刘海舟毕业论文0615
分类号Q93 密级
UDC 编号
中国科学院研究生院
博士学位论文
甲基叔丁基醚降解培养物特性及降解基因的研究
刘海舟
指导教师 袁志明 研究员、博士、中国科学院武汉病毒研究所 申请学位级别 博士学位 学科专业名称 微生物学 论文提交日期 2007.05. 论文答辩日期 2007.06. 培养单位 中国科学院武汉病毒研究所 学位授予单位 中国科学院研究生院
答辩委员会主席 孙 明 教授
评阅人 陈向东 教授
陈士云 教授
唐 兵 教授
摘 要
甲基叔丁基醚 (methyl tert-butyl ether, MTBE) 是从20世纪90年代以来广泛使用的一种汽油添加剂，以提高汽油发动机运行效率、降低发动机废气造成空气污染和消除含铅汽油导致的铅污染。但由于MTBE在水中溶解度较高，而且很难生物降解，泄漏到环境中后，尤其在地下水中能够长期存留而蓄积，最终造成严重的地下水污染，影响人类健康和生活质量。随着我国MTBE的大量生产及其作为汽油添加剂的应用，大范围的地下水MTBE污染必将成为今后重要的环境生态问题。为了有效地开展地下水MTBE污染进行生物修复，我们在野外富集获得的MTBE降解混合物的基础上，开展了该混合物的MTBE降解效率及影响因素、混合物微生物组成类型及特性、关键酶基因序列及调控等方面的研究，为建立MTBE的生物降解技术提供了储备。
首先建立了检测水溶液中MTBE含量稳定的环境顶空-气相色谱 (ambient headspace-gas chromatography) 检测方法，分别适用于检测MTBE浓度为1-1000 μg/L和1-500 mg/L的样品，并进行了环境样品检测验证，为实验室以及环境样品中MTBE含量的测定和MTBE污染监测奠定了基础。
混合培养物降解分析特性表明，该培养物能够降解浓度达500 mg/L的MTBE，降解速率为33.14 mg/L/h。辅助碳源，如葡萄糖，能够提高培养物降解MTBE的速率。连续培养的培养物降解延迟期缩短，降解速率加快。
在采用传统分离技术对混合培养物中微生物分离鉴定的基础上，通过对混合物中不同组分的16S rDNA PCR及RFLP分析，证明混合物主要是由Terrimonas ferruginea，以及酸杆菌门(Acidobacteria) 的细菌组成，而后者是已知的在环境中广泛存在的未培养微生物。这也是首次在MTBE降解培养物中报道酸杆菌门微生物的存在。
同时，本研究通过PCR的方法得到了一个长为260 bp的DNA片段，BLAST 结果表明是与alk基因有很高的一致性。随后以此片段开始，应用基因组步行(genome walking) 的方法获得了长度为2 810 bp DNA片段，经过ORF预测软件分析，其中可能包含3个ORF，依次分别是TetR家族转录调节蛋白、烷烃单加
氧酶和phy H双加氧酶基因。为下一步alk基因的克隆表达和活性检测，以及此混合培养物降解MTBE途径的研究提供了良好的基础。
关键词：甲基叔丁基醚，顶空-气相色谱法，宏基因组学，酸杆菌门，烷烃单加氧酶
Degradation and genetic characters of a MTBE-degrading
consortium
Author Liu Hai-zhou（Major in Microbiology）
Directed by Prof. Yuan Zhi-ming
Abstract
Methyl tert-butyl ether (MTBE) is a broadly used gasoline additive which was used to replace the traditional gasoline additive tetra-ethyl lead for reducing gasoline lead pollution, improving gasoline engine operating efficiency and decreasing air pollution caused by engine. However MTBE caused serious groundwater pollution because of its high resolution in water and resistance to biodegradation. Although MTBE has been used in China since 1990s, the possible groundwater pollution is still unknown. With the increasing usage of MTBE, the management of serious groundwater pollution by MTBE will be one of the greatest challenges in environment management program in China.
