细胞增殖检测MTT法

细胞增殖检测：MTT法

MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-（4，5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide，MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO 来溶解。

MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。

一、步骤

1、接种细胞

用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。

2、培养细胞

同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。

3、呈色

培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配）20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。

4、比色

选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

二、注意事项

1、选择适当得细胞接种浓度。

2、避免血清干扰：一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。

3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。

MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系，

IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！

三、举例

各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入计算公式：

Pm=0.95

Pn=0.06

P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1

Xm=lg0.1=-1

lgI=lg0.1/0.01=1

lgIC50=-1-1*（3.1-（3-0.95-0.06）/4）=-3.6025

IC50=0.00025

有一个公式可供参考；

lgIC50=Xm-I（P-（3-Pm-Pn）/4）

Xm：lg 最大剂量

I：lg（最大剂量/相临剂量）

P：阳性反应率之和

Pm：最大阳性反应率

Pn：最小阳性反应率

抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值

公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率

例：

用96孔板培养SMMC-7721肝癌做MTT测细胞活力，应该加多少1640培养基，多少MTT和DMSO合适?根据书上说的加200ul1640，20ulMTT，150ulDMSO 加DMSO之前要尽量去掉培养液，便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定

一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/ml，MTT加20ul，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值。

一般要低于IC50，避免非调亡性杀伤的细胞太多，造成流式细胞仪检测碎片太多。我一般用1/2-1/3的IC50，作用时间为36h。一般肿瘤细胞系空白处理的调亡率应低于1%，用药后一般为5-10%（Annexin V），细胞周期的亚G0峰比较明显。

MTT法心得

MTT实验是检测细胞活力的实验方法，由于细胞活力与细胞数呈正相关，因此也常常用来检测细胞的增殖情况。

一、MTT的原理

活细胞有琥珀酸脱氢酶，将MTT还原成棕褐色沉淀。由于一般介绍园子里已经很多，笔者将自己的心得按照实验流程与大家交流交流。

二、MTT法检测细胞增殖实验的注意事项

1、培养好细胞点板

养细胞没啥好说的，如果不知道细胞如何养，那就看看相关的文献方法。如果知道了细胞的名字，就可以上https://www.wendangku.net/doc/7818558151.html,检索细胞的培养信息，这个网站上的培养方法是标准培养方法。当然可以根据自己实验要求进行修改。由于细胞计数很繁琐，点板时的细胞浓度是最难掌握的，这一点笔者的心得如下：

自己先将细胞养一段时间，大概了解细胞的增殖情况，在MTT检测时实际上要求细胞大概能长满96-孔板的80-90%，如果打算养48小时就检测，根据细胞的生长情况反推点板时的细胞浓度状况。这时可以将细胞不进行计数，将消化好的细胞混匀后（可能是10ml）直接在一个废弃（最好进行过无菌处理）的96孔板中依次加入180、100、50微升细胞，将细胞放置几分钟就会沉到板底了，这时在显微镜下观察，推测哪个孔的细胞48 h能基本长满板底，假设50微升的孔比较合适，而点板时没孔需点200 微升，那么就将细胞浓度再稀释4倍就可以正式点板了，这时顺便将细胞进行计数（因为实验记录要求写啊）。这样就OK了！如果细胞还太多，将细胞稀释4倍后再重复以上操作。注意：不要过分信赖细胞计数，因为细胞计数的取样量为20 微升左右，由于颗粒的分布不均匀，代表性是很差的。建议：细胞计数一定要会，但不要完全依赖它。

点板时一定要将细胞消化成单个细胞，而且一定要混匀，最好用排枪，否则，MTT的SD 会狂大！

2、点板布局

其实这一点很多人不懈一顾。如果你的细胞要养48 h或更长，建议不要吝啬96-孔板的四周边孔，这32个边孔不能使用，建议加入灭菌PBS以饱和中间64个孔的水分。因为细胞培养过程中，边孔的水分蒸发很快，培养液及里面的药物会出现浓缩现象，细胞的状况就复杂了，有些人称之为%26ldquo;边缘效应%26rdquo;这些孔的SD也会狂大，既然如此，不如不用。

3、加MTT

如果确认你考察的药物没有氧化还原性，你可以直接加入MTT溶液（总体积的1/10），如果你没有把握，建议在加MTT前换一次液；如果你肯定考察的药物的氧化还原性很强，比如谷胱甘肽、Vit E、VitC，那建议你用PBS将细胞洗洗，否则这些药物会将MTT还原成棕褐色沉淀，这种效果可能是你不需要的。

4、加入MTT后的反应

时间为3-4h，此时弃去各孔中的液体在加入200微升的DMSO。为了将沉淀溶解完全，尽可能将水弃除干净，加入DMSO后在摇床上震摇10min。提醒：如果你的细胞贴壁不好，此时的沉淀在弃去液体时易丢失，因此贴壁不好的细胞在点板时记得将96孔板用多聚赖氨酸处理处理，要么在弃液体时先用甩板机离心，再轻轻弃去液体。关于DMSO的量，每孔的体积有点儿差异不干扰检测，只要能将沉淀完全溶解就行了。至于DMSO的体积差异不同为什么不影响检测值已经被数学证明了，在此我不多说，如果有人不明白我再证明给他看。当然为了养成良好的实验习惯，DMSO的体积还是一致的好。

