壳聚糖酶的分离提纯及其酶学性质研究
第21卷第5期高校化学工程学报No.5 V ol.21 2007 年10月 Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities Oct. 2007文章编号：1003-9015(2007)05-0814-06
壳聚糖酶的分离提纯及其酶学性质研究
隋斯光, 方文建, 郑连英
(浙江大学化学工程与生物工程学系, 浙江杭州 310027)
摘要：从土壤中筛选获得的高产壳聚糖酶菌株Penicillium sp.ZD-Z1，经发酵、分离提取出两种壳聚糖酶A和酶B，
并对它们分别进行酶学性质测试。分别测定酶A和酶B的等电点、相对分子质量、最适反应温度和pH、不同脱乙酰
度的壳聚糖对酶活的影响。并考察了两种壳聚糖酶的酶解方式，结果表明，酶A为内切酶，酶B为外切酶。
关键词：壳聚糖酶；Penicillium sp.；分离纯化；酶学性质
中图分类号：Q814.1；TQ925.5 文献标识码：A
Purification and Properties of Chitosanase from Penicillium sp. ZD-Z1
SUI Si-guang, FANG Wen-jian, ZHENG Lian-ying
(Department of Chemical and Biochemical Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China)
Abstract:Penicillium sp. ZD-Z1 screened out from the soil was applied to produce chitosanase by submerged fermentation. From the crude broth, two species of chitosanases (Ch A and Ch B) were found and were separated and purified. The isoelectric points and relative molecular weights of the two enzymes found were determined and their most suitable reaction temperatures and pH values were ascertained. The effect of deacetylation degree of the substrate, chitosan, on the enzymatic activities of Ch A and Ch B was investigated too. From the HPLC chromatography of Ch A and Ch B hydrolysis products, it was found that the Ch A is a kind of endo-splitting enzyme, while the Ch B is an exo-splitting one.
Key words: chitosanase; Penicillium sp.; separation and purification; enzymatic property
1前言
壳聚糖作为一种价格低廉、生物相容性好、并且可被生物降解的无毒阳离子聚合物，可以作为基因介导载体转载外源DNA到细胞中去[1~3]。研究结果表明，壳聚糖的相对分子质量能够影响DNA/壳聚糖聚合物的稳定性、细胞吸收的效率，以及在发生细胞吞噬现象之后DNA从聚合物上的解离。壳聚糖的相对分子质量一般有十几万甚至几十万，因此在基因载体研究工作中，制备高纯度的壳低聚糖显得十分重要。在诸多降解壳聚糖的方法中，酶法降解具有条件温和，可以控制降解速率和壳聚糖分子量，不产生二次污染等优点，因此得到越来越广泛的关注。
真菌、细菌、放线菌等微生物在生长代谢过程中，在壳聚糖的诱导下均可以产生壳聚糖酶(EC 3.2.1.132)[4]。大多数壳聚糖酶为内切酶，其降解产物壳寡糖的大量存在对其酶解作用具有一定的抑制作用。从土壤中筛选得到了产壳聚糖酶菌种Penicillium sp.ZD-Z1，经过筛选、诱变、优化后，其产酶能力大大提高，为分离提纯壳聚糖酶，并测试其酶学性质[5]提供了条件。本文对壳聚糖酶的分离、纯化和酶学特性进行了研究。
收稿日期：2005-10-10；修订日期：2006-03-15。
基金项目：浙江省重点科技项目(2005c-22001)，国家自然科重点基金资助项目(50233020)。
作者简介：隋斯光(1980-)，男，辽宁沈阳人，硕士。通讯联系人：郑连英，E-mail：zhengly@https://www.wendangku.net/doc/7f8370988.html,
第21卷第5期隋斯光等：壳聚糖酶的分离提纯及其酶学性质研究815
2材料和方法
2.1试剂和材料
壳聚糖：分子量290 000，脱乙酰度90%；氨基葡萄糖盐酸盐，均为浙江玉环澳兴甲壳素有限公司提供。菌株：Penicillium sp.ZD-Z1，本实验室从土壤中筛选并进行紫外诱变得到，已授权国家发明专利(ZL02159880.0)。发酵培养基：壳聚糖3%，(NH4)2SO4 0.1%，尿素0.1%，KH2PO4 0.06%，MgSO4 0.012%。
AKTA Prime蛋白质纯化系统、阳离子交换预装柱HiPrep 16/10 SP XL、凝胶过滤预装柱HiPrep 16/60 Sephacryl S-100，均为瑞典Amersham公司生产。
2.2 实验方法
2.2.1 粗酶液的制备
以Penicillium sp.ZD-Z1作为出发菌株，经筛选、诱变、优化获得一株高产壳聚糖酶的菌株，在5 L 的发酵罐中发酵70 h。在6000 r?min?1下离心去除悬浮菌体，采用截留分子量为10 000的超滤膜，对发酵液进行超滤收集粗酶液。
2.2.2 有机溶剂沉淀
取粗酶液200 mL，按体积1:3的比例加入冰乙醇，搅拌混匀于4℃静置。离心得沉淀物，加入50 mL 20 mmol?L?1乙酸缓冲液(pH 4.4)溶解得到浓缩粗酶液，备用。
2.2.3 离子交换粗分离
将HiPrep 16/10 SP XL阳离子交换柱，用20 mmol?L?1的乙酸缓冲液(pH 4.4)进行平衡后，取上述有机溶剂沉淀浓缩的酶液上样。用含有1 mol?L?1 NaCl的20 mmol?L?1乙酸缓冲液(pH 4.4)，按线性梯度从0到100%进行洗脱，分别收集洗脱峰。
2.2.4 凝胶过滤
自制Sephadex G50凝胶过滤柱，用20 mmol?L?1的乙酸缓冲液(pH 4.4)平衡，取上述离子交换后得到的壳聚糖酶A溶液上样，进一步纯化壳聚糖酶A。
2.3 分析方法
2.3.1 壳聚糖酶活性测定
采用DNS法[6]。准确量取1 mL壳聚糖酶溶液，加入3 mL 1%壳聚糖溶液，30℃下保温30 min，用NaOH溶液调节pH至8.0，离心去除絮状沉淀。吸取上清液1 mL，用DNS法测定其还原糖含量，计算得到酶活。以每分钟内产生1 μmol还原糖所需要的酶量作为一个酶活单位U。
2.3.2蛋白质含量测定
蛋白质含量测定采用考马斯亮兰法[7]，用牛血清蛋白作标准蛋白。
2.3.3 降解产物测试
采用HPLC的方法检测壳聚糖酶的降解产物，并以氨基葡萄糖盐酸盐作为标准品。根据降解产物的流出时间和标准品进行比较，来判断降解产物中是否含有氨基葡萄糖单体。
3结果和讨论
3.1壳聚糖酶的分离纯化
3.1.1阳离子交换
在进行离子交换之前首先测试目标蛋白的等电点。将有机溶剂沉淀后得到的浓缩粗酶液用Sephacryl S 100凝胶进行凝胶过滤分离，缓冲液为20 mmol?L?1乙酸缓冲液(pH 4.4)，如图1所示，分离得到两个具有壳聚糖酶活性的洗脱峰1和2。
分别收集洗脱峰E1和E2，浓缩处理，进行等电聚焦实验，得到两种壳聚糖酶的等电点分别为5.92和5.21。根据目标蛋白等电点的不同，选择阳离子交换方法分离。取有机溶剂沉淀后得到的浓缩粗酶液
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图5 Sephadex G-50纯化后Ch A 的SDS-PAGE 图谱Fig.5 SDS-PAGE of Ch A purified by Sephadex G-50
Marker Ch A Marker mL
Ch A
Cond UV
mAu
14.0
12.010.08.06.04.02.0图4 Sephadex G-50分离洗脱峰A Fig.4 Ch A purified by Sephadex G-50
20 mmol ?L ?1HAc-NaAc pH4.4+0.15 mol ?L ?1NaCl
306090120
150180
150300450600750
Fraction number 1mL ?tube ?1
图1 Sephacryl S-100凝胶过滤壳聚糖酶活力测试Fig.1 Chitosanase activity of chitosanase purified by
Sephacryl S-100
C h i t o s a n a s e a c t i v i t y / U ?m L ?1
A b s o r b a n c e a t 280 n m
0.0
0.20.40.60.8
1.0
???