Considering the future national need for the management of MTBE pollutant, we initiated the study on biodegradation of MTBE. In this paper, the MTBE degradation ability, bacterial composition, and affecting factors, as well as one key gene of MTBE degrading consortium has been investigated. The data might provide solid information for the development of MTBE bioremediation technology. In the first part of this thesis, an ambient headspace-gas chromatography method was established to measure MTBE in water, which could be used for water solution contained 1-1000 μg/L or 1-500 mg/L MTBE. This stable MTBE assay method can be used for monitoring MTBE pollution in environments.
The consortium culture degraded MTBE concentration up to 500 mg/L and the degrading speed was 33.14 mg/L/h. Extra s upplement of l ow concentration of carbon
sources, such as glucose, increased consortium degradation speed. After a continuous cultivation, the consortium had an increased MTBE degrading rate.
Several isolates were isolated from the consortium, but none of them has been proved to have MTBE degradation ability. 16S rDNA sequence and their RFLP analysis revealed that the consortium, was composed of several bacteria and most of them belonged to Terrimonas ferruginea and Acidobacteria. The latter were known uncultured bacteria. This was the first report on the existence of Acidobacteria in MTBE degradation cultures.
The alkane-1-monooxygenase is the key enzyme in MTBE degradation pathway.
A 260 bp DNA fragment was obtained by PCR from the total consortium DNA. By using a genome walking method, a 2810 bp DNA fragment was spliced. NCBI ORF prediction indicted there were 3 possible ORFs: a TetR family regulatory factor gene, an alk gene, and a pyh H dioxygenase gene. The data provide a basis for the future research on degradation pathway and the MTBE management.
Keywords: MTBE, ambient headspace-gas chromatography, metagenome, Acidobacteria, alkane -1-monooxygenase.
