低温对水稻类囊体膜蛋白磷酸化及光合机构光能分配的影响

生物物理学报第二十二卷第三期二!!六年六月

ＡＣＴＡＢＩＯＰＨＹＳＩＣＡＳＩＮＩＣＡＶｏｌ．２２Ｎｏ．３

Ｊｕｎ．２００６

收稿日期：２００５－１２－２８

基金项目：国家自然科学基金项目（３０２７０１２４，３９９７００６８），教育

部博士点基金项目（２００２０６１００９４），教育部新世纪人才支持计划ＮＣＥＴ－０４－０８６１和四川大学９８５的资助

通讯作者：杜林方，电话：（０２８）８５４１２７６６，Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｕｌｉｎｆａｎｇ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ

０引言

温度是影响植物物种分布和生产的一个重要因素，许多温带和热带植物如水稻、黄瓜、玉米等对低温十分敏感。当处于０～１０℃低温下一定时间时，植物会不同程度地受到伤害，其中光合器官的受损较为明显［１］。研究认为黑暗中低温处理主要影响光系统Ⅱ（ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍⅡ，ＰＳⅡ）的活性，不影响光系统Ⅰ（ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍⅠ，ＰＳⅠ）活性；但是，近年来研究发现低温光照情况下，ＰＳⅠ更易受到影响［２］。弱光下低温处理对光合器官的危害接近现实环境，更具研究意义［３￣６］。目前有关低温弱光处理对植物光合器官功能影响的报道不多，陈启林等［６］曾发现低温弱光条件下黄瓜类囊体膜发生了解耦联。研究认为光合磷酸化解耦联与类囊体膜蛋白磷酸化和光合机构光能分配密切相关。为此，我们研究了水稻幼苗在低温处理过程中光系统光能分配的改变情况和类囊体膜蛋白磷酸化的变化，以期了解水稻耐冷机理和其光合机构对低温的响应方式。

１材料与方法

１．１材料培养和低温处理

水稻（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．）种子（由四川农业大

学水稻研究所提供）土培于温室（２８℃／２２℃，昼／夜），每天光照１２ｈ（光子通量密度为１００μｍｏｌ／ｍ２?ｓ），按照常规进行管理，保证充足的水肥。待幼苗长至４叶期时，选生长一致的幼苗移入恒温培养箱内，光子通量密度为３５μｍｏｌ／ｍ２?ｓ（１２ｈ／１２ｈ，光／暗）的弱光照条件和６℃下冷害处理２、２４、４８、７２和９６ｈ，以不经低温处理的弱光照同批幼苗为对照。

１．２

类囊体膜的提取及叶绿素含量的测定

参照Ｒｉｎｔａｍ!ｋｉ等［７］的方法分别提取不同处理叶片的高活性的类囊体膜，叶片加入预冷缓冲液Ａ（含３００ｍｍｏｌ／Ｌ蔗糖，５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２，１ｍｍｏｌ／ＬＮａ－ＥＤＴＡ，１０ｍｍｏｌ／ＬＮａＦ，５０ｍｍｏｌ／ＬＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ，ｐＨ７．５）进行匀浆，匀浆液经两层纱布过滤后，１５００ｇ离心４ｍｉｎ。所得沉淀用缓冲液Ｂ（含５ｍｍｏｌ／Ｌ蔗糖，５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２，１０ｍｍｏｌ／ＬＮａＦ，１０ｍｍｏｌ／ＬＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ，ｐＨ７．５）悬浮并洗涤１次，３０００ｇ离心３ｍｉｎ。最后将类囊体膜悬低温对水稻类囊体膜蛋白磷酸化及光合机构

光能分配的影响

郭军伟１，

魏慧敏１，

吴守锋１，

杜林方１，２

（１．四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都６１００６４；

２．四川大学纳米生物医学技术与膜生物学研究所，成都６１００４１）

摘要：研究了低温胁迫对水稻类囊体膜蛋白磷酸化和光能分配的影响。类囊体膜蛋白组分的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和免疫印迹分析结果显示，低温弱光条件下光系统Ⅱ（ＰＳⅡ）功能蛋白的稳态水平均有所降低。低温（７７Ｋ）荧光分析表明，低温处理后类囊体膜光能吸收明显下降，而且ＦＰＳⅡ／ＦＰＳⅠ的比值均较对照组下降，表明低温弱光条件下有更多的激发能被分配到ＰＳⅠ。低温处理同时还改变了类囊体膜蛋白磷酸化水平，捕光天线ＬＨＣⅡ蛋白中ｌｈｃｂ１的磷酸化水平明显降低，ｌｈｃｂ２的磷酸化水平增加，进一步证实ｌｈｃｂ２向ＰＳⅠ移动，改变光能分配。ＰＳⅡ反应中心Ｄ１、Ｄ２蛋白和核心天线ＣＰ４３的磷酸化水平增高，有利于ＰＳⅡ二聚体的稳定。

关键词：低温胁迫；光系统Ⅱ；蛋白磷酸化；光合机构；低温荧光中图分类号：Ｑ９４５

２００６年生物物理学报

浮在少量缓冲液Ｃ（１００ｍｍｏｌ／Ｌ蔗糖，５ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，１０ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２，１０ｍｍｏｌ／ＬＮａＦ，１０ｍｍｏｌ／ＬＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ，ｐＨ７．５）中，整个过程避光４℃进行。所得样品按Ａｒｎｏｎ［８］的方法测定叶绿素含量，然后储存于液氮中备用。

１．３类囊体膜蛋白磷酸化检测

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ参照杜林方等的方法［９］进行，采用１５％含６ｍｏｌ／Ｌ尿素的分离胶（ｐＨ８．８）和５％浓缩胶（ｐＨ６．８）。在类囊体膜样品中加入等体积的样品缓冲液（含２％ＳＤＳ、５％β－巯基乙醇、２０％甘油、０．０１％溴酚蓝以及０．１２５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ６．８），５０℃水浴处理３０ｍｉｎ。每泳道样品含５μｇ叶绿素。蛋白分开后用考马斯亮兰Ｒ－２５０染色，或电转移至ＰＶＤＦ膜上进行免疫检测反应［１０］。用针对磷酸化的苏氨酸抗体（Ｚｙｍｅｄ公司）免疫检测磷酸化的类囊体膜蛋白。并用捕光天线复合物Ⅱ（ｌｉｇｈｔｈａｒｖｅｓｔｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘｅｓⅡ，ＬＨＣⅡ）抗体（德国ＫｌａｕｓＫｌｏｐｐｓｔｅｃｈ教授赠送）、Ｄ２抗体（意大利ＲｏｂｅｒｔｏＢａｒｂａｔｏ教授赠送）和Ｄ１抗体［１１］，特异性免疫检测类囊体膜中ＬＨＣⅡ、Ｄ２和Ｄ１蛋白含量。显色试剂用ＥＣＬ发光系统（Ａｍｅｒｓｈａｍ），并采用ＢｉｏＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍ系统（ＧｅｎｅＧｅｎｉｕ，Ｓｙｎｇｅｎｅ）进行定量分析。