5、检测MTT

还原的MTT在460-630均有较好的吸收，如果你的酶标仪是滤光片，可以选470 nm左右或630 nm左右的滤光片，如果酶标仪有单波长，你可以在检测前扫描一下吸收谱，选用最大细说波长检测就是了，最大波长，大概在550nm附近，必要时加一个参比波长以扣除非特异性吸收。

6、吸收值分析

在理想的MTT实验中，如果是细胞抑制实验，不加药物处理组的吸收值应该在0.8-1.2左右，太小检测误差占的比例较多，太大吸收值可能已经超出线性范围。这个原理在朗伯-比尔定律中有解释。

7、建议

如果你觉得MTT中出现的问题不好解决，那么建议你做CCK-8实验，原理与MTT相似，但操作上简化些，当然，费用也稍微高一些。

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细胞增殖练习题

第6章细胞的生命历程 第1节细胞的增殖 一、选择题 1.要观察植物细胞的细胞板结构,所选择的细胞应处于有丝分裂的() A.前期 B.中期 C.后期 D.末期 解析:植物细胞有丝分裂末期在赤道板位置上由高尔基体形成细胞板逐渐扩展成为细胞壁,分裂成两个子细胞。 答案:D 2.下列选项中,两类细胞的染色体数目均可呈周期性变化的是() A.蛙的红细胞与淋巴细胞 B.小鼠骨髓瘤细胞与皮肤生发层细胞 C.人的胚胎干细胞与成熟红细胞 D.牛的精细胞与精原细胞 解析:染色体数目呈周期性变化的细胞必须是能进行连续分裂的细胞,A选项中蛙的红细胞进行无丝分裂,无染色体变化;C选项中人的成熟红细胞、D选项中牛的精细胞都不再分裂;B选项中小鼠的骨髓瘤细胞与皮肤生发层细胞均能进行连续的有丝分裂,染色体数目呈周期性变化。 答案:B 3.菠菜根的分生区细胞不断分裂,对该过程的叙述,正确的是() A.细胞分裂间期,DNA复制,DNA和染色体的数目增加一倍 B.细胞分裂前期,核膜和核仁逐渐消失,中心体发出星射线形成纺锤体 C.细胞分裂中期,染色体形态稳定、数目清晰,适于染色体计数和形态观察 D.细胞分裂末期,在细胞中央赤道板的位置出现一个由膜构成的细胞板 解析:本题主要考查细胞有丝分裂的过程。间期复制的结果是DNA含量加倍,染色体数目不变;中心体发出星射线形成纺锤体只发生在动物细胞和部分低等植物细胞中;细胞板没有膜结构。 答案:C 4.在人体成熟的红细胞、蛙的红细胞以及鸡的红细胞中均能进行的生理活动是() A.中心体发出星射线 B.细胞膜中央凹陷 C.ATP合成 D.着丝点分裂 解析:人的成熟红细胞没有细胞核和复杂的细胞器,所以不能分裂,但是可以通过无氧呼吸产生乳酸和ATP。蛙的红细胞能够进行无丝分裂,先核分裂,然后细胞膜中央凹陷,缢裂形成两个子细胞,能进行有氧呼吸产生二氧化碳、水和ATP。鸡的红细胞有细胞核和各种具膜的细胞器,可以进行有氧呼吸产生二氧化碳、水和ATP。 答案:C 5.在“观察根尖分生组织细胞的有丝分裂”实验中,以下操作和结论正确的是() A.剪取5 cm根尖,用酒精和吡罗红混合液解离染色 B.右图是高倍显微镜下调节细准焦螺旋看到的视野 C.持续观察,视野中的K细胞将分裂成两个子细胞 D.视野中,N细胞的染色体数目是M细胞的一半 解析:解离时用的解离液是酒精和盐酸混合液,且剪取的根尖长2~3 mm。该实验所观察的细胞在解离时已经死亡,不会继续分裂。M细胞的着丝点尚未分裂,染色体数目并没有加倍;N细胞中着丝点分裂,染色体数目加倍。所以N细胞的染色体数是M细胞的两倍。

细胞增殖及细胞活力检测方法

细胞增殖及细胞活力检测方法 目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。 用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA链中氚含量。若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA 的合成。 但更为常用的方法是BrdU检测法。用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，

所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。 BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA 的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性DNA双链中的EdU分子。采用BrdU方法时，你必须非常小心的去对DNA进行变性，才能一方面使BrdU抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链DNA分子来进行细胞周期的分析。有了EdU 后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于DNA变性的HCl，可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在EdU法中不存在。 图1：EdU及BrdU原理示意图（摘至invitrogen说明书） 在一些情况下，细胞活力的检测相当于细胞增殖能力的测定。用于细胞活力检测的方法又很多，这些方法主要采用特殊的试剂来测定细胞的代谢活力，Alamar Blue，MTT及其他四唑盐。它们通过检测细胞的氧化还原活性来检测细胞增殖能力，所以这是一种间接的方法。 Calbiochem的快速细胞增殖试剂盒，或者，严格来说，叫细胞活力试剂盒，采用一