目 录
第1章引言 (1)
1.1 甲基叔丁基醚的使用 (1)
1.2. 甲基叔丁基醚对环境的污染及危害 (2)
1.3 环境样品中MTBE的检测 (6)
1.4. 甲基叔丁基醚污染的治理 (6)
1.5 甲基叔丁基醚微生物降解途径 (14)
1.6 本研究的目的意 (17)
第2章环境顶空气相色谱法检测水溶液中的MTBE (19)
2.1 实验材料 (19)
2.2 实验方法 (20)
2.3 实验结果 (22)
2.4 讨论 (27)
第3章 MTBE降解混合培养物降解特性研究 (28)
3.1 仪器设备 (28)
3.2 实验材料 (28)
3.3 实验方法 (29)
3.4 实验结果 (31)
3.5 讨论 (35)
第4章降解MTBE培养物的微生物组成分析 (37)
4.1 实验材料 (37)
4.2 实验方法 (39)
4.3 实验结果 (44)
4.4 讨论 (48)
第5章烷基单加氧酶的序列分析 (51)
5.1 实验材料 (51)
5.2 实验方法 (52)
5.3 实验结果 (58)
5.4 讨论 (68)
第6章结论和展望 (71)
6.1 结论 (71)
6.2 展望 (71)
参考文献 (73)
发表文章 (82)
致谢 (83)
第一章 引言
第1章 引言
醚是广泛存在于自然界的有机物，也是工农业生产中的重要中间体。由于醚
键（R-O-R ）的键能高达360 kJ/mol ，导致含有醚键的化合物在自然界中很难被生物完全降解，而且降解周期很长。如自然界中含量仅次于纤维素的生物多聚体木质素，是苯丙烷类似物单元以醚键相连结的三维高分子多聚物，结构复杂，性质稳定，在自然条件下分解十分缓慢。尽管目前已经发现了一些酶，如木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶等，能够降解木质素，但是对其降解机理还不是十分清晰。
同时，醚作为一种重要的工业原料，被广泛用于各种添加剂、除草剂、药剂、
杀虫剂生产中，也是化工工业、食品工业、石油工业的一种重要的有机溶剂。由于醚的大规模应用，醚类化合物被释放到环境中，导致不同程度的环境污染。研究表明醚对人体有一定的危害，很多醚类物质是致癌剂，因此，对醚类化合物的土壤和水体的污染整治越来越受到重视。甲基叔丁基醚（Methyl tert -butyl Ether, MTBE ）就是近十年被广泛关注的醚类污染物。
1.1 甲基叔丁基醚的使用
在烷基醚中，目前使用和研究最为广泛的是甲基叔丁基醚以及相关的乙基叔
丁基醚（Ethyl tert -butyl ether, ETBE ）、甲基叔戊基醚（tertiary -amylmethyl ether, TAME ）和二异丙基醚（Diisopropyl ether ，DIPE ），这些醚作为汽油添加剂，主要用来取代传统的汽油添加剂四乙基铅（tetraethyl lead ），以提高汽车发动机的运行效率，降低汽车尾气造成的空气污染。其分子结构分别如下：
表1-1 醚类汽油添加剂的化学结构 CH 3
C H 33O
CH 3 C H 3O 3CH 3C 2H 5C 2H 5O CH 33CH 3C H 3H 3O CH 3CH 3
MTBE ETBE TAME DIPE
甲基叔丁基醚降解培养物特性及降解基因的研究
美国首先大规模使用MTBE作为汽油添加剂。根据其《清洁空气法案》 (Clean Air Act) 1990年修订案的规定，新配方汽油(reformulated gasoline，RFG) 必须含有2%的氧 (w/w)，因此在汽油中至少应添加11%的MTBE或5.7%的乙醇。到1999年，美国添加了MTBE的新配方汽油（RFG）占了全部新配方汽油的85%，其中MTBE的使用量达11-15%。到2000年1、2月，全美所销售的汽油中，RFG 汽油占30%。全世界已经有82个国家在使用RFG汽油。英国、法国、希腊、西班牙的汽油中MTBE的混合比例为10%，德国、比利时、丹麦、卢森堡、荷兰的汽油中已经达到15%。与之相应，国际上对MTBE的需求也随之扩大。Sabis 公司研究报告表明，1980年全世界MTBE需求量几乎为零，1987年全世界就有MTBE生产装置37套，生产能力4536 kt/a，1990年增加到8000 kt/a，到2000年已经达到17 000 kt/a。2000年全世界生产MTBE 54.4万桶，其中美国占58%、欧洲16%、亚太11%、拉美7%、非洲和中东5%、其他3%[1, 2]。