１．４７７Ｋ荧光光谱测定

低温（７７Ｋ）荧光发射光谱用ＨｉｔａｃｈｉＦ－４５００型荧光分光光度计测定。类囊体膜溶液与等体积的甘油快速混合后注入４ｍｍ的石英管内［１２］，插入液氮杜瓦瓶中，激发光波长为４３６和４７５ｎｍ，记录６４０～７８０ｎｍ的发射光谱。对反映ＰＳⅡ和ＰＳⅠ的峰值进行了分析，分别计算了Ｆ６８５／Ｆ７２０（４３６ｎｍ激发）和Ｆ６８５／Ｆ７１０（４７５ｎｍ激发）的比值。样品的叶绿素终浓度为５０ｍｇ／Ｌ，分别进行３次检测和分析。

１．５数据处理

测量结果以均数±标准差（ｘ±ｓ）表示，采用Ｏｒｉｇｉｎ６．０软件数据分析方法ＴｗｏＳａｍｐｌｅＩｎｄｅｐｅｎ－ｄｅｎｔｔ－Ｔｅｓｔ对各组处理间进行数据分析，以Ｐ＜０．００５表示有统计学意义。

２结果与讨论

２．１低温胁迫对类囊体膜蛋白组分的影响

已有研究表明，低温胁迫会导致类囊体膜电子传递受到影响，类囊体膜中捕光天线ＬＨＣⅡ蛋白、３３ｋＤ锰稳定蛋白和反应中心Ｄ１蛋白等也会发生变化［１３，１４］。通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和免疫检测对类囊体膜蛋白组分进行了分析（图１）。图１Ａ是ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果，与未处理材料提取的类囊体相比，处理２ｈ的类囊体的膜蛋白组分几乎没有变化；而处理

Ｆｉｇ．１Ｃｈａｎｇｅｓｉｎｔｈｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｔｈｙｌａｋｏｉｄｍｅｍｂｒａｎｅｓｆｒｏｍｒｉｃｅｌｅａｖｅｓｗｈｅｎｅｘｐｏｓｕｒｅｔｏｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（６℃）ａｔｉｎｄｉｃａｔｅｄｐｅｒｉｏｄｔｉｍｅｕｎｄｅｒｌｏｗｌｉｇｈｔｉｎｔｅｎｓｉｔｙｏｆ３５μｍｏｌ／ｍ２?ｓ．５μｇｏｆＣｈｌｗｅｒｅｌｏａｄｅｄｐｅｒｃｅｌｌｉｎＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ａ）；ＩｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｗｉｔｈＤ２，Ｄ１ｏｒＬＨＣⅡａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂ）；ＱｕａｎｔｉｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｕｓｉｎｇａＢｉｏＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍ（Ｃ）．Ｔｈｅａｍｏｕｎｔｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅｉｎｄｉｃａｔｅｄｒｅｌａｔｉｖｅｔｏｃｏｎｔｒｏｌｓａｍｐｌｅ（１）ｗｉｔｈｏｕｔｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓ１００％．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｍｅａｎｓ±ＳＤｏｆｔｈｒｅｅｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．—■—：Ｄ２；—●—：ＬＨＣⅡ；—△—：Ｄ１；—○—：Ｄ１／Ｄ２

ＭＣｏｎｔｒｏｌ２ｈ２４ｈ４８ｈ７２ｈ９６ｈ

Ｄ１／Ｄ２

３３ｋＤ

ＬＨＣⅡｋＤ

６６

４５

３６

２９

２４

２０．１

１４．４

Ｃｏｎｔｒｏｌ２ｈ２４ｈ４８ｈ７２ｈ９６ｈＤ１／Ｄ２

Ｄ１

Ｄ２

ＬＨＣⅡ

（Ａ）

（Ｂ）

（Ｃ）

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３．５

３．０

２．５

２．０

１．５

１．０

０．５

０

Ｃｏｎｔｒｏｌ２２４４８７２９６

Ｔｉｍｅ（ｈ）

Ｒ

ｅ

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ａ

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●

●

●

●

●

１９８

第３期低温对水稻类囊体膜蛋白磷酸化及光合机构光能分配的影响

２４ｈ类囊体在５５ｋＤ附近出现１条新的蛋白带，处理４８ｈ类囊体３３ｋＤ的蛋白带减少，并随处理时间延长，变化更明显。Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交（图１Ｂ）显示：与未处理的对照相比，短时间的低温胁迫引起ＬＨＣⅡ（ｌｈｃｂ１，ｌｈｃｂ２，ｌｈｃｂ４）的轻微减少（降低了１０％），随处理时间的延长而略有升高。冷胁迫处理导致ＬＨＣⅡ蛋白的轻微减少，有可能导致类囊体膜不能有效地吸收光能和传递能量。而ＰＳⅡ反应中心Ｄ１和Ｄ２蛋白受低温胁迫的影响较大，Ｄ１蛋白的稳态水平减少了２０％左右，Ｄ２蛋白的稳态水平减少了３０％左右（图１Ｂ），冷胁迫处理后Ｄ１／Ｄ２聚合物却有所增加。可能的解释是：在低温下光抑制加强，引起Ｄ１与Ｄ２蛋白发生交联，产生的Ｄ１／Ｄ２聚合物有利于ＰＳⅡ光合机构的稳定［１５］。我们还检测到３３ｋＤ锰稳定蛋白在胁迫后也不同程度的减少（数据未显示），证实了他人的结果［１６］，由于ＰＳⅡ氧化侧的锰簇复合物也参与了电

子传递，３３ｋＤ锰稳定蛋白在胁迫后减少会导致ＰＳⅡ放氧活性中心的不可逆抑制，从而影响到电子传递。

２．２低温胁迫对水稻类囊体７７Ｋ荧光的影响

低温弱光处理对２个光系统都有影响，但是ＰＳⅠ更易发生光抑制［１４］。然而人们对低温条件下ＰＳⅠ和ＰＳⅡ响应环境的状况尚不清楚［１］。我们检测了低温弱光处理对水稻类囊体膜低温（７７Ｋ）荧光发射的影响（图２），以考察光能在２个光系统间的分配和光合机构的状态转化。

