和真菌的数量;

原理三:向培养基添加适量的重铬酸钾能抑制其他细菌、真菌的生长，但不影

响放线菌的生长。

图1 稀释涂平板法示意图

四、实验组织运行要求

根据本实验的特点、要求和具体条件，采用“采用集中授课形式，分组试验进行”的组织运行模式。

五、实验条件

试剂与仪器

试剂:可溶性淀粉、KNO、KHPO?3HO、NaCl、FeSO?7HO、MgSO?7HO、琼脂、32424242盐酸、氢氧化钠、pH 试纸、重铬酸钾

仪器:微波炉、电磁炉、干燥箱、50 或100mL 量筒(灭菌)、玻璃涂铲(灭菌)、90mm 培养皿(灭菌)、250ml三角瓶(灭菌)、1 或 2mL 移液管(灭菌)、试管(灭菌)、小玻璃珠(灭菌)、标签纸、洗耳球。

培养基:高氏1号合成培养基:可溶性淀粉20 g，KNO 1.0 g，KHPO?3HO 0.5 g， 3242NaCl 0.5 g，FeSO?7HO 0.01 g，MgSO?7HO 0.5 g，pH:7.2-7.4，琼脂20 g，水1000 mL， 4242

分装，高压湿热灭菌。

培养基制备过程:称取一定量可溶性淀粉，放入装有少量水的小烧杯中，用玻棒将淀粉调成糊状，再加入少于所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。再称取其他各成分依次溶解。对微量成分FeSO?7HO 可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在42

10ml 水中加入0.1g 的FeSO?7HO 配成0.01g/ml 母液，再在1000ml培养基中加入1ml的42

0.01g/ml 的贮备液即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积，调节pH、分装、包扎、湿热灭菌。

土样:从校园各处采样。要求学生到不同生境、不同深度土壤中取样，如:塘泥、森林、苗圃、路边菜园土或林地土，适量、自然风干，待用。

六、实验步骤

土样基本处理:每处理随机取不同土壤约100 g，自然条件下风干，颜色由深变浅后碾碎，过孔径为840 μm(20 目)的土壤筛(或人工挑取较大的石粒或土块)。用无菌的报纸将土样包好(单层)，放到电热鼓风干燥箱中，60?干热处理1h。(教师在课堂讲授前先指导学生完成该步骤的实验)

倒平板:将装有灭好菌的高氏一号培养基的三角瓶直接置于微波炉中加热溶解(视情况定加热时间，注意掌握好加热的时间)、冷却后倒平板，每皿约20 mL。待充分冷却后用于涂布。

称取待测样品10.0 g(盛放于灭菌纸中)，放入装有90 mL 无菌水的250 mL 三角瓶中，

-1-1充分振荡10 min，即配成10 稀释度的土悬液;用移液管量取1mL 稀释度为10 的土壤悬 -2浮液于装有9mL 无菌水的试管中，充分振荡，即配成10 稀释度的土壤悬浮液，按此法依

-3-4次配成10，10 稀释度的悬浮液。

-2-3-4用平板表面成菌落法测定土壤中微生物数量。将配好不同稀释度(10，10，10)的菌悬液，用无菌移液管吸取0.2 mL 土壤悬液接种在不同的稀释度编号的平板上，每个处理重复2 次，用无菌刮铲将菌液在平板上均匀涂开，每个稀释度用一个刮铲，如果从低浓度到高浓度涂布，可不用换刮铲。将涂好的平板置于操作台面上20,30 min，使菌液充分渗透于培养基内，然后将平板倒放，置于28 ?条件下恒温培养至长出菌落开始计数，观察。

每组在每个浓度两个平板分两种处理:一组无需向高氏一号培养基中加入0.5, 重铬酸钾溶液，直接置于微波炉中加热溶解、冷却后倒平板;另一组需向已加热溶解并冷却至60?高氏一号培养基中加入1.5 mL 0.5%重铬酸钾溶液，充分摇匀后倒平板。

七、作业

实验记录

一、土样处理步骤

(将之前得到的土样60?干热处理1h拿到称取待测样品10.0 g) (将土样溶解溶于

-1250 mL 三角瓶中无菌水中，变浑浊，即得10 稀释度的土悬液)

-1(将10稀

-2 -3 -4释度的土悬液稀释成 10、10、10稀释度的土悬液，颜色随浓度降低变浅 ) 二倒平板步骤

倒平板前的实验处理

将装有灭好菌的高氏一号培养基的三角瓶直接置于微波炉中加热溶解

(微波炉中加热溶解)

冷却后倒平板，每皿约20 mL。(准备十二个平板用于分两组处理情况，一组六个每一个浓度四个处理。一组为无重铬酸钾处理一组为添加了重铬酸钾1.5 mL 0.5%)

倒平板步骤 -2-3-4将配好不同稀释度(10，10，10)的菌悬液，用无菌移液管吸取0.2 mL 土壤悬液接种在不同的稀释度编号的平板上，每个处理重复2 次

用无菌刮铲将菌液在平板上均匀涂开，每个稀释度用一个刮铲

(涂布，将不同稀释度的悬浮液涂布到平板上)

将涂好的平板置于操作台面上20,30 min，使菌液充分渗透于培养基内

然后将平板倒放，置于28 ?条件下恒温培养3天至长出菌落开始计数，观察三土壤中(湿重)放线菌的数量及培养的特征描述

-2 (有重铬酸钾10稀释度)

-2 (无重铬酸钾 10)

-3 (有重铬酸钾10稀释度)

-3 稀释度) (无重铬酸钾10

-4 (无重铬酸钾10稀释度)