细胞增殖教学设计

《细胞的增殖》教学设计 巨鹿二中王耀华 一．教材分析： 细胞的增殖是必修一《分子与细胞》第六章第1节的内容。是学生在学习了细胞生命系统的物质组成、结构之后，来认识细胞这个系统的产生、发展和消亡的过程。细胞分裂的三种方式中，有丝分裂是最主要、同时也是最重要的方式。多细胞生物的生长发育过程中，体细胞的增多就是通过有丝分裂实现的。无论是单细胞真核生物还是多细胞生物他们各种形式的无性生殖也是通过有丝分裂完成的。有丝分裂还是学习减数分裂的基础，而减数分裂知识又是学习遗传变异规律的基础。由此可见有丝分裂是非常重要的基础知识。因此在教学过程中一定要讲透，要让学生真正掌握有关知识。 二、学情生分析： 高一的学生由于在初中基本上不学习生物学，对生物学中的一些基本概念不甚了解，而且缺乏一定的空间感，故对本节内容的学习比较困难。因此要借助多媒体或模型来帮助理解。三．教学方法： 本节课教学内容理论性强、抽象复杂，所以课前我指导学生做好预习，课堂上充分利用多媒体辅助教学，增强教学的直观性和形象性性通过上一节课的模拟探究使学生了解了细胞增殖的必要性，明白了生物体的生长还要靠细胞增殖增加细胞数量。可以通过不同方式，从不同的角度进行分析，要充分调动学生参与整个学习过程。通过学习使学生了解到认识和分析一个生命现象可以有多种不同的方法——除了一般的文字描述外，还可以用图形描述特点；用图解和表格突出重点；用曲线描述量的变化规律和趋势；通过实验观察、验证生物学知识等……。使学生在掌握知识的同时了解一些常用的生命科学研究的基本方法。在讲有丝分裂各时期的主要特点时，我采用了FLASH动画逐步演示有丝分裂各时期，很好地让学生感受细胞分裂过程的动态性和连续性。黑板粘贴模型克服了多媒体手段转瞬即逝的弊端，较好地化难为易，化抽象为形象。 四．教目学标： （一）知识目标： 1、了解真核细胞增殖的方式及意义。 2、理解细胞周期的概念。 3、准确描述细胞有丝分裂各阶段的重要特征。了解动、植物细胞有丝分裂过程的异同。 4、掌握有丝分裂的过程、特征和意义。尤其是DNA和染色体的规律性变化。 （二）能力目标： 1、学习用曲线图描述DNA和染色体数量的变化规律 2、通过学习有丝分裂过程培养学生分析图像、解读图像的能力。 3、通过实验培养学生制作临时装片的技能，培养学生的观察、分析能力以及识图和绘图能力。 （三）情感态度与价值观： 1、通过对细胞周期以及有丝分裂过程中DNA和染色体的规律性变化的学习，培养学生树立唯物主义的世界观。使学生对生命的运动性、对事物发展变化过程中由量变到质变的转化等哲学问题有正确的认识。 2、通过对实验思路的分析和对实验现象的观察培养学生实事求是的科学态度和严谨的科学工作作风。 五．教学重难点： 教学重点：1、细胞周期的概念。

高三生物专项训练试题：细胞的增殖(含答案)

专项训练试题：细胞的增殖 一、单选题 1.a、b、c、d分别是一些生物细胞某个分裂时期的示意图，下列有关描述正确的是 （） A. a图表示植物细胞有丝分裂中期 B. b图表示人红细胞分裂的某个阶段 C. c图细胞分裂后将产生两个染色体数目不同的细胞 D. d图细胞中含有8条染色单体 2.真核细胞的分裂方式有减数分裂、有丝分裂和无丝分裂。下列叙述最可能属于该三 种细胞分裂方式共性的是（） A. 染色质丝先螺旋化变成染色体，再解螺旋变成染色质丝 B. 同源染色体先两两配对，再彼此分离并进入不同的子细胞 C. 细胞完成分裂后，每个子细胞都能将葡萄糖分解成丙酮酸 D. 子染色体在纺锤丝或星射线的牵引下分别移向细胞两极 3.将全部核DNA分子双链经32P标记的1个果蝇精原细胞置于不含32P标记的培养基培 养，先经过一次有丝分裂，再经过一次减数分裂，产生了8个精细胞。下列说法错误的是 A. 有丝分裂中期和1个减Ⅰ中期细胞内染色体数相同，标记的染色单体数不同 B. 有丝分裂后期和1个减Ⅰ后期细胞内染色体数不同，标记的染色体数也不同 C. 1个减Ⅰ后期和1个减Ⅱ后期细胞内染色体数相同，标记的染色体数不同 D. 产生的8个精细胞，每个细胞内含有4条染色体，均有2条被标记 4.下图表示人体内干细胞的增殖分化。下列有关叙述正确的是

A. 干细胞与白细胞的基因型不同，但合成的mRNA和蛋白质的种类相同 B. 红细胞可以通过无丝分裂增殖 C. 图示所有的细胞中，干细胞具有细胞周期，而且其分裂能力较强 D. 白细胞能够穿过血管壁去吞噬病菌,这是因为细胞膜的选择透 过性 5.如图表示洋葱根尖分生区细胞的一个细胞周期，不能得出的推断是 （） A. I时期一定发生DNA复制 B. II时期可出现四分体 C. 细胞周期开始于a D. 在做观察细胞有丝分裂实验时，应尽可能选择Ⅱ 比值大的作实验材料 ⅠⅡ 6.实验室培养甲、乙、丙、丁四种不同类型细胞，测得分裂间期占细胞周期的比例如 下图所示，有关说法正确的是( ) A. 四种细胞中丙分裂间期持续的时间最长 B. 不同温度下培养以上四种细胞，细胞周期持续的时间都会发生变化 C. 加入DNA复制抑制剂，停留在分裂间期细胞数量最少的是丁 D. 正常情况下四种细胞在分裂间期可发生染色体数目变化 7.测定一定数量细胞的DNA含量以分析细胞周期．下表是三组DNA、细胞数的相对 量．下列关于细胞周期的叙述，错误的是（） A. 甲组的大部分细胞处于G1期 B. 乙组细胞正在进行DNA复制