? ? ? Fraction number l mL ?tube ?1
图2 壳聚糖酶的阳离子交换色谱
Fig.2 Cation-exchange chromatography of the
crude enzyme
C h i t o s a n a s e a c t i v i t y /U ?m L ?1 N a C l / m m o l ?L
?1 5 mL ，上阳离子交换柱HiPrep 16/60 SP XL 进行分离，流动相选用20 mmol ?L ?1乙酸缓冲液(pH4.4)。梯度洗脱中，每1 mL 收集一管，测定蛋白质浓度以及壳聚糖酶活性，得到的洗脱曲线如图2所示。
从图2中可以看到洗脱得到的两个蛋白质峰均具有壳聚糖酶活性，本研究将洗脱峰A 和B 分别收集。将两个洗脱峰浓缩后，并采用SDS-PAGE 的方法来检测其纯度，结果如图3所示。
由图3中可以看出洗脱峰B 的纯度较高，主要为一种蛋白质；而洗脱峰A 中主要含有两种蛋白或者为同一蛋白的不同亚基。 3.1.2 凝胶过滤
根据离子交换所得洗脱峰A 中两种蛋白相对
分子质量的不同，选用Sephadex G50凝胶对洗脱峰A 进行进一步纯化，结果如图4所示。
收集图4中的洗脱峰A ，浓缩后进行SDS-PAGE 纯度测试，得到结果如图5所示。
由步骤3.1.2节和3.1.1节分别得到纯度较高的壳聚糖酶A(ChA)和壳聚糖酶B(ChB)，进行酶学性质测试。
图3 阳离子交换洗脱峰A 和B 的SDS-PAGE 图谱
Fig.3 SDS-PAGE of Ch A and Ch B purified by cation-exchange
chromatography
第21卷第5期 隋斯光等： 壳聚糖酶的分离提纯及其酶学性质研究 817
50100150
20025030
40
50
60
70 ???
pH
???
图7 不同pH 下Ch A 和Ch B 的活性测试 Fig.7 Ch A and Ch B activity at different pH
C h A / U ?m g ?1
C h B / U ?m g ?1
Temperature / ℃
图8 最适反应温度测试
Fig.8 Ch A and Ch B activity at different temperatures
C h A / U ?m g ?1
C h B / U ?m g ?1
3.1.3 分离纯化效率
在整个壳聚糖酶的分离纯化过程中，各步骤的分离纯化效率如表1。
表1 5 L 发酵液中壳聚糖酶分离纯化收率表
Table 1 Chitosanase purification yield in 5 L fermentation broth
Total activity / U Total protein / mg Specific activity / U ?mg ?1
Purification of multiples Yield / % Crude enzyme 4615 201.57 22.9 1.0 100.0 Ultrafiltration 4130 94.08 43.9 1.9 89.5
Ethanol precipitation 3937 51.20 76.9 3.4 85.3 Ch A 1421 7.65 185.8 8.1 30.8 Ion exchange
Ch B
1034
15.32
67.5
2.9
22.4
从表1中可以得到，两种壳聚糖酶的酶活收率较低，主要是实验中使用的离子交换柱处理量较小、分步收集损失较大、两种壳聚糖酶洗脱峰相互重叠部分没有收集。 3.2 壳聚糖酶的酶学性质测试 3.2.1 相对分子质量测定
采用SDS-PAGE 法，测试两种分离纯化得到的壳聚糖酶A 和B 的相对分子质量。结果如图6所示，得到壳聚糖酶A 和B 的相对分子质量分别为43 000和115 000。 3.2.2 最适反应pH 测试
以乙酸缓冲液调节不同pH 的缓冲体系，并在30℃条件下测试ChA 和ChB 的活性，结果如图7所示。随着pH 的升高，两种酶的活性均逐步上升，其中酶A 的最适反应pH 为5.0，酶B 为5.5。 3.2.3 最适反应温度测定
在不同的反应温度下，对其反应活性进行测定，其中反应体系的pH 为5.0，结果如图8所示。酶A 的最适反应温度为65℃，而酶B 最适反应温度为60℃。
3.2.4 失活曲线测试
取7支3 mL 的酶液，在不同的温度下(45℃、50℃、55℃、60℃和65℃)保温，每间隔20 min 取出一支，测定其在该温度下的壳聚糖酶活力。酶A 和酶B 的失活曲线分别如图9和图10所示。
由图9可以看出，酶A 在50℃下的热稳性较强，2 h 以后仍能够保持75%以上的活性；当温度上升至55℃时，活性下降较快，1 h 后活力仅剩20%左右。
由图10可以看出，酶B 在55℃下的热稳定性较强，2 h 以后仍能够保持90%以上的活力；当温度上升到60℃时，活性下降很快，2 h 后剩余活力已经低于10%。
图6 纯化壳聚糖酶A 和B 的
SDS-PAGE 图谱
Fig.6 SDS-PAGE of Ch A and Ch B
Marker Ch A Ch B Marker 14400 20100 30000 45000 66000 97000
144002010030000450006600097000
818 高 校 化 学 工 程 学 报 2007年10月
10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00
130.00 120.00 110.00 100.00 90.00 80.00
70.00
Auto-Scaled Chromatogram t / min
图12 Ch A 降解产物HPLC 图谱
Fig.12 HPLC chromatography of ChA hydrolysis product
61467
S p e c i f i c a c t i v i t y / %
Time / min
图10 温度对Ch B 稳定性的影响
Fig.10 Effect of temperature on the stability of Ch B
S p e c i f i c a c t i v i t y / %
Time / h
图9 温度对Ch A 稳定性的影响
Fig.9 Effect of temperature on the stability of Ch A
Time / min
3.2.5 酶解底物特性测定
以脱乙酰度分别为97%、90%、80%的壳聚糖和羧甲基壳聚糖为底物，分别进行了降解实验。底物浓度均为1%，反应温度为50℃，反应体系pH 5.0，降解时间30 min ，结果如表2所示。随着壳聚糖脱乙酰度的增大，酶A 和酶B 的降解能力均有所增强，且对羧甲基壳聚糖均没有降解作用。由此可见，底物壳聚糖中的氨基对两种酶的降解作用至关重要。
3.2.6 壳聚糖酶切方式测试
实验中，酶A 和酶B 在表现出相同的活性时，降解产物的水溶性能相差很大：底物经酶A 降解后，调节pH 大于8.0，很少甚至几乎没有壳聚糖沉淀；而经酶B 降解后的溶液，调节pH 大于8.0，可以看到大量的壳聚糖沉淀析出。为此，设计实验以HPLC 法检验两种酶的降解产物的性质，以此考察两种酶降解方式。图11为酶B 的降解产物HPLC 的图谱，图12为酶A 的降解产物HPLC 图谱。可以得出，酶B 的降解产物中包含氨基葡萄糖单体，故酶B 为外切酶；而酶A 的酶解产物中不包
含单糖，故为内切酶。
表2 底物对壳聚糖酶解的影响
Table 2 Effect of substrate on chitosanase hydrolysis
Substrate
ChA ChB Chitosan with degree of deacetylation 97% 100 100 Chitosan with degree of deacetylation 90% 98 87 Chitosan with degree of deacetylation 80%
89 64 Carboxymethyl chitosan
0 0
1.60
2.00 2.40 2.80
3.20
3.60 3.58 3.56
V / 0.1×V o l t s