-4 (有重铬酸钾10稀释度) 分析与描述

1数量

土壤浓度越高的培养基中放线菌的数量越多，其中中等浓度的放线菌长势最好，而且数量大约是随着浓度梯度呈现成倍增加。

2外观与干燥度

放线菌的菌落质地紧密，表面呈紧密的绒状，或者坚实，干燥且不易挑起，或者被挑起后不容易破碎。当孢子丝形成大量孢子布满菌落表面时，使菌落呈现絮状或者颗粒状。 3

无重铬酸钾的培养基中除放线菌以外还有其他类型细菌的菌落，呈现絮状外观为浅黄色的八、注意事项

添加重铬酸钾要适量;

注意涂平板的方法;

3 天和5 天后请记录观察实验结果。

九、结果记录与分析

取平均数

菌液稀释度放线菌个数/(有重铬酸钾) 放线菌个数/(无重铬酸钾) -210 600 350

-310 280 180

-410 10 20

分析1

高氏培养基的配制关键是PH值得调节和重铬酸钾的加入，放线菌最适生长的温度是在23~27都 PH是7.0~7.5.而在同样的条件下也有利于霉菌的生长。在高温条件下，放线菌和霉菌都

不能被完全杀死，仍可以存活，加入重铬酸钾可以抑制霉菌和细菌的生长，而对放线菌不抑

制。

分析2

整个环境要在无菌的条件下进行，培养基以及实验过程使用的刮铲，报纸等等要经过灭菌

处理。接种是在火焰区的无菌范围内操作，且打开培养基的时间要控制好，补课过长。

分析3

稀释倒平板法涂布是要均匀，否则，细菌密度不均将导致菌落生长过于集中，细菌可能无法

充分利用营养成分影响细菌生长，且在鉴别是比较难看到明显的抑菌圈。

分析4

从实验得到的培养基中科院看到，可能存在操作上的小误差，培养基还有轻微的污染，可能

的原因是中倒平板是没有完全在火焰区操作，导致的误差。

Shi li da ma

lao lao shi shi zi ji xie

shi yan bao gao

土壤中放线菌的分离

土壤中放线菌的分离 实验目的：1掌握配制合成培养基的一般方法。 2掌握稀释倒平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 3掌握平板划线法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 4掌握涂布平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 实验材料： 药品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、琼脂。 其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。 实验原理： 高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3 、NaCl 、K2HPO4?3H2O 、MgSO4?7H2O作为无机盐，FeSO4?7H2O作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成。 放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。 实验步骤： 1.高氏一号合成培养基的制备 高氏一号琼脂培养基（培养放线菌用） 可溶性淀粉20g，硝酸钾1g,氯化钠0.5g，K2HPO4 ?3H2O 0.5g，MgSO4?7H2O 0.5g，FeSO4?7H2O 0.01g，琼脂20g，水1000ml，pH7.2～7.4。 配制时，先用冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至1000ml。112℃灭菌20分钟。 2.土壤中放线菌的分离 （1）待测样液的制备 选定取样点（最好是有机质含量高的菜地），按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm 的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等，土样取回后应尽快投入实验。 称土样1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡10～20min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为10-2浓度的菌悬液，静置30s。另取装有9ml无菌水的试管3支，编号10-3、10-4、10-5。用无菌吸管无菌操作取10-2浓度的土壤悬液1ml并加入编号10-3的无菌试管中，并吹吸吸管2~3次，使与9ml水混匀，即为10-3浓度的土壤稀释液。依此类推，直到稀释至10-5的试管中（每个稀释度换1支无菌吸管）。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。（2）稀释倒平板法分离土壤中放线菌 取2支1毫升移液管分别从10-5、10-4菌悬液中吸取1毫升菌悬液，分别注入编号10-5、10-4的培养皿内。将温度为45～50℃的高氏一号培养基倒入上述各培养皿内，轻轻旋转使菌悬液充分混合均匀，凝固后，将培养皿倒扣放置在温暖处（28℃左右），每天观察培养基表面有无微生物菌落。（3）涂布平板法分离土壤中放线菌 取2套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（10-4、10-5）、组别、姓名、操作

土壤中放线菌的分离

土壤中放线菌的分离 实验目的： 1 掌握配制合成培养基的一般方法。 2 掌握稀释倒平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 3 掌握平板划线法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 4 掌握涂布平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 实验材料： 药品：可溶性淀粉、 KNO 3、NaCI、K2HPO 4?3H 2O、MgSO 4?7H 2O、FeSO4?7H2O、琼脂。 其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。 实验原理： 高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO 3 、 NaCI 、 K2HPO 4?3H 2O 、MgSO 4?7H2O 作为无机盐， FeSO4?7H2O 作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成。 放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（1h1）0或加入某种抑制剂（如加数滴 10% 酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。 实验步骤： 1.高氏一号合成培养基的制备

微生物--土壤放线菌的分离与鉴定

土壤放线菌的分离与鉴定实验设计报告 学院：生命科学学院 班级： 2013级生科2班 组长：刘瑜 2013506076 组员：汤界世 2013506070 李宇秀 2013506071 于淑婷 2013506075 陈洁作 2013506079

郑国梁 2013506083 2015年10月15日 一、实验目的 1、了解采集土样的要求和方法。 2、掌握由土壤中分离稀有放线菌的基本原理和操作技术。 3、学习并掌握土壤稀释法和微生物的纯培养技术。 4、学习并掌握抗生菌的鉴别方法。 二、实验原理 土壤是微生物的大本营，其中的放线菌多以链霉菌为主，因此人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌。一般地，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。若以常规方法进行分离，得到的几乎全部是链霉菌。然而，当采用加热处理土样、选用特殊培养基或添加某种抗生素等方法时，均可提高稀有放线菌的获得率。由土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释法，并通过选用特