1983年，国内第一套MTBE生产装置在齐鲁石化公司橡胶厂投产。到2001年，全国已经有MTBE生产装置27套，生产能力620kt/a。我国于1999 年6 月4 日制定汽油新标准，并决定从2000 年7 月1 日首先在北京、上海、广州三地实行汽油无铅化，到2003 年1 月1 日起在全国实行汽油无铅化。我国使用的高辛烷值无铅汽油，如93#、95#和97#汽油等，所用的辛烷值改进剂MTBE 的含量也在10-15%。到2005年全国MTBE产能达到1200 kt/a。在可见的将来，国内MTBE的需求仍然会继续增长。
1.2. 甲基叔丁基醚对环境的污染及危害
MTBE为无色透明液体，有醚类所特有的气味，氧含量为18%（质量分数），其物理性质见下表[3, 4]：
第一章引言
表1-2 MTBE的物理性质
物理性质指标
分子量 88.15 密度 (20 ℃) (g/m3) 0.740
折光系数 (20 ℃) 1.3689
冰点(℃) -108.6
沸点(℃) 55.2
着火点(℃) 480
空气中爆炸极限 (%，体积分数） 1.65–8.4
蒸发热 (55 ℃) (kJ/kg) 336.8
燃烧热 (MJ/kg) 38.21
蒸汽压 (25 ℃) (kPa) 32.664
溶解度 (25 ℃，水) (g/L) 51.26
蒸汽压 (mgHg, 25 ℃) 245
亨利常数 (25 ℃) (atm·m3/mol) 5.5×10-4
嗅阈 (mg/m3) 0.32-0.47
早在20世纪80年代，人们就发现了MTBE对环境造成的不良影响。1998年，美国加州大学（University of California, Davis）发布报告，首次评估了MTBE 对环境和人类健康的影响。美国环境保护署（United States Environmental Protection Agency，USEPA）于1999年也发表报告，对汽油中添加的增氧剂（oxygenates）对环境的影响作了阐述。近两年来的深入环境评估研究也证明了MTBE对环境，尤其是地下水体的危害。
MTBE 的物理化学性质基本上决定了它的环境化学行为。与苯比较，它的水溶性非常高，达48 g/L (20 ℃)；纯MTBE 的蒸气压也较高，202 mmHg （20 ℃），然而它在汽油混合物中蒸气压却不高（19 mmHg, 20 ℃），20 ℃时亨利常数仅为0. 023。因此，MTBE 有较强的水溶性，要将其从水中萃取出来是比较困难的，同时也排除了用萃取修复的方法清除土壤和地下水中MTBE 的可行性[5]。
甲基叔丁基醚降解培养物特性及降解基因的研究
MTBE的主要污染途径通常是由油库、地下贮油罐、输油管、加油站或生产厂家的泄漏渗透至地下，造成周围土壤及地下水体的污染。使用含有MTBE汽油的船舶发动机，也会造成河道和湖泊的污染。同时，汽车排放到大气中的MTBE 也可以随着雨水进入到土壤和水体中。由于MTBE具有很高的水溶性，一旦泄漏土壤或其它环境中，能够迅速随着水流移动，从而使得被污染区域迅速扩大，更重要的是随着水流渗透到地下水体，造成地下水体的污染。
图1-1 MTBE的污染途径
(图片引自 https://www.wendangku.net/doc/7c10077186.html,/world/content/water1.html)
UC Davis的报告指出，在加州的Santa Monica城的饮用水井中，MTBE的含量最高达到600 μg/L，MTBE对水体的污染导致半数的市政供水被迫关闭。据统计，在使用新配方汽油(RFG)的地区，5-10%的饮用水源中含有MTBE，有250,000处水源含有不同浓度的MTBE；全美国，估计有高达7%的地下水源中的MTBE 的含量超过 0.2 μg/L，部分地区地下水体中的MTBE的含量大大超过美国环境
第一章引言
保护署的标准（20-40 μg/L）[6, 7]。目前在美国，每年用于处理被MTBE污染的水的费用高达30亿美元。而在欧洲大部分地区，如德国、法国、丹麦等，部分河流和地下水体中也检测到了高浓度的MTBE，在原东德地区，地下水体的MTBE污染尤为严重[8]。在韩国，地下水中的MTBE的含量达1.2-6.7 μg/L，部分土壤中MTBE的含量高达达11.2 μg/g。