t / ×10 minutes
图11 Ch B 降解产物HPLC 图谱
Fig.11 HPLC chromatography of ChB hydrolysis product
第21卷第5期隋斯光等：壳聚糖酶的分离提纯及其酶学性质研究819
4结论
本文的壳聚糖酶来自于Penicillium sp. ZD-Z1发酵所得产物，只有Fenton等人[8]从类似的Penicillium islandicum中得到过壳聚糖酶，而大多报道均来自于其他菌种。对Penicillium sp.ZD-Z1产壳聚糖酶进行分离纯化，并对其酶学性质进行了初步研究。实验中采用超滤、有机溶剂沉淀、阳离子交换、凝胶过滤等方法，分离得到了两种具有壳聚糖酶活性的酶A和酶B。经过等电聚焦实验测得酶A和酶B的等电点分别为5.21和5.92。经过SDS-PAGE测定酶A和酶B的相对分子质量分别为43 000和115 000。在反应30 min的条件下，酶A和酶B的最适反应pH分别为5.0和5.5，最适反应温度分别为65℃和60℃。酶A在50℃下较稳定，酶B在55℃下较稳定。对脱乙酰度为80%~97%的壳聚糖底物，随着脱乙酰度的升高，酶A和酶B的降解能力均有所增强，而对羧甲基壳聚糖均不能降解。通过HPLC法检测两种酶的降解产物，分析得到酶A为内切酶，而酶B为外切酶。目前所见报道中的壳聚糖酶大多为内切酶，青霉菌产外切壳聚糖酶尚未见报道。
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壳聚糖的应用研究进展(综述性论文)
绿色原料——壳聚糖的应用研究进展 09化学1班 XXX 指导老师：沈友教授 (惠州学院化学工程系，广东，惠州，516007) 摘要:本文综述了绿色原料壳聚糖的应用研究进展，着重介绍了壳聚糖在食品，水处理，生物药用，造纸业等方面的应用。 关键词:壳聚糖应用食品水处理 前言 原料在化学品的合成中非常重要，其可以成为影响一个化学品的制造、加工与使用的最大因素之一。如果一个化学品的原料对环境有负面的影响，则该化学品也很可能对环境具有净的负面影响。要实现绿色化学，在选择原料时应尽量使用对人体和环境无害的材料，避免使用枯竭或稀有的材料，尽量采用回收再生的原材料，采用易于提取、可循环利用的原材料，使用环境可降解的原材料。 自然界的有机物，数量最大的是纤维素，其次是蛋白质，排在第三位的是甲壳素，估计每年生物合成甲壳素100 亿t。甲壳素N-脱乙酰基的产物壳聚糖就是一种重要的绿色原料。 壳聚糖化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖，壳聚糖的外观为白色或淡黄色半透明状固体, 略有珍珠光泽, 可溶于大多数稀酸如盐酸、醋酸、苯甲酸等溶液, 且溶于酸后,分子中氨基可与质子相结合, 而使自身带正电荷。自1859年，法国人Rouget首先得到壳聚糖后，这种天然高分子的生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等优良性能被各行各业广泛关注，在医药、食品、化工、化妆品、水处理、金属提取及回收、生化和生物医学工程等诸多领域的应用研究取得了重大进展。壳聚糖无毒无害,具有良好的保湿性、润湿性,能防止静电; 化学稳定性良好, 但吸湿性较强, 遇水易分解。对壳聚糖进行化学改性, 得到的壳聚糖衍生物在许多物化性质方面都得到改善，其应用也更加受到关注。本文着重介绍了壳聚糖在食品，医药，水处理方面的应用进展。
酵母蔗糖酶的提取工艺
酵母蔗糖酶的提取工艺 摘要 蔗糖酶是一种水解酶, 广泛存在于动物、植物、微生物等各种生物体内。它可以不可逆的催化蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖，为微生物的生长提供碳源和能源。 采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种方法从酵母中提取蔗糖酶[1]，冻融法和SDS 抽提法的提取效率远高于传统的甲苯自溶法。其中冻融法的效率最高（纯化倍数比活力与总活力），加之其操作简便，更适合于酵母蔗糖酶大规模的制备提取。 比较了乙醇分级沉淀、硫酸铵分级沉淀对于冻融法得到的粗提物的沉淀效果，结果表明：50%(w/w)乙醇分级沉淀效果较好（比活力与总活力），乙醇分级沉淀所得蔗糖酶经DEAE-Sepharose 离子交换层析纯化后，制得高纯度的酵母蔗糖酶（比活力与总活力）。纯化倍数为16.14倍，比活性为947.805U/mg，回收率为51.6%。 蔗糖酶的酶促动力学性质表明，蔗糖酶的最适PH值为4.5，最适温度为50℃，酶的特征米氏常数Km值为13.8mmol/L，最大反应速度Vmax为5.98ug/min。 关键词：酵母；蔗糖酶；提取；纯化 Study on Purification of Invertase from Yeast Abstract Sucrase is widespread in prokaryotes and eukaryotes .Sucrase catalyzes the irreversible hydrolysis of sucrose into glucose and fructose.the mainfroms of carbon and energy supplies in microorganism growth and development. This paper used three methods to extract invertase from yeast,which included in this manuscript, three different extraction method breaking cells by adding methylbenzene,frost grinding,and adding SDS for extracting invertase from yeast were investigated.Then the purified invertase was obtained by precipitatation with 50% ethyl alcohol、sequential ammonium sulpate precipitation and DEAE-Sepharose lon-exchange chromatography.The purified sucrase was characterized by SDS-PAGE.The results showed all three methods had both advantages and disadvantages.The invertase extracted by adding SDS and frost grinding had much more total activity than that of extracted by adding methylbenzene.A highest total invertase activity was found in the forst grinding,and it was a convent and economical method for commercial production of invertase from yeast. The results of our study were followed: 1、Purification of invertase from yeast The specific activity was 947.805U/mg,purification fold was 32.28.The activity recovery of sucrase was 51.6%. 2、Properties of sucrase The kinetic characters of the enzyme have been studied.The optimum PH and optimum temperature for the enzyme are PH4.5 and 50℃.Km is 21mmol/Land Vmax is 6.57ug/min. Key words : yeast;invertase;extraction;purification 第一部分文献综述