在液氮（７７Ｋ）里，所有的生理生化反应都已经停止，只有光能传递的物理过程存在［１７］。用波长４３６ｎｍ（激发叶绿素ａ）的光分别激发水稻类囊体时，在６８５～６９５和７２０ｎｍ处有两个荧光发射峰，它们分别为ＰＳⅡ和ＰＳⅠ的特异荧光发射峰（图２Ａ），其中６８５ｎｍ处的峰来自ＰＳⅡ反应中心而６９５ｎｍ处的峰来自核心天线ＣＰ４７。用波长

Ｆｉｇ．２Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌａｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｅｍｉｓｓｉｏｎｓｐｅｃｔｒａｏｆｔｈｙｌａｋｏｉｄｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄａｔｌｉｑｕｉｄｎｉｔｒｏｇｅｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ

（７７Ｋ）．Ｔｈｅｔｈｙｌａｋｏｉｄｍｅｍｂｒａｎｅｓｌｉｑｕｉｄｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌａｎｄｃｏｌｄｔｒｅａｔｍｅｎｔ（２，２４，４８，７２ａｎｄ９６ｈ）ｌｅａｖｅｓ．Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｗａｓ４３６ｎｍ（Ａ）ｏｒ４７５ｎｍ（Ｂ）ａｎｄｅｍｉｓｓｉｏｎｓｐｅｃｔｒａｗｅｒｅｒｅｃｏｒｄｅｄｆｒｏｍ６４０ｔｏ７８０ｎｍａｎｄｔｈｅｅｍｉｓｓｉｏｎｍａｘｉｍａｏｆＰＳⅡａｎｄＰＳⅠａｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ，４３６ｎｍ（Ｃ）ａｎｄ４７５ｎｍ（Ｄ），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｔｙｐｉｃａｌｓｐｅｃｔｒａｆｒｏｍ３ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓｗｅｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ

６０５０４０３０２０１００

６４０６６０

６８０

７００

７２０

７４０

７６０

７８０

Ｒｅｌａｔｉｖｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙ

８０７０６０５０４０３０２０１００

６４０６６０

６８０

７００

７２０

７４０

７６０

７８０

Ｒｅｌａｔｉｖｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙ

６０５０４０３０２０１０

Ｃｏｎｔｒｏｌ２ｈ２４ｈ４８ｈ７２ｈ９６ｈ

Ｒｅｌａｔｉｖｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙ

Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ

Ｔｉｍｅ

７０６０５０４０３０２０１０Ｃｏｎｔｒｏｌ

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Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ

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（Ａ）

（Ｂ）

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—■—：Ｃｏｎｔｒｏｌ—□—：２ｈ—●—：２４ｈ—▲—：４８ｈ—○—：７２ｈ—★—：

９６ｈ

—■—：６８５ｎｍ

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—■—：Ｃｏｎｔｒｏｌ—□—：２ｈ—●—：２４ｈ—▲—：４８ｈ—○—：７２ｈ—★—：

９６ｈ

—■—：６８５ｎｍ—●—：６９５ｎｍ—▲—：７１０ｎｍ—’—：７２５ｎｍ

１９９

２００６年

生物物理学报２．３低温胁迫对类囊体膜蛋白磷酸化水平的影响

研究认为类囊体膜蛋白磷酸化参与了植物光合作用和许多生理活性的调节［２１］。ＬＨＣⅡ磷酸化可以调节光能在２个光系统间的分配，然而ＰＳⅡ蛋白磷酸化与植物对环境胁迫响应的信号途径关系并不是很清楚。为此，我们用针对磷酸化的苏氨酸抗体对类囊体膜蛋白的磷酸化水平进行了检测。图３结果显示：弱光照条件下，未处理水稻的类囊体膜中ＰＳⅡ反应中心Ｄ１、Ｄ２蛋白和核心天线ＣＰ４３蛋白，以及ＬＨＣⅡ蛋白发生磷酸化，分别是Ｐ－Ｄ１、Ｐ－Ｄ２、Ｐ－ＣＰ４３，３条Ｐ－ＬＨＣⅡ（Ｐ－ｌｈｃｂ１，Ｐ－ｌｈｃｂ２，Ｐ－ｌｈｃｂ４）；低温胁迫引起类囊体膜蛋白的磷酸化水平显著变化，其中Ｐ－ｌｈｃｂ１和Ｐ－ｌｈｃｂ４明显减少，Ｐ－ｌｈｃｂ２略有增加，ＰＳⅡ核心蛋白Ｄ１、Ｄ２和ＣＰ４３的磷酸化水平有不同程度的增高。

ＬＨＣⅡ磷酸化后，引起捕光天线与ＰＳⅡ解离，并迁移到ＰＳⅠ［２２，２３］。已有研究显示：在ＬＨＣⅡ三聚体中Ｐ－ｌｈｃｂ２的增加有利于ＬＨＣⅡ向ＰＳⅠ移动，

Ｆｉｇ．３Ｅｆｆｅｃｔｏｆｐｒｏｔｅｉｎｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｉｎｉｓｏｌａｔｅｄ

ｔｈｙｌａｋｏｉｄｓｏｆｒｉｃｅ．

Ｔｈｙｌａｋｏｉｄｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄ

ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎｓｌａｂｅｌｅｄａｓｄｅｓｃｒｉｂｅｄｉｎ“ｍａｔｅｒｉａｌｓａｎｄｍｅｔｈｏｄｓ，”ａｎｄｆｉｖｅｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｉｎｃｕｂａｔｅｄａｔ６℃ｉｎｓｔｅａｄｏｆ２２￣２８℃

Ｃｏｎｔｒｏｌ２ｈ２４ｈ４８ｈ７２ｈ９６ｈ

Ｐ－ＣＰ４３ｐ－Ｄ２Ｐ－Ｄ１Ｐ－ＬＨＣⅡ

ＴｗｏＳａｍｐｌｅＩｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｔ－ＴｅｓｔＰ＜０．００５

Ｎｏ．Ｃｏｎｔｒｏｌ２ｈ２４ｈ４８ｈ７２ｈ９６ｈＦ６８５／Ｆ７２０（Ｅ４３６）１．４１３±０．０２１．２１８±０．００７１．２±０．００４１．１７６±０．０５１．１２９±０．００６１．１７８±０．００６Ｆ６８５／Ｆ７１０（Ｅ４７５）