细胞增殖练习题

细胞增殖练习题 1、细胞有丝分裂过程中，染色单体的形成和出现分别发生于下列哪个时期（）。 A.产生于间期，出现于前期 B.产生于前期，出现于前期和中期 C.产生于间期，出现于前期和中期 D.产生于后期，出现于中期和后期 2、下列对人体细胞生命历程的描述，正确的是 A.细胞生长:细胞体积增大，核糖体数量增加，染色体复制加快 B.细胞分化:细胞形态改变，遗传物质发生变异，功能趋向专门化 C.细胞衰老:细胞核体积变小，细胞膜通透性增大，色素积累增多 D.细胞凋亡:特定基因表达，合成新的蛋白质，细胞自动结束生命 3、关于姐妹染色体的说法中，不正确的是 A.产生于分裂间期，消失于分裂后期 B. —条来自父方，一条来自母方 C.所含遗传物质通常相同 D.共用一个着丝粒 4、下列关于细胞周期的叙述正确的是 A.进行分裂的细胞都存在细胞周期 B.在一个细胞周期中，分裂期通常长于分裂间期 C.分裂间期包括一个合成期和两个间隙期 D.细胞周期是指上一次分裂开始到下一次分裂结束 5、动物细跑与植物细胞的有丝分裂过程明显不同的是 A.间期有染色质的复制 B.末期在细廁的中部不形成细胞板 C.后期有着丝点的分裂 D.末期染色体平均分配到两个子细胞中 6、人体细跑内含有46条染色体，当姐妹染色单体为92条时，此时细胞可能处于有丝分裂的 A.前期、中期 B.中期、后期 C.后期、末期 D.间期、末期 7、在观察植物细胞的有丝分裂实验中，制作装片的正确顺序是 A. 染色→解离→漂洗→压片 B. 解离→漂洗→染色→压片 C. 漂洗→解离→染色→压片 D. 解离→染色→漂洗→压片 8、一个细胞周期分为分裂间期和分裂期，可用一圆周作细胞周期的模式图，如图所示，下列选项中能表示细胞周期的是 A. A→A B. B→B C. A→B D. B→A 9、用化学药物抑制人体肿瘤细胞DNA的复制可以达到治疗肿瘤的目的，这在医学上属于“化疗”。用化学药物处理的肿瘤细胞停留在细胞周期的( ) A. 间期 B. 前期 C. 中期 D. 末期 10、下列关于生命活动变化关系的描述，正确的是（） A．细胞体积增大，与外界物质交换效率提高 B．细胞液浓度增大，植物细胞吸水能力减弱 C．生长素浓度升高，植物细胞生长速度加快 D．体内血浆渗透压降低，抗利尿激素释放减少 11、在体细胞的增殖过程中，肯定发生的是 ( ) A．DNA含量的变化B．纺锤体的形成 C．基因突变D．染色体自由组合 12、a、b、c、d分别是一些生物细胞某个分裂时期的示意图，下列有关描述正确的是( ) A．a图表示植物细胞有丝分裂中期 B．b图表示人的红细胞分裂的某个阶段 C．c图细胞可能来自于d图所示细胞 D．d图细胞中含有8条染色体 13、细胞不能无限长大的原因是 A、细胞器数量过少 B、细胞膜不能太大 C、细胞表面积与体积的关系限制了细胞的长大 D、细胞核中的遗传物质DNA可以复制，所以细胞增大体积也无所谓 14、在观察植物细胞有丝分裂过程中，不能通过连续观察同一细胞达到观察不同时期细胞分裂相的原因是 A．实验时环境温度低，细胞分裂速度太慢 B．在解离过程中，细胞已经死亡 C．染色体着色太浅，细胞分裂时的变化不易观察到 D．实验过程中，细胞缺乏营养供应，不再分裂 15、下列关于动植物细胞有丝分裂的异同点叙述中，不正确的是（） A.在分裂前期，动物细胞由中心粒周围发出星射线形成纺锤体

Brdu细胞增殖检测实验

Brdu检测细胞增殖实验 实验操作: 孵箱中培养72h（细胞密1．铺细胞，每个3.5cm dish 10万个，在37℃、5%CO 2 度至50-60%左右）。 2．Brdu（5-溴-2′-脱氧尿苷）加入培养细胞中，1mg/ml，标记48h。(量：Brdu 以铺满整个dish底面为准。) 3．固定：PBS洗细胞爬片3次，每次5min，在摇床上晃动清洗，4%PFA固定30min。4．变性：将固定好的细胞爬片用PBS洗3次，每次5min，2mol/L的HCl在37℃条件下变性5min，可放置于37℃恒温孵箱，应用封口膜把培养皿封好。（120r/m）5．中和：0.1mol/L的硼酸钠（PH8.3）中和10min，PBS洗3次，每次5min。（50r/m）6．加入1ml的0.2%TritonX-100，10min。 7．吸出TritonX-100，用PBS洗3次，每次5min。 8．加入1ml 3%的BSA封闭，室温1h，可在摇床上晃动。 9．吸出BSA，用PBS洗3次，每次5min。 10．加一抗（尿嘧啶脱氧核苷Brdu（鼠单抗）1:200），用1%BSA稀释，4度过夜。11．将孵好一抗的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。 12．加二抗（羊抗鼠IgG/Alexa Fluor 594 1: 100），用1%BSA稀释，避光室温孵育1h。（60 r/min） 13．将孵好二抗的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。 14．加DAPI染细胞核，储存浓度为1mg/ml，应将DAPI完全混匀，可用手弹几下，一般稀释比例为1:1000（用PBS稀释），避光室温反应10min。 15．将DAPI染好的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。 16．中性树胶封片，荧光显微镜观察，200×镜下取5个视野，计数Brdu阳性细