殊培养基的方法，来获得放线菌。

放线菌菌丝由基内菌丝，气生菌丝和孢子丝组成。其菌丝体在培养基内，即基内菌丝或称营养菌丝体。基内菌丝体一般没有横隔，由于菌丝体长入培养基内和培养基表面，并纠缠在一起形成密集的菌落，所以用接种针将整个菌落培养基挑起而不破裂。基内菌丝体大部分呈黄、橙、蓝、紫、绿、徽，但也有无色在显微镜下观察时，气生菌丝体颜色较深，且较基内菌丝体粗两倍左右。气生菌丝体发育到一定阶段，在它上面形成孢子丝。孢子丝形状有直、波曲、螺旋、轮生之分。螺旋有松、紧、大、小之分，其螺旋的方向也有左旋与右旋之分，大多数种为左旋，少数为右旋。孢子具有不同的形状，有球形、椭球形、杆状、柱状，在光学显微镜下就能看清楚。根据菌体基内菌丝，气生菌丝和孢子丝的这些特征即可判断出分离出的菌体为放线菌。 三、实验材料试剂与仪器设备 1、材料：土壤样品（采集生科院门前草地土壤、16号楼内花圃土壤各500g） 2、试剂：1）培养基（高氏一号培养基）：可溶性淀粉（20.0g）、硝酸钾（1.0g）、磷酸氢二钾（0.5g）、硫酸镁（0.5g）、氯化钠（0.5g）、硫酸亚铁（0.01g）、水1000ml、pH7.2-7.4

最新土壤中放线菌的分离与纯化

土壤中放线菌的分离与纯化 实验目的 1掌握放线菌的生长特性，微生物的培养方法。 2掌握微生物实验的基本生物技术，主要包括无菌操作技术，纯种分离技术，纯种培养技术，以及抗生素检测等。 3掌握合成培养基，选择培养基的制备方法。 4学习对微生物实验的中出现问题的分析，解决方法 实验材料 药品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、琼脂、重铬酸钾 其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。 实验原理 放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中（主要是链霉菌），其数量仅次于细菌。一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒

平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。 放线菌可以产生抗生素，抑制其他菌种的生长，故可用金黄色葡萄球菌（G+）和大肠杆菌（G-）作指示菌鉴别放线菌。 高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3 、NaCl 、K2HPO4?3H2O 、MgSO4?7H2O 作为无机盐，FeSO4?7H2O作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成 1.高氏一号合成培养基的制备 K2HPO4 ?3H2O 0.125g，可溶性淀粉5g，硝酸钾0.25, MgSO4? 7H2O0.125g， FeSO4?7H2O 0.025g，氯化钠0.125g，琼脂5g，水250ml。 配制时，先依次加入上述药品（除琼脂外）顺序溶解，加入无菌水至250ml，调节pH＝7.4，再加入琼脂不断搅拌震荡至溶化后，121℃灭菌20分钟。 将6套平皿、12只试管灭菌。

放线菌

土壤中放线菌的提取与分离 环境科学与工程学院 环工13实验班杨健3130206323 【摘要】:放线菌是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强大的原 核生物。因在固体培养基上呈辐射状生长而得名。大多数有发达的分枝菌丝。菌丝纤细，宽度近于杆状细菌，约0.5～1微米。可分为：营养菌丝，又称基质菌丝，主要功能是吸收营养物质，有的可产生不同的色素，是菌种鉴定的重要依据；气生菌丝，叠生于营养菌丝上，又称二级菌丝。放线菌[1] 是一群革兰氏阳性、含量( >55% ) 的细菌。放线菌因菌落呈放线状而的得名。它是一个原核生物类群，在自然界中分布很广，主要以孢子繁殖，其次是断裂生殖。与一般细菌一样，多为腐生，少数寄生。从土壤中提取放线菌主要用高氏一号培养基进行培养。 【关键词】：原核微生物，高氏一号，革兰氏阳性，孢子等。 【Abstrat】：Actinomycetes is a kind of main assumes the hypha growth and to spore reproductive land was more powerful prokaryotes. Named after the deep in radiating growth on solid medium. Most have developed branch hyphae. Hyphae slender, width to rod-shaped bacteria, about 0.5 ~ 1 micron. Can be divided into: vegetative hyphae, also known as the substrate mycelium, main function is to absorb nutrients, some can produce different colors, is important basis of species identification; Aerial hyphae, fold, was born in the vegetative hyphae, also known as secondary hyphae. Actinomycetes [1] is a group of gram positive bacteria, content (> 55%). Actinomycetes by colony is put a line of its name. It is a prokaryotic organisms, is widely distributed in nature, mainly by spore reproduction, followed by rupture of reproduction. As the common bacteria, and more for saprophytic, a few stray. Extracted from the soil actinomycetes mainly use high's number one medium for culture. 【Key words】: procaryote microbiology, coates, number one gram positive, spores, etc. 引言 放线菌在自然界分布广泛，主要以孢子或菌丝状态存在于土壤、空气和水中，尤其是含水量低、有机物丰富、呈中性或微碱性的土壤中数量最多。放线菌只是形态上的分类，属于细菌界放线菌门。土壤特有的泥腥味，主要是放线菌的代谢产物所致。本次实验所取的放线菌都来自于土壤,用高氏一号培养基进行对土壤放线菌的分离和培养。一、高氏一号合成培养基的制备

实验二_____土壤中放线菌的分离

实验讲义5 土壤中枯草芽孢杆菌分离方法 取土样时最好选取如花坛等地方的土样，去掉表层5~10cm的土壤后取样。 放入100ml三角瓶中，加入30ml水，常压加热至水沸腾后维持20min，取出，置28-37摄氏度培养24-48h，液面则产生黄白色皮膜。 用接种环取皮膜适量于无菌水中分散，稀释涂布于蔗糖豆芽汁琼脂平皿，置28-37摄氏度培养24-48h，挑取典型菌落。 实验6土壤中放线菌的分离（实训） 实验目的：1掌握配制合成培养基的一般方法。 2掌握稀释倒平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 3掌握平板划线法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 4掌握涂布平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 实验材料： 药品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、琼脂。 其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。 实验原理： 高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3 、NaCl 、K2HPO4?3H2O 、MgSO4?7H2O作为无机盐，FeSO4?7H2O作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成。 放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。 实验步骤： 1.高氏一号合成培养基的制备 高氏一号琼脂培养基（培养放线菌用） 可溶性淀粉20g，硝酸钾1g,氯化钠0.5g，K2HPO4 ?3H2O 0.5g，MgSO4?7H2O 0.5g，FeSO4?7H2O 0.01g，琼脂20g，水1000ml，pH7.2～7.4。 配制时，先用冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至1000ml。112℃灭菌20分钟。 2.土壤中放线菌的分离 （1）待测样液的制备 选定取样点（最好是有机质含量高的菜地），按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm 的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等，土样取回后应尽快投入实验。 称土样1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡10～20min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为10-2浓度的菌悬液，静置30s。另取装有9ml无菌水的