１．２６１±０．００３

１．０７±０．００８

１．０４±０．００８

０．９７７±０．０２

０．８７１±０．０２

０．８０９±０．０１

Ｔａｂｌｅ１

ＣｈａｎｇｅｓｉｎｔｈｅｒａｔｉｏｏｆｅｍｉｓｓｉｏｎｍａｘｉｍａｏｆＰＳⅡｔｏＰＳⅠ

４７５ｎｍ（激发叶绿素ｂ）的光激发时，出现６８５～６９５ｎｍ处的荧光发射峰和７１０、７２５ｎｍ处荧光发射肩峰，其中６８５ｎｍ荧光发射峰来自ＰＳⅡ反应中心而６９５ｎｍ荧光发射峰来自核心天线ＣＰ４７，７１０ｎｍ峰来自ＰＳⅠ反应中心而７２５ｎｍ峰来自ＰＳⅠ天线ＬＨＣⅠ（图２Ｂ）。与正常光照和室温条件下培养的水稻类囊体膜具有７１０￣７４０ｎｍ的ＰＳⅠ低温荧光发射峰的结果相比，弱光条件下水稻类囊体ＰＳⅠ的特异荧光发射峰发生了蓝移。

无论用波长４３６（激发叶绿素ａ）或４７５ｎｍ（激发叶绿素ｂ）的光激发水稻类囊体，低温处理均会使类囊体的叶绿素荧光降低。图２Ａ和图２Ｃ显示：处理２ｈ的类囊体的荧光发射峰强度显著降低，来自ＰＳⅡ的６８５ｎｍ荧光发射峰强度为未处理的５５％，来自ＰＳⅠ的７２０ｎｍ荧光发射峰强度为未处理的６５％；处理２４ｈ的类囊体的荧光发射峰强度继续下降，来自ＰＳⅡ的６８５ｎｍ荧光发射峰强度为原来的４０％，来自ＰＳⅠ的７２０ｎｍ荧光发射峰强度为原来的４２％。处理４８ｈ的类囊体的荧光发射峰却有回升，而处理７２和９６ｈ的类囊体的荧光发射峰为７００、６８５和７２０ｎｍ处的荧光发射强度明显下降，表明水稻叶片类囊体的结构受到严重

破坏，ＰＳⅡ和ＰＳⅠ能量传递和光合作用发生变化。图２Ｂ和图２Ｄ也显示低温处理均会使类囊体的叶绿素荧光降低。

ＦＰＳⅡ／ＦＰＳⅠ比值大小可以反映激发能在两个光系统间的分配情况［１８，１９］。我们分别计算了Ｆ６８５／Ｆ７２０（４３６ｎｍ激发）和Ｆ６８５／Ｆ７１０（４７５ｎｍ激发）的比值［２０］（表１），对光能在两个光系统间的分配进行了分析。无论激发叶绿素ａ或叶绿素ｂ，低温处理均会使类囊体的叶绿素荧光中ＦＰＳⅡ／ＦＰＳⅠ比值降低。未处理的Ｆ６８５／Ｆ７２０为１．４１３，处理后为１．２１８（２ｈ）、１．２（２４ｈ）和１．１７６（４８ｈ）；未处理的Ｆ６８５／Ｆ７１０为１．２６，处理后为１．０７（２ｈ）、１．０４（２４ｈ）和０．９７７（４８ｈ）。这些结果表明低温胁迫导致较多的激发能被分配到ＰＳⅠ，且与处理时间相关，处理７２ｈ时为１．１２９，而处理９６ｈ时为１．１７８。说明分配到ＰＳⅡ的光能有所回升。据此推断，低温条件下ＰＳⅠ更易受到光抑制的原因可能与激发能的分配有关，由于较多的激发能被分配到ＰＳⅠ，使得ＰＳⅠ更容易发生光抑制。而光抑制引起ＰＳＩ发生损伤后，光能分配又发生改变，分配到ＰＳⅡ的光能会增加。

２００

第３期低温对水稻类囊体膜蛋白磷酸化及光合机构光能分配的影响

将其捕获的光能传递给ＰＳⅠ［２４］。低温荧光分析的结果也显示光能更多地分配给了ＰＳⅠ。ＰＳⅡ核心蛋白，特别是反应中心Ｄ１、Ｄ２蛋白的磷酸化，对于ＰＳⅡ二聚体结构的维持和稳定起着重要的作用［２５，２６］，此外有证据表明，光抑制时磷酸化的Ｄ１蛋白比非磷酸化的Ｄ１蛋白更稳定［１０，２６］。低温处理初期Ｄ１、Ｄ２蛋白的磷酸化水平升高（图３），而且Ｄ１／Ｄ２聚合物也相应增多（图１）；但处理９６ｈ时Ｄ１、Ｄ２蛋白的磷酸化程度较短时间处理的样品有所增加，同时低温荧光分析也显示分配到ＰＳⅡ的光能增加了（图２），说明低温条件下反应中心Ｄ１、Ｄ２蛋白磷酸化的增加可以减少低温下光对ＰＳⅡ的胁迫压力。以上结果表明，ＰＳⅡ蛋白的磷酸化可能是水稻叶片光合机构对低温环境的一种防御机制，但是这个过程是如何发生的有待进一步研究。

综上所述，低温弱光处理使水稻类囊体膜蛋白水平下降、ＰＳⅡ蛋白磷酸化水平发生变化，从而导致了水稻叶片对光能吸收和分配的改变，有利于光能向ＰＳⅠ传递，这是水稻光合机构对低温的响应方式。同时低温下ＰＳⅡ蛋白磷酸化水平的改变也是一种防御机制。

致谢：感谢意大利ＰｉｅｍｏｎｔｅＯｒｉｅｎｔａｌｅ大学ＲｏｂｅｒｔｏＢａｒｂａｔｏ教授提供Ｄ２抗体和德国ＫｌａｕｓＫｌｏｐｐｓｔｅｃｈ教授提供的ＬＨＣⅡ抗体。

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［１２］ＭｕｒａｋａｍｉＡ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆ７７ＫｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｅｍｉｓｓｉｏｎｓｐｅｃｔｒａｉｎＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ．ＰＣＣ６７１４ａｎｄＣｈｌａｍｙ－ｄｏｍｏｎａｓｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉｗｉｔｈｖａｒｉａｂｌｅＰＳＩ／ＰＳⅡｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｅｓ．ＰｈｏｔｏｓｙｎｔｈＲｅｓ，１９９７，５３（２）：１４１～１４８