酶学性质研究
1.6 酶学性质研究 （1）pH 的影响：分别测定粗酶液在pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0下的酶活力，确定其最适反应pH 值；将粗酶液用上述pH 缓冲液稀释后，45℃水浴保温4小时后，测定其剩余酶活力。 （2）温度的影响：分别在40~95℃下测定酶活力，确定其最适反应温度；将酶液在40～90℃范围内的不同温度下保温60 min 后，测定其剩余酶活力。 （3）金属离子的影响：在酶液中分别添加各种金属离子，使其浓度为4 mmol ／L ，然后测定酶活力。 2.5 纤维素酶粗酶液酶学性质 2.5.1酶反应的最适pH 值和酶的pH 稳定性 粗酶液在不同pH 值下测得的酶活及在不同pH 值下处理4小时后测得的相对酶活示于图11。结果表明，CMCase 在pH 3.5～4.5有较高的酶活力，最适反应pH 值为4.0；β-Gluase 在pH 4.5～5.5酶活力较高，最适反应pH 值为5.0，同样方法测得FPA 最适反应pH 为5.0。可见，该菌株所产的各组分纤维素酶是酸性酶。 图11表明，该菌产CMCase 在pH3.0～6.0的范围内，β-Gluase 在pH3.5～5.5的范围内，酶活力均可保持在80％以上，说明该菌株所产酸性纤维素酶可在较宽的pH 值范围内保持其酶活力的稳定性。2.5.2 酶反应的最适温度和酶的热稳定性 在不同温度下直接进行酶促反应测得的酶活及在不同温度下热处理60 min 后于最适反应温度和最适pH 下测得的相对酶活(以4℃保存的酶液活力为100%)示于图12。结果表明，CMCase 、β-Gluase 及FPA 最适反应温度均为65℃。 c e l l u l a s e a c t i v i t y ( U .m l -1) pH r e l a t i v e y a c t i v i t y （%） c e l l u l a s e a c t i v i t y ( U .m l -1) temperature ( o C ) r e l a t i v e y a c t i v i t y （%） 图11 pH 值对酶活力及酶稳定性的影响 Fig.10 Effects of pH value on Cellulase activity and stability 图12 温度对酶活力及酶稳定性的影响 Fig.11 Effects of temperature on activity and stability of cellulase
壳聚糖的结构、性质及其应用--综述
壳聚糖的结构、性质及其应用 张洁海洋药学0844130 摘要：生物相容性好、可降解、对组织和细胞无毒副作用的生物材料一直是生物医学领域研究的热点。壳聚糖(α(1-4)2-氨基2-去氧β-D葡聚糖)是甲壳素脱乙酰得到的天然多糖中惟一的碱性多糖,具有很多优良的特性。本文就壳聚糖的结构、性质及其应用进行综述。 关键词：壳聚糖，结构，性质，应用 壳聚糖(Chitosan，简称CTS)，壳聚糖是由N-乙酰糖胺组成,其中糖胺的含量超过90%,具有黏多糖相似的结构特点,而黏多糖在组织中分布广泛,是细胞膜有机组成成分之一,故壳聚糖具有优异的生物相容性⑴~⑵。表现为无毒、无刺激、无免疫抗原、无热原反应、不溶血,有抗菌消炎、促进伤口愈合,抗酸、抗溃疡、降脂和降低胆固醇的作用⑶~⑸。而且具有直接抑制肿瘤细胞的作用,并可通过活化免疫系统显示抗癌活性,与现有的抗癌药合用可增强抗癌效果,近年来其作为药物微球材料的研究也受到了极大的重视⑹,是一种安全可靠的天然生物活性多糖。本文就壳聚糖的结构、性质及其应用进行综述。 一．壳聚糖的结构与性质 1.壳聚糖的来源—甲壳素 壳聚糖来源于一种自然资源十分丰富的线性聚合物一甲壳素，是甲壳素经脱乙酰化反应后得到的一种生物高分子Ⅲ。甲壳素是一种天然多糖类生物高分子聚合物，在自然界中广泛存在于低等生物菌类、藻类的细胞，节支动物虾、蟹、昆虫的外壳，软体动物(如鱿鱼、乌贼)的内壳和软骨，高等植物的细胞壁等，将甲壳动物的外壳通过酸碱处理，脱去钙盐和蛋白质，即可得到甲壳素。甲壳素化学名为[(1，4)一2一乙酰胺基一2一脱氧一B—D-葡萄糖]，分子式为(C8H13N05)。，单体之间以B(1-4)糖苷键连接，分子量一般在lO6左右，理论胺含量为6．9％。甲壳素的化学结构与植物中广泛存在的纤维素结构非常相似(见图l)，故又称为动物纤维素。 （a）甲壳素（b）纤维素 图1甲壳素和纤维素的结构
耐高温_淀粉酶的酶学性质研究
３结 论 植物乳杆菌素Ｌ－１经硫酸铵沉淀，透析除盐后效价达１２８０ＡＵ／ｍｌ，作用方式为杀菌。在７、１５、３０、３７℃下，添加植物乳杆菌素Ｌ－１对单增李斯特菌都有一定的抑制作用。７℃下该细菌素在１４４ｈ内控制住初始菌数，温度较高的情况下则可以在短时间内迅速降低活菌数。在选用的六种ｐＨ下，ｐＨ７．０时植物乳杆菌素Ｌ－１的抑菌效果最好。不论在培养基中还是ｐＨ７．０，５ｍｍｏｌ／Ｌ的磷酸缓冲液中，盐对该细菌素具有一定的拮抗作用，各盐分之间和同种盐不同浓度之间差异不显著。有关吸附作用的研究发现：低ｐＨ（５．０～５．５）下，植物乳杆菌素Ｌ－１不能吸附在单核细胞增生李斯特氏菌上，而ｐＨ６．０～７．５下有５０％吸附在指示菌上。盐对该细菌素吸附单核细胞增生李斯特氏菌没有显著影响。 参考文献： ［１］ 吕燕妮， 李平兰， 江志杰． 乳酸菌３１－１菌株产细菌素的初步研究［Ｊ］． 中国食品学报， ２００３， 增刊： １３０－１３３． ［２］郁庆福， 蔡宏道， 何晓青， 等． 现代卫生微生物学［Ｍ］． 北京： 人民卫生出版社， １９９５． １１６－１１７． ［３］ Ｓｏｐｈｉｅ Ｍ Ｐ， Ｅｍｉｌｉａ Ｆ， Ｒｉｃｈａｒｄ Ｊ． Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｐａｒｔｉａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄ ｍｏｄｅ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉｎ ＥＦＳ２， ａｎ ａｎｔｉｌｉｓｔｅｒｉａｌ ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａ ｃｈｅｅｓｅ［Ｊ］．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９９６， ３０： ２５５－２７０． ［４］ Ａｔｒｉｈ Ａ， Ｒｅｋｈｉｆ Ｎ， Ｍｏｉｒ Ａ Ｊ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｃ１９［Ｊ］． ＣａｎａｄａｎＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９９３， ３９： １１７３－１１７９． ［５］ Ａｔｒｉｈ Ａ， Ｒｅｋｈｉｆ Ｎ， Ｍｏｉｒ Ａ Ｊ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｍｏｄｅ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｌａｎｔａｒｉｃｉｎ Ｃ１９， ａｎ ａｎｔｉ－Ｌｉｓｔｅｒａ ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ ｐｒｏ－ｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｃ１９［Ｊ］． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＦｏｏｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２００１， ６８： ９３－１０４． ［６］ Ｒｏｎｇｇｕａｎｇ Ｙ， Ｍｏｎｔｙ Ｃ Ｊ， Ｂｉｂｅｋ Ｒ． Ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｌａｒｇｅａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎｓ ｆｒｏｍ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ］． Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉ－ｒｏｎｍｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９９２， ５８： ３３５５－３３５９． ［７］还连栋， 贾士芳， 庄增辉， 等． 乳链菌肽（ＮＩＳＩＮ）的杀菌作用机制［Ｊ］．中国食品添加剂， １９９７， （４）： ２０－２３． ［８］ Ｓ Ｔｏｄｏｒｏｖ， Ｂ Ｏｎｎｏ， Ｏ Ｓｏｒｏｋｉｎｅ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆａ ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍＳＴ ３１ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｏｕｒｄｏｕｇｈ［Ｊ］． Ｉｎｔ Ｊ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １９９９， ４８： １６７－１７７． 收稿日期：２００５－０１－２１ 作者简介：毕金峰（１９７０－），男，副教授，博士后，主要从事食品化学与生物技术研究。 耐高温α－淀粉酶的酶学性质研究 毕金峰１，董福奎２ （１．中国农业科学院农产品加工研究所 农业部农业核技术与农产品加工重点实验室，北京 １０００９４； ２．内蒙古呼和浩特市赛罕区蔬菜技术推广站，内蒙古 呼和浩特 ０１００２０） 摘 要：耐高温α－淀粉酶是淀粉生产麦芽糖的关键酶。本文对两种耐高温α－淀粉酶的酶学性质进行了对比研究。结果表明：两种酶的耐高温能力差别较大，酶活差别明显；最适ｐＨ值均为７．０，耐酸性较差；当Ｃａ２＋浓度在７～９ｍｍｏｌ／Ｌ时，酶活提高明显。关键词：耐高温α－淀粉酶；性质 Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔｉｎｇ α－ａｍｙｌａｓｅ ＢＩ Ｊｉｎ－ｆｅｎｇ１，ＤＯＮＧ Ｆｕ－ｋｕｉ２ （１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｇｒｏ－Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｇｒｏ－Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ， ＭＯＡ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００９４， Ｃｈｉｎａ；２．Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｏｐｕｌａｒｉｚｅ Ｓｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｉｈａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ ｉｎ Ｈｕｈｅｈａｏｔｅ Ｃｉｔｙ， Ｈｕｈｅｈａｏｔｅ ０１００２０， Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ ：Ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔｉｎｇ α－ａｍｙｌａｓｅ ｉｓ ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｅｎｚｙｍｅ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｍａｌｔｏｓｅ． Ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔｉｎｇα－ａｍｙｌａｓｅｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ： ｔｈｅ ｈｅａｔ－ｒｅｓｉｓｔｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ｔｗｏ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ ｗａｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ，ａｎｄ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ａｎ ｅｖｉｄｅｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｐＨ ｗａｓ ７．０， ａｎｄ ｔｈｅ ａｃｉｄ－ｒｅｓｉｓｔｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｗａｓ ｐｏｏｒ． Ｔｈｅ
实验 酶学性质研究
实验四酶学性质研究 一、实验目的 1、了解pH、温度、金属离子对酶的活性的影响机理； 2、掌握如何选择酶催化反应的最适pH、温度和获得最适pH条件的确定、以及Km常数的测定。 二、实验原理 酶促反应速度受介质pH的影响，一种酶在几种pH介质中测其活力，可看到在某一pH时酶促效率最高，这个pH称为该酶的最适pH。pH影响酶分子的活性部位的解离，另外，也影响底物的解离状态，从而影响酶活性中心的结合与底物或催化。其次，有关基团解离状态的改变影响酶的空间构象，甚至会使酶变性。酶的最适pH不是酶的特征性常数，如缓冲液的种类与浓度，底物浓度等均可改变酶作用的最适pH。 在一定温度范围内，酶促反应速率随温度的升高而加快；但当温度高到一定限度时，酶促反应速率不仅不再加快反而随着温度的升高而下降，最终，酶因高温变性失去活性，失去了催化能力。在一定条件下，每一种酶在某一温度时活力最大，这个温度称为这种酶的最适温度 在进行酶学研究时一般都要制作一条pH与酶活性的关系曲线，即保持其他条件恒定，在不同pH条件下测定酶促反应速度，以pH值为横坐标，反应速度为纵坐标作图。由此曲线，不仅可以了解反应速度随pH值变化的情况，而且可以求得酶的最适pH。最适温度的实验方法和pH类似。 酶促动力学研究酶促反应的速度及影响速度的各种因素，而米氏常数K m值等于酶促反应速度为最大速度一般时所对应的底物浓度，其值大小与酶的浓度无关，是酶促反应的特征常数。不同酶的K m值不同，同一种酶与不同的底物反应
时，其Km值也不同，Km值反映了酶和底物亲和力的强弱程度，Km值越大，表明酶和底物的亲和力越弱；Km值越小，表明酶与底物的亲和力越强。 酶的活力就是酶所催活的反应速度，通常用单位时间内底物的减少或产物的增加来表示。酶反应过程中产物的生成和时间的关系可以用进程曲线来说明，曲线的斜率就是酶反应过程中的反应速度。从进程曲线来看，在一定时间内反应速度维持恒定，但随着时间的延长，反应速度逐渐降低，这是由多种因素造成的。所以，为了准确表示酶的反应速度必须采用初速度，即保持恒定时的速度。同样，不同酶浓度下的反应进程曲线也可以说明这个问题。V=Vmax[S]/Km+[S]，Vmax 指该酶促反应的最大速度，[S]为底物浓度，Km是米氏常数，V是在某一底物浓度时相应的反应速度。双倒数作图（将米氏方程两边取倒数，可转化为下列形式：1／V=Km／Vmax.1／[S]+1／Vmax，可知，1/V对1/[S]的作图得一直线，其斜率是Km/V，在纵轴上的截距为1/Vmax，横轴上的截距为-1/Km。此作图除用来求Km和Vmax值外，在研究酶的抑制作用方面还有重要价值 三、实验器材与试剂 1、试剂：磷酸二氢钠、柠檬酸、ABTS、酸性靛蓝。 2、器材：可见分光光度计、恒温水浴锅、试管、酸度计 四、操作步骤 1、配置缓冲溶液 按下表配置缓冲溶液，其溶液pH值以酸度计测定值为准。
啤酒酵母的蔗糖酶的提取提纯及测定
浙江工业大学药学院生物化学实验论文 2013 年12 月13日
