胚胎干细胞的研究进展

胚胎干细胞的研究进展

摘要：胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES cells) 是存在于胚胎发育早期阶段，具有自我更新和多分化潜能性的干细胞，是组成机体各种组织器官的起源细胞。已经广泛用于生命科学的许多领域，它在医学方面的应用成为医学领域的研究热点。本文综述了近些年关于胚胎干细胞分离培养与鉴定特征和应用的研究进展，同时也指出了目前所面临的问题，对今后的研究方向进行了展望。

关键词：胚胎干细胞；分离培养与鉴定特征；应用

胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）是一种从早期胚胎的囊胚内细胞团细胞或胎儿原始生殖细胞( primordial germ cells，PGCs) 中经分离体外抑制分化培养得到的具有发育全能性( 或多能性) 的一类干细胞，与已经成熟分化的体细胞一样，ES细胞也是一分为二地分裂增殖，且ESC具有体外培养无限增殖自我更新和多向分化的特性。在一定的培养条件下，ES细胞可以在体外长久和稳定地自我复制，实现永生，无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为内中外3个胚层的几乎所有类型细胞。因此，ES细胞成为研究哺乳动物早期胚胎发生细胞组织分化基因表达调控等发育生物学基础研究的一个非常理想的模型系统和非常有用的工具，也是进行动物胚胎工程开发和用于治疗各种疾病，修复受损伤的组织和器官的一个重要途径，具有广泛的应用前景[1,2]。

20世纪末开始，ES细胞的研究就一直是生物医学领域的热点。美国《科学》杂志评出的上个世纪十大科学突破中，“干细胞研究与应用”名列榜首。ES细胞的研究还处于起步阶段，目前人们已经能够分离培养干细胞，但诱导ES细胞定向分化还面临许多困难。

1 胚胎干细胞的概念和研究历史

胚胎干细胞研究的起源来自20世纪70年代对畸胎瘤的研究：有人把早期的小鼠胚胎移植到成年小鼠体内后产生了畸胎癌( 即恶性的畸胎瘤) ，畸胎癌内的细胞( 即EC，胚胎癌细胞) 能在体外自我更新且能分化成不同种类的细胞，由于这种类型的畸胎癌只能由着床前的早期小鼠胚胎产生，因此推测EC细胞的来源是胚胎发育早期短暂出现的外胚层细胞( epiblast) 关于EC细胞的研究使科学家认为可能从小鼠早期胚胎中分离到一种能分化成多种细胞的具有全能性的干细胞，即胚胎干细胞( ESC)。

ES细胞研究，首先源于畸胎瘤干细胞(teratocarcinoma stem cell)或胚胎瘤细胞(embryoniccarcinoma cell , EC细胞)。1958年，Steven通过把小鼠早期胚胎移植到129小鼠精巢或肾脏被膜下得到了EC细胞。1981年，英国剑桥大学的Evans和Kaufman[3]用延缓着床的胚泡和美国加州大学旧金山分校的Martin用条件培养基分别成功地分离、体外培养了小鼠的ES，从此进入了胚胎干细胞培养建系的新纪元。此后，人们建立了许多动物的ES细胞系，1990年，Evans[4]、Strojek[5]各自成功地建立了猪类ES细胞系。1992年，Matsui[6]等用小鼠原始生殖细胞首先建成EC细胞系，又开创了一种新的建立全能性(或多能性)细胞系的材料。1994年，Robert[7]用牛原始生殖细胞建成EC细胞系，证明了原始生殖细胞可以作为建立全能性(或多能性)细胞系的新型材料。1995年Thomson[8]等从恒河猴的胚囊中分离、建立了ES细胞株，这是第一个建株的灵长类动物的ES。近年来，美国Wiscosin大学的Thomson和Hopkins大学的Gearhart分别用不同的方法成功的得到了几个人的ES细胞系，这一工作奠定了对人ES实验研究的基础。国内在细胞胚胎干方面的综合性研究虽然起步较晚(1989年) ，但发展非常迅速，在基础研究方面，尚克刚赖学良等已先后建立了小鼠和兔细胞系，盛惠珍研究小组在国际上首次构建了人-兔核移植重构胚。在应用研究方面，窦忠英的科研小组已第6次从人类胚胎干细胞中分化诱导得到心脏跳动

样细胞团，中国军事医学科学院发现了人胚胎干细胞素，用于临床多种疾病的治疗取得了明显效果[9]。

2 胚胎干细胞的特征

2.1 胚胎干细胞的生物学特征

ES细胞显著区别于其他细胞：（1）ES细胞具有全能性，体外培养可诱导分化成机体的任何组织细胞类型。细胞全能性的标志是细胞表面有胚胎抗原和Oct4蛋白[10]；（2）ES细胞具有无限增殖性，体外培养能在未分化状态下无限增值；（3）ES细胞具有种系传递功能；（4）ES细胞易于进行基因改造操作；（5）ES细胞保留了正常二倍体的性质且核型正常；（6）ES细胞能参与胚胎各组织器官的生长发育，获得包括生殖系在内的后代；（7）ES细胞多数处在细胞周期的S期，缺少G1期检测点；（8）在雌性哺乳动物的每个体细胞内，2个X染色体中的一个会永久失活，X失活不发生于未分化的ES细胞[11,12]。

2.2 胚胎干细胞的形态学特征

ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，细胞体积小，核大，核质比高，有一个或多个明显的核仁，核型正常，具有整倍性。在体外分化抑制性生长时，ES细胞呈克隆状生长，排列紧密，呈鸟巢集落状，难以看清细胞界限，集落边界清晰，有立体感用碱性磷酸酶染色，ES细胞呈棕红色，而周围的成纤维细胞呈淡黄色，小鼠ES细胞的直径为7 ～18 m，猪牛羊ES细胞的颜色较深，直径为12 ～18m [13]。

3 胚胎干细胞的分离与培养

3.1 胚胎干细胞的建系

ES细胞建系，来自由分离的内细胞群细胞从5 ～9周的胚胎生殖腺中分离ES细胞，

也用克隆技术将体细胞核移植到去核卵母细胞中，使之发育成囊胚，再分离其内细胞群细胞，由这种方法获得的细胞或组织，遗传物质和供体一致，故移植后不会产生免疫排斥反应。Hwang等[14]应用这种方法获得了胚胎干细胞1981年，Evans等首先建立了小鼠的ES细胞系，在此之后近20年里，人们相继自早期胚胎建立了仓鼠、猪、兔、水貂、大鼠、鱼类、鸟类、牛等灵长类动物( 恒河猴狨) 和人的类ES细胞系，从PGCs分离克隆到小鼠EG细胞系后，人们分别自PGCs分离克隆到人山羊鸡等类ES细胞[15]。