MTBE污染的水体有一种令人不快的气味，即使水中含有微量的MTBE，都会产生很难闻的松节油似的味道，影响饮用水的质量。MTBE 能通过口及呼吸快速吸人，皮肤的吸收约为口吸入的39%。人畜摄入的MTBE在机体内代谢较为缓慢、表现为低吸收（占吸入总量的32%–41%）、高呼出(占吸收总量的18%–34%)，血液清除率低。MTBE在体内主要分布于血、脑及脂肪组织，吸人后MTBE的靶器官为：上呼吸道、中枢神经系统和肝脏。MTBE 能通过口及呼吸快速排出，从口吸人的MTBE 46%–69%从呼气中排出，11%–36%从尿中排出，呼吸进人体内的MTBE 53%–72%从尿中排出，17%–22%从呼气中排出MTBE在体内主要通过肝细胞色素P-450的氧化去甲基作用，代谢生成甲醛、TBA 和α-羟基异丁酸等，具有一定的致突变性[9]。因此MTBE有可能在体内形成二次损害。
研究表明，高浓度的MTBE对人畜具有潜在的致癌性，但是对于低浓度的MTBE没有给出明确的评价。国内的研究也认为，低浓度的MTBE没有明显的致突变性。袁东等采用Ames 试验检测MTBE 的遗传毒性，并用单细胞凝胶电泳法检测国产MTBE 大鼠经口亚慢性染毒后血液有核细胞的DNA 的损伤状况，未发现MTBE 对受试系统有致突变性[10]。McGregor等也证明MTBE、叔丁基醇(tert-butyl alcohol, TBA)和乙酸叔丁酯(tert-butyl acetate)对伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium) 没有诱变能力[11]。但是 MTBE 仍然对人体健康有一定的负作用，例如：引起呼吸困难和气喘、头晕、头痛和失眠，以及眼睛充水和皮疹等过敏症状[12]。
总之，MTBE会引起感觉不适，但是其长期毒害尚没有一致的认识。一般认为，普通人群接触MTBE而造成的健康危害可能性不大，但是还是值得关注。
甲基叔丁基醚降解培养物特性及降解基因的研究
1.3 环境样品中MTBE的检测[13]
研究MBTE首先要解决的问题就是环境样品中MTBE的分析检测。水样中MTBE的分析方法主要有USEPA方法524.2 (P&T/GC/MS)，即吹扫捕集 (purge and trap)/色谱/质谱联用技术。得克萨斯自然资源保护委员会推荐用USEPA方法8021B (P&T/GC/PID)，即吹扫–捕集色谱–光离子化检测来测定土样中MTBE的含量。USEPA方法8020、8240和8260通常也被引用，用于不同样品中MTBE 的测定[5]。此外，还有傅立叶转换红外光谱法[14, 15]、核磁共振波谱法[16]和飞行时间质谱法[17]等测定水样和大气样品中MTBE含量的方法。
其中使用最多的前处理方法是吹扫捕集法[18]：将氮气通入液体样品进行吹扫，一部分沸点较低的化合物随氮气流出进人捕集装置。捕集装置一般有常温和低温捕集2种，低温捕集器外层喷射液氮以降温，使吹扫出的化合物快速冷却，滞留在捕集装置中。样品富集结束后，升温解析使样品随载气进入色谱柱进行分离。其他还有顶空法[19, 20]、液体直接进样[21]、用吸附剂富集后再热解脱进样[22]、固相微萃取[8]等等方法。Szelewski等提出了适合自动进样器的环境顶空–GC/MS法测定水溶液中的MTBE浓度[23]。对于汽油样品，用0 ℃的85% H3PO4溶液萃取后直接进样[24]。
色谱柱的选择主要根据被测试样及所用方法采用不同极性的毛细管色谱柱。在一般色谱柱中MTBE 很难与2–甲基戊烷和3–甲基戊烷完全分离，如果样品中含有这2 种物质，除质谱外对于其他检测器都会干扰测定。Agilent公司已经推出了专用于MTBE分离的色谱柱DB–MTBE，可使MTBE 与二者得到较好分离。
常用的检测器主要有质谱 (Mass Spectrometry) 和火焰离子化检测器 (FID)等用于环境样品中MTBE的分析。质谱检测器虽然检测灵敏度高，选择性强，但是MS 法的费用较高。FID检测器能够响应大多数的有机化合物，而且有较好的灵敏度，适合常规的MTBE检测。
1.4. 甲基叔丁基醚污染的治理
MTBE比较容易从表面水中以挥发的形式除去，其半衰期约为14天[25]。但是，MTBE在自然条件下却极其难以降解；特别在地下水中，MTBE的半衰期至
第一章引言
少为2年[26]。MTBE同时具有醚键和叔碳基团，由于醚键的高键能和叔碳的空间位阻作用，难以生物降解。
1.4.1 理化方法清除甲基叔丁基醚的污染
由于长期以来MTBE被认为是难以生物降解，理化方法治理是首选的清除污染方法，包括氧化、气提、吸收等方法。
1.4.1.1 催化氧化法
催化氧化法是利用UV/H2O2、O3/H2O2、Fenton试剂（H2O2+Fe2+）等，结合其他方法来氧化去除水中的MTBE[27]。