啤酒酵母蔗糖酶的提取、提纯及测定研究论文 摘要：为了了解蔗糖酶的性质，我们用啤酒酵母做了一系列的实验，它们主要是以下内容：（1），蔗糖酶的提取与初提纯：a、先将酵母自溶，再两次离心得初提液A；b、接着调PH并加热、离心得热提取液B；c、用乙醇沉淀离心得提取液C。（2），蔗糖酶的纯化—Q Sepharose 柱沉析法：先装柱，再安装盐度梯度发生器与柱的平衡，接着加样并洗脱，最后处理结果与交换剂的再生并得到提取液D。（3），蔗糖酶活力的测定：第一人做葡萄糖标曲，第二人测定各提取液反应后的值，得各提取液的酶活力与回收率。（4），蔗糖酶蛋白质含量的测定及活力OD 540 计算：遇上一个实验相反，第二人做标曲，第一个人测与各提取液相对应的OD 660值，再对比得到各提取液的总蛋白、比活力、蛋白回收率、酶活回收率与纯化倍数。(5),微量凯氏定氮法（以B为样品）：先将样品B消化得消化液，洗涤定氮仪，再将消化液蒸馏，用HCl滴定馏出液，计算蛋白质含量。（6），SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量：首先制备分离胶并使之凝固，再制备浓缩胶使之在分离胶之上凝固，加处理后的样品和标准液，接着电泳，最后染色和脱色，确定样品相对分子质量。 关键词：蔗糖酶；蛋白质；提取；纯化；酶活力测定；Folin-酚试剂；微量凯式定氮；SDS-聚丙烯胺凝胶;标曲；电泳； 正文： 文献综述 蔗糖酶(Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶(Invertase)，可作用于β21,2糖苷键,将蔗糖水解为D2葡萄糖和D2果糖，广泛存在于动植物和微生物中，主要从酵母中得到。蔗糖酶的最适温度为45℃-50℃，最适ph为4.0-4.5. 实验原理、试剂与器材、操作方法、结果与分析、注意事项、认识与体会 1 蔗糖酶的提取及初步提纯 1.1实验原理 酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶属于胞内酶，所以常将细胞壁破碎后进行提取。酶的生产方法有生物提取法、微生物发酵法及化学合成法，细胞破碎又有化学裂解法、低渗溶液法等，本法属于生物提取法、菌体自溶的方法。经破碎提取的蔗糖酶液再经热提取、乙醇沉淀提取，使蔗糖酶得到初步的提纯。 1.2 试剂与器材 1.2.1试剂
壳聚糖的制备方法及研究进展
龙源期刊网 https://www.wendangku.net/doc/7f8370988.html, 壳聚糖的制备方法及研究进展 作者：张立英 来源：《山东工业技术》2018年第02期 摘要：壳聚糖作为一种碱性多糖被广泛应用于食品、生物、化工、医疗等领域。本文重点介绍了壳聚糖的制备方法及其研究进展，并对其发展趋势进行了展望。 关键词：壳聚糖；碱性多糖；制备方法 DOI：10.16640/https://www.wendangku.net/doc/7f8370988.html,ki.37-1222/t.2018.02.016 壳聚糖本身的分子结构类似于纤维素，因其多了一个带正电荷的胺基，使其化学性质较为活泼。目前壳聚糖正因其优良的生理活性在食品、化妆品、医药、化工、污水处理等方面展现出广阔的应用前景，近十年来国内外对于壳聚糖的开发研究热度一直持续不减，各种新颖的制备方法也是层出不穷。 1壳聚糖的来源 壳聚糖通常是由甲壳素（又名几丁质）经脱乙酰基作用获得，甲壳素在自然界中广泛存在于高等真菌以及节肢动物（虾、蟹、昆虫等）的外壳中，其中虾壳、蟹壳是工业生产壳聚糖的主要原料。由于大分子间的氢键作用，天然存在的甲壳素构造坚固，化学性质稳定，不溶于水、酸碱和一般的有机溶剂，这也使得甲壳素的应用范围非常有限，因此甲壳素只有经脱乙酰基处理成壳聚糖才能获得广泛应用。 2壳聚糖的制备方法 （1）化学降解法。传统的壳聚糖生产多采用化学降解法。作为壳聚糖工业生产最常用的制备方法，化学降解法简便易行，效率高，整个生产过程容易控制，但该法环境污染较为严重，对周边环境具有一定的破坏性。欧阳涟等从蟹壳中获取甲壳素，并通过脱乙酰反应制备出了壳聚糖。试验探究了影响产物壳聚糖脱乙酰反应的各种因素，如反应温度、碱液含量及反应时间等，最终确定制备高脱乙酰度壳聚糖的条件为反应温度70℃，碱液质量分数47%，反应时间10 h。 （2）微生物培养法。微生物发酵法生产壳聚糖起源于美国，我国从上世纪90年代开始研究。其主要原理是利用微生物自身生产的酶进行催化，从而脱去甲壳素中的乙酰基，进而制备壳聚糖。目前该领域研究重点主要集中在优良菌株的选育和培养基的优化上。 贺淹才等首先采用电解法从培养的黑曲霉湿菌体中制得甲壳素，然后采用碱提取法从培养的黑曲霉湿菌体中制备壳聚糖。试验基于黑曲霉细胞壁的主要成分为蛋白质与甲壳素，而蛋白质带有可电离的基团，于溶液中可形成带电荷的阳离子和阴离子，在外加电场作用下发生迁
萌发小麦种子中淀粉酶酶学性质研究解析
萌发小麦种子中淀粉酶酶学性质研究（东北农业大学，生命科学学院，黑龙江省哈尔滨市 150030） 摘要： 酶是酶是一种生物催化剂，它具有催化剂属性，同是也具有一些无机催化剂所不具有的特性。催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。是生物催化剂，能通过降低反应的活化能加快反应速度，但不改变反应的平衡点。本实验通过利用淀粉酶水解还原糖，还原糖能使3，5-二硝基水杨酸还原，生成棕色的3-氨基-5硝基水杨酸。淀粉酶活力与还原糖的量成正比，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位质量样品在一定时间内生成还原糖的量表示酶活力。以淀粉在碘液中显蓝色性质，探究酶活性影响因素，常见的影响因素有：温度 pH 活性剂和抑制剂等。 Abstract:Enzyme is a biological catalyst is an enzyme, the catalyst having the property, the same also has some inorganic catalysts do not have the characteristics. Proteins catalyze specific chemical reactions,RNA or a composite thereof. Are biological catalysts,by reducing the activation energy of the reaction to accelerate the reaction rate, but does not change the equilibrium reaction. In this study, the use of enzymatic hydrolysis of starch sugar, sugar makes 3,5-dinitrosalicylic acid reduction ,a brown 3-amino-nitro-salicylic acid.Proportional to the amount of amylase activity and reducing sugars,measuring the amount of amylase in starch sugar produced by colorimetry ,a unit mass of the sample at the certain time. 关键词： 淀粉酶活性温度 PH 激活剂和抑制剂 引言： 新陈代谢是生命活动的基础，是生命活动最重要的特征。而构成新陈代谢的许多复杂而有规律的物质变化与能量变化，都是在酶催化下进行的。生物的生长发育、繁殖、遗传、运动、神经传导等生命活动都与酶的催化过程紧密相关，可以说，没有酶的参与，生命活动一刻也不能进行。酶是细胞产生的，受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂，与一般催化剂比较有以下不同点：酶易失活、酶具有很高的催化效率、酶具有高度专一性、酶活性受到调节和控制。而调节和控制又包括调节酶浓度、抑制剂和激活剂的调节等。[1] 按照淀粉酶水解淀粉的作用方式，可以分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、异淀粉酶和麦芽糖酶四种类型。实验证明，当谷类种子萌发时，两类淀粉酶（α，β型）都存在，淀粉酶总酶活性随种子萌发将升高，有利于淀粉被降解为植物生长发育所需的葡萄糖。许多微生物包括