土壤中放线菌的分离

土壤中放线菌的分离纯化和染色 实验方案 一、实验目的 1.掌握放线菌的分离纯化及染色的基本流程； 2.掌握高氏一号培养基的配制方法； 3.复习分离纯化放线菌的基本操作技术、培养方法以及接种技术； 4.学会使用高压蒸汽灭菌锅、培养箱、超净工作台、显微镜等实验仪器设备； 5.培养微生物实验的设计思路和动手能力。 二、实验材料 1、实验仪器 培养箱、超净工作台、显微镜、三角锥形瓶、无菌培养皿、接种环、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、分析天平、接种环、载玻片、盖玻片、玻璃珠、移液枪、剪刀等其它常规的实验仪器 2、实验耗材 擦镜纸、吸水纸、标签纸、无菌称量纸、无菌水、蒸馏水 3、实验药品 草酸铵结晶紫、番红、95%酒精、碘液、可溶性淀粉、硝酸钾、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸镁、硫酸亚铁、琼脂、重铬酸钾 4、实验材料 土壤 四、实验步骤 1、土壤取样 在实验前，取学校体育馆附近树木下10~20㎝土壤作为土样。 2、培养基的配制 高氏一号培养基（分离和培养放线菌）：可溶性淀粉 2.0g 硝酸钾0.1g 磷酸氢二钾0.05g 氯化钠0.05g 硫酸镁0.05g 硫酸亚铁0.001g 琼脂2g 水100ml 先把淀粉放在烧杯里，用5毫升水调成糊状后，倒入95毫升水，搅匀后加入其他药品，使它溶解。在烧杯外做好记号，加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。调整pH值到7.2～7.4，分装后灭菌，备用。 3、仪器灭菌 将培养基溶液的三角瓶用报纸包扎好以及玻璃珠、试管、三角锥瓶、载玻片、盖玻片放到高压灭菌锅内进行高温蒸汽灭菌。

4、制备土壤稀释液 （1）称取土样2.00g，在火焰旁加到一个盛有48ml无菌水并装有玻璃珠的100ml锥形瓶中。振荡20-30min，使样品的菌体、芽孢或孢子均匀分散。静止20-30s，标记为编号1。 （2）按照一定的梯度进行稀释（该实验采用10倍梯度） ①取3个各装有9.5ml无菌水的25ml锥形瓶，分别按照顺序标记好2、3、4. ②在超净工作台上，用微量移液器从1号锥形瓶中移取0.5ml土壤悬液加到2号锥形瓶中，摇匀后，再用微量移液器从2号锥形瓶中移取0.5ml土壤悬液加到3号锥形瓶中，依此类推，分别将土壤悬液制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10的土壤稀释液。 5、稀释涂布法分离土壤中放线菌 （1）倒平板 将配制好并且灭菌的高氏一号培养基加热融化，待冷却至55—60℃时，往高氏1号培养基中加入1ml的0.5%重铬酸钾, 然后分别倒平板。方法是在超净工作台，右手持盛培养基的三角烧瓶，置火焰旁边，左手拿平皿并松动瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出。令三角瓶瓶口在火焰上灭菌，左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养液约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待冷凝后即成平板。共制备6个平板（一个稀释度做3个平行样品）。 （3）涂布平板 用1ml无菌吸管分别精确地吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液1ml，对号放入编好号的无菌培养皿中，每一浓度对应两个平板。用无菌涂布棒（从浓度小液开始）将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀，涂完一个平板用酒精灯灭菌。 （4）倒置平板 将培养基平板倒置（防皿盖的冷凝水下滴），置于28度培养箱中培养3d 6、放线菌的纯化 （1）倒平板同上 （2）平板划线 将蘸有菌种的接种环在平板培养基上做以Z字行划线，每划完一次要充分燃烧接种环烧掉残余微生物，再从上一次划线处末点开始下一次划线。划线完毕后盖上培养皿盖，倒置与恒温箱中培养。 7、放线菌的观察 玻璃纸法 （1）将玻璃纸剪成培养皿大小，用旧报纸隔层叠好后灭菌。 （2）将高氏一号琼脂培养基熔化后在火焰旁倒入无菌培养皿内，每皿倒15ml左右，待培养基凝固后，在无菌操作下用镊子将无菌玻璃纸履盖在琼脂平板上即制成玻璃纸琼脂平板培养基。 （3）用接种环挑取纯化后的放线菌，在玻璃纸上划线接种。 （4）将接种的玻璃纸琼脂平板置28—30℃下培养。 （5）在培养至3天，5天，7天时，从温室中取出平皿。在超净工作台上，打开培养皿，用无菌镊子将玻璃纸与培养基分离，用无菌剪刀取小片玻璃纸置于载玻片上用显微镜观察。