3.2 胚胎干细胞的体外培养

3.2.1培养基成分

需要特殊的培养液，由于胚胎干细胞来源于分裂增殖的早期胚胎细胞，营养要充足以维持其生长代谢。因此，需要含糖量高营养丰富的高糖型DMEM培养基以提供饲养细胞生长所需要的能量，同时又能提高胚胎干细胞的增殖速度。

3.2.2饲养层细胞

饲养层细胞能向培养液中分泌多种细胞因子提供胚胎干细胞生长的环境和信号，通过细胞接触机制和非接触机制，促进胚胎干细胞增殖并阻止其分化饲养层细胞的来源，可以是人或胚鼠的成纤维细胞。

3.2.3细胞因子

许多细胞因子有促进胚胎干细胞增殖和抑制其分化的作用，需要加入白血病抑制因子抑制分化。

4 胚胎干细胞的鉴定

4.1 形态学鉴定

胚胎干细胞的形态结构与早期胚胎细胞相似，细胞体积小，核质比高，细胞核显著，核

内有一个或多个核仁，细胞之间界限不清晰，紧密聚集呈鸟巢状。

4.2 生长特性鉴定

ES细胞在体外分化抑制培养时，有集群生长的趋势，呈集落状生长，细胞堆积密集，集落周边整齐，与饲养层界限分明且色泽深亮，有时会有单个ES细胞和分化的扁平状上皮细胞。但不同物种、不同类型的ES细胞的特征又有所不同。如小鼠ES细胞直径一般为12～14μm，ES细胞集落表面细胞层次分明，以环状形式排列，呈典型的“鸟巢状”；牛的为11～19μm，猪的为12～15μm，兔的为9～12μm，且它们的ES细胞集落呈“馒头状”。

4.3 免疫学鉴定法

碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, AKP)：许多研究表明，AKP的高表达与未分化的多能干细胞相关，如哺乳动物的桑葚胚和早期囊胚碱性磷酸酶呈阳性，并且在桑葚胚和胚泡细胞中均有AKP的表达，ES细胞中也都含有丰富的AKP，而在已分化的ES细胞中AKP 呈弱阳性或阴性，因此，可以鉴定ES细胞是否分化[16]。

5 胚胎干细胞的研究应用

5.1 胚胎干细胞在生物基础上的应用

5.1.1胚胎干细胞作为外源基因导入的重要受体细胞之一

随着功能基因组学研究的全面展开，利用胚胎干细胞建立转基因动物的研究热点在基因打靶上，因为这种方法能够将外源基因导入靶细胞染色体上某一特定部位或使某一基因发生定点突变实现了外源基因的定点整合。

5.1.2胚胎干细胞用于人体发育的细胞和分子机制的研究

在哺乳动物中，由于在胚胎发生的重要时期的细胞数量很少且细胞之间的关系极为复

杂分析单个信号的作用十分困难。胚胎干细胞体外培养定向诱导分化体系的建立避开了这些障碍，将十分复杂的问题简单化为细胞及细胞外分化调节因子，提供一个相当对单纯的反应环境，大大方便了人们对细胞分化及胚胎发育的分子机制的研究。

5.1.3胚胎干细胞用于动物生理机能调控的研究

利用基因定位技术破坏相关基因，可以制备甲状腺肾上腺卵巢胰腺功能紊乱的小鼠模型，以研究高血压和繁殖功能与下丘脑-垂体分泌激素调节的关系。利用基因定位技术可以研究肿瘤的形成过程，转基因小鼠可用于研究肿瘤的形成过程近交系小鼠肿瘤发生过程的特异性，表明肿瘤发生具有遗传性。利用基于定位技术研究激素与控制生物发育基因的关系，用细胞遗传操作技术增加或删除控制发育的基因制备基因缺失型小鼠，观测这种小鼠的表现以及对有关激素作用的反应。

5.2 人类胚胎干细胞的临床应用

人类ES细胞的临床应用，既是将人类ES细胞进行一定程度的克隆，用于治愈疾病。而治疗性克隆，一直是世界上争议的话题，英国、日本、中国、韩国等支持治疗性克隆，认为这是社会的进步；而美国、德国等一直反对对人类胚胎进行的任何克隆。2010年10月，美国杰龙生物医药公司培植的GRNOPC1人类ES细胞已在佐治亚州亚特兰大“牧者中心”医院展开全球首宗人类胚胎干细胞治疗的人体临床试验，以评估GRNOPC1人体ES细胞用在治疗脊髓损伤方面的安全性与耐受性。2010年11月，美国食品和药物管理局（FDA）同意美国先进细胞技术公司可以实施使用闲置的试管婴儿的ES细胞治疗遗传性眼病的临床试验。2011年7月，该公司正式进行了首例以人类ES细胞医治渐进式失明患者的手术。早期迹象显示，患者在手术过程中适应良好。2011年9月，英国药品监管部门于批准美国马萨诸塞州的先进细胞技术公司开展人类ES细胞试验。该公司今后将利用人类ES细胞就青少年失明展开临床试验。这是欧洲首次批准人类胚胎干细胞临床试验。

5.3 胚胎干细胞在生产上的应用

由于胚胎干细胞可以作为外源基因的受体，所以人们可以利用它来生产一些携带有特殊功能基因的转基因动物。生产转基因动物的方法有两种：①胚胎嵌合法将一定数量的转基因胚胎干细胞注射入囊胚或裸胚共同培养生成嵌合胚，再将嵌合胚移植入同期发育的受体母畜子宫使其产下嵌合体动物，然后互相交配通过有性生殖生产纯合基因型转基因动物。

②细胞核移植法以携带有外源基因的胚胎干细胞作核供体进行核移植生产转基因胚胎，通过胚胎移植将转基因胚胎移植给受体母畜即可生产转基因动物，转基因动物携带的外源基因在世代交替过程中能逐代传递。

6 目前存在的问题及展望

在ES细胞的研究中，仍然存在着许多问题，如诱导分化效率低定向细胞分离和纯化困难培养条件滞后定向分化的机制临床应用与转基因的安全性交叉污染免疫排斥等。除这些外，由于ESC涉及早期胚胎，因此由涉及的伦理社会法律医学神学和道德等争议也限制了当前hES细胞的发展，不得不引起重视[17]。

近年来的研究显示，体细胞在四个转录因子Oct-4 Klf-4Sox-2和c-Myc的作用下可以重编程为诱导多能干细胞( induced pluripotent stem cells，iPSC)，由于人iPSC 可以较容易地由个体自身的体细胞经诱导获得，同时避免伦理方面的问题，因此，iPSC 被认为是替代ESC的良好材料，为了提高iPS 细胞技术的效率及安全性，研究围绕着筛选标记载体系统转导基因的种类体细胞类型和一些可以促进效率提高的化合物筛选等展开，目前进展很快。