［１３］ＷｉｌｌｉａｍＧＮ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｔｒａｎｓｐｏｒｔａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｉｓｏｌａｔｅｄｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，１９８０，６６（２）：２３４～２３７

［１４］Ｓｕｎ－ＪｕＫ，Ｃｈｏｏｎ－ＨｗａｎＬ，ＡｌｅｘａｎｄｅｒＢＨ，ＷａｈＳＣ．Ｉｎｈｉｂｉ－ｔｉｏｎｏｆｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍｓＩａｎｄＩＩａｎｄｅｎｈａｎｃｅｄｂａｃｋｆｌｏｗｏｆｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍＩｅｌｅｃｔｒｏｎｓｉｎｃｕｃｕｍｂｅｒｌｅａｆｄｉｓｃｓｃｈｉｌｌｅｄｉｎｔｈｅｌｉｇｈｔ．ＰｌａｎｔａｎｄＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ，２００１，４２（８）：８４２～８４８

［１５］ＹａｍａｍｏｔｏＹ．ＱｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｏｆｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍＩＩ．ＰｌａｎｔａｎｄＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ，２００１，４２（２）：１２１～１２８

［１６］ＷｏｌｌｍａｎＦＡ，ＭｉｎａｉＬ，ＮｅｃｈｕｓｈｔａｉＲ．Ｔｈｅｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｈｙｌａｋｏｉｄｍｅｍｂｒａｎｅｓ．ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ，１９９９，１４１１（１）：２１～８５

［１７］ＫａｒｕｋｓｔｉｓＫＫ．Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｓａｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｂｅｏｆｔｈｅｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｐｐａｒａｔｕｓ．ＳｃｈｅｅｒＨ，ｅｄ．Ｃｈｌｏｒｏ－ｐｈｙｌｌｓ，Ｓｅｃｔｉｏｎ４．——

—ＢｏｃａＲａｔｏｎ：ＣＲＣＰｒｅｓｓ，１９９１．７６９～７９６

［１８］Ｇｏｖｉｎｄｊｅｅ．Ｓｉｘｔｙ－ｔｈｒｅｅｙｅａｒｓｓｉｎｃｅＫａｕｔｓｋｙ：ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌａｆｌｕ－ｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．ＡｕｓｔＪＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，１９９５，２２（１）：１３１～１６０

［１９］ＳｔｒａｓｓｅｒＲＪ，Ｔｓｉｍｉｌｌｉ－ＭｉｃｈａｅｌＭ，ＳｒｉｖａｓｔａｖａＡ．Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｔｒａｎｓｉｅｎｔ．Ｉｎ：ＰａｐａｇｅｏｒｇｉｏｕＧ，Ｇｏｖｉｎｄｊｅｅ，ｅｄ．Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：ａｓｉｇｎａｔｕｒｅｏｆｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．

Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ：ＫｌｕｗｅｒＡｃａｄａｍｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２００４，３２１～３６２［２０］ＰａｍｅｌａＢＧ，ＪｏｈｎＢ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｅｘｃｉ－ｔａｔｉｏｎｅｎｅｒｇｙｉｎＯｃｈｒｏｍｏｎａｓｄａｎｉｃａ，ａｎｏｒｇａｎｉｓｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ－Ａ／Ｃ／ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｌｉｇｈｔｈａｒｖｅｓｔｉｎｇａｎｔｅｎｎａ．

ＰｈｏｔｏｓｙｎｔｈＲｅｓ，１９８９，２１（２）：８１～９１

［２１］张海波，许大全．光系统ＩＩ蛋白磷酸化及其生理意义．植物生理与分子生物学学报，２００３，２９（６）：４８７～４９３

［２２］ＶｅｎｅｒＡＶ，ｖａｎＫａｎＰＪ，ＲｉｃｈＰＲ，ＯｈａｄＩ，ＡｎｄｅｒｓｓｏｎＢ．Ｐｌａｓｔｏｑｕｉｎｏｌａｔｔｈｅｑｕｉｎｏｌｏｘｉｄａｔｉｏｎｓｉｔｅｏｆｒｅｄｕｃｅｄｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｂｆｍｅｄｉａｔｅｓｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｌｉｇｈｔａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ：ｔｈｙｌａｋｏｉｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｄｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｂｙａｓｉｎｇｌｅ－ｔｕｒｎｏｖｅｒｆｌａｓｈ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，１９９７，９４（４）：１５８５～１５９０

［２３］ＺｉｔｏＦ，ＦｉｎａｚｚｉＧ，ＤｅｌｏｓｍｅＲ，ＮｉｔｓｃｈｋｅＷ，ＰｉｃｏｔＤ，Ｗｏｌｌ－ｍａｎＦＡ．ＴｈｅＱｏｓｉｔｅｏｆｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｂ６ｆｃｏｍｐｌｅｘｅｓｃｏｎｔｒｏｌｓ

２０１

２００６年

生物物理学报ＥＦＦＥＣＴＳＯＦＬＯＷＴＥＭＰＥＲＡＴＵＲＥＯＮＴＨＥＤＩＳＴＲＩＢＵＴＩＯＮＯＦＥＸＣＩＴＡＴＩＯＮＥＮＥＲＧＹＩＮＰＨＯＴＯＳＹＳＴＥＭＡＮＤＴＨＥＰＨＯＳＰＨＯＲＹＬＡＴＩＯＮＯＦＴＨＹＬＡＫＯＩＤＭＥＭＢＲＡＮＥ

ＰＲＯＴＥＩＮＳＩＮＲＩＣＥ

ＧＵＯＪｕｎ－ｗｅｉ１，

ＷＥＩＨｕｉ－ｍｉｎ１，

ＷＵＳｈｏｕ－ｆｅｎｇ１，

ＤＵＬｉｎ－ｆａｎｇ１，２

（１．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏ－ｒｅｓｏｕｒｃｅｓａｎｄＥｃｏ－ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ），ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＳｉｃｈｕａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ６１００６４，Ｃｈｉｎａ；２．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＮａｎｏｂｉｏｍｅｄｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＭｅｍｂｒａｎｅＢｉｏｌｏｇｙ，ＳｉｃｈｕａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，

Ｃｈｅｎｇｄｕ６１００６１，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃｈａｎｇｅｓｉｎｔｈｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｌｉｇｈｔｅｎｅｒｇｙｉｎｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍａｎｄｔｈｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ

ｔｈｙｌａｋｏｉｄｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｒｉｃｅｌｅａｖｅｓ（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．）ｄｕｒｉｎｇｃｈｉｌｌｉｎｇｓｔｒｅｓｓｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ．ＴｈｅＳＤＳ－ＰＡＧＥｏｆｔｈｙｌａｋｏｉｄｍｅｍｂｒａｎｅｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｍｏｓｔｔｈｙｌａｋｏｉｄｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍⅡ，ｄｅｃｒｅａｓｅｄｄｕｒｉｎｇｔｈｅｃｈｉｌｌｉｎｇｓｔｒｅｓｓ．ＦｕｒｔｈｅｒｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈｅＬＨＣⅡｈａｄａｌｉｔｔｌｅｄｒｏｐａｎｄｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｃｅｎｔｒｅｐｒｏｔｅｉｎＤ２ｗａｓｒｅｄｕｃｅｄｇｒｅａｔｌｙ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（７７Ｋ）ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｅｍｉｓｓｉｏｎｓｐｅｃｔｒｕｍｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｌｉｇｈｔｅｎｅｒｇｙａｂｓｏｒｂｄｒｏｐｓｏｂｖｉｏｕｓｌｙｉｎｔｈｅｔｈｙｌａｋｏｉｄｍｅｍｂｒａｎｅａｆｔｅｒｃｈｉｌｌｉｎｇｓｔｒｅｓｓ．ＴｈｅｆａｃｔｏｆｒｅｄｕｃｔｉｏｎｏｆＦＰＳⅡ／ＦＰＳⅠｄｕｒｉｎｇｔｈｅｃｏｌｄｓｔｒｅｓｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈｅｍｏｒｅｅｘｃｉｔａｔｉｏｎｅｎｅｒｇｉｅｓｔｏａｓｓｉｇｎｔｏｔｈｅｌｉｇｈｔｓｙｓｔｅｍⅠ．Ａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ，ｔｈｅｌｏｗ－ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔａｌｓｏｃｈａｎｇｅｄｔｈｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｈｙｌａｋｉｏｄｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓｗｉｔｈｐｈｏｓｐｈｏｔｈｒｅｏｎｉｎｅ（Ｔｈｒ（Ｐ））ａｎｔｉｂｏｄｙｓｈｏｗｅｄｔｈｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆｌｉｇｈｔｈａｒｖｅｓｔｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘｅｓｐｒｏｔｅｉｎ（ｌｈｃｂ１、ｌｈｃｂ４）ｗａｓｄｒｏｐｅｄ，ｏｂｖｉｏｕｓｌｙｂｕｔｔｈｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆｌｈｃｂ２ｗａｓｓｏｍｅｗｈａｔｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ｉｔｉｓａｌｓｏｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈｅｍｏｒｅｅｘｃｉｔａｔｉｏｎｅｎｅｒｇｉｅｓｔｒａｎｓｆｅｒｔｏＰＳⅠｔｈｒｏｕｇｈｌｈｃｂ２．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅＰＳⅡｃｏｒｅｐｒｏｔｅｉｎｓＤ１，Ｄ２ａｎｄＣＰ４３ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌｉｎｃｒｅａｓｅｄｗｈｉｃｈｐｌａｙａｋｅｙｒｏｌｅｉｎｔｈｅｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍｔｗｏｄｉｍｍｅｒｓ．

ＫｅｙＷｏｒｄｓ：Ｃｈｉｌｌｉｎｇ；Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ；Ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ；Ｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ

ＴｈｅｗｏｒｋｗａｓｓｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙｇｒａｎｔｓｆｒｏｍｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ（３０２７０１２４，３９９７００６８），ｔｈｅＤｏｃｔｏｒａｌＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ（２００２０６１００９４），ＰｒｏｇｒａｍｆｏｒＮｅｗＣｅｎｔｕｒｙＥｘｃｅｌｌｅｎｔＴａｌｅｎｔｓｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮＣＥＴ－０４－０８６１）ａｎｄＳｉｃｈｕａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＲｅｓｅａｒｃｈＧｒａｎｔ９８５Ｒｅｃｅｉｖｅｄ：Ｎｏｖ２８，２００５

Ｃｏｒｒｅｓｐｏｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＤＵＬｉｎ－ｆａｎｇ，Ｔｅｌ：＋８６（２８）８５４１２７６６，Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｕｌｉｎｆａｎｇ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ

ｔｈｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＬＨＣＩＩｋｉｎａｓｅ．ＥＭＢＯＪ，１９９９，１８（１１）：２９６１～２９６９［２４］

ＳｔａｎｄｆｕｓｓＪ，

Ｋü

ｈｌｂｒａｎｄｔＷ．Ｔｈｅｔｈｒｅｅｉｓｏｆｏｒｍｓｏｆｔｈｅ

ｌｉｇｈｔ－ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘⅡ：ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃｆｅａｔｕｒｅｓ，ｔｒｉｍｅｒｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｏｌｅｓ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００４，２７９（３５）：３６８８４～３６８９１

［２５］ＫｒｕｓｅＯ，ＺｈｅｌｅｖａＤ，ＢａｒｂｅｒＪ．Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ

ｔｗｏｄｉｍｅｒｓｂｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ

ｏｆｔｈｅｔｕｒｎｏｖｅｒｏｆＤ１ｐｒｏｔｅｉｎ．ＦＥＢＳＬｅｔｔ，１９９７，４０８（３）：２７６～２８０

［２６］

ＫｅｔｔｕｎｅｎＲ，ＴｙｙｓｔｊａｒｖｉＥ，ＡｒｏＥＭ．ＤｅｇｒａｄａｔｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｏｆｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍⅡｒｅａｃｔｉｏｎｃｅｎｔｅｒｐｒｏｔｅｉｎＤ１ｉｎｉｎｔａｃｔｌｅａｖｅｓ：ｔｈｅ

ｍａｊｏｒ

ｐｈｏｔｏｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ

ｃｌｅａｖａｇｅ

ｓｉｔｅ

ｉｎ

Ｄ１

ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｉｓｌｏｃａｔｅｄａｍｉｎｏｔｅｒｍｉｎａｌｌｙｏｆｔｈｅＤＥｌｏｏｐ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，１９９６，１１１（４）：１１８３～１１９０