CCK8法检测细胞增殖预实验

SRT-1720, EX527 —定要应用在白血病细胞株起作用的浓度方可比较对 293T细胞和白血病细胞株的不同影响，请重复实验。 实验日期：2015/08/22-2015/08/27 实验项目：CCK8法检测细胞增殖 实验地点：广西医科大学药基楼14楼生物靶向中心 实验人员：高宗燕、宁海萍、李登峰 实验目的：检测SRT-1720/EX527刺激293T细胞后对细胞增殖的影响 主要试剂：SRT-1720,EX527,CCK8试剂盒 主要仪器：酶标仪 实验步骤： 一、制作标准曲线（测定细胞具体数量时） 1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞至96孔板。 2、设置4个细胞浓度梯度：0, 2000，4000，8000,每组4个复孔。 3、接种后培养24小时使细胞贴壁，然后加CCK试剂培养4小时后测定OD值，制作出一条以细胞数量为 横坐标（X轴），OD值为纵坐标（Y轴）的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（试用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK后的培养时间。） 图一、标准曲线 二、细胞增殖检测 1、在96孔板中配置100卩泊勺细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时（在37C, 5% CO2的条件下）。 2、向培养板加入10 ^L SRT-1720（终浓度3um）, EX527 （终浓度100um）。 3、将培养板在培养箱孵育约24h 4、每孔加入10卩L CCK溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。

5、将培养板在培养箱内孵育2小时。

6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。 图二、3um SRT1720刺激293T细胞后的细胞增殖曲线。该曲线呈S形，符合细胞正常生长情况。 图三、100um EX527刺激293T细胞后的细胞增殖曲线。该曲线前部分呈S形，符合细胞正常生长情况，但 在进入对数期之后曲线有下滑，之后进入平台期。 分析： SRT1720为SIRT1特异性活化剂，在前期实验中对白血病细胞株的生长表现出抑制作用，此次实验中SRT1720对正常细胞（293T）的生长无明显抑制作用。暗示SIRT1的活化对正常细胞的生长可能无明显影 响。 小剂量EX527为SIRT1特异性抑制剂，在前期实验中大剂量EX527对白血病细胞株的生长表现出抑制作用，而小剂量EX527无此效应，此次实验中大剂量EX527对正常细胞（293T）的生长可能有轻度抑制作用。但不能以一次实验结果做出肯定的结论，该实验还需重复。

人教版高一生物必修一第六章细胞增殖练习题

必修1·第六章周测 1月11 一、选择题 1．下图a →d 表示连续分裂细胞的两个细胞周期。下列叙述不正确的是（ ） A ．a 和b 为一个细胞周期 B ．c 段结束DNA 含量增加一倍 C ．遗传物质平分一般发生在d 段 D ．b 和c 为一个细胞周期 2. 用光学显微镜观察有丝分裂过程，若从细胞周期的时间考虑，应选择下表中哪种植物作为实验材料（ ） 3. 小明在割草时不小心伤到手指，7天后伤口愈合再生，这个过程中合成的主要物质和发生的细胞分裂方式分别是（ ） A ．脂肪、有丝分裂 B ．核酸、无丝分裂 C ．蛋白质、无丝分裂 D ．蛋白质、有丝分裂 4．连续分裂的细胞体积增大，发生在细胞周期的（ ） A ．分裂间期 B ．分裂前期 C ．分裂中期 D ．分裂后期 D ．细胞分裂末期，高尔基体参与细胞壁的形成 5．一种动物体细胞中的染色体数为24。该动物体内一个处于有丝分裂前期的细胞,其DNA 分子数和染色体数分别为（ ） A ．12、48 B ．24、48 C ．24、24 D ．48、24 6．在细胞有丝分裂的分裂期开始时，如果它的染色体数为N ，DNA 含量为Q ，则该细胞分裂后每个子细胞中的染色体数和DNA 含量分别是( ) A ．N 和O B ．N/2和Q/2 C ．N 和Q/2 D ．N/2和Q 7．动物细胞有丝分裂区别于植物细胞有丝分裂的特点是（ ） A ．核膜、核仁消失 B ．形成纺锤体 C ．中心粒周围发出星射线 D ．着丝点分裂,染色单体分离 8．下列细胞具有分裂能力的是（ ） A ．根尖成熟区细胞 B ．人的角质层细胞 C ．癌细胞 D ．高度分化的细胞 9．对于多细胞生物而言，下列有关细胞生命历程的说法正确的是（ ） A ．细胞分化导致细胞中的遗传物质发生改变 植 物 细胞周期时间/h 分裂间期 分裂期 合计 A 、物种A 10.6 0.4 11 B 、物种B 18 0.5 18.5 C 、物种C 18.5 2.5 21 D 、物种D 10.4 2.3 12.7