但是，iPS 细胞也存在许多谜团，如iPS 细胞其体细胞特异的基因是否完全沉默重编程的结果差异和危险性等[18]希望随着科技的发展，科学家们能陆续解答这些谜团，让ESC和

iPS 更好的造福于人类。

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人胚胎干细胞的研究发展

人胚胎干细胞的研究发展 摘要：叙述了人胚胎干细胞（hES细胞）的研究现状，并对hES 细胞的研究进展及其应用前景等全面综述。 关键词：人，胚胎干细胞，原始生殖细胞，全能性，多功能性干细胞(Stemcell)是一类具有自我更新能力的多潜能细胞，即干细胞保持未定向分化状态和具有增殖能力，在合适的条件下或给予合适的信号，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，又称其为“万用细胞”。干细胞来源于胚胎、胎儿组织和成年组织。根据发育阶段，干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。1998 年Thomson等第一次从胚胎中分离培养了人体胚胎干细胞(hES C)，并随后发现它能分化为体内几乎所有的细胞后，由此掀起全球范围内的hESC研究热潮。 人胚胎干细胞的生理意义：人胚胎干细胞最有价值的应用是用来修复甚至替换已丧失功能的组织和器官，因为它具有发育分化成所有类型组织细胞的能力。任何导致丧失正常细胞的疾病都可以通过移植由胚胎干细胞分化而来的特异组织细胞来治疗，如用神经细胞治疗神经变性疾病（帕金森综合征、亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病等），用造血干细胞重建造血功能，用胰岛细胞治疗糖尿病，用心肌细胞修复已坏死的心肌等。 1 人胚胎干细胞的来源 胚胎干细胞来源于着床前的囊胚内细胞团或早期胚胎的原始生殖细胞是一大类未分化的二倍体全能干细胞，具有无限增殖、自我更新

和多向分化的潜能。 2 人胚胎干细胞的生物学特性 (1)具有分化的多潜能性，在体外可诱导分化出属于三个胚层的分化细胞; (2)具有种系传递功能; (3)具有长期的未分化增殖能力，细胞不仅能分化成各种器官组织，而且能增殖生成新的保持同种性状的ES 细胞; (4)易于进行基因改造操作; (5)保留了正常的二倍体的性质且核型正常; (6)胚胎干细胞端粒酶活性呈阳性,具有维持端粒长度,保持干细胞增殖能力的重要作用。 3 人胚胎干细胞的培养 (1) 常规培养液常用的基础培养基有改良伊格尔培养基(MEM)α、达氏修正依氏培养基(DMEM)、组织培养基(TCM)199、F12 等合成培养基，以DMEM应用最为普遍。它的主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和一些其他辅助物质。 (2) 无血清培养基血清中含有许多未知的成分和一些分化诱导因子，不利与ESC未分化状态的维持。为此人们尝试使用无血清培养液、化学合成培养液’进行ESC的培养，加入刺激细胞生长的激素、细胞因子等，实验表明ESC增殖旺盛，且能保持未分化状态，并认为无血清培养基优于血清培养基。但也有学者认为含血清培养液更利于胚胎干细胞向中胚层细胞分化,是因为血清中富含中胚层诱导因子,

胚胎干细胞的体外诱导分化模型

胚胎干细胞的体外诱导分化模型马宗源　李祺福(厦门大学生命科学学院福建厦门361005) 胚胎干细胞是具有全能性及无限制的自我更新与分化能力的一类特殊的细胞群体,它能通过祖细胞为中介,分化为各种类型的体细胞,可重演体内干细胞的分化过程。自80年代从小鼠囊胚的内细胞团分离到胚胎干细胞并建系到现在已建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞、造血细胞等体外分化体系。将胚胎干细胞体外分化成为可利用的分化模型,无论从组织结构、细胞及分子水平都体现了体内分化过程的体外重演,再加上胚胎干细胞系具有体系简单,影响因子少,可控制,便于研究等特点,因此可用于研究早期胚胎发育和细胞分化调控;可成为器官移植和修复器官的细胞来源;还可用于新型药物筛选。 1　胚胎干细胞的生物学特性 胚胎干细胞具有与早期胚胎相似的结构特征,具有较高的核质比和整倍体核型。体外培养的细胞紧密堆积,呈克隆状生长,具有发育分化的多潜能性和无限制的自我更新能力,碱性磷酸酶染色呈阳性,具有高的端粒酶活性,早期胚胎细胞均表达胚胎阶段特异性抗原SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、T RA-1-81、T R A-1-60等;表达种系转录因子OCT-4,并且可将O CT-4基因作为细胞多能性的一个标志;白介素6型细胞因子家族参与维持调节胚胎干细胞未分化状态。 胚胎干细胞建系的过程中要解决的问题在于体外不断增殖的过程中保持未分化的状态,但是细胞如何维持其未分化状态的机理并不清楚。研究发现主要是通过膜上的特异受体蛋白gp130来发挥作用,细胞因子受体蛋白g p130可激活JA N U S、酪氨酸激酶,JA K-ST A T、M EK/M A P K等信号途径,而JAK/ST A T3和M EK/ ERK信号途径则处于相对平衡的状态。另外,一些未知的膜结合分子也参与胚胎干细胞的增殖与分化。分离纯化及鉴定调节细胞的自我更新及分化的未知分子已成为研究的热点。 2　胚胎干细胞为基础的分化模型 胚胎干细胞要维持其未分化的状态,需要在胚胎饲养层中加入分化抑制因子。一旦改变了维持胚胎干细胞未分化状态的条件,胚胎干细胞首先形成胚胎小体,胚胎小体有外中内三胚层,继续分化可形成多种类型的细胞。在体外分化培养时,可自发形成有节律性跳动的心肌细胞,同时还形成骨骼肌、神经细胞、上皮细胞等。由于体外胚胎细胞可重演体内胚胎细胞的发育过程,并且基因的表达时相与体内的胚胎发育过程是相似的,在这一过程中加入外源的诱导分化因子并与相关的调控基因结合,可使胚胎干细胞分化为各种类型的细胞。现在已初步建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞和造血细胞等体外分化模型。 2.1　神经细胞　体外培养胚胎干细胞可模拟从未定型细胞向功能性神经元转化的过程,并且其基因的表达时相与体内的胚胎发育过程相似。在分化的早期表达N FL、N F M基因,后期则表达N eur ocan基因。维甲酸及神经生长因子可诱导胚胎干细胞定向分化为神经细胞,是常用的诱导分化物,它能上调神经元特异基因的表达,同时下调中胚层基因的表达。将神经元特异的SOX2基因转进胚胎干细胞,再经维甲酸诱导,可表达90%以上的具有神经元标志的神经细胞。可能是外源基因和维甲酸同时拮抗分化抑制因子的作用,阻碍细胞向其他的方向分化,迫使其向神经元的方向分化。维甲酸能诱导胚胎干细胞分化为C-氨基丁酸能和多巴胺能神经元,而维甲酸分别结合无血清培养基和含胎牛血清的培养基培养胚胎干细胞后发现,采用无血清培养时,几乎检测不到分化的多巴胺能神经元的存在;但在有血清培养时,却能检测到大量的多巴胺神经元。这暗示血清中的某些未知的因子和维甲酸共同起到定向诱导分化 化为特定组织细胞,将这些细胞回输体内,从而达到长期治疗的目的。干细胞的医学应用还包括体外克隆人体器官,然而这比体内移植干细胞要复杂的多。相信随着研究的不断深入,来自人体干细胞的器官应用于临床治疗已为期不远。干细胞研究与应用不仅在疾病治疗方面有着极其诱人的前景,而且将对克隆动物,转基因动物生产,发育生物学,新药物的开发与药效、毒性评估等领域产生极其重要的影响。 参考文献 　1　Th omson J A,Itsk ovitz-Eldor J os eph,Shapiro S S,et al. Em bryonic s tem cell lin es d erived from human b las tocysts.S cience,1998,282:1145—1147. 　2　Sh amb lott M J,Axelman J,W ang S,et al.Derivation of Plurip otent stem cells from cultured human primordial germ cell.Proc Natl Acad S ci U SA,1998,95:13726—13731. 　3　Jack son K A,M i T,Goodell M A.Hematopoietic potential of s tem cells isolated from murie s keletal mus cle.Proc Natl Acad Sci USA,1999,96:14482— 14486. 　4　裴雪涛.干细胞研究现状与展望.高技术通讯,2001, (6):93—95. (BH)