放线菌筛选的一般方法定稿版

放线菌筛选的一般方法 HUA system office room 【HUA16H-TTMS2A-HUAS8Q8-HUAH1688】

放线菌筛选的一般方法 摘要：放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中（主要是链霉菌），其数量仅次于细菌。放线菌是革兰氏阳性细菌。因菌落呈放线状而的得名。常以孢子或菌丝状态存在，在自然界中分布很广，主要以孢子繁殖。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。 关键词：放线菌筛选微生物 1 放线菌的情况 放线菌（Actinobacillus）是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强大的原核生物。因在固体培养基上呈辐射状生长而得名。大多数有发达的分枝菌丝。菌丝纤细，宽度近于杆状细菌，约0.5～1微米。可分为：营养菌丝，又称基质菌丝，主要功能是吸收营养物质，有的可产生不同的色素，是菌种鉴定的重要依据；气生菌丝，叠生于营养菌丝上，又称二级菌丝。是一群革兰氏阳性、高(G+C)mol%含量(>55%)的细菌。放线菌因菌落呈放线状而的得名。 放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，广泛应用的抗生素约70%是各种放线菌所产生。一些种类的放线菌还能产生各种酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、和纤维素酶等）、维生素（B12）和有机酸等。弗兰克菌属（Frankia）为非豆科木本植物根瘤中有固氮能力的内共生菌。此外，放线菌还可用于甾体转化、烃类发酵、石油脱蜡和污水处理等方面。少数放线菌也会对人类构成危害，引起人和动植物病害。因此，放线菌与人类关系密切，在医药工业上有重要意义。

实验十二___土壤中产抗生素放线菌的分离纯化

实验十二土壤中产抗生素放线菌的分离纯化 实验目的： 1、从土壤中分离产抗生素的放线菌。 2、抗生素产生菌的抗菌谱测定。 3、掌握微生物的基本操作。 实验原理： 放线菌是一类呈菌丝状生长，主要以孢子繁殖，革兰染色为阳性的单细胞原核微生物，是细菌中的一种特殊类型。放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，目前广泛应用的抗生素约70%是各种放线菌所产生。 许多临床应用的抗生素均由土壤中分离的放线菌产生。微生物大量存在与土壤中，其中包括细菌、放线菌和真菌等，采用选择性培养基可分离土壤中的放线菌。产抗生素的放线菌经液体培养后，其分泌的抗生素存在于离心所得的上清液中，可采用微生物的抑菌试验进行检测，从而筛选到所需的抗生素产生菌。 实验材料： 1、土壤菜园土。 2、实验菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的8h培养物。 3、培养基淀粉琼脂和淀粉液体培养基。 4、其它 10％的酚、牛津杯、灭菌生理盐水、接种环、无菌涂棒、酒精灯、无菌吸管等。 实验方法： 一、土壤中放线菌的分离 1、配制淀粉培养基 配方一淀粉琼脂培养基（高氏培养基） 可溶性淀粉 2克；硝酸钾 0.1克；磷酸氢二钾 0.05克；氯化钠 0.05克；硫酸镁 0.05克；硫酸亚铁 0.001克；琼脂 2克水 100毫升先把淀粉放在烧杯里，用5毫升水调成糊状后，倒入95毫升水，搅匀后加入其他药品，使它溶解。加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。调整pH值到7.2～7.4，分装后灭菌，备用。 配方二面粉琼脂培养基 面粉 60克；琼脂 20克；水 1000毫升 把面粉用水调成糊状，加水到500毫升，放在文火上煮30分钟。另取500毫升水，放入琼脂，加热煮沸到溶解后，把两液调匀，补充水分，调整pH值到7.4，分装，灭菌，备用。 2、土壤悬液梯度稀释 （1）将5.0g土壤加入到50ml灭菌的生理盐水中，震荡10min制备土壤悬液。（2）用无菌吸管吸取1ml土壤悬液，加入到9ml灭菌的生理盐水中10倍稀释。

济宁市土壤放线菌资源调查研究

山东农业科学　2008,4:68～71,90Shandong Agricultural Sciences 收稿日期:2007-10-12;修回日期:2007-12-14基金项目:曲阜师范大学科研启动基金 作者简介:司美茹(1977-),女,汉,硕士,讲师,主要从事土壤微生物研究。E -mail:si m eiru1016@1631com 济宁市土壤放线菌资源调查研究 司美茹,苏　涛,李桂芝 (曲阜师范大学生命科学学院,山东曲阜　273165) 摘　要:从济宁市采集土样,采用高氏1号琼脂和淀粉铵琼脂两种培养基分离放线菌,按国内外通用方法进行鉴定,并对土壤放线菌主要属———链霉菌属的类群进行分析与鉴定。结果表明:同一样品在高氏1号琼脂培养基上分离得到的放线菌要高于淀粉铵培养基上的。放线菌组成中,链霉菌占绝大多数,达放线菌总数的70%以上,其次是小单孢菌属,马杜拉放线菌属和诺卡氏菌属;链霉菌类群的组成较复杂,主要为白孢类群和粉红孢类群。 关键词:放线菌;链霉菌属;土壤;济宁 中图分类号:S154138+3 文献标识号:A 文章编号:1001-4942(2008)04-0068-05 I nvesti gati on on Soil Acti n o mycetes i n Ji n i n g C ity SIMei -ru,S U Tao,L I Gui -zhi (College of L ife Science,Q ufu N or m al U niversity,Q ufu 273165,China ) Abstract Soil sa mp les were collected fr om J ining city 1The actinomycetes were is olated and identified by s p reading the sa mp les on Gao 1agar mediu m and starch tartar agar mediu m 1A t the sa me ti m e,the gr oup s of Strep t omyces were als o identified and analyzed 1The results showed that the is olated nu mber of actinomycetes on Gao 1agar mediu m was larger than that on starch tartar agarmedium 1I n the genus of actinomycetes,Strep 2t o myces accounted f or more than 70%of the t otal ,and the next oneswere M icr omonos pora,Actinos porangir m and Nocardia 1The main gr oup s of strep t omyces were A lbos porus and Roseos porus 1 Key words Actinomycetes;Strep t omyces;Soil;J ining 放线菌能产生抗生素等多种有益代谢产物, 具有很高的经济价值[1,2] 。据知,目前世界上报道的上万种抗生素中,70%以上是放线菌产生的[3] ,且临床上使用的抗生素有三分之一来自放 线菌[4] 。放线菌还可以合成淀粉酶、纤维素酶等代谢产物。此外,放线菌的数量、种类与土壤肥力有着极密切的关系,是土壤肥力高低的标志之一[5～7]。因此,放线菌的研究具有十分重要的科学价值和实用价值。但是,目前国内放线菌区系调查及其资源开发研究的较少。近年来,姜成林 等对云南[8,9]、薛泉宏等对西藏[10～13]和蔡艳等[14] 对青海高原有过详细报道,山东省报道较少。 山东省济宁市,北依泰山,南傍微山湖,暖温带季风性大陆气候,四季明显,降水较为充沛,常年降水量为89412mm ,境内平均太阳辐射量为 503164kJ /k m 2 ,这些自然条件决定了济宁地区独 特的土壤生态环境和该地区土壤放线菌资源的独特性。因此,研究该地区土壤放线菌类群组成及生态分布规律,初步摸清土壤放线菌资源状况,以期为该地区放线菌资源的开发提供依据。 1　材料与方法 111　土壤样品 2005年4月从济宁地区采集土样,取2～20c m 深度的土壤,按覆盖植被类别采5个样品,每 样品采集土样10份,带回实验室风干研磨备用。112　方法11211　放线菌的分离与纯化　采用稀释平板涂抹法纯化[15] ,用高氏1号琼脂培养基培养。分离时,为抑制真菌的生长添加少量重铬酸钾。