CFSE细胞增殖实验

准备： 1.20ml预冷5%FBS(HI)-PBS 2.50ml 预冷MACS buffer 3.70um滤网 4.2.5ml RBC lysis 5.LS column 6.50ml 37度预热PBS 7.50ml 37度预热complete culture medium(RPMI 1640 +10% Heat Inactivated FBS+10 mM HEPES+1 mMpenicilline streptomycin+ 50 mM 2-mercaptoethanol) （一）CD3抗体包被 取96孔板每孔加入100ul 10ug/ml anti-CD3抗体（PBS）密封4度过夜。 （二）淋巴细胞获取 1.小鼠的脾脏结摘取于10ml 冷5%FBS-PBS中。 2.于70um滤网研磨滤过，500g 4度5min离心后弃上清。 3.2.5ml RBC lysis裂红5 min，10ml 冷5% PBS终止。

4.500g 4度5min 离心后弃上清，10ml MACS buffer重悬，计数。留取105 个细胞进行FACS。 （三）磁珠分选na?ve CD8a+ T细胞 1.Centrifuge cell suspension at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely. 2.Resuspend cell pellet in 400 μL of MACS buffer per 108 total cells. 3.Add 100 μL of Naive CD8a+ T Cell Biotin-Antibody Cocktail per 108 total cells. 4.Mix well and incubate for 5 minutes in the refrigerator (2?8 °C). 5.Add 200 μL of MACS buffer per 108 total cells. 6.Add 200 μL of Anti-Biotin MicroBeads per 108total cells. Add 100 μL of CD44 MicroBeads per 108 total cells. 7.Mix well and incubate for an additional 10 minutes in the refrigerator (2?8 °C). 8.Wash cells by adding 10ml of MACS bufferper 108 cells and centrifuge at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely. 9.Resuspend up to 108cells in 500 μL of MACS bu ffer. 10.Place LS column in the magnetic field of a suitable MACS Separator.

(完整版)细胞增殖的练习题及答案(2)

细胞的增殖作业 一、选择题： 1、在一个细胞周期中，最可能发生在同一时期的是（） A．着丝点的分裂和细胞质的分裂 B．染色体数加倍和染色单体形成 C．细胞板的出现和纺锤体的出现D．染色体复制和中心粒复制 2．科学家用15N的硝酸盐作为标记物浸泡蚕豆幼苗，追踪蚕豆根尖细胞分裂情况，得到蚕豆根尖分生区细胞连续分裂数据如下，则下列叙述正确的是（） A．高尔基体、线粒体、叶绿体在蚕豆根尖细胞分裂过程中活动旺盛 B．蚕豆根尖细胞的DNA分子结构稳定性最低的时期有0—2h、19.3—21.3h、 38.6—40.6h C．基因重组可发生在19.3—21.3h D．蚕豆根尖细胞分裂的一个细胞周期为19.3h 3．下列有关“观察植物细胞有丝分裂”实验现象的叙述，其中错误的是（）A．分生区的细胞呈正方形 B．根尖的整体呈乳白色，尖端（根冠）略显淡黄 C．处于分裂前期的细胞均无核仁 D．向左下方略移动装片，图像向右上方移动 4．种子萌发时，在利用光能之前，不会发生下列哪种现象（） A．细胞分化B．细胞分裂 C．细胞呼吸D．利用无机物合成有机物 5．有关细胞分化的叙述，正确的是（） A．分化只发生在人的胚胎时期 B．分化过程中，细胞器种类和数量不会发生改变 C．分化过程中遗传物质发生了改变 D．生物体生长发育过程是细胞发生分化的过程 6．癌细胞属于恶性分化的细胞，表现为（） A．细胞表面糖蛋白减少B．存在大量游离核糖体 C．细胞代谢速率下降D．细胞含水量急剧下降 7．下图中甲—丁为某动物（染色体数=2n）睾丸中细胞分裂不同时期的染色体数、染色单体数和DNA分子数的比例图，关于此图叙述中错误 ．．的是（）

细胞增殖实验(MTT法)的步骤及方法

细胞增殖实验（MTT法）的步骤及方法 一、技术简介 细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖。单细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的个体。多细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的细胞，用来补充体内衰老和死亡的细胞；同时，多细胞生物可以由一个受精卵，经过细胞的分裂和分化，最终发育成一个新的多细胞个体。必须强调指出，通过细胞分裂，可以将复制的遗传物质，平均地分配到两个子细胞中去。可见，细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。真核细胞的分裂方式有三种，即有丝分裂、无丝分裂和减数分裂。 MTT是3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide的简称。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。然后采用二甲基亚砜（DMSO）溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在570 nm波长处测定其光吸收值，反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。 二、实验流程（以贴壁细胞为例） 1. 收集对数期细胞，调整浓度。 2. 将细胞种植于96孔板中，待细胞贴壁后（约4-12 h）加药。 3. 5% CO2，37 o C孵育一定时间。 4. 每孔中加入200 μL MTT溶液（配制成5 mg/ml），培养4 h。 5. 吸去孔内的培养液，加入150 μL DMSO，可继续孵育4 h，使结晶物充分溶 解。 6. 取出96孔板，将其置于酶联免疫检测仪上，震荡15 s，然后在570 nm下 测量吸光值。 7. 结果统计分析。