人胚胎干细胞研究的临床意义

人胚胎干细胞研究的临床意义 [关键词] 人胚胎干 健康讯: 吕广秀 20XX14上海市解放军第85医院儿科1998年11月，美国James和John Gearhart领导的2个科学小组分别发表论文阐述如何利用囊胚和原始的胚胎生殖细胞培养出可能的人全能型胚胎干细胞（ES cells）和胚胎生殖细胞系（EG cells）［1，2］。ES细胞最引人关注的2条特征是:ES细胞能在体外条件下生长，在原始的去分化条件下能够无限地分裂;同时在体外培养的所有时间内都能保持胚胎来源细胞的一个关键性特征—全能性，即发育成成体中各种细胞的能力。ES细胞的应用前景十分令人鼓舞。胚胎干细胞可以作为研究人类胚胎发育、出生缺陷及胚胎瘤等疾病的新的手段;可以用于至今为止尚未进行的关于的方法;制造人类疾病模型以利用于基础研究、药物开发和毒理学研究，如果克隆技术可以从患者自体组织中获得干细胞，则它们可解决用于治疗退行性疾病的组织短缺以及结束在移植治疗中使用免疫抑制剂;另外干细胞还可以用来作为基因治疗的一种新的基因运载系统。总之，其前景十分广泛。 1 胚胎干细胞的一般定义特征考虑到ES或EG细胞的特性，可以认为有一些表型是所有的ES细胞都应该具有的，其他一些特点可能是属于从不同种属或不同组织中分离出来的某种特定全能性细胞所特有，或表现出在胚胎发育过程中某个特定阶段所具有的特征。一般认为全能性干细胞所应具有的特征如下:（1）来源于一个全能性的细胞群体;（2）具有正常的细胞核型;（3）具永生性，在胚胎状态下能无限制的分裂;（4）培养的细胞株在体外或在畸胎瘤中能自发分化成胚胎外组织（extraembryonic tissues）和分属所有3种胚层的体细胞。但到目前为止，所有已培养成功的哺乳动物细胞中，除小鼠外，灵长类动物ES细胞只满足上述4条标准的前3条。一些研究人员将ES细胞的定义限定为那些能分化成包括生殖细胞在内的所有的细胞。但出于伦理上的原因，来源于人的ES细胞不可能进行试验以验证是否满足这一标准。因此，如果来源于人的细胞能满足其他3条关于ES细胞的一般定义，我们就认为它属于ES细胞。需要指出的是，要从体外培养或畸胎瘤试验验证一个ES细胞能否分化成所有组织类型的细胞是十分困难的，因为不论在体外培养条件下或畸胎瘤中，一些组织都是十分罕见的。 2 胚胎干细胞的最新研究James Thomson和同事于1998年报道利用治疗不孕症所遗弃的囊胚分离出ES细胞。他们所使用的技术与分离小鼠ES细胞相似:将可能

人胚胎干细胞研究进展

人胚胎干细胞的研究进展 周进学号10170807 【摘要】干细胞( Stem Cell)是一类具有分化潜能和自我复制的早期未分化细胞。胚胎干细胞( Embryonic stem cells, ES细胞)是一种早期胚胎内细胞（inner cell mass, ICM）或原始生殖细胞（primordial germ cell, PGC）经体外分化抑制培养，分离和克隆得到的具有发育全能性的高度未分化细胞。人类胚胎干细胞系的建立是人类发育生物学研究的重大突破,揭示了人体发生发展奥秘的进程,可能为现代临床医疗模式带来革命性的变化。现对人类胚胎干细胞的来源,建系、生物学特性、应用前景及所涉及的伦理学问题作一综述。 【关键词】胚胎干细胞；克隆；伦理学,医学;综述 1、胚胎干细胞的概念 胚胎干细胞是从哺乳动物早期胚胎内细胞团(ICM)或桑椹胚分离出来的、能在体外长期培养的、高度未分化的全能细胞系,可在适合的条件下分化为胎儿或成体的各种类型的组织细胞。 胚胎干细胞属全能干细胞。ESCs 这一名词因其来源于胚胎而得名, 但从研究角度来说, 其概念一直没有一个特殊的标准, 2001 年美国国立卫生院根据Austin Smith 对小鼠ESCs 的研究, 概括了ESCs 的一些基本特征, 对其概念提出了一系列标准[1]: ①、来源于内细胞团或囊胚上胚层; ②、能够无限地进行对称分裂并保持未分化状态( 长期自我更新) ; ③、显示并维持正常、完整( 二倍体) 和稳定的染色体核型; ④、全能的ESCs 能够分化成三个胚层( 内胚层、中胚层、外胚层) 来源的所有细胞类型;⑤、在发育过程中能整合到所有胚胎组织中( 体外经长期培养的小鼠ESCs, 被植入另一胚胎形成嵌合体动物后, 仍能产生所有组织) ; ⑥、具有能克隆形成胚胎细胞系的能力, 并能产生卵子或精子细胞; ⑦、基因克隆, 即一个单一的ESCs 能产生一群具有相同遗传特性的细胞( 克隆) , 这些细胞有着与亲代细胞