实验四、土壤中放线菌的分离

实验四、土壤中放线菌的分离 一、实验目的 1、从土壤中分离、纯化放线菌;初步掌握药用微生物的分离纯化方法和操作技术。 2、了解不同生境条件中土壤放线菌的种类与数量。 二、实验内容 筛选放线菌永远是新抗生素研究的课题之一。迄今为止，已发现的抗生素约有80%来自于放线菌。土壤中放线菌最丰富，品种齐全。通常情况下，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。随着地理分布、植被及土壤性质的不同，放线菌的种类、数量和拮抗性也各不相同。从堆肥或过热的材料中如干草或蔗渣中可分离到大量的嗜热放线菌，从淡水和海洋环境中可分离到嗜碱性的和嗜酸性的菌种。土壤中含有的放线菌主要是链霉菌，人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌，如小单孢菌、游动放线菌、诺卡氏菌等，它们是生物活性物质重要的产生菌。但往往由于样品中稀有放线菌的数量太少，常规的分离方法很难得到。 对样品进行风干、干热处理、培养基添加重铬酸钾等方法可以减少细菌和真菌的数量，以提高放线菌的获得率。用干热和苯酚处理可减少链霉菌数量和比例的方法，可以分离得到更多种类的放线菌。 土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释法来获得放线菌。 注:从土壤中分出的放线菌要进一步鉴别是否为抗生菌。首先应根据筛选目的确定试验模型，然后利用培养基平板进行拮抗性测定。常用的方法有琼脂块法和滤纸片法。其主要依据是扩散原理，即观察在抗生菌周围是否会出现明显的抑菌圈。抑菌圈的大小和透明度则表明了该菌株抗菌活性的强弱。

三、实验原理、方法和手段 原理一:稀释涂布平板法;如图1。 原理二:对样品进行风干、干热处理以减少细菌和真菌的数量; 原理三:向培养基添加适量的重铬酸钾能抑制其他细菌、真菌的生长，但不影 响放线菌的生长。 图1 稀释涂平板法示意图 四、实验组织运行要求 根据本实验的特点、要求和具体条件，采用“采用集中授课形式，分组试验进行”的组织运行模式。 五、实验条件 试剂与仪器 试剂:可溶性淀粉、KNO、KHPO?3HO、NaCl、FeSO?7HO、MgSO?7HO、琼脂、32424242盐酸、氢氧化钠、pH 试纸、重铬酸钾 仪器:微波炉、电磁炉、干燥箱、50 或100mL 量筒(灭菌)、玻璃涂铲(灭菌)、90mm 培养皿(灭菌)、250ml三角瓶(灭菌)、1 或 2mL 移液管(灭菌)、试管(灭菌)、小玻璃珠(灭菌)、标签纸、洗耳球。 培养基:高氏1号合成培养基:可溶性淀粉20 g，KNO 1.0 g，KHPO?3HO 0.5 g， 3242NaCl 0.5 g，FeSO?7HO 0.01 g，MgSO?7HO 0.5 g，pH:7.2-7.4，琼脂20 g，水1000 mL， 4242

土壤中放线菌的采集、分离、培养、发酵及提取实验报告

土壤中放线菌的采集、分离、培养、发酵及提取 实验目的： 1、从土壤中分离产抗生素的放线菌 2、放线菌的培养 3、放线菌的发酵产生活性物质 4、放线菌产生的活性物质提取。 实验原理： 放线菌是一类呈菌丝状生长，主要以孢子繁殖。放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，目前广泛应用的抗生素约80%是各种放线菌所产生的。 许多临床应用的抗生素均由土壤中分离的放线菌产生。采用选择培养基可分离土壤中的放线菌。产抗生素的放线菌经液体培养后，其分泌的抗生素存在于离心所得的上清液中，可采用微生物的抑菌试验进行检测，从而筛选到所需的抗生素产生菌，并对其进一步培养，繁殖，发酵，最终提取我们所需的抗生素。 实验器材： 1、土壤 2、培养基：高氏一号培养基、种子培养基、发酵培养基 3、其他：重铬酸钾、培养皿、牛津杯、接种环、酒精灯，无菌涂棒、三角锥瓶、高压蒸汽灭菌锅、天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、试管、牛皮纸、线绳等。 实验步骤：