MTT分解比色法测定细胞生存和增殖

MTT reduction - a tetrazolium-based colorimetric assay for cell survival and proliferation Contributed by Joan M. Chapdelaine Pharmakon Research International, Inc.Waverly, PA, 18471 INTRODUCTION In 1983, a quantitative colorimetric assay for mammalian cell survival and cell prolifera-tion was proposed by Mosmann.1 The assay is dependent on the reduction of the tetrazo-lium salt MTT (3-(4,5-dimethylthazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) by the mitochondrial dehydrogenase of viable cells to form a blue formazan product. The assay measures cell respiration and the amount of formazan produced is proportional to the number of living cells present in culture. The assay has been shown to be a simple, rapid alternative to counting cells by dye inclusion/exclusion, monitoring the release of 51Cr from lysed cells, or the incorporation of [3H]-thymidine into cellular DNA. The MTT assay has been used with a growing number of cell types including primary cultured cells as well as established cell lines. This colorimetric microplate assay is cost effective because of the number of tests which can be performed at one time without the problem of radio-isotope and contaminated materials disposal. Applications of the MTT assay The use of the colorimetric assay for cell growth and cell survival offers major advantages in speed, simplicity, cost, and safety over conventional cell counting assays. Figure 1 shows in a block diagram form how the MTT assay can be substituted for the thymidine uptake assay. The MTT assay has fewer steps, uses fewer materials, and does not carry the added burden of radioactive waste disposal. Application Note 5

细胞增殖习题及答案

细胞增殖测试题 一、选择题 1．有关真核细胞分裂的叙述，正确的是(多选)( ) A．无丝分裂过程核膜不消失 B．动物细胞仅以有丝分裂方式进行增殖 C．动物细胞有丝分裂末期不形成细胞板 D．无丝分裂仅出现于高等生物的衰老细胞 2．有1位同学做根尖有丝分裂实验，在显微镜中观察到的图像如图所示。造成这种情况的原因可能是( ) ①取材位置不合适②取材时间不合适③制片时压片力量不合适④解离时间不合适⑤视野选择不合适 A．②③B．②⑤ C．①②⑤ D．①③④ 3．在制作洋葱根尖压片观察细胞有丝分裂时，不可能用到的试剂是( ) A．龙胆紫染液 B．醋酸洋红染液 C．稀盐酸溶液 D．30%蔗糖溶液 4．下列有关体细胞有丝分裂的叙述，错误的是( ) A．细胞周期中，间期时间较短，分裂期时间较长 B．分裂完成后两个正常子细胞的DNA序列相同 C．分裂中期，着丝粒排列在赤道板上 D．间期发生DNA复制和蛋白质合成 5．下列有关正常动物体细胞有丝分裂间期的叙述错误的是( ) A．分裂间期发生DNA复制 B．分裂间期有蛋白质合成 C．分裂间期有RNA合成 D．分裂间期有逆转录发生 6．细胞有丝分裂完成后，平均分配到两个子细胞的物质是( ) A．叶绿体DNA B．线粒体DNA C．细胞核DNA D．核糖体RNA 7．连续分裂的动物体细胞的生长即体积增大，发生在细胞周期的( ) A．分裂间期 B．分裂前期 C．分裂中期 D．分裂后期 8．人体细胞有丝分裂时，产生的四分体个数是( ) A．46 B．23 C.4 D.0 9．能在细胞分裂间期起作用的措施是( ) ①农作物的诱变育种②用秋水仙素使染色体数目加倍 ③肿瘤的化疗④花粉离体培养 A．①③ B．①④ C．②③ D．②④ 10．用高倍显微镜观察洋葱根尖细胞的有丝分裂。下列描述正确的是( ) A．处于分裂间期和中期的细胞数目大致相等 B．视野中不同细胞的染色体数目可能不相等

必修16.1细胞的增殖基础知识填空及练习题(可编辑修改word版)

6.1 细胞的增殖 一、不能无限长大 1、细胞与的关系限制了细胞的长大。即：细胞体积越小，其相对表面积越，细胞物质运输的效率也越。 2、细胞的所有生命活动都受的控制，一般细胞核中的DNA 不会随细胞体积的增大而增加，细胞太大，细胞核的“负担”就会过重。 二、细胞通过分裂进行增殖 1、细胞以方式进行增殖。细胞增殖包括和整个连续的过程。 2、真核细胞的分裂方式有：、、。 三、有丝分裂 1、细胞周期即的细胞，从时开始，到时为止。一个细胞周期包括和两个阶段。 2、分裂间期占细胞周期的。为分裂期进行物质准备，完成 和，同时细胞。 3、分裂期是一个的过程，为了研究方便，人为的将其分成四个时 期：、 、、。 （1）前期：a、染色质成为，一条染色体包括两 条； b、核仁逐渐、核膜逐渐； c、细胞两极发出形成； d、染色体散乱地分布在纺锤体中央。 （2）中期：a、所有染色体的着丝点都排列在上； b、染色体的形态稳定、数目清晰。 （3）后期：a、着丝点，姐妹染色单体分开，成为，分别移向两极； b、染色体数目，到两极。两极各有。（4）末期：a、染色体变成； b、逐渐消失； c、重现； d、在赤道板位置出现，它形成新的细胞壁。 有丝分裂的意 义：。 四、动物细胞有丝分裂与植物细胞有丝分裂不同点 1、。 2、。 五、无丝分裂 细胞无丝分裂过程比较简单，一般是先延长，核的中部，缢裂成为；接着。分裂过程中没有和变化，所以叫做无丝分裂。例如：。 六、观察根尖分生组织细胞有丝分裂 染色体易被染料着色，如和。 装片制作过程：———