Fenton试剂在水中产生大量的具有强氧化性的羟基自由基可以降解有机污
染物[28]。Xu等认为MTBE的氧化降解过程主要分两步进行：(1) MTBE 在Fe2+ /H2O2的作用下迅速降解；(2) MTBE在Fe3 +/H2O2的作用下以低于前一步的速率降解。同时，提出整个降解反应过程如下[29]：
H2O2 + Fe2+?·OH + OH- + Fe3+
·OH + Fe2+ ? OH- + Fe3+
·OH + 有机物?产物
H2O2 + Fe3+? H+ + FeOOH2+
FeOOH2+?·O2H + Fe2 +
·O2H + Fe2+? HO2- + Fe3+
·O2H + Fe3+? H+ + O2 + Fe2+
John等使用还原性更强的Fe0来代替Fe2+。研究发现，反应10 min后，MTBE 的降解率就可高达99 %。利用Fenton试剂降解MTBE中间产物和副产物主要包括叔丁醇、甲酸丁酯、乙酸甲酯、丙酮等[30]。
Walger等证明了在污泥反应器中用UV/H2O2能够处理MTBE污染的水[31]。Barreto等在水中利用TiO2表面光催化氧化作用，处理含MTBE 100 mg/L的废水取得了良好的处理效果[32]。Endalkachew等分别用污泥降膜光反应器（slurry falling film photoreactor）和整合了气提（air stripping）的气相光氧化系统（gas phase photooxidation system），发现含0.1 g/L TiO2的泥浆，流速0.26 L/min，1 kW汞
甲基叔丁基醚降解培养物特性及降解基因的研究
灯照射下，1 mg/L MTBE在90分钟内99%被分解，主要产物是TBA、TBF及少量丙酮。但是Fe2+、Cl-、芳香化合物对此有干扰[33]。Xu等的实验表明，15 mM H2O2，2 mM Fe2+，pH 2.8，在室温下，初始浓度 1 mM MTBE溶液在120分钟内MTBE含量降低98%[34]。Bergendahl等采用类似的方法在10分钟内降解99% MTBE，而且其副产物丙酮也等到降解[35]。Kang等发现在O3存在情况下会使超声波分解MTBE的能力提高了1.5-3.9倍[36]。
1.4.1.2 吸附和气提法
用活性炭和气提等方法处理MTBE污染也有报道，但是其花费高昂，很难大规模使用。Shih等以颗粒活性炭为吸附剂, 对3种不同水源的污染饮用水进行了研究。结果发现活性炭对MTBE 有着很好的吸附效果，可使污染水中MTBE的质量浓度降至5 μg/L以下[37]。然而, 当污染水中存在其他有机物时，由于多组分竞争吸附的影响，会造成活性炭对MTBE吸附性能的下降。Wilhelm等的研究表明，为治理MTBE高度污染的Truckee河，花费可能达5百万美元，其中活性炭吸附和气提成本分别为0.043和0.047美元每升水[38]。
1.4.1.3 辐射分解法
辐射分解法也是被采用的方法。其基本机理是水经射线或高能电子束照射后可分解产生大量的活性物质，如羟基自由基、氢原子、水合电子和氢离子等，这些活性物质可分解MTBE。利用γ射线作为放射源辐射降解MTBE过程中，尽管也有一些中间产物，如叔丁醇、甲酸丁酯、乙酸甲酯、丙酮等的出现，但随着降解反应的进行，这些产物会进一步降解至完全[39, 40]。Hsieh等研究发现，以60Co 为放射源，59.7 Gy/min照射5 min，可使浓度为92500 μg/L的MTBE溶液降低到19 μg/L，几乎完全降解。其分解反应的中间产物有TBF、TBA、丙酮、甲基乙酸，分别占47%、11%、6.4%和9.1%。当溶液中有苯存在时，由于苯竞争捕获了更多的羟基自由基，显著降低MTBE 的去除率。Cu2+离子的存在虽然不会影响MTBE 的去除效果，但会抑制中间产物TBF的进一步降解[41]。Wu等在辐射分解MTBE 前，用4:1的N2O/O2混合气饱和100 mg/L的MTBE溶液。在辐射剂量率为0.12 kGy/ min时，30 min内可使MTBE全部降解。产生的主要挥发性有机物包括TBF、TBA、
第一章引言
丙酮和甲基乙酸[42]。
1.4.1.4 超声波处理法
超声波法主要通过3种方式氧化降解溶液中的有机污染物：(1) 自由基氧化，(2) 高温裂解，(3) 超临界水氧化。频率在15 kHz以上的超声波可使水溶液发生超声空化效应，空化气泡坍塌产生的高能冲击波以及伴随发生的瞬时高温高压(1 900–5 200 K, 50–100 MPa) 可使某些挥发性有机物直接裂解，并使泡内水蒸气裂解为·OH、·HO2和·O等自由基，由部分自由基结合生成的H2O2与这些氧化性自由基进入超声空化而产生的高温高压区形成超临界水[27, 43]。