胚胎干细胞体外诱导分化综述

胚胎干细胞体外诱导分化综述 摘要：由于胚胎干细胞具有自我更新、高度增值和多向分化的潜能，因此，自20世纪90年代开始，对胚胎干细胞的研究成为生物学领域和医药工程领域研究的一个焦点。本文从胚胎干细胞的分离、体外诱导胚胎干细胞的原理和定向分化的机制、胚胎干细胞体外诱导的方法、定向分化的细胞、应用前景和研究存在的问题对胚胎干细胞进行综述。 关键词：胚胎干细胞；体外培养；诱导分化；应用 干细胞是一种具有多分化潜能和自我更新功能的早期未分化细胞。在特定条件下，它可以 分化成不同的功能细胞，形成多种组织和器官，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。前者指早期胚胎的多能干细胞，后者是存在于胎儿和成体不同的组织内的多潜能干细胞这些细胞具有自我复制能力，并产生不同种类的具有特定表型和功能的成熟细胞的能力，能够维持机体功能的稳定，发挥生理性的细胞更新和修复组织损伤作用[4,9,10]。 胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC)是从着床前胚胎内内细胞团(inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞[1]。它能在体外长期不断自我更新,并保持多向分化潜能,可以分化为内、中、外三个胚层的几乎所有类型细胞。自1981年Evans和Kauffman[2,8]用不同的方法首次成功分离得到小鼠胚胎干细胞以来,小鼠胚胎干细胞成为近20年来人们用来研究发育分化、基因表达调控、基因治疗等最理想的模型，并且有大量研究表明小鼠胚胎干细胞可以在体外被诱导分化为绝大多数类型的成体细胞.1998年Thomson等首次成功分离并建立人胚胎干细胞系。自此，人胚胎干细胞不但提供了一个研究人类自身发育分化的良好机会,而且如果人胚胎干细胞能像小鼠胚胎干细胞一样可以在体外诱导形成各种成体细胞,那么利用这些诱导分化形成的成熟细胞将有可能进行细胞和组织替代治疗, 包括糖尿病、帕金森病、早老性痴呆、心血管疾病和肿瘤等多种目前临床上难以治愈的疾病。 1 胚胎干细胞的分离 自Thomson成功分离并建立人胚胎干细胞系后，多年以来，人们研究出很多胚胎干细胞的 分离方法，在这里主要介绍三种： 1.1 分离自胚胎内细胞团 内细胞团又称胚细胞（embryoblast）,是一团于哺乳动物初期胚胎中的一个细胞团块。从早期胚胎内细胞团（inner cell mass,ICM）分离是获得胚胎干细胞的主要途径。由于不同动物的胚胎发育存在差异，因此应注意取材时间。可通过免疫外科手术法、机械剥离法、组织培 养法等方法除去胚胎滋养层细胞获得囊胚内细胞团（ICM）细胞进行体外分化抑制培养。 1.2分离自原始生殖细胞

小鼠胚胎干细胞培养实验步骤

细胞的原代培养 点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园 一、原代细胞培养原理 原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。 ? 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养 ? 掌握无菌操作技术 ? 了解小鼠解剖操作技术 ? 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 ?了解培养细胞的消化分散 ? 了解倒置显微镜的使用 二、实验材料 ? 实验动物：孕鼠或新生小鼠 ? 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清） 0.25%胰蛋白酶 平衡盐溶液 70%乙醇 ?器材：灭菌镊子、剪刀若干把 灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个 吸管若干支 酒精灯 原代细胞培养方法 三、胰酶消化法 （1）胰酶消化法操作步骤——取材 a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。

b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。 c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。 e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。 f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。 （2）胰酶消化法操作步骤——切割 a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。 b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。 c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。 （3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养 a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。 e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。 e. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。 （4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养

胚胎干细胞研究进展-干细胞的研究进展

---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 胚胎干细胞研究进展-干细胞的研究进展胚胎干细胞研究进展-干细胞的研究进展干细胞的研究进展干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞群体。 近年来干细胞的应用几乎涉及到所有生命科学和生物医学领域。 本文概述了干细胞的生物学特性，并综述了干细胞的可塑性、分离培养及其在基础研究及临床上的应用的研究进展。 最后，展望了今后研究的方向。 干细胞；生物学特性；可塑性；分离培养；应用 Advances in study of stem cells Stem cells are non-specialized cells which have the ability of self-renewal and multiple differentiation potential. The application of stem cells has nearly involved in all the research field on life sciences and biomedicine in recent years. This article summarizes the biological characteristic of stem cells, and reviews the latest progress in the study on stem cells plasticity, isolation, culture in vitro, and its extensive application in basic research and clinical application. The prospects of stem cells are also discussed. stem cells; biological characteristic; plasticity; isolation; culture in vitro; application 干细胞（stem cells）是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细 1 / 10

简述干细胞的形态特征及其研究进展

简述干细胞的形态特征及其研究进展 干细胞是一类具有自我复制能力的原始的未分化细胞，是形成哺乳类各组织器官的原始的多潜能的细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。干细胞在形态上具有共性，通常呈圆形或椭圆形，细胞体积小，核相对较大，细胞核多为常染色质，并具有较高的端粒酶活性。根据它所处的发育阶段可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。 胚胎干细胞的发育等级较高，是全能干细胞，而成体干细胞的发育等级较低，是多能干细胞或单能干细胞。干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响。目前人类胚胎干细胞已可成功地在体外培养。 干细胞的形态特征： 干细胞具有自我更新复制的能力，能够产生高度分化的功能细胞。 1 胚胎干细胞：胚胎干细胞当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团的 细胞即为胚胎干细胞。具有全能性，可以自我更新并具有分化为体内所有组织的能力。进一步说，胚胎干细胞是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。 2 成体干细胞：成年动物的许多组织和器官，比如表皮和造血系统，具 有修复和再生的能力。成体干细胞在其中起着关键的作用。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。 3 造血干细胞：造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在 于骨髓、外周血、脐带血中。造血干细胞的移植是治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性和转移性恶性肿瘤疾病的最有效方法。 4 神经干细胞:理论上讲，任何一种中枢神经系统疾病都可归结为神经 干细胞功能的紊乱。脑和脊髓由于血脑屏障的存在使之在干细胞移植到中枢神经系统后不会产生免疫排斥反应。除此之外，神经干细胞的功能还可延伸到药物检测方面，对判断药物有效性、毒性有一定的作用。 5 肌肉干细胞:可发育分化为成肌细胞，可互相融合成为多核的肌纤维，形成骨骼肌最基本的结构。

胚胎干细胞体外培养.