练习题 1、无丝分裂和有丝分裂最主要的差别是无丝分裂( ) A、没有DNA 的复制 B、核物质平均分配到两个子细胞中 C、染色体数目有规律的变化 D、不出现纺缍丝和染色体的变化 2、在细胞周期中，要辨认染色体的形态和数目，应选择（） A．间期B．前期C．中期D．后期 3、下列有关细胞分裂时期的四个叙述中，其中有一个叙述与另外三个叙述不在同一时期，这个叙述是( ) A、染色体数目加倍 B、染色体的着丝点数目加倍 B、DNA 分子的数目加倍D、染色单体变为染色体 4、细胞的有丝分裂过程中，染色体数与体细胞数相同，而DNA 数不同的时期是( ) A、后期和末期 B、前期和后期 C、前期和中期 D、中期和后期 5、某植物体细胞内有 4 条染色体，那么在有丝分裂的前期和中期，其染色体、染色单体、DNA 分子和脱氧核苷酸链数依次是( ) A、4、4、4、8 B、4、4、4、6 C、4、8、8、16 D、4、8、16、32 6、下列关于细胞周期的叙述，正确的是（） A．蛙的红细胞与哺乳动物红细胞染色体数目均可呈周期性变化 B．机体内所有的体细胞处于细胞周期中 C．抑制 DNA 的合成，细胞将停留在分裂期 D．细胞分裂间期为细胞分裂期提供物质基础 7、下面的a、b、c、d 分别是一些生物细胞某个分裂时期的示意图，有关描述正确的是( ) A.a 图表示植物细胞有丝分裂中期 B.b 图表示人红细胞分裂的某个阶段 C.c 图表示细胞分裂过程，甲→甲是一个细胞周期 D.d 图细胞中含有 8 条染色单体 8、某同学在光学显微镜下观察洋葱根尖有丝分裂并绘制出下图。据此推测高尔基体的活动明显增强的是( ) 9、某细胞有丝分裂后期有染色体数目为16 个，那么该物种染色体数为：（）

细胞增殖MTT检测经验总结

细胞增殖检测：MTT实验经验总结 MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-（4，5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide，MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。 MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。 一、步骤 1、接种细胞 用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。 2、培养细胞 同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。 3、呈色 培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配）20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。 4、比色 选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。 二、注意事项 1、选择适当得细胞接种浓度。 2、避免血清干扰：一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。 3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。 MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系， IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！ 三、举例 各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入计算公式：

细胞增殖毒性实验步骤cck8知识讲解

如有侵权请联系网站删除 细胞增殖-毒性实验步骤 1、细胞传代、细胞计数、细胞增殖-毒性实验步骤： 实验准备：用75%酒精擦生物安全柜台面2遍，紫外线消毒30分钟（枪、枪头、 15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶），复温实验所需试剂［细胞培养液（DMEM、1640）、磷酸缓冲盐溶液（PBS、胰酶（0.25% Trypsin-EDT）胎牛血清（FBS、双抗］，所有的试剂、仪器放入生物安全柜前要用酒精喷洒消毒。显微镜下看细胞生长状态，有无污染。 1、倒去培养瓶内的培养液； 2）加入PBS 2ml洗涤培养瓶内细胞2次； 3）加入胰酶500ul/0.5ml 2?10min （具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）； 4）加入含10%FBS勺培养液1?1.5ml［培养液：胰酶=（2?3）:1］中和胰酶；5）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜； 6）将单细胞悬液吸入10?15ml离心管中，低速离心800rpm 3分钟，倒去上清 液； 7）加入含10%FBS ffl胞培养液1?2ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液； 8）吸取20ul细胞悬液（10ul细胞悬液+10ul台盼兰液：给坏死细胞染色，判断细胞活力）至细胞计数板，进行细胞计数； CCK-8实验： 9）在96孔板中，给每孔加100卩L （约7000个）的细胞悬液，将培养板放在培养箱预培养 24-72 小时（37 C，5%CO2,使细胞贴壁； 10）向培养板中加入10卩L不同浓度（5、10、20、40、80、160ug/ml）的待测药物； 11）将培养板在培养箱孵育一段适当的时间24小时（例如：6、12、24或48小时）（药物起作用）； 注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。 当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。 12）向每孔加入10让（约10%）CCK-8溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）； 13）将培养板在培养箱内孵育1?4小时（半小时测一次OD值）； 14）用酶标仪测定在450nm处的吸光度。 精品资料

细胞增殖及细胞活力检测方法

细胞增殖及细胞活力检 测方法 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT

细胞增殖及细胞活力检测方法 目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。 用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA 链中氚含量。若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA的合成。 但更为常用的方法是BrdU检测法。用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。 Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。 BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性DNA双链中的EdU分子。 采用BrdU方法时，你必须非常小心的去对DNA进行变性，才能一方面使BrdU抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链DNA分子来进行细胞周期的分析。有了EdU后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于DNA变性的HCl，可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在EdU法中不存在。