H2O ?·OH + ·H
2·H + O2?·HO2 + ·H
·OH + ·OH ? H2O2
2·HO2? H2O2 + O2
Neppolian等研究了超声频率为20 kHz条件下的MTBE的降解情况。随着MTBE 的含量由2.84×10-2 mmol/L增至2.84×10-1 mmol/L，降解假一级反应速率常数从1.25×10-4 s-1降至5.32×10-5 s-1，超声波功率的增大和反应器温度的升高可以加快MTBE的降解。主要的中间产物是TBF和丙酮。在超声波体系下加入氧化剂过硫酸钾或Fenton试剂, 可使超过95 %的浓度为2.84×10-2 mM的MTBE 得到完全降解[44]。
超声波技术用于有机污染物降解研究多处于实验室阶段。超声波源的放大和换能器的使用寿命是超声波技术实际应用主要障碍。
1.4.2 生物方法处理MTBE污染
目前在世界上对芳香醚的降解已经有了较深入的研究，如广泛使用的除草剂：2, 4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）的生物降解途径和降解基因已经很清楚。而对于烷基醚和环烷基醚的生物降解，尤其是分子生物学方面的研究，国内外的报道尚不多。但近几年，已发现一些微生物能够以烷基醚和环烷基醚类作为碳源和能源生长，如Bernhardt et al.发现Rhodococcus sp.能够以环醚，如二氧六环
甲基叔丁基醚降解培养物特性及降解基因的研究
（dioxane）、四氢呋喃（tetrahydrofunan）、四氢吡喃（tetrahydropyrane）等和二乙醚为唯一碳源和能源生长[45]；Parales et al等分离到的一株放线菌CB1190，能降解1，4-二氧六环、1，3-二氧六环、1，3-二氧戊环、2-甲基-1，3-二氧戊环、乙醚、四氢呋喃、四氢吡喃和甲基丁基醚等[46]；Hyman et al报道的一株欧洲亚硝化单胞菌（Nitrosomonas europaea）通过氨单氧化酶（ammonia monooxygenase）的共氧化二甲醚为甲醇和甲醛[47]；Hur et al分离的Burkholderia cepacia G4/PR1的能利用乙醚，并且可以氧化甲丁醚、二乙硫醚（diethyl sulfide）和2-氯乙醚（2-chloroethyl ethyl ether）等[48]。
MTBE的燃烧热是38.21 MJ/kg (3 368 kJ/mol)，甚至大于葡萄糖的燃烧热，2 804 kJ/mol。这意味着1 mol MTBE完全氧化所释放的能量要高于1 mol 葡萄糖完全氧化释放的能量，应该能够更多的支持生物生长。但是事实是MTBE难以被生物所降解。这主要是由于MTBE分子中醚键 (-O-) 和叔丁基团的存在，阻碍了降解过程。
在20世纪90年代以前，一直认为MTBE是无法生物降解的。直到1994年，Salanitro等从化工厂生物反应器的活性污泥中首次分离到能够在好氧条件下利用MTBE为唯一碳源和能源生长的混合菌培养物，BC-1[49]，人们开始重视MTBE降解微生物的分离，筛选及其降解机理研究。1997年，Mo等首次报道能够利用MTBE为唯一碳源和能源生长的纯培养物，在1-2星期内能够部分降解MTBE[50]。1999年，Hanson等筛选出一株革兰氏阳性细菌 PM-1，能够降解浓度达500 mg/L的MTBE[51]；Deeb等又证明，PM-1在利用MTBE生长后，能够以两条不同的途径降解MTBE和苯[52]。同时，也有报道在厌氧条件下，如甲烷化，硫酸盐还原，铁还原和硝酸盐还原等条件下，MTBE也会缓慢分解，但降解机制尚不明确[53-56]。Zaitsev等富集了好氧的细菌混合培养物CL-EMC-1，能够在低温下以MTBE为唯一碳源和能源生长；生长温度在3-30 ℃，最适温度18-22 ℃，能够耐受1.5 g/L MTBE和7 g/L TBA。在18 ℃以上培养时没有检测到中间产物TBA。从中分离得到一株细菌，Variovorax paradoxus CL-8，能够利用MTBE[57]。下表1-2是一些已知的降解MTBE的培养物。
第一章引言
表1-3 几种降解MTBE的培养物（修改自Deeb等[58]）