一、土壤放线菌株的采集 采集样品：选定取样点（最好是有机质含量高的菜地），按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等。 样品（土壤）处理：室温风干 二、土壤中放线菌的分离、培养 1、配制淀粉培养基 淀粉琼脂培养基（高氏培养基） 可溶性淀粉2g；硝酸钾0.1g；磷酸氢二钾0.05g；氯化钠0.05g；硫酸镁0.05g；硫酸亚铁0.001g；琼脂2g；水100ml. 先把淀粉放在烧杯里，用5ml水调成糊状后，倒入95ml水，搅匀后加入其他药品，使它溶解。加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。调整PH到7.2-7.4，分装后灭菌，备用。 2、土壤悬液梯度稀释 ①将5.0g土壤加入到50ml灭菌的生理盐水中，震荡10min制备土壤悬液。 ②用无菌吸管吸取1ml土壤悬液，加入到9ml灭菌的生理盐水中10倍稀释。 ③按1：:1稀释至10-3、10-4、10-5，将3块灭菌平板分别标记10-3、10-4、10-5 ，稀释过程应在无菌条件下进行。

土壤中提取放线菌

一、实验目的： 1．掌握配置合成培养基的一般方法 2．掌握稀释倒平板法从土壤中分离放线菌的原理与方法 3．掌握放线菌的染色及制片方法 4．了解放线菌的结构特点，并能够加以区分 二、实验原理： （一）、综述： 放线菌在自然界分布广泛，主要以孢子或菌丝状态存在于土壤、空气和水中，尤其是含水量低、有机物丰富、呈中性或微碱性的土壤中数量最多。土壤特有的泥腥味，主要是放线菌的代谢产物所致。 （二）、菌落特征： 放线菌的菌落由菌丝体组成。一般圆形、光平或有许多皱褶，光学显微镜下观察，菌落周围具辐射状菌放线菌丝。总的特征介于霉菌与细菌之间，因种类不同可分为两类：一类是由产生大量分枝和气生菌丝的菌种所形成的菌落。链霉菌的菌落是一类型的代表。链霉菌菌丝较细，生长缓慢，分枝多而且相互缠绕，故形成的菌落质地致密、表面呈较紧密的绒状或坚实、干燥、多皱，菌落较小而不蔓延；营养菌丝长在培养基内，所以菌落与培养基结合较紧，不易挑起或挑起后不易破碎：当气生菌丝尚未分化成孢子丝以前，幼龄菌落与细菌的菌落很相似，光滑或如发状缠结。有时气生菌丝呈同心环状，当孢子丝产生大量孢子并布满整个菌落表面后，才形成絮状、粉状或颗粒状的典型的放线菌菌落；有些种类的孢子含有色素，使菌落有面或背面呈现不同颜色，带有泥腥味。 另一类菌落由不产生大量菌丝体的种类形成，如诺卡氏放线菌的菌落，粘着力差，结构呈粉质状，用针挑起则粉碎。若将放线菌接种于液体培养基内静置培养，能在瓶壁液面处形成斑状或膜状菌落，或沉降于瓶底而不使培养基混浊；如以震荡培养，常形成由短的菌丝体所构成的球状颗粒。 （三）、形态与结构： 1．菌丝（mycelium）：放线菌种类很多，多数放线菌具有发育良好的分支状菌丝体，少数为杆状或原始丝状的简单形态。菌丝大多无隔膜，其粗细与杆状细菌相似，直径为1微米左右。根据菌丝的着生部位、形态和功能的不同，放线菌菌丝可分为基内菌丝、气生菌丝和孢子丝三种。 （1）．基内菌丝(substrate mycelium) ：又称初级菌丝或者营养菌丝.色淡，主要功能是吸收营养物质和排泄代谢产物。可产生黄、蓝、红、绿、褐和紫等水溶色素和脂溶性色素，色素在放线菌的分类和鉴定上有重要的参考价值。放线菌中多数种类的基内菌丝无隔膜，不断裂，如链霉菌属和小单孢菌属等；但有一类放线菌，如诺卡氏菌型放线菌的基内菌丝生长一定时间后形成横隔膜，继而断裂成球状或杆状小体。 （2）．气生菌丝（aerial mycelium）：是基内菌丝长出培养基外并伸向空间的菌丝，又称二级菌丝。在显微镜下观察时，一般气生菌丝颜色较深，比基内菌丝粗，长度相差悬殊，形状直伸或弯曲，可产生色素，多为脂溶性色素。 （3）．孢子丝（spore hypha）：是当气生菌丝发育到一定程度，其顶端分化出的可形成孢子的菌丝，叫孢子丝，又称繁殖菌丝.放线菌孢子丝的形态及其在气生菌丝上的排列方式，随菌种不同而异，是链球菌菌种鉴定的重要依据。孢子丝的形状有直形、波曲、钩状、螺旋状.螺旋状的孢子丝较为常见，其螺旋的松紧、大小、螺数和螺旋方向因菌种而异。孢子丝的着生方式有对生、互生、丛生与轮生等多种。 2．孢子（spore）：孢子丝发育到一定阶段便分化为孢子。在光学显微镜下，孢子呈圆形、椭圆形、杆状、圆柱状、瓜子状、梭状和半月状等，即使是同一孢子丝分化形成的孢子