２０２

水稻条纹病毒与水稻蛋白质互作研究

目录 摘要 (4) ABSTRACT (5) 缩略词列表 (7) 前言 (8) 第一章文献综述 (10) 1.1水稻条纹病毒简介 (10) 1.2.1 RdRp (12) 1.2.2 P2 (13) 1.2.3 Pc2 (14) 1.2.4 P3 (15) 1.2.5 Pc3 (16) 1.2.6 P4 (16) 1.2.7 MP (17) 第二章研究路线设计 (19) 2.1研究的目的和意义 (19) 2.2拟解决的主要问题 (19) 2.3研究内容 (19) 2.3.1采用YTHS研究互作的思路 (19) 2.3.2RSV蛋白的各酵母双杂交载体构建 (21) 2.3.3构建高质量cDNA文库 (21) 2.3.4酵母双杂交筛选与RSV蛋白互作的寄主因子 (22) 2.3.5 RSV编码蛋白之间的互作研究 (22) 2.3.6 RSV蛋白的互作网络图谱 (22) 2.4技术路线 (22) 第三章实验与方法 (24) 3.1材料 (24) 3.2试剂与仪器 (27) 3.3实验方法 (25) 3.3.1 RSV编码蛋白各基因酵母双杂交载体构建 (25) 3.3.2 水稻cDNA文库构建和互作蛋白筛选 (31) 3.3.3寄主因子与RSV编码蛋白的互作验证 (35) 3.3.4 RSV编码蛋白互作研究 (36) 3.3.5 网络图谱的绘制 (37) 第四章结果与讨论 (38) 4.1 构建RSV编码蛋白的酵母双杂交载体 (38) 4.1.1引物设计 (38) 4.1.2构建RSV编码蛋白诱饵载体 (38)

4.1.3诱饵质粒的自激活检测 (39) 4.2 水稻cDNA文库构建 (40) 4.2.1水稻总RNA提取及LD-PR (40) 4.2.2筛选与RSV编码蛋白互作的水稻蛋白 (41) 4.3寄主因子与RSV编码蛋白的互作验证 (48) 4.3.1 YTHS验证水稻蛋白与RSV编码蛋白的互作 (48) 4.3.2 BiFC验证水稻蛋白与RSV编码蛋白的互作 (51) 4.4 RSV编码蛋白之间的互作研究 (58) 4.4.1 YTHS研究RSV编码蛋白之间的互作 (58) 4.4.2采用YTHS研究RSV蛋白互作 (59) 4.5 绘制RSV互作网络图 (60) 4.5.1 RSV编码蛋白间互作图谱的建立 (60) 4.5.2 RSV编码蛋白与水稻蛋白互作图谱的建立 (62) 4.5.3 RSV互作网络图谱的绘制 (62) 4.6讨论 (63) 第五章结论 (65) 5.1结论 (65) 5.2主要创新点 (65) 5.3不足之处 (65) 致谢 (66) 参考文献 (67) 附录 (73) 原创性声明 (74)

水稻UBox蛋白质在不同发育时期的表达分析

河北农业大学 硕士学位论文 水稻U-Box蛋白质在不同发育时期的表达分析 姓名：陈浩 申请学位级别：硕士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：刘国振;李莉云 2009-06-05

摘要 背景：真核生物基因组中广泛存在U-Box基因，其编码蛋白质大部分是泛素系统中决定底物特异性识别的E3蛋白质，其构象与RING-finger极其相似。U-Box蛋白质能促进底物蛋白质泛素化降解，对细胞内异常蛋白质的降解及质量控制方面发挥着重要的作用。水稻基因组中有77个U-Box蛋白质，系统了解他们的表达可为功能研究提供数据。 研究目的：制备针对水稻U-Box蛋白质的抗体，了解水稻中U-Box蛋白质在不同发育时期的表达信息，为功能研究积累数据。 材料与方法：选取5个水稻U-Box蛋白质，其共同结构特点为U-Box结构在N 端，C端有ARM结构重复。用计算机软件预测抗原决定簇，细菌体系体外表达、纯化U-Box蛋白质的片段，免疫动物制备多克隆抗体，用Western blotting检测U-Box 蛋白质在水稻品种93-11苗期地上部和地下部、分蘖期根和茎、孕穗期剑叶和幼穗、开花期剑叶和穗子、成熟期剑叶和种子中的表达，并与EST数据库中公布的U-Box 基因EST数据进行了比较分析。 结果：体外克隆表达后，获得了纯化的蛋白质，制备的抗体特异性强，Western blotting 检测可见一条明显的主带，其中Os06g01304和Os12g38210两个蛋白质的表观分子量与预测分子量相符，Os01g66130、Os02g49950和Os08g01900三个蛋白质的表观分子量低于预测分子量。5个U-Box蛋白质在水稻生长发育的不同时期或部位基本上是组成型表达，且表达量接近。对NCBI上公布的来自274个文库的100万条以上的EST进行分析，可以看出5个U-Box蛋白质EST的数量分布大致均匀，与Western blotting结果揭示的组成型表达平行，与ATPase、HSP81-3、EGF-1 alpha和RuBisCo 等对照基因相比，U-Box基因的EST数目相对很少，说明它们属于低丰度转录的基因。 结论：选取5个水稻U-Box蛋白质，通过抗原决定簇预测，表达片段蛋白质，制备了特异性抗体，证明了这一技术路线的可行性。利用抗体对水稻不同发育时期材料进行蛋白质表达谱研究，发现这些U-Box蛋白质呈组成型表达，与EST数据揭示的结果具有平行性。所制备的抗体也为相关功能研究，如免疫共沉淀、ChIP-on-chip、Pull-down以及在抗病、抗逆反应中U-Box蛋白质的表达等积累了资源。 关键词: 水稻；U-Box；蛋白质表达；Western blotting