胚胎干细胞体外培养 (一)胚胎干细胞的来源 目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。其中囊胚的ICM最为常用。 (二)胚胎干细胞的分离 1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。以PGCs取ES细胞时：小鼠取1 2.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或1 3.5～1 4.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。 2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。 从囊胚分离ICM的方法主要有三种： (1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。 (2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。Evans和Kaufman采用这种方法第一个建立了小鼠ESCs系。 (3)显微外科学方法：小鼠受精后3～4天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养。 由于免疫外科学方法需要特殊的试剂去除透明带和滋养层，易对内细胞群造成损伤，而显微外科学方法需要专门的仪器设备，且对人员的技术水平要求较高，均难以推广应用。组织培养法将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落。 (三)胚胎干细胞的培养和建系 ESCs的分离培养和建系是其得以应用的前提。ESCs建系的原理是：将分离获取的ICM 或PGCs与饲养层共同培养，使之增殖而又保持其未分化状态，这样代代相传从而使ESCs

胚胎干细胞的起源和同一性

胚胎干细胞的起源和同一性 摘要 胚胎干细胞在生物研究方面应用广泛，也作为研究哺乳动物早期发育的模型，但是它们精确的起源却是备受争议。传统上认为它们来源于植入前的胚胎，但这暗示着形成胚胎干细胞的细胞可能已经有发育为原始生殖细胞命运倾向的外胚层细胞产生，它通过原始生殖细胞系形成胚胎干细胞。根据最近的研究发现我们提出胚胎干细胞可以直接来源于早期的外胚层细胞，这些胚胎干细胞可以通过不同培养条件形成的两条不同路径出现。 关键词：细胞，胚胎干细胞，同一性 简介 多能性是小鼠胚胎内细胞团形成外胚层的首要要求。在合适的培养条件下，内细胞团细胞可以在体外以胚胎干细胞的形式增殖。这些细胞保持有重新进入一个胚胎（形成嵌合体）的能力，使这些细胞发育为成体的所有组织，包括生殖细胞系和俗称为幼稚多能细胞。多能干细胞最初来源于小鼠睾丸的畸胎瘤。由于畸胎瘤相对其他组织而言在生殖细胞系中更常见可以推断这些畸胎瘤起源于干细胞；小鼠的睾丸瘤一般在出生后形成；在胎儿的睾丸小管中可以清晰的观察到初期的瘤。随后发现多能性细胞系很难与胚胎干细胞区分开来，这些胚胎干细胞来源于体外发育的小鼠重新编程的胚胎的原始生殖细胞。因此，捕获幼稚多能细胞的机会之窗在发育过程中打开两次：第一次在早期的外胚层而第二次在干细胞系。

胚胎生殖细胞与胚胎干细胞的相似之处强烈暗示着胚胎干细胞可能来源于那些已经有发育为原始生殖细胞倾向的外胚层细胞。也有假说称是原始生殖细胞促进培养植入前和植入后发育阶段的胚胎形成外植体。在这个假说中，我们依据近来的发现猜想胚胎干细胞可能通过两条途径得到外植体：直接来源于新形成的外胚层，它处于幼稚多能状态；或者培养在进行遗传重编程的特定原始生殖细胞，使它们重获多能性（图1）。 图1.幼稚多能细胞来源在一定条件下分离小鼠的胚胎干细胞、胚胎生殖细胞和原始生殖细胞。（A）体内发育过程。在囊胚后期的早期外胚层（红色）出现幼稚多能细胞系和受精后8.5天的原始生殖细胞（黄色）（B）体外培养到囊胚期的另一条产生幼稚多能细胞的途径。红心代表早期外胚层分离胚胎干细胞的路径；黄心代表通过形成原始生殖细胞而发育为胚胎干细胞的较长的路径。灰色箭头代表长期培养可能会得到胚胎干细胞或胚胎生殖细胞的假说。图示大小不代表真实比例。 幼稚多能性的出现 哺乳动物受精后产生一个发育为完整的胚胎的受精卵和形成胚外世系。受精卵经过几轮的卵裂之后产生均等的卵裂球，但是在囊胚

苏教版高中生物选修3 3.2《胚胎干细胞的研究及其应用》学习要点

第二节胚胎干细胞的研究及其应用 学习目标 1.理解干细胞的概念与分类。 2.掌握胚胎干细胞来源、特点及分离途径与方法。 3.举例说明胚胎干细胞的应用。 4.了解胚胎干细胞的研究进展及其所面临的各种挑战。 学习重、难点 学习重点 1.理解干细胞的概念。 2.简述胚胎干细胞的特点及其研究进展。 学习难点 简述胚胎干细胞的特点及其研究进展。 知识要点梳理 一、胚胎干细胞及其研究进展 1.干细胞的概念：是动物（包括人）胚胎及某些器官中具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞。 2.干细胞作用：具有重建、修复病损或衰老组织、器官功能。 3.干细胞分类 （1）专能干细胞：只能分化成一种类型或功能密切相关的两种类型的细胞，如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞。（2）多能干细胞：具有分化成多种细胞或组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，如造血干细胞等。（3）全能干细胞：可以分化为全身的多种细胞，并进一步形成机体的所有组织、器官。 二、胚胎干细胞的应用 1.如果科学家最终能够成功诱导和调控胚胎干细胞的分化与增殖，将会给胚胎干细胞的基础研究和临床应用带来积极的影响。 2.在研究新药对各种细胞的药理和毒理试验中，提供了材料，大大减少了新药研究所需动物的数量，从而降低了成本。 3.胚胎干细胞研究为细胞或组织移植提供无免疫原性的材料，用于疾病治疗等，给人类带来全新的医疗手段。

4.通过胚胎干细胞，结合基因工程等还可以在试管中改良并创造动物新品种，培育出生长快、抗病力强、高产的家畜品种等。 三、胚胎干细胞研究面临的挑战 1.胚胎干细胞的应用给法律、伦理、国家和社会安全带来的冲击是空前的。 2.胚胎干细胞在体内或者是体外都具有自我分化的潜能，极易分化成其他细胞，对培养条件的优化仍需要进一步研究。 3.对胚胎干细胞向不同组织细胞定向分化的条件还不清楚。 4.创造一种“万能供者”细胞，需要破坏或改变细胞中的许多基因，其可行性仍不清楚。