土壤中放线菌的分离与应用

土壤中放线菌的分离与应用 詹庆，曹雅丽 （台州科技职业学院，浙江台州 318020 ） 放线菌是一类具有发展前景的新微生物资源，放线菌的产物除了常用的抗生素除青霉素和头孢霉素类外，绝大多数都是 它的产物。筛选的放线菌的代谢产物分类方式有很多，但按功能分类，大致可分为抑菌、杀虫、植物生长调节、抗肿瘤活性及其他多种重要的活性类型。本文主要从放线菌的分离，应用两大方面进行研究，从而筛选出优质、纯种、功效强的放线菌 。 放线菌；筛选；分离；应用 化而不断增强，耐药菌也不断出现，这就要求我们需不 断发现新型的抗生素。1.2重寄生作用 放线菌能使菌丝发生形态上的畸变，而菌丝体破裂的部分是重寄生在病原菌营养菌丝体。同时研究发现，具有重寄生能力的还有游动放线菌属的游动孢子，卵菌纲真菌的休眠合子和休眠孢子等。有的抗生素是干扰细菌的细胞壁的合成，有的抗生素是使细菌的细胞膜发生损伤，有的抗生素能阻碍细菌的蛋白质合成，有的抗生素是通过改变细菌内部的代谢，故使得放线菌侵入病原菌细胞进行重寄生作用，从而达到破坏宿主细胞的目的。 1.3酶及抑制剂的降解作用 放线菌可产生降解细胞壁的酶，在该种作用的酶的存在下破坏相应细菌菌体，从而起到细胞破裂或病原菌自身发生质壁分离的作用。这些包括纤维素酶，p-葡糖苷酶，p-1,6-葡聚糖酶，p-1,3-葡聚糖酶等。1.4产纤维素酶放线菌的应用 随着人类社会的发展，生活生产中会生成大量的含纤维素废物，如废纸、稻梗木屑、秸秆等，而这些废物则可用纤维素酶将其水解，重新利用。而这其中，放线菌由于产生的纤维素酶活性最好，从而成为是产纤维素酶的主要生产菌。目前，由于大量的纤维素也存在于畜禽饲料中，所以应用在饲料工业中也十分广泛，除了一些反刍动物，大部分动物没有分解纤维素的能力。动物体内分泌的纤维素酶可以通过分解纤维素，使其转化为易消化的葡萄糖从而被自身吸收。如果将纤维素酶添加到牲畜的饲料中，对其牲畜的生长具有良好的促进作用。 2 放线菌在医药中的应用 放线菌在医药中的应用也十分广泛，但本文重点提到的是放线菌对于抗癌效果的作用。大多数微生物的次级代谢产物在癌症化疗药剂中占有重要位置。放线菌中产生的一种次级代谢产物放线菌素D 是最早用于癌症治疗的抗生素。放线菌素是一些小单孢菌产生的色素肽内酯和许多链霉菌属菌的一种抗生素，具 放线菌是广泛分布于土壤中的优势微生物类群, 其分枝状的菌丝体能够产生各种胞外水解酶，降解土壤中的各种不溶性有机物质，以获得细胞代谢所需的各种营养，对有机物的矿化有着重要作用，从而参与自然界物质循环，净化环境，改良土壤。而现如今，人们对放线菌的应用远不及此，放线菌更多地被应用到医学治疗，减少农产品病虫害等各个领域中。 1 放线菌在农业当中的应用 近年来，随着人们对食品和环境中化学农药安全性的普遍关注，对一些危险性化学农药使用的谈虎色变情况，促使人们寻求其它安全有效的植物病害控制新途径。而近年来微生物发展迅速，让人们去除植物病虫害的途径逐渐从化学农药的使用向微生物方法转变，利用有益微生物防治植物病害。它既可以改善，维持植物自然生态系统，又可通过微生物之间的相互作用达到防病之目的。自20世纪60年代Umezawa 研究微生物产生的酶抑制剂以来，对由微生物产生的非抗生素的生物活性物质研究逐步拓宽，此类物质在控制人类非感染性疾病方面发挥了很大的作用。这些活性物质有70%~80%是由放线菌产生的，这说明放线菌作为药物产生者具有巨大价值。1.1抗生素的使用 放线菌与人类关系极为密切，绝大部分属有益菌，放线菌的产品多种多样，特别突出的是抗生素，对人类健康作出重要贡献。至今已报道通过的近10000种抗生素中，约70%有放线菌产生，如链霉菌、土霉素、多黏霉素、庆大霉素、井冈霉素等。而最早的农用抗生素是链霉菌产生的医用土霉素和链霉素，用于防治某些果树、蔬菜的病害。这些农用抗生素取得了良好的效果，从而引起了农业研究者的广泛关注，故从20世纪50年代起，有不少国家逐渐开始重视研究农用抗生素。之后，农业研究者相继筛选出多氧霉素和有效霉素等既具有良好的防效作用，同时低毒害的新农用抗生素。由于生物在生存进化过程中，抗性能力会随着环境的 变 现代园艺2017年第2期 2 4〇

土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化

土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化 一、实验目的 1. 学习、掌握从土壤稀释分离、划线分离各类微生物的技术。 2. 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。 3. 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。 4. 学习平板菌落计数法。 二、实验原理 将待分离的样品进行一定的稀释，使微生物的细胞（或孢子）尽量呈分散状态，选用有针对性的培养基，在不同温度、通风等条件下培养，让其长成一个纯种单个菌落。 要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表2-1所示。 表2-1 微生物四大类菌的分离和培养要求 样品来源分离对象分离方法稀释度培养基名称培养温度 /℃培养时间/d 土样细菌稀释分离10-5，10-6， 10-7 牛肉膏蛋白胨30～37 1～2 土样放线菌稀释分离10-3，10-4， 10-5 高氏1号28 5～7 土样霉菌稀释分离10-2，10-3， 10-4 马丁氏琼脂28～30 3～5 面肥或土样酵母菌稀释分离10-4，10-5， 10-6 马铃薯葡萄糖28～30 2～3 细菌分离平 板 细菌单菌落划线分离10-2 牛肉膏蛋白胨30～37 1～2 三、实验材料 1. 菌源土样 2. 培养基牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏培养基，高氏合成1号培养基，马铃薯葡萄糖培养基(制平板和斜面)，见附录Ⅲ。 3. 无菌水 250 mL锥形瓶，每瓶装99 mL无菌水(或95mL为分离霉菌用)，内装10粒玻璃珠。 4.5 mL无菌水试管(每人5～7支)。 4. 其他物品无菌培养皿，无菌移液管，无菌玻璃涂棒(刮刀)，称量纸，药勺，橡皮头，10%酚溶液。 （一）系列稀释平板法 1. 取土样 选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等杂物，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。同时取10～15g，称重后经105℃烘干8h，置干燥器中冷却后再次称重，计算含水量。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌种的变化。 2. 制备土壤稀释液