实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质
实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020
实验四、马铃薯块茎多酚氧化酶（PPO）活性测定及酶学性质一、实验目的 1掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。 2了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。 二、实验原理 马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值大为降低，制约着马铃薯的开发利用。酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。 多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等．是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶．普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，使组织形成褐变．以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。因此，检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。 多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在410nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值的变化确定PPO的酶活大小。 多酚氧化酶 邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2O 2——————→邻醌＋H 2 O
三、试验材料、试剂及试验用品 1．材料：马铃薯块茎。 2．仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶 3．试剂：L 磷酸缓冲液（pH=）；L邻苯二酚；L磷酸氢二钠；L磷酸二氢钠；10mmol/L 柠檬酸；10mmol/L抗坏血酸；10mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）；10mmol/L亚硫酸钠 四、实验方法： 1.多酚氧化酶的提取 取马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（）3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在４℃下离心（8000r/min）5min，取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。 2.多酚氧化酶活性测定 采用比色法测定。将ｍl邻苯二酚加入2ｍl磷酸缓冲液（ｐＨ）中，加入ｍl酶提取液，立即于波长410nm下测定吸光值，2min后再计吸光值，以不加酶提取液的反应液做对照(注意空白为： ml缓冲液和 mL邻苯二酚溶液)。以每分钟吸光度变化为1个多酚氧化酶活性单位。 表1 多酚氧化酶活性测定
酵母蔗糖酶提取方法的研究
酵母蔗糖酶提取方法的研究 生命科学学院 10级生物科学类李倩 10197022 指导老师：陶芳 摘要：采用自溶法从酵母中提取蔗糖酶，通过抽提、30﹪乙醇分级、50﹪乙醇分级和透析，同时测定各步的蛋白质浓度和酶活，并据此计算比活、回收率和纯化倍数。 关键词：蔗糖酶提取自溶法 Research on the Extraction Method of Yeast Sucrose School of Life Sciences，Biological Sciences of grade 2, li Qian, 10197022 Abstract:The autolysis extract from yeast invertase,through extraction,30 ethanol fractionation and dialysis,simultaneous determination of each step of concertration of protein and enzyme avtivity,and then calculate the radio of live,recovery and purification. Key words:yeast；extraction；autolysis method 前言：蔗糖酶（Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶（Invertase),1928年Dumas等首先指出酵母菌发酵蔗糖时必须有这种酶的存在，蔗糖在蔗糖酶的作用下，水解为葡萄糖和果糖，还原力增加，又由于生成果糖，甜度增加。 按水解蔗糖的方式，蔗糖酶可分为从果糖末端切开蔗糖的β-D-呋喃果糖苷酶（β-D-frutofuranosidases,EC 3.2.1.26)和从葡萄糖末端切开蔗糖的α-D-葡萄糖苷酶（α-D-glucosidases,EC 3.2.1.20)。前者存在于酵母中，后者存在于霉菌中。工业上多从酵
壳聚糖溶液行为研究-温度、分子量、浓度、酸浓度依赖性
https://www.wendangku.net/doc/7f8370988.html,
壳聚糖纺丝溶液行为研究 ——温度、分子量、浓度等的依赖性
陈雄，庄洋，廖青，赵国樑
北京服装学院材料科学与工程学院，北京 （100029）
E-mail: qing@https://www.wendangku.net/doc/7f8370988.html,
摘 要： 本文从壳聚糖纺丝溶液的制备入手， 利用乌氏粘度计和本体粘度仪测定了不同浓度、 分子量、温度、静置时间、酸浓度、不同种酸作为溶剂的壳聚糖纺丝原液的特性粘度和本体 粘度，研究了粘度随上述不同因素的变化规律，从而为后期的纺丝做理论准备。研究结果表 明，所用稀酸体积分数的增大，会使溶液粘度下降的趋势更加明显。壳聚糖醋酸水溶液随着 温度升高与存放时间的延长，粘度下降。随壳聚糖溶液浓度升高，溶液粘度上升。所采用的 壳聚糖样品的分子量升高，使溶液粘度升高。 关键词：壳聚糖；粘度；聚电解质；湿法纺丝 壳聚糖（chitosan）学名为：(1,4)-2 氨基-2-脱氧-β-D 葡聚糖，为白色无定型、半透明， 略有珍珠光泽的固体[1]，是甲壳素的脱乙酰化产物。其含量在自然界中仅次于纤维素，是自 然界中唯一存在的碱性多糖。 由于壳聚糖化学结构 C-2 位上是氨基， 在其溶液中可形成阳离 子，因此具有独特的理化性能，是地球上少有的一种天然阳离子高聚物;又由于其良好的生 物相容性和生物可降解性，壳聚糖在生物医药、环保、纺织、农业、食品等领域有着广阔的 应用前景[2,3]。 虽然壳聚糖易溶于酸的水溶液，但由于聚电荷效应，这些溶液往往具有很高的粘度。在 湿法纺丝挤出过程中,这种高粘度会影响壳聚糖的加工性能[4]。另外，壳聚糖纤维强度较低， 自 1980 年第一次报道以来， 国内外学者一直致力于其纤维强度的提高[5,6]。 Qin-Yimin 于 1993 年通过湿法纺丝工艺制备出了壳聚糖纤维，最大断裂强度为 2.43cN/dtex[5]。至今为止，国内 外已有相当一部分学者研究了温度、浓度、添加剂、溶剂 pH、溶剂种类等[7-20]对壳聚糖聚 电解质溶液性质的影响，并正努力将理论应用于壳聚糖纺丝工艺之中。 本文从壳聚糖纺丝溶液的制备入手， 用粘度法研究了不同平均分子量壳聚糖溶液粘度性 质随壳聚糖溶液浓度、稀酸浓度、酸种类、温度和静置时间变化的规律，从而为后期的纺丝 做理论准备。
1. 实验
1.1 原料