胚胎干细胞的研究进展

胚胎干细胞的研究进展 摘要：胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES cells) 是存在于胚胎发育早期阶段，具有自我更新和多分化潜能性的干细胞，是组成机体各种组织器官的起源细胞。已经广泛用于生命科学的许多领域，它在医学方面的应用成为医学领域的研究热点。本文综述了近些年关于胚胎干细胞分离培养与鉴定特征和应用的研究进展，同时也指出了目前所面临的问题，对今后的研究方向进行了展望。 关键词：胚胎干细胞；分离培养与鉴定特征；应用 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）是一种从早期胚胎的囊胚内细胞团细胞或胎儿原始生殖细胞( primordial germ cells，PGCs) 中经分离体外抑制分化培养得到的具有发育全能性( 或多能性) 的一类干细胞，与已经成熟分化的体细胞一样，ES细胞也是一分为二地分裂增殖，且ESC具有体外培养无限增殖自我更新和多向分化的特性。在一定的培养条件下，ES细胞可以在体外长久和稳定地自我复制，实现永生，无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为内中外3个胚层的几乎所有类型细胞。因此，ES细胞成为研究哺乳动物早期胚胎发生细胞组织分化基因表达调控等发育生物学基础研究的一个非常理想的模型系统和非常有用的工具，也是进行动物胚胎工程开发和用于治疗各种疾病，修复受损伤的组织和器官的一个重要途径，具有广泛的应用前景[1,2]。 20世纪末开始，ES细胞的研究就一直是生物医学领域的热点。美国《科学》杂志评出的上个世纪十大科学突破中，“干细胞研究与应用”名列榜首。ES细胞的研究还处于起步阶段，目前人们已经能够分离培养干细胞，但诱导ES细胞定向分化还面临许多困难。

2.1 干细胞来源及生物学特征

干细胞来源及生物学特征

什么是干细胞(STEM CELL)？ ?干细胞(stem cell)是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。 ?在细胞的分化过程中，细胞往往由于高度分化而完全失去了再分裂的能力，最终衰老死亡。 ?机体在发展适应过程中为了弥补这一不足，保留了一部分未分化的原始细胞，称之为干细胞。 ?一旦生理需要，这些干细胞可按照发育途径通过分裂而产生分化细胞。 ?1963年，恩尼斯特.莫科洛克和詹姆士.堤尔首次证明了血液中干细胞的 存在，开启了干细胞研究的大门。 ?。

什么是细胞分化？ ?细胞分化(cell differentiation )：同一来源的细胞，通过细胞分裂在细胞间产生形态结构、生化特征和生理功能有稳定性差异的过程。 ?是个体发育中组织器官形成的基础，是发育生物学的中心问题。 ?时间上的分化：一个细胞在不同的发育阶段有不同的形态结构、生化特征和生理功能，如骨髓内血细胞的发生过程。 ?空间上的分化：同一种细胞的子代细胞所处的环境位置不同，其形态结构、生化特征和生理功能也不一样，如外胚层来源的细胞可发育成表皮细胞、神经细胞等。

干细胞的特点 ?干细胞本身不是处于分化途径的终端。 ?能无限的增殖分裂。 ?可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态。 ?通过两种方式生长： 对称分裂--形成两个相同的干细胞 非对称分裂--由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀地分配，使得一个子细 胞不可逆的走向分化的终端成为功能专一的分化细胞;另一个保持亲代的特征，仍作为干细胞保留下来。 干细胞是具有多向分化潜能和自我更新特点的增殖速度较缓慢的细胞。

干细胞的应用及研究方向

干细胞的应用及研究方向 摘要 干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞群体。近年来干细胞的应用几乎涉及到所有生命科学和生物医学领域。本文概述了干细胞的生物学特性，并综述了干细胞的可塑性、分离培养及其在基础研究及临床上的应用的研究进展。最后，展望了今后研究的方向。 干细胞（stem cells）是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，即这些细胞可以通过细胞分裂维持自身细胞群的大小，同时又可以进一步分化成为各种不同的组织细胞，从而医学界称之为“万用细胞”。1981年英国的Evans和Kaufman用延缓着床的胚泡首次成功地分离了小鼠胚胎干细胞,从而在全球掀起了有关干细胞的研究热潮。1997年2月英国苏格兰罗斯林研究所威尔穆特博士等成功克隆出“多利”绵羊，1998年11月,美国Thomson［1］和Gearhart［2］分别用不同的方法获得人胚胎干细胞及胚胎生殖细胞,此后,干细胞的研究便进入了一个全新的时代。1999年，有关干细胞的研究被Science评为1999年度十大科学进展之首。2000年12月干细胞研究再次被《科学》杂志评为该年度世界十大科学成就之一。本文就近几年来干细胞的研究进展综述如下。 1干细胞的生物学特性 根据干细胞的发育阶段，可将其分为胚胎干细胞和成体干细胞（Adult Stem Cell，AS）。胚胎干细胞即具有分化为机体任何一种组织器官潜能的细胞,包括胚胎干细胞、胚胎生殖细胞（Embryonic Germ Cell，EG）。成体干细胞即具有自我更新能力,但通常只能分化为相应组织器官组成的“专业”细胞,它是存在于成熟个体各种组织器官中的干细胞,包括神经干细胞、血液干细胞,骨髓间充质干细胞、表皮干细胞、肝干细胞等。 1.1胚胎干细胞的生物学特性 胚胎干细胞最早是直接从小鼠早期胚胎分离建系的,它们具有其自身的生物学特性。与其他细胞系相比较, 胚胎干细胞的特点在于:（1）具有不断增殖分化的能力，所以，在体外培养条件下可以建立稳定的干细胞系，并保持高度未分化状态和发育潜能性。1999年Soiter等［3］利用这个特性将ES/EBs及其分化细胞作为有关药物的针对筛选系统,进行药物毒性检测实验。（2）具有高度的发育潜能和分化潜能。体内外可分化出外、中、内三个胚层的分化细胞，可以诱导分化为成体细胞内各种类型的组织细胞。胚胎干细胞含有正常二倍染色体，具有种系传递功能,能广泛参与宿主胚胎各组织器官的生长发育,并形成包括生殖系在内的合体后代生殖细胞。1995年Pacacio等［4］利用骨髓基质细胞或其培养液,将胚胎干细胞在体外诱导分化为造血干细胞。1997年Baker等［5］在缺乏新霉素(geneticin,g418)的条件下,将Rosaβ-geo基因转染胚胎干细胞后能在体外诱导分化为软骨细胞。同年Deni等报告将胚胎干细胞通过悬滴培养可分化出脂肪细胞。（3）能进行体外培养扩增,还可以对其进行遗传操作选择, 如导入异源基因、报告基因或标志基因，诱导某个基因突变等。扩增、遗传操作及冻存均不丧失其多能性。冻存的细胞可在需要时随时解冻,继续培养不失其原有特性。 1.2成体干细胞的生物学特征

小鼠胚胎干细胞培养实验步骤 一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化 ...