铝毒对覆铁膜水稻生长和根尖细胞壁组分的影响

2017 年广东微量元素科学 GUANGDONG WEIUANG YUANSU KEXUE第24卷第2期文章编号：1006—446X (2017) 2-0012-06 铝毒对覆铁膜水稻生长和根尖细胞壁组分的影响 郭东磊1邢承华2姚瑶1刘庆1蔡妙珍 (1.浙江师范大学地理与环境科学学院，浙江金华321004; 2.金华职业技术学院农业与生物工程学院，浙江金华321007 ) 摘要：以水稻浙辐802为材料，通过缺磷（-P)和供Fe2+( +F e)两种方式诱导形成根表铁膜， 研究根系生长、根尖铝（A1)含量和根尖细胞壁组分差异。结果表明，100 ijunol/L Al3 +处理48 h, -P和+ Fe处理的根相对伸长率降低了 66. 67%和51. 25%，其中-P处理的根相对伸长率显著低 于+ Fe处理。根尖A1和MDA含量分别比对照组（CK)增加了1105. 6%和322. 5%，82. 45%和 51.61%, -P处理的水稻根尖A1和MDA含量显著高于+Fe处理。A1处理也显著增加根尖细胞 壁的果胶、半纤维素1和半纤维素2含量，其中-P处理的增加幅度高于+ Fe处理。表明-P处 理受A1毒害更加严重。由于-P处理诱导形成的铁膜中的Fe含量显著高于+ Fe处理，而铁膜中 的P含量则是前者显著低于后者，因此可以认为，根表铁膜上吸附的P在水稻耐铝中起主要 作用。 关键词：水稻；铝毒；铁膜；根系生长；细胞壁多糖组分 中图分类号：S 511 文献标识码：A Effects of Aluminum Toxicity on Growth and Root Cell Wall Composition of Rice with Iron Plaque on the Root Surface GUO Donglei1, XING Chenghua2, YAO Yao1, LIU Qing1, CAI Miaozhen1* (1. College of Geography and Environmental Sciences, Zhejiang Normal University, Zhejiang Jinhua 321004, China； Bioengineering Institute, Jinhua College of Vocation and Technology, Zhejiang Jinhua 321007, China) Abstract ；In this study, iron plaque on the root surface was induced by phosphorus deficiency ( - P) and Fe2+ supply ( +Fe). Rice, Zhefu 802, was used to investigate the effect of aluminum ( A1) toxicity on root growth, A1 content in root tips and root cell wall composition. Relative root length in the - P and + Fe treatment was decreased by 66. 6%and 51. 25% when treated with 100 [xmol/L Al3+ , and it was significantly lower in - P treatment than in + Fe treatment. A1 content and malonaldehyde ( MDA) content in root tips was increased by 1 105. 6%and 322. 5% , 82. 45% and 51. 61% in - P and Fe treatment than CK. Furthermore, A1 supply significantly increased pectin, hemicellulose 1 and hemicellulose 2 content, and the increase degree in roots treated with -P is higher than that + Fe 收稿日期：2017 —01 —04 基金项目：浙江省自然科学基金项目（Yl5Cl5〇〇23)。 作者简介：郭东磊，男，汉族，河南驻马店人，硕士研究生，主要从事环境生态研究。 通讯作者：蔡妙珍（1976—)，浙江东阳人，博士，教授，主要从事植物逆境营养与环境生态的研究。E-mail:mzcai@https://www.wendangku.net/doc/7110395837.html, ? 12 ?

水稻种子蛋白质含量及组分在品种间的变异与分布

水稻种子蛋白质含量及组分在品种间的变异与分布 周丽慧;刘巧泉;张昌泉;徐勇;汤述翥;顾铭洪 【期刊名称】《作物学报》 【年(卷),期】2009(035)005 【摘要】采用近红外光谱技术测定分析了351份不同类型水稻品种(系)糙米中的蛋白质含量,结果显示粗蛋白含量在9.3%～17.7%之间,平均为12.4%;籼稻平均蛋白质含量为13.2%,比粳稻高约1个百分点.蛋白质含量低的粳稻品种明显偏多,表现出明显的遗传不平衡现象.现有生产上主栽品种稻米蛋白质含量大多处于中等水平,而高蛋白粳稻种质极少.但仍有部分蛋白质含量极高或低的种质,如饲料稻、早籼稻和一些籼粳交后代品系蛋白质含量较高,而部分粳稻和外来籼稻品种中的蛋白质含量较低.因此可以从一些地方品种、外来品种以及籼粳交后代中筛选到极端类型的种质,为遗传育种提供研究的原材料.SDS-PAGE分析结果显示不同类型水稻间各贮藏蛋白组分具一定差异. 【总页数】8页(884-891) 【关键词】水稻;种子蛋白质含量;种子贮藏蛋白组成;变异;分布 【作者】周丽慧;刘巧泉;张昌泉;徐勇;汤述翥;顾铭洪 【作者单位】扬州大学农学院/教育部植物功能基因组学重点实验室/江苏省作物遗传生理重点实验室,江苏扬州,225009;扬州大学农学院/教育部植物功能基因组学重点实验室/江苏省作物遗传生理重点实验室,江苏扬州,225009;扬州大学农学院/教育部植物功能基因组学重点实验室/江苏省作物遗传生理重点实验室,江苏扬州,225009;扬州大学农学院/教育部植物功能基因组学重点实验室/江苏省作物遗传生理重点实验室,江苏扬州,225009;扬州大学农学院/教育部植物

水稻根系活力测定

一、水稻根系活力测定 1. 水稻根系流液的测定 （1）测定意义水稻根伤流液的多少与根系活力有密切的关系，在一定时间内测定伤流液的重量，是衡量根系活力的一个较为简便的方法。 （2）测定方法选用一端封闭，一端开口的很薄的塑料套管，管内放进少时脱脂棉（在天平上称得重W2），两次重的差数，代表一定时间内（t）的伤流量，并按下式计算：伤流量（g/小时）=（W1-W2）/t （3）注意事项 ① 如果没有合适的塑料套管，可以自己制作，直径大小出切口直径稍大一点，使能自由套昆为度。水稻伤流量较少，套管的长度一般2-3cm即可。用塑料薄膜根据所需大小栽成小片，在需要合缝的地方折迭起来上面紧贴上玻璃纸，而后将烧燃的烙铁在纸上前后左右移动，检查套管不漏气即可使用。 ② 收集伤流液在一天当中的最适时间随植物种类和环境条件而异，一般最好在上午进行。 ③ 套管理与地上部切口套管理接之处，一般不须密封。一则可省去手续上的麻烦，二是水分从套接的地方蒸发的机会微不足道，不影响测定结果。 2. 水稻根系氧化的测定（a-萘胺法） （1）测定意义：水稻根系的氧化力除了叶部吸收的氧转入根部外，根部还有一条乙醇酸氧化途径，这条途径可产生过氧化验氢，以后在过氧化酶的作用下产生氧，是水稻根产生氧化力的一条特殊代谢途径，由于水稻根有氧化力，可氧化土壤中有害的还原物质，从而保证了根的正常代谢。据试验报道，当根氧化力增大时，根的有氧呼吸较旺盛，吸收养料也较多。根的a蔡胺氧化力可作为水稻根系活力的一个重要指标。 （2）原理与方法 a-蔡胺吸附在水稻根表面时，能被根系氧化，生成红色羟基蔡胺，故可从根表面染争的深浅，粗略地估计根的氧化力。定时测定则是对a-蔡胺氧化前后浓度的变化进行测