壳聚糖由浙江金壳生物化学有限公司生产，粘均分子量分别为 5、10、15 和 20 万，脱 乙酰度分别为 81.5%、92.7%、91.3%及 87.9%；实验所用其它试剂均为分析纯。
1.2 仪器设备
表 1 仪器设备列表 Table.1 The list of instruments used in lab 型号 4-0.55 SYP－III DZF－6050 Viscolab 3000 -1-
仪器名称 乌氏粘度计 玻璃恒温水浴 真空干燥箱 CAS 粘度计
生产厂家 上海启航玻璃仪器厂 南京桑力电子设备厂
上海精宏实验设备有限公司 CAMBRIDGE APPLIED SYSTEMS
萌发小麦种子中淀粉酶酶学性质
萌发小麦种子中淀粉酶酶学性质 XXX A091100XX 生学1101 Enzymatic properties of amylases from germinant wheat 摘要：在小麦种子中提取淀粉酶，研究相关酶学性质，了解温度、PH值以及激活剂和抑制剂对淀粉酶活性的影响，并且对酶的活力进行测定。不同的温度、PH条件下和加激活剂或抑制剂情况下淀粉酶将淀粉水解的程度不同，产物遇碘呈现不同的颜色，由此可知道酶活性的最适温度和最适PH，也可知道激活剂能使酶的性增加，抑制剂能使酶的活性降低。对酶的活力进行测定时，是测定产物麦芽糖的量，来表示酶的活力。麦芽糖能将3、5—二硝基水杨酸还原成棕红色的氨基化合物（520nm处有最大吸收峰），其颜色深浅与麦芽糖浓度成正比，利用分光光度法测定棕红色的氨基化合物吸光值，从而得到产物麦芽糖的量，来表示酶的活力[1]。 关键词：淀粉酶、温度、PH值、激活剂、抑制剂、分光度计 研究背景：二十一世纪是生物信息时代，各种生物学领域研究层出不穷 ,对酶的研究是其中一个重要方面,目前对酶的研究已转入了后期，各种酶的生化性质也相继被研究出，酶是一种具有催化活性的蛋白质，由氨基酸通过肽链连接而成,只有在适当的温度、pH和离子强度下才具有生物活性,有些酶还需要辅酶或者辅因子[2]。通过此次实验研究，让我们进一步加深对淀粉酶的认识和学习，同时培养我们设计实验的基本思路，学会科学的实验组合，提出合理的实验方案,为以后研究其他种类的酶提供了研究方法和实验依据,也为我们以后更多的设计型实验作好铺垫。 原理：淀粉是植物最主要的储藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本
改性壳聚糖的研究进展
改性壳聚糖的研究进展 1壳聚糖的理化性质 壳聚糖(chitosan，(1,4)-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖)是甲壳素(chitin,(1,4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖)部分脱乙酰化的产物。甲壳素广泛存在于蟹、虾以及藻类、真菌等低等动植物中，含量极其丰富，自然界每年产量约在100亿吨，是仅次于纤维素的第二大多糖。它是由葡萄糖结构单元组成的直链多糖，此多糖中含有数千个乙酰己糖胺残基，因此在分子间形成很强的氢键，导致其不溶于水和普通有机溶剂，这就大大限制了其应用范围。 将甲壳素在碱性条件下加热，脱去N-乙酰基后可生成壳聚糖。人们常将N-脱乙酰度和粘度(平均相对分子质量)作为衡量壳聚糖性能的两项指标。N-脱乙酰度是判定壳聚糖溶解性的依据，脱乙酰度越高，分子链上的游离氨基就越多，在酸中的溶解性就越好；而壳聚糖相对分子质量越大，分子之间的缠绕程度就越大，溶解度就越小。壳聚糖是自然界中唯一的一种碱性多糖，它一般是白色无定型、半透明、略有珍珠光泽的固体。壳聚糖可溶于大多数稀酸，如盐酸、醋酸、苯甲酸溶液，且溶于酸后分子中氨基可与质子结合，使自身带上正电荷。甲壳素及壳聚糖的结构式如图1所示：
图1壳寡糖与壳聚糖的结构式 甲壳素和壳聚糖在自然界可以被各种微生物降解。微生物中的甲壳素酶(chitinase)可以随机地水解甲壳素的N-乙酰-β-(1-4)糖苷键。而壳聚糖可以被多种酶水解，包括壳聚糖酶(chitosanase)、麦芽糖酶、脂肪酶、以及各种来源的蛋白酶。在人体内甲壳素酶和壳聚糖酶并非普遍存在，通过测定显示N-乙酰壳聚糖在人血清中可以被人体内普遍存在的溶菌酶(lysozyme)降解。 壳聚糖的主链结构中引入了2-氨基，化学性质区别于3,6-羟基，与甲壳素相比增加了反应选择性的功能基团。由于C6-OH是一级羟基，C3-OH是二级羟基，空间位阻不同反应活性也不同，再加上C2-NH2，壳聚糖就具有三个活性不同的可供修饰的基团。根据不同的需要，被修饰的壳聚糖作为一种功能大分子广泛用于各种领域。由于壳聚糖只在酸性水溶液中溶解，而在中性或碱性水溶液中以及多数有机溶剂中不溶，限制了它的应用范围，因此科学家们采用衍生化的方法对壳聚糖进行改性获得了多种水溶性和可溶解于某些有机溶剂的衍生物，大大扩展了壳聚糖的应用范围。其中包括对壳聚糖进行N-,O-酰化，含氧无机酸酯化，醚化，N-烷基化，C6-OH和C3-OH的氧化，以及鳌合、交联等，在此过程中获得了许多性能良好，甚至是
蔗糖酶的分离提纯讲解
蔗糖酶的分离提纯 【实验目的】 1．了解蔗糖酶分离提纯的方法。 2．掌握离心技术、电泳技术、层析技术、膜分离技术和分光光度法。 【实验原理】 蔗糖酶[Ec 3．2．1．26]习惯命名β--D--Fructofuranosidase 系统命名：β--D —Fructofuranosideffructonydrolase 。 蔗糖酶是一种水解酶，能使蔗糖水解为果糖和葡萄糖。它所催化的反应是： H OH OH H 蔗糖 + H OH OH H 葡萄糖 果糖 蔗糖酶的分布相当广，在微生物、植物及动物中都有它的存在。在微生物中，酵母中的含量很丰富。在研究中用的最多的是面包酵母和啤酒酵母。 研究表明采用菌体自溶法破碎酵母细胞，采用乙醇分级和DEAE--纤维素柱层析两步分离提纯步骤，就可制备纯度较高的蔗糖酶制剂，而且收率也较好。从酵母中制备蔗糖酶，材料来源十分方便，而且以自己提纯的酶制剂进行蔗糖酶的性质、动力学研究也十分方便。 【实验材料、仪器和试剂】 1．实验材料和试剂 (1)0．2％葡萄糖标准液；(2)3，5-二硝基水杨酸试剂；(3)新鲜啤酒酵母； (4)甲苯；(5)乙酸钠；(6)稀乙酸溶液；(7)95％乙醇；(8)DEAE--纤维素；(9)0.5mol ／L NaOH ；(10)0.5mol ／L HCl ；(11)0.005mol ／L ，pH6.0的磷酸钠缓冲液；(12)含O.15mol ／L NaCl 的O.005mol ／L ，pH6.0的磷酸钠缓冲液； CH 2OH H OH H H OH CH 20H
(13)5％蔗糖；(14)测定蛋白质浓度试剂；(15)聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂2．仪器 (1)恒温水浴；(2)烧杯、量筒、移液管、容量瓶、玻棒；(3)冰盐浴； (4)离心机；(5)721型分光光度计；(6)柱层析装置；(7)天平；(8)pH计； (9)滴管、试管和血糖管；(10)秒表 【方法】 一、葡萄糖浓度标准曲线的制作 1．取10支血糖管，按下表加入0．2％葡萄糖溶液、水及3，5一二硝基水杨 上述试剂混匀后，在沸水浴中加热5min，取出立即冷却，以蒸馏水稀释至25mL，摇匀，于540nm测光密度。 2．以葡萄糖含量(mg)为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制标准曲线。 二、蔗糖酶的分离提纯 1．蔗糖酶粗品的制备 (1)自溶 称取10克干酵母，放在200mL的烧杯中，加30mL蒸馏水搅成糊状，再加入 1.5克乙酸钠。然后在35℃水浴中搅拌30min，此时会观察到菌体自溶的现象。 (2)提取及粗酶的制备 往上述自溶液中加60mL蒸馏水，将烧杯用表面皿或玻璃纸盖好，于35℃保温过夜。第二天，将自溶液于4500r／min离心20min。取出离心管，小心将上清液倒入烧杯中，弃沉淀。得到的上清液就是无细胞抽提液，即粗酶液（E1）。 量出粗酶液体积，记录。取2mL作为待测活力和蛋白浓度的样品（4℃保存）。2．乙醇分级 将粗酶液用稀醋酸调pH至4.5。 (1)32％乙醇饱和度 按下面的公式算出使粗酶液的乙醇浓度达32％时所需乙醇体积。