培养物来源代谢类型 MTBE降解速率参考文献混合培养物BC-1 处理工业化学品的活
性污泥
完全代谢34 mg/g cells/h [49]
Methylobacterium mesophilicum (ATCC 700107)
Rhodococcus sp. (ATCC 700108)
Arthrobacter ilicis (ATCC 700109) 活性污泥、银杏树果
实及树周围土壤
不完全代谢 0.18
mg/L/h
a[50]
混合培养物降解MTBE的生物滴
滤塔完全代谢
MTBE
10 mg/g cells/h [59, 60]
Rubrivivax sp. PM1降解MTBE的生物滤
膜
完全代谢50 mg/g cells/h [58]
Graphium sp. ATCC 58400 正丁烷和丙烷氧化培
养物共代谢、部分
降解
0.92 mg/g cells/h [61]
Xanthobacter sp Alcaligenes eutrophus Mycobacterium vaccae 直链和支链烷烃氧化
培养物
共代谢，完全
降解
43.6 mg/g cells/h [62]
ENV425 ENV421 氧化丙烷的纯培养物共代谢，完全
降解
26.7 mg/g cells/h [63]
Pseudomonas aeruginosa 来自汽油污染土壤的
氧化戊烷混合培养物共代谢，完全
降解
11.3 mg/g cells/h [64]
PEL-B201 氧化苯的纯培养物共代谢0.33 mg/g cells/h [65]
Mycobacterium austroafricanum IFP 2012 甲基营养型，纯培养
物
完全代谢 52.89
mg/g
cells/h
[66]
Streptomyces sp. ISO SL1
Sphingomonas sp. Iso2A
混合培养物部分降解[67]
Pseudomonas mendocina KR-1利用甲苯、直链烷烃
生长的纯培养物
与C5-C8直链
烷烃共代谢
[68]
Fusarium solani 生物滤膜部分降解 16
mg/g
protein/h
[69]
Pseudonocardia sp. ENV478降解四氢呋喃(THF)
的纯培养物
与THF共代谢9.1 mg/h/g TSS [70]
Variovorax paradoxus strain CL-8 降解MTBE的混合培
养物CL-EMC-1
完全代谢[57]
a. 接种量5×105-5×107 CFU/ml
甲基叔丁基醚降解培养物特性及降解基因的研究
虽然已经有一些降解MTBE的混合培养物或纯培养物的报道，但是对于所有的培养物而言，低降解MTBE速率和低生物量产生都是所面临的主要问题。
1.4.
2.1 甲基叔丁基醚的异位生物处理[13]
异位生物处理是将地下水或者地表水抽取，经生物反应器处理后再注入到地下或地表水中。
1.4.
2.1.1 悬浮生长反应器
利用浓缩的悬浮细胞处理高浓度的有机物。Pitre等用混合菌群ENV425处理MTBE污染的地下水，先间歇运行，加入氮、磷促进混合菌生长，将MTBE浓度从40 mg/L提高到115 mg/L。处理时，MTBE加入量0.271 kg/(kg·d)，连续运行状态下，MTBE的平均降解速率达96.2%。地下水中MTBE浓度从100–2 400 mg/L降低到1.6–120 mg/L。Wilson等用连续搅拌生物反应器（continuously stirred tank reactor）研究MTBE的好氧降解。MTBE为唯一碳源以150 mg/L的浓度加入反应器，发现悬浮固体浓度超过600 mg/L时，MTBE降解达到99.99%[71]。Vainberg 等[18 ]在实验室使用基于粒状活性炭(GAC) 的流化床生物反应器，在25 ℃条件下，反应器出水MTBE 浓度不到20 μg/ L。虽然在25～15 ℃间随着温度的下降，处理效果也下降，但在最低温度下，去除率仍在99%以上，在该条件下，,处理效率也没有受到TBA 或者BTEX 的影响[72]。
1.4.
2.1.2 膜生物反应器
生物膜吸附在固体载体表面，如生物滴滤器、流化床反应器等，微生物细胞不易被水流冲走，使生长缓慢的微生物能够较快的累积到较高的浓度。
Morrison等用超滤膜反应器处理MTBE污染的水。系统先用活性炭处理过的含5 mg/L MTBE 的自来水，添加一定的营养成分，经120天驯化后，99.95%的MTBE和TBA被去除，出水中的MTBE浓度降低到了0.32 μg/L[73]。