小鼠胚胎干细胞培养实验步骤 一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态 培养基 细胞复苏 冻存细胞 明胶包被 细胞传代 体外分化 培养基 包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片） 体外分化方法 注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol 和培养基。 一般培养--维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed 细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。 培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml 该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。 贮存液 DMEM(高糖) 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST LIF

干细胞研究的历史、现状与未来

干细胞研究的历史、进展与未来 中国科学技术大学生命科学学院2004级胡文宝 干细胞是尚未分化发育的，能生成各种器官组织的全能细胞。它是具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，即这些细胞可以通过细胞维持自身细胞群大小，同时又可以进一步分化成为各种不同的组织细胞，从而构成机体各种复杂的组织和器官。干细胞可以来自胚胎、胎儿或成体。根据其来源不同，干细胞可分胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞的分化和增殖构成动物发育的基础，即由单个受精卵发育成为具有各种组织器官的个体，成体干细胞的进一步分化则是成年动物体内组织和器官修复再生的基础。 干细胞研究的历史： 1959年，美国首次报道了通过体外受精（IVF）动物。 60年代，几个近亲种系的小鼠睾丸畸胎瘤的研究表明其来源于胚胎生殖细胞（embryonic germ cells, EG细胞）,此工作确立了胚胎癌细胞（embryonic carcinoma cells, EC细胞）是一种干细胞。 1968年，Edwards 和Bavister 在体外获得了第一个人卵子。 70年代，EC细胞注入小鼠胚泡产生杂合小鼠。培养的SC细胞作为胚胎发育的模型，虽然其染色体的数目属于异常。 1978年，第一个试管婴儿，Louise Brown 在英国诞生。 1981年，Evan, Kaufman 和Martin从小鼠胚泡内细胞群分离出小鼠ES细胞。他们建立了小鼠ES细胞体外培养条件。由这些细胞产生的细胞系有正常的二倍型，像原生殖细胞一样产生三个胚层的衍生物。将ES细胞注入上鼠，能诱导形成畸胎瘤。 1984—1988年，Anderews 等人从人睾丸畸胎瘤细胞系Tera-2中产生出多能的、可鉴定的（克隆化的）细胞，称之为胚胎癌细胞（embryonic carcinoma cells, EC细胞）。克隆的人EC细胞在视黄酸的作用下分化形成神经元样细胞和其他类型的细胞。 1989年，Pera 等分离了一个人EC细胞系，此细胞系能产生出三个胚层的组织。这些细胞是非整倍体的（比正常细胞染色体多或少），他们在体外的分化潜能是有限的。 1994年，通过体外授精和病人捐献的人胚泡处于2-原核期。胚泡内细胞群在培养中得以保存其周边有滋养层细胞聚集，ES样细胞位于中央。 1998年，Thomoson等从治疗不育症的夫妇捐献的正常人胚泡中分离得到内细胞群。细胞经培养可多次传代，保持正常核型，具有高水平的端粒酶活性，表达人ES细胞而灵长类ES细胞的特征。当将几种非克隆化细胞系的细胞注入免疫缺陷小鼠内后可形成畸胎瘤。畸胎瘤含有来源于原始胚层的多种细胞类型，这证明了人ES细胞的多能性。 2000年，由Pera、 Trounson 和 Bongso 领导的新加坡和澳大利亚科学家从治疗不育症的夫妇捐赠的胚泡内细胞群中分离得到人ES细胞，这些细胞体外增殖，保持正常的核型，自发分化形成来源于三个胚层的体细胞系。将其注入免疫缺陷小鼠错开内产生畸胎瘤。 2003，建立了人类皮肤细胞与兔子卵细胞种间融合的方法，为人胚胎干细胞研究提供了新的途径。 2004年，Massachusetts Advanced Cell Technology 报道克隆小鼠的干细胞可以通过形成细小血管的心肌细胞修复心衰小鼠的心肌损伤。这种克隆细胞比来源于骨髓的成体干细胞修复作用更快、更有效，可以取代40%的瘢痕组织和恢复心肌功能。这是首次显示克隆干细胞在活体动物体内修复受损组织。 干细胞研究的进展： 1.干细胞的来源 胚胎干细胞主要来源于胚胎组织，而用于治疗的应该是人的胚胎干胚胎干细胞，由于人

胚胎干细胞

胚胎干细胞的研究现状及应用前景 专业：生物技术班级：093班 姓名:贺霞霞学号：2009132117 摘要：胚胎干细胞是一种早期胚胎内细胞或原始生殖细胞经体外分化抑制培养，分离和克隆得到的具有发育全能性的高度未分化细胞。本文综述了胚胎干细胞的全能性或多能性、生物学特性及国内外研究现状和胚胎干细胞的应用，并对其应用前景进行了展望。从胚胎干细胞生物学特性，从胚胎干细胞研究给医疗领域带来的广泛应用前景到目前研究尚存在的困难,比较全面的反映了胚胎干细胞研究的现状和应用前景。 关键词：胚胎干细胞;生物学特性;现状;应用前景 1 胚胎干细胞概述 1.1 胚胎干细胞的概念 胚胎干细胞(embryonic stem cells，简称ESC),它是由着床前（受孕3～5d）的囊胚内细胞团(ICM)经体外分化抑制培养所得一种高度未分化细胞,具有全能性、无限增殖和多向分化的潜能。这种细胞在形态上有较高的核浆比，核仁明显；表达高水平的端粒酶，端粒酶是一种可使细胞无限分裂的RNA 依赖性DNA聚合酶，为永生化细胞所特有，分化细胞内无此酶活性。 1.2 胚胎干细胞的生物学特性 ①全能性。在体外培养的条件下, 胚胎干细胞可以诱导分化为机体的任何组织细胞。全能性的标志是细胞表面有胚胎抗原和Oct4蛋白[1]。 ②无限增殖性。胚胎干细胞在体外适宜条件下, 能在未分化状态下无限增殖。 ③胚胎干细胞具有种系传递的功能。 ④胚胎干细胞易于进行基因改造操作。 ⑤细胚胎干胞保留了正常二倍体的性质且核型正常。 2 胚胎干细胞的研究现状 2.1 国内研究现状 在干细胞研究方面, 我国的反应较快。综合性干细胞研究在我国虽然刚刚起步, 但